CN105030655B - 一种负载cq的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及金属纳米材料制备领域，具体公开了一种负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统及其制备方法和应用。其制备方法为：S1.将介孔二氧化硅MSN进行氨基化修饰得MSN‑NH₂；再经4‑羧基苯硼酸修饰得MSN‑BA；S2.将MSN‑BA溶于PBS中，超声分散后加入CQ，搅拌反应12～24h，洗涤得负载CQ的MSN‑BA；S3.将负载CQ的MSN‑BA溶于PBS中，再加入单糖修饰的AuNPs，搅拌反应12～24h，洗涤得MSN‑CQ‑AuNPs。所述的MSN‑CQ‑AuNPs不仅能抑制Aβ的自发聚集，而且具有抑制金属离子所诱导Aβ多肽聚集的作用，可以作为一种潜在的治疗阿尔兹海默症的药物。

Description

一种负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统及其制 备方法和应用

技术领域

本发明涉及金属纳米材料制备领域，具体涉及一种负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统及其制备方法和应用。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是一种以记忆和认知功能障碍为主要特征的进行性神经变性疾病。AD多发于老年群体，60岁以上人群中AD的患病率约为5-10％，而在85岁以上人群中AD的患病率高达40-50％。随着人口的老龄化的加剧及缺乏有效的预测与治疗的手段，AD患者数量一直在增加。AD患者的平均生存期仅为5.5年，该病已成为继心脏病、癌症、中风之后，导致老年人死亡的第四大病因。然而，目前已进入临床应用乙酰胆碱酯酶抑制剂及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)只能适度减轻AD症状或减缓认知能力的下降，但却不能终止AD的病理进程。因此，根据AD的发病机理研制新型的抗AD药物具有重大意义。

AD患者的大脑的主要病理特征为细胞外出现淀粉样蛋白β(Aβ)聚集形成的老年斑及细胞内磷酸化Tau蛋白形成的神经原纤维缠结。Aβ可自发聚集形成β-折叠片层结构的不可溶纤维，这是Aβ斑块的主要形态。另一方面，金属离子是诱导Aβ聚集的重要因素之一。在AD患者脑部Aβ斑块中部分金属离子的浓度显著增加。最新研究发现金属离子如Zn²⁺和Cu²⁺离子在Aβ的聚集和活性氧(ROS)产生并导致AD中的氧化应激中有着重要作用。

根据以上研究，Aβ聚集被认为是导致神经性退行疾病AD发病的关键。金属螯合剂如氯碘羟喹(CQ)和8-羟基喹啉衍生物(PBT2)等在抑制Zn²⁺和Cu²⁺离子所诱导的Aβ聚集和ROS的产生上取得一定的效果，然而大部分的金属螯合剂不能透过血脑屏障(BBB)，即使可以透过BBB，这些金属螯合剂对金属离子的螯合不具有选择性，无法区分Aβ淀粉样蛋白斑块中的有毒金属离子或者正常组织器官中金属酶所含的金属离子。这种不加选择的螯合作用将导致扰乱生物体内正常的生理功能，从而导致一定的毒副作用并阻碍了这些金属离子螯合剂在临床上的应用。为了克服这一缺点及提高药物治疗的有效性，人们设计了具有同Aβ多肽结合及螯合金属离子能力的双功能分子，但是目前没有效的临床证据表明这些双功能分子的治疗有效性。因此，设计合成有效安全的控制释放系统用于负载金属螯合剂进入AD的靶向部位以提高金属螯合的治疗作用并减少其毒副作用仍是十分必要的。

近年来，纳米载体由于靶向运输、减少药物毒性及可提高药物治疗有效性等特点而受到人们越来越多的关注。目前，人们已设计合成了多种具有很好生物相容性、能在靶向位置控制释放药物的纳米载体，特别是在抗癌研究中。这些有效的控制释放系统中，介孔二氧化硅(MSN)具有大的比表面积和孔容量、表面容易修饰上各种基团、规则的孔道和稳定的骨架结构等优点，非常适合作为药物载体。

经检索至今未发现有关纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统同时抑制金属离子诱导Aβ多肽聚集及Aβ多肽自发聚集的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够抑制Aβ聚集的负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

一种负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统的制备方法，包含如下步骤：

S1.将介孔二氧化硅MSN进行氨基化修饰得MSN-NH₂；再经4-羧基苯硼酸修饰得MSN-BA；

S2.将MSN-BA溶于PBS中，超声分散后加入金属螯合剂CQ，搅拌反应12～24h，洗涤得负载CQ的MSN-BA；

S3.将负载CQ的MSN-BA溶于PBS中，再加入单糖修饰的AuNPs，搅拌反应12～24h，洗涤得负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统MSN-CQ-AuNPs。

优选地，S1.中所述的MSN-NH₂通过如下方法制备得到将MSN溶于有机溶剂中超声分散，随后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应12～24h，即得MSN-NH₂；

最优选地，MSN-NH₂与3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为1g:1～2mL，所述的有机溶剂为无水甲苯；

优选地，所述的MSN-BA通过如下方法制备得到：将MSN-NH₂溶于DMSO中备用，将4-羧基苯硼酸、NHS和EDC溶于DMSO中搅拌反应10～20min，然后加入MSN-NH₂的DMSO溶液，在室温下搅拌反应12～24h，离心、洗涤得经4-羧基苯硼酸修饰得MSN-BA。

进一步优选地，所述的4-羧基苯硼酸、NHS、EDC和MSN-NH₂的用量比为1～2:1～2:1～2：3～5。

最优选地，所述的4-羧基苯硼酸、NHS、EDC和MSN-NH₂的用量比为1～2:1:2：4。

优选地，S2.中MSN-BA与金属螯合剂CQ的用量比为：1g:50～100ml；金属螯合剂CQ的浓度为1～2mM。

最优选地，S2.中MSN-BA与金属螯合剂CQ的用量比为：1g:50ml；金属螯合剂CQ的浓度为1mM。

优选地，S3.中所述的负载CQ的MSN-BA与单糖修饰的AuNPs的摩尔比为1:1～1:6。

优选地，S3.中所述的负载CQ的MSN-BA与单糖修饰的AuNPs的摩尔比为1:5。

优选地，S3.中单糖修饰的AuNPs通过如下方法制备得到，将单糖与HAuCl4·3H₂O溶液混合形成均一的水溶液，然后滴加还原剂至溶液变成酒红色即得单糖修饰的AuNPs。

进一步优选地，所述的单糖为D-葡萄糖、D-半乳糖或D-甘露糖；所述的还原剂为硼氢化钠，所述的单糖与HAuCl₄·3H₂O的摩尔比为1:1～1:6；所述HAuCl₄·3H₂O与还原剂的摩尔比为1:1～1:6。

最优选地，所述的单糖与HAuCl₄·3H₂O的摩尔比为1:1；所述HAuCl₄·3H₂O与还原剂的摩尔比为1:1。

一种由上述制备方法制备得到的负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统。

所述的负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统制在备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。

所述的负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统制作为Aβ聚集抑制剂或Aβ纤维化抑制剂的应用。

有益效果：(1)本发明所述的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统MSN-CQ-AuNPs不仅能抑制Aβ的自发聚集，而且同时具有抑制金属离子所诱导Aβ多肽聚集的作用；(2)所述的MSN-CQ-AuNPs控制释放系统不仅提高了CQ在靶向位置释放减少其在血液循环中的过早释放，而且同时所释放的AuNPs协同促进CQ在抑制Aβ聚集方面的效果；(3)此外，所述的MSN-CQ-AuNPs能有效增加PC12细胞的活性，对细胞起到保护作用，并且能有效降低Aβ纤维对PC12凋亡诱导能力；可以作为一种潜在的治疗阿尔兹海默症的药物。

附图说明

图1是D-葡萄糖修饰的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统MSN-CQ-AuNPs的形貌图；其中A，C为MSN的形貌图；B，D为MSN-CQ-AuNPs的形貌图。

图2是D-葡萄糖修饰的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统抑制Aβ的自发聚集及金属离子所诱导Aβ多肽聚集的ThT荧光图。

图3是D-葡萄糖修饰的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统对铜离子诱导的Aβ40多肽聚集体神经毒性的抑制作用。

图4是D-葡萄糖修饰的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统减少铜离子诱导的Aβ40多肽聚集体对细胞膜的损伤的结果图。

图5是D-葡萄糖修饰的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统抑制铜离子诱导的Aβ40多肽聚集体所引起的神经细胞凋亡的结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

本发明所用原料的纯度只要达到化学纯以上即可，来源均可从市场购得。

实施例1 MSN-CQ-AuNPs的制备

MSN的制备：将0.1g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于48mL水中并加入3.5mL0.2M NaOH，待溶液加热到85℃，剧烈搅拌1h；随后，逐滴加入0.5mL的正硅酸乙酯(TEOS)，混合溶液再搅拌1h；MSN通过离心获得，用乙醇洗涤数遍后离心去除乙醇；MSN在HCl/甲醇中回流24h以去除表面活性剂CTAB；最后，离心得到的MSN在60℃过夜真空干燥除去介孔中的溶剂。

MSN-NH₂的制备：1.0g MSN溶于80.0mL无水甲苯并超声5min。随后加入1.0mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)并回流24h将3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰到MSN表面获得MSN-NH2。

MSN-BA的制备：将400mg纯化的MSN-NH₂溶于20mL DMSO。0.15g 4-羧基苯硼酸与0.10g NHS和0.20g EDC在5.0mL DMSO中搅拌反应15min后再加入上述MSN-NH₂溶液中。该混合液在室温(25℃)下搅拌反应24h后，离心，沉淀经过DMSO、甲醇及蒸馏水洗涤后得到4-羧基苯硼酸修饰的MSN(MSN-BA)。

D-葡萄糖修饰的AuNPs制备：200μL 0.05M HAuCl₄·3H₂O溶液同50mL D-葡萄糖溶液(0.05M)混合均匀，随后，逐滴滴入600μL新鲜制备的0.05M NaBH₄溶液。当溶液逐渐变为酒红，得D-葡萄糖修饰的AuNPs。

MSN-CQ-AuNPs的制备：

将100mg MSN-BA溶于PBS并超声5min后同5ml 1mM金属螯合剂CQ搅拌24h，离心洗涤数得负载CQ的MSN-BA；将负载CQ的MSN-BA溶于溶于PBS中，加入D-葡萄糖修饰的AuNPs(将负载CQ的MSN-BA与D-葡萄糖修饰的AuNPs的摩尔比为1:5，并搅拌12h，离心分离，弃上清液，洗涤，得到MSN-CQ-AuNPs。通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)观察，如图1所示，其中MSN与AuNPs粒径分别为50与10nm左右。MSN-CQ-AuNPs能在室温下稳定存在，容易保存。

实施例2 MSN-CQ-AuNPs对Aβ的自发聚集及金属离子所诱导Aβ多肽聚集的抑制作用

Aβ40多肽聚集成纤维的程度通过染料ThT检测，在JASCO FP6500荧光分光光度计上检测ThT的荧光强度。Aβ40溶液(30μM)同0.125,0.25和0.5mg/mL MSN或MSN-AuNPs在37℃中孵育0到5天。Aβ40溶液(30μM)同Cu²⁺(60μM)、0.5mg/mL MSN-CQ或MSN-CQ-AuNPs孵育0到5天。每天从孵育溶液中取出50μL同200μL ThT(15μM)在黑暗处孵育15min后在荧光分光光度计上检测ThT的荧光强度。ThT的激发波长为440nm，发射波长为490nm。实验重复三次并计算标准偏差。实验结果如图2所示，MSN-CQ-AuNPs对Aβ的自发聚集及金属离子所诱导Aβ多肽聚集均有抑制作用。

实施例3 MSN-CQ-AuNPs对Aβ的自发聚集及金属离子所诱导Aβ多肽聚集神经毒性的抑制作用

本实验中PC12细胞购自ATCC公司，培养条件为添加了5％马血清、10％牛血清的DMEM培养基，5％CO₂，37℃条件下。

MTT测试方法：将PC12细胞接种到96孔板上，每孔5×10³个细胞，培养24h等细胞贴壁。为了检测Aβ40纤维的毒性，Aβ40多肽(30μM)同Cu²⁺(60μM)及0.5mg/mL纳米粒子在细胞培养基中37℃孵育3天。随后细胞同这些孵育溶液中继续培养72h。为了检测纳米材料的毒性，贴壁的PC12(5×10³个/孔)同不同浓度的纳米粒子孵育48h。在培养结束的前4h加入60μL/孔MTT溶液。4h后吸弃培养液，加入100μL DMSO，振荡15min。酶标仪测定OD值，吸收峰为450nm。按以下公式计算细胞的存活率：细胞存活率(％)＝(加药孔平均OD值/对照组平均OD值)×100％

乳酸脱氢酶(LDH)释放检测：将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，细胞密度不超过80-90％满。吸去培养液，用PBS液洗涤一次。换新鲜无血清培养液或含孵育的Aβ40多肽样品处理48h。到达预定培养时间后，将96孔板用多孔板离心机1500g离心10min。分别取各孔的上清液120μL，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。各孔分别加入60μLLDH检测工作液混匀，避光孵育30min后在490nm处测定吸光度。

实验结果见图3，本发明中负载了CQ的D-葡萄糖修饰的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统MSN-CQ-AuNPs不仅细胞毒性都很低，而且能有效地抑制铜离子诱导的Aβ40多肽聚集体及Aβ40多肽自发聚集的神经毒性，相比于对照组，细胞存活率大于90％。

实施例4 MSN-CQ-AuNPs减少铜离子诱导的Aβ40多肽聚集体对细胞膜的损伤

将PC12细胞用胰酶消化成悬浮液，接种在玻片上并培养24h到细胞贴壁。Aβ40多肽(30μM)同Cu²⁺(60μM)及0.5mg/mL纳米材料在细胞培养基中37℃培养3天。随后，接种在玻片上的细胞同上述孵育的Aβ40多肽溶液继续培养48h。等到培养结束，用PBS将细胞洗涤3遍，用2％戊二醛和2％多聚甲醛溶液固定细胞30min。PBS洗涤3遍，1％OsO₄处理15min。细胞再经过梯度酒精(30％,40％,50％,70％,80％,90％和100％)脱水。细胞经过CO₂临界点干燥4h，最后喷金后在扫描电镜上观察Aβ40多肽对PC12细胞形态的影响。实验结果见图4，清晰展示Aβ40及纳米粒子对细胞形态及细胞膜的影响。与对照组相比，细胞经过Aβ40纤维处理后，细胞发生萎缩。在Aβ40-Cu²⁺复合物组中，可以清楚观察到Cu²⁺离子所诱导的Aβ40聚集体粘附在细胞膜上，细胞的大小及形态发生极明显变化，细胞膜发生褶皱、破裂，说明这些细胞的细胞膜发生损伤主要是由于Aβ40-Cu²⁺复合物与细胞膜的相互作用的结果。MSN-CQ-AuNPs和MSN-CQ可以抑制Aβ40-Cu²⁺复合物对细胞膜的损伤，然而由于未封堵的MSN所负载的CQ易过量释放，PC12细胞发生轻微变化，说明MSN-AuNPs这一控制释放系统可保护PC12细胞免受Aβ40-Cu²⁺复合物所引起的细胞膜损伤并减少CQ的一些毒副作用。

实施例5 MSN-CQ-AuNPs抑制铜离子诱导的Aβ40多肽聚集体所引起的神经细胞凋亡

在12孔培养板中各孔放置一片高温灭菌过的玻片，取对数生长期的PC12细胞用0.1％胰蛋白酶溶液消化制成细胞悬浮液，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，接种于玻片上，在超净工作台上放置40min，添加1mL培养基，置培养箱中培养。Aβ40多肽(30μM)同Cu²⁺(60μM)及0.5mg/mL纳米材料在细胞培养基中37℃培养3天。将PC12细胞接种到玻片上，待细胞贴壁后同上述孵育的Aβ40多肽溶液培养48h。用2％戊二醛和2％多聚甲醛溶液固定细胞30min。PBS洗涤3遍，再用0.1％Triton X-100通透15min。DNA因双链断裂或一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3'-OH末端，3'-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将FITC标记的核苷酸标记DNA片段标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测。最后用DAPI染色10min，在Nikon Eclipse TE 2000-E荧光显微镜(200×)观察凋亡的细胞核。实验结果如图5所示，发生凋亡的细胞被TUNEL染成绿色，Aβ40-Cu²⁺复合物所诱导PC12细胞凋亡的数量显著增加，而在加入MSN-CQ-AuNPs后，PC12细胞凋亡的数量显著减少，说明MSN-CQ-AuNPs可保护PC12细胞免受Aβ40-Cu²⁺复合物所诱导凋亡。

Claims (9)

1.一种负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

S1.将介孔二氧化硅MSN进行氨基化修饰得MSN-NH₂；再经4-羧基苯硼酸修饰得MSN-BA；

S2.将MSN-BA溶于PBS中，超声分散后加入金属螯合剂CQ，搅拌反应12～24h，洗涤得负载CQ的MSN-BA；

S3.将负载CQ的MSN-BA溶于PBS中，再加入单糖修饰的AuNPs，搅拌反应12～24h，洗涤得负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统MSN-CQ-AuNPs。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1.中所述的MSN-NH₂通过如下方法制备得到将MSN溶于有机溶剂中超声分散，随后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应12～24h，即得MSN-NH₂；所述的MSN-BA通过如下方法制备得到：将MSN-NH₂溶于DMSO中备用，将4-羧基苯硼酸、NHS和EDC溶于DMSO中搅拌反应10～20min，然后加入MSN-NH₂的DMSO溶液，在室温下搅拌反应12～24h，离心、洗涤得经4-羧基苯硼酸修饰得MSN-BA。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，MSN-NH₂与3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为1g:1～2mL，所述的有机溶剂为无水甲苯；所述的4-羧基苯硼酸、NHS、EDC和MSN-NH₂的用量比为1～2:1～2:1～2：3～5。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2.中MSN-BA与金属螯合剂CQ的用量比为：1g:50～100ml；金属螯合剂CQ的浓度为1～2mM。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3.中所述的负载CQ的MSN-BA与单糖修饰的AuNPs的摩尔比为1:1～1:6。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3.中单糖修饰的AuNPs通过如下方法制备得到，将单糖与HAuCl₄·3H₂O溶液混合形成均一的水溶液，然后滴加还原剂至溶液变成酒红色即得单糖修饰的AuNPs。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的单糖为D-葡萄糖、D-半乳糖或D-甘露糖；所述的还原剂为硼氢化钠，所述的单糖与HAuCl₄·3H₂O的摩尔比为1:1～1:6；所述HAuCl₄·3H₂O与还原剂的摩尔比为1:1～1:6。

8.权利要求1～7任一项制备方法制备得到的负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统。

9.权利要求8所述的负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。