CN102294016A - 治疗血管相关疾病的包含肽的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗血管相关疾病的药物组合物，其包含具有Xaa-Gly-Asp序列的肽作为有效成分，其中，所述肽的氨基酸Xaa是精氨酸或赖氨酸，所述血管相关疾病是选自由以下疾病所组成的组中的一种或多种疾病：(i)血管壁血液渗漏，(ii)血管损伤，(iii)由于血管壁血液渗漏或血管损伤引起的局部缺血性血管相关疾病，(iv)由于血管壁血液渗漏或血管损伤引起的水肿。

Description

治疗血管相关疾病的包含肽的药物组合物
本申请是原申请的申请日为2007年1月19日，申请号为200780002554.3，发明名称为《治疗血管相关疾病的包含肽的药物组合物》的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及治疗水肿、缺血和血管相关疾病的化合物，该化合物通过稳定血管壁以形成和维持新血管，从而防止血液渗漏并帮助正常血管生长。更具体地，本发明涉及能够用作治疗血管相关疾病治疗剂的组合物，该组合物通过利用含有碱性氨基酸-Gly-Asp序列的肽和/或干细胞形成和维持正常血管，从而防止血液渗漏。
背景技术
作为血管疾病之一的缺血也被称为局部缺血，在局部缺血中，供给到组织的血液因血管狭窄、收缩、血栓、栓塞等原因被止住而导致细胞损伤。
1961年，据Majno和Palade报告，血液渗漏是由于由组织胺、缓激肽和5-羟色胺引起的炎症导致小静脉血管的内皮细胞之间形成间隙造成的。是(Majno G.，Palade G.E.，生物物理学和生物化学细胞学杂志(J.Biophys.Biochem.Cytol.)11：571-605(1961)；Majno G.，Palade G.E.，Schoefl G.I.，J.Biophys.Biochem.Cytol.11：607-625(1961)。
已知血管内皮细胞之间的间隙是在暴露于炎症诱导剂以及各种细胞因子(Claudio L.等.，Lab Invest.70：850-861(1994)；Wu N.Z.，Baldwin A.L.Am.生理学杂志(J Physiol).262：H1238-1247(1992))、蛋白酶(Volkl K.P.，DierichsR.血栓研究(Thromb.Res.)42：11-20(1986))、轻微灼伤(Clough G.等，J.Physiol.395：99-114(1988))之后产生的。在不同种类的癌症中也发现了这种现象(Hobbs S.K.等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95：4607-4612(1998)；Roberts W.G.等，美国病理学杂志(Am.J Pathol.)153：807-830(1998)；Nishio S.等，神经病理学学报(Acta.Neuropathol).(Berl)59：1-10(1983)。除癌症之外，这种现象在人哮喘病(Laitinen A.，Laitiene L.A.过敏进展(Allergy Proc).15：323-328(1994))、色素性荨麻疹(Ludatscer R.M.Microrasc.Res.31：345-355(1986))、风湿病(Schurnacher H.R.Jr.纽约科学院院报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)256：39-64(1975))等病症中也有体现。
血管具有各种特征，例如在慢性炎症的情况下，与血管变化相关的特征包括血管舒张和血管生成。这时，人们发现血管的形状变成畸形，它具有异常特征而非正常特征，以及血管的直径增加，同时在鼠慢性气管炎症模型中，对血管假性血友病因子和P-选择蛋白(血小板选择蛋白)的免疫反应提高。如上所述揭示出，与正常小鼠的血管相比，畸形血管对免疫介质的反应能力较差。
为此，为了开发出能够抑制或减慢异常血管生长或血液渗漏的物质，人们做出了很多努力。据报道，合成肽麦斯蒂辛斯(mystixins)能够抑制血浆渗漏不阻止血管内皮细胞中的间隙形成(Blauk P.等，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，284：693-699(1998))。同样，如果血管内皮细胞中的间隙形成得到抑制，β-2-肾上腺素能受体激动剂福莫特罗减少血液渗漏(Blauk P.和McDonald D.M.，Am.J.Physiol，266：L461-468(1994))。
已经有很多尝试来开发引起血管形态变化的物质，血管生成素是其中关注的焦点物质之一。血管生成素-1具有稳定血管的功能(Thurston G.等，天然药物(Nat.Med).6(4)：460-3(2000))，并能够使血管内皮生长因子的血管生成稳定化，因此能抑制血液渗漏。已报道这一机理用于治疗包括慢性糖尿病中因外周血管疾病引起的视网膜病、因血管发育异常而导致的早产儿视网膜病等(Joussen A.M.等，Am.J.Pathol.160(5)：1683-93(2002))的疾病。然而，重组血管生成素-1因其存在诸如稳定性、可溶性等问题而不能直接用于疾病治疗，因此，人们已把努力开发具有血管生成素-1活性的取代物作为另一种选择(Koh G.Y.等，实验与分子病理学(Exp.Mol.Med).34(1)：1-11(2002))。近年来，人们已知通过激活血小板以释放血管生成素-1可以稳定血管形成中新生的血管(Huang等，血液(Blood)95：1993-1999(2000))。而且，据报道，凝血酶与激活血小板以从血小板中释放血管生成素-1有关(Li等，血栓与止血学(Throm.Haemos)t.85：204-206(2001))。然而，凝血酶不仅能释放出血管生成素-1来稳定血管，而且它还是伴随血小板凝固现象的一部分。所以，使用凝血酶来控制血管生成素-1的释放是很困难的，并且预计可能会存在因血液凝固而产生的副作用。此外，人们一直致力于寻找诱导生成血管生成素-1的化合物，但是现有技术中却没有这种化合物的报道。
已经已知常规的含有RGD基序和KGD基序的肽抑制血管形成(Victor I.R.和Michael S.G.前列腺(Prostate)39：108-118(1999)；Yohei M.等，生物化学杂志(J.of Biological Chemistry)276：3：31959-31968(2001))。据报道，当含有RGD基序和KGD基序的肽与血管内皮细胞的ovβ3整联蛋白结合时，就会出现上述效应(Pasqualini R.等，天然生物化学(Nat.Biotechnol).15(6)：542-6(1997))。通常，整联蛋白是血管内皮细胞生长必需的细胞与细胞间或细胞与底物间介质(Brian P.Eliceiri，环境研究(Circ.Res).89：1104-1100(2001))。所以，与整联蛋白结合以抑制其作用的解聚素含有构成纤维蛋白原主要结构基序之一的RGD或KGD基序。为此，出现了很多尝试关于有多少含有RGD和KGD序列的肽的研究，所述肽结合整联蛋白以通过中断血管内皮细胞的生长迁移而抑制血管生成。此外，如在国际专利公开No.WO 95/25543(1995)中所公开的，组织中的血管生成需要整联蛋白αvβ3，并且抑制血管形成的含RGD和KGD基序的肽用于抑制血管形成，因此通过抑制新血管的形成和消灭新形成的血管而阻断血液供给。美国专利No.5,766,591(1998)揭示了利用包含RGD和KGD基序的肽作为整联蛋白αvβ3的拮抗剂抑制血管形成可以抑制实体癌的生长。
近年来，为了治疗心脏疾病，已经尝试研发能够通过以纤维蛋白原作为配体结合整联蛋白中的αIIbβ3并抑制整联蛋白的抑制剂(Topol等，Lancet353：227-231(1999)；Lefkovits等，新英格兰医药杂志(N.Eng.J.Med).23：15530-1559(1995)；Coller BS临床研究杂志(J.Clin.Invest).99：1467-1471))。然而，据报道这些尝试都没有获得成功(OtNeill等，N.Eng.J.Med.342：1316-1324(2000)；Cannon等，循环(Circulation)102：149-156(2000))。这也是含有RGD和KGD基序的肽能够以浓度依赖方式激活整联蛋白以诱导激活血小板，以及能和现有的整联蛋白结合以抑制整联蛋白活化的原因(Karlheinz等，Throm.Res.103：S21-27(2001)；Karlheinz等，Blood 92(9)：3240-3249(1998))。整联蛋白中存在诱导配体的结合位点(Ligand-induced binding site，LIBS)。这时，如果所述RGD和KGD肽与整联蛋白结合，就会诱导整联蛋白构象发生变化并暴露LIBS，接着配体就与暴露的LIBS相结合从而激活血小板(Leisner等，生物化学杂志(J.Biol.Chem).274：12945-12949(1999))。据报道所述血小板的激活能够在低浓度而非高浓度的条件下得到诱导。如果RGD和KGD基序能够以这种方式稳定血小板，在血小板激活过程中分泌的细胞因子(例如，血管生成素-1)可能有助于增加和稳定而非抑制血管形成。
本发明中，得到了非常不同的结果，含RGD和KGD基序的肽并非如上文所述通过抑制和消灭新生血管来抑制血液供给，而是通过促成正常血管的形成和稳定已生成的血管来抑制血液渗漏，因此有利于血液供给。经证实，含有RGD和KGD基序的肽不能有效地通过直接与整联蛋白反应而抑制血管生成，但是它却能有效地治疗和预防损伤(injury)、烧伤、褥疮和慢性溃疡，同时还能预防血液渗漏以治疗眼内疾病如：糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、年龄相关性黄斑变性等，它对血管的形成和稳定也很有效，同时含RGD和KGD基序的肽在次级反应中抑制异常的血管形成。
而且，在脱发或灰发症(trichopoliosis)的情况下，与血管接触的毛囊负责形成组成头发的髓质、皮质、角质层。这时，如果由于异常血管中的血液渗漏导致不能促成平稳提供给毛囊的血液供给，那么毛囊，即毛发就不会形成，同样由于不能在组成毛干的毛根细胞中正常形成黑素体而导致毛色变白的灰发症。
可以预料，由于其能够通过稳定血管形成来抑制血液渗漏继而促进血液供给，本发明提供的组合物还能够有效地预防和治疗这些病症。另外，可以预料该组合物能够同样有效地预防和治疗与肥胖相关的心血管疾病，同样也是用于人造皮肤和移植、局部缺血的血管治疗剂。
作为另外一种选择，有一种方法能够促进正常新血管在血管损失阶段生成，并能够预防随后阶段出现的疾病。在这种方法中，已经有使用干细胞治疗眼血管疾病的尝试。已知骨髓包含可以形成新血管内皮前体细胞(EPCs)，并且据报道当为了促进视网膜血管生成而施用骨髓来源的造血干细胞(HSCs)时，其能充当内皮前体细胞的角色(Grant M.B.等，Nature Med.8：607-612(2002))。内皮前体细胞可以分化成同血管发生有关的循环EPCs(cEPCs)。另外，据报道造血干细胞(heamatopoietic stem cells，HCSs)、造血祖细胞(HPCs)等均与新血管的形成和维持有关(Rafii S.等，Nature Med.9：7027-712(2003))。据报道为了治疗目的通过将骨髓来源的造血干细胞施用至小鼠眼中的玻璃体腔内，造血干细胞可以充当祖细胞用于形成视网膜血管(Otani A.等，NatureMed.9：1004-1010(2002))。除造血干细胞之外，也报道了各种类型的干细胞，诸如胚胎干细胞、间充质干细胞等。在自体移植中，造血干细胞不会引起免疫排异反应，但在同种异基因移植或异种移植中，它会引起免疫排异反应。因此，上述方法中的问题仍有待解决。
发明内容
因此，本发明就是为解决现有技术中的这些问题而设计的，因此，它的目的就是提供一种能利用含有特定序列的肽诱导正常血管生成的治疗剂。
为了完成上述目的，本发明提供了能够治疗水肿和/或血管相关疾病的包含含有Xaa-Gly-Asp序列的肽作为有效成分的药物组合物。
根据本发明，所述肽中的氨基酸Xaa优选为精氨酸或赖氨酸，并且肽的序列最优选是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所列的序列。
根据本发明，所述肽序列也包括选自从SEQ ID NO：4，以及SEQ ID NO：6到SEQ ID NO：10所组成的组中的一个肽序列。
本发明中，血管相关疾病包括但不特别局限于选自下列的疾病所组成的组中：糖尿病视网膜病、早产儿视网膜病变、老年性黄斑变性、青光眼、糖尿病足溃疡、肺动脉高压、缺血性心肌病(ischemic myocardium)、缺血性脑病、皮瓣(skin flap)存活、心力衰竭、急性后肢缺血、损伤、灼伤、褥疮、慢性溃疡、脱发或正常毛细血管形成条件下的灰发症、肥胖相关的心血管疾病、用于人工皮肤和移植的血管治疗剂和局部缺血。
还可以预料包含RGD和KGD基序的肽能够有效治疗脱发或正常毛细血管形成中的灰发症或肥胖相关的心血管疾病，而且还可有效治愈因水肿及局部缺血或烧伤造成的损伤，同时可以治疗和预防褥疮和慢性溃疡。
另外，本发明中的肽还可以诱导血管生成素-1的分泌。
同样，据报道在单侧输尿管梗塞模型(UUO)中，作为改良的血管生成素-1的COMP-Angl具有保护肾的血管内皮细胞以抑制炎症，从而阻止单核细胞或巨噬细胞的浸润作用，而且还具有通过减少组织中TGF-β1的数量来抑制Smad2/3磷酸化和激活Smad7以减轻肾纤维化的作用(Kim等，美国肾病学会杂志(J.Am.Soc.Nephrol.)17：2474-2483(2006))。已经揭示血管生成素-1可被用作能特异性地对肾纤维化中的血管内皮细胞做出反应以治疗肾疾病的治疗剂。依据本发明，认为含有RGD或KGD基序的多肽可以通过间接诱导体内血管生成素-1的释放用于治疗肾疾病。
本发明的包含序列Xaa-Gly-Asp的多肽可以单独使用，但是如果与VEGF(Benest等，微循环(Microcirculation)13：423-437(2006))或bFGF联合使用，将更有效。
此外，本发明提供了用于治疗血管相关疾病的药物组合物，该组合物除了所述肽之外还包含干细胞。
根据本发明，干细胞优选是至少具有分化成血管内皮细胞能力的干细胞，例如：胚胎干细胞、间充质干细胞和造血干细胞。
此外，能用本发明中包含干细胞的组合物治疗的血管相关疾病是但不限于选自由肺动脉高压、局部缺血心肌病、皮瓣存活、心力衰竭、急性后肢局部缺血、眼部疾病所组成的组中。
本发明中描述的具有治疗诸如局部缺血的疾病能力的肽包括含有序列Xaa-Gly-Asp的肽或其片段或其具有相同功能的衍生物，并且，如果用干细胞来治疗所述疾病，那么优选所述干细胞和含有序列Xaa-Gly-Asp的多肽一起使用。
能够用本发明的蛋白质和干细胞治疗或预防的血管生成相关疾病优选是利用诱导血管生成素-1的分泌稳定新生血管的治疗机制治疗的疾病，这些疾病选自由肺动脉高压(Ann Thorac Surg 20042月77(2)449-56)、心肌缺血(与VEGF；Biochem Biophys Res Commun.200310月24；310(3)：1002-9)、皮瓣存活(显微外科手术(Microsurgery.)2003；23(4)：374-80)、心力衰竭(冷泉港定量生物学会议录(Cold Spring Harb Symp Quant Biol)2002；67：417-27)、急性后肢缺血(与血管内皮生长因子(VEGF)；生命科学(Life Sci)20036月20；73(5)：563-79)等所组成的组中，更优选眼部疾病。
适用本发明治疗的眼部疾病具体是早产儿视网膜病、糖尿病视网膜病、青光眼等。
本发明药学可用的组合物包含例如可用的稀释液、添加剂或载体。
本发明的药学可用的组合物包含所述肽和适于递送或施用到体内或体外的组织或器官中的药学可用的组合物。
由于肽和/或蛋白质可能含有酸性和/或碱性的末端和/或侧链，所以本发明的药物组合物可以包含以游离酸或游离碱或药学上可用的盐形式存在的肽和/或蛋白质。药学上可用的盐可能含有合适的能与本发明中的肽和/或蛋白质形成碱的酸，所述合适的酸选自由无机酸和有机酸所组成的组中，其中无机酸诸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸及它们的衍生物；有机酸有甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、邻氨基苯甲酸(anthranilic acid)、肉桂酸、萘磺酸、磺胺酸及它们的衍生物。与目标蛋白质形成碱的合适的碱例如包括无机碱和有机碱；所述无机碱诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾及它们的衍生物；所述有机碱诸如单、二和三烷基胺(例如：三乙胺、二异丙胺、甲胺、二甲胺及它们的衍生物)和任选取代的乙醇胺(例如：乙醇胺、二乙醇胺及它们的衍生物)。
所述药物组合物可以以各种途径给药，包括但不局限于肠胃外、肠、局部的给药或吸入。肠胃外给药是指任何不经过消化道的给药，包括但不局限于注射液(即下文描述的静脉内、肌内和其他注射方式)。肠内给药就是用于肠胃外给药的任何给药方式，它包括但不局限于片剂、胶囊、口服溶液、混悬液、喷雾剂及它们的衍生物。为此，肠内给药途径指经直肠和阴道的给药。局部给药途径包括但又不局限于乳剂、软膏、凝胶剂和肠胃外帖剂(parenteral patches)的任何给药方式(也可参见雷氏药学大全(Remington’s PharmaceuticalSciences)，第18版，Gennaro，等，马克印刷公司，伊斯顿，宾夕法尼亚(MackPrinting Company，Easton，Pennsylvania)，1990)。
例如，本发明的肠胃外药物组合物例如可以静脉(静脉内地)给药、动脉(动脉内地)给药、肌肉(肌内注射地)给药、给药给皮肤(皮下或植入组合物(depot composition))，通过冠状动脉的注入或利用递送入组织或器官的溶液给药给心包。
可注射的组合物可以是适合注射给药途径的药物组合物，其中注射包括但不局限于注射到静脉、动脉、冠状血管、血管周围的间皮瘤、肌肉内、皮下和关节的给药。可注射的药物组合物可以是能直接给药至心脏、心包或冠状动脉的药物组合物。
对于口服给药，所述药物组合物可以通过常规方法制备的片剂或胶囊形式而被摄入，例如：利用药物上可获得的添加剂制备片剂或胶囊，诸如粘合剂(例如：预凝胶玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如：乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如：硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如：马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或润湿剂(例如：十二烷基硫酸钠)。片剂可以利用本领域已知的方法进行包衣(见Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版.Gennaro等，Mack Printing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。
口服药物组合物可以是以例如溶液、糖浆或悬浮液，或者是使用前与水或其他合适的溶剂混合的干燥制品的形式摄入。制备药物组合物溶液可以使用常规方法利用药学上可用添加剂诸如悬浮剂(例如：山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如：卵磷脂或阿拉伯胶)；不溶的载体(例如：杏仁油、油酯、乙醇或分馏的植物油)；防腐剂(例如：甲基或对羟基苯甲酸丙酯或已二烯酸)。
必要时，药物组合物还可以包含缓冲盐、香料、色素和甜味剂。
肠内给药的药物组合物可以是适合口服的形式，例如片剂、含片或锭剂。本发明中的肽和/或蛋白质可以制备成用于经过直肠和阴道内给药途径的溶液(直肠乳剂)、栓剂或软膏。肠内药物组合物可以是适合全胃肠外营养(totalparenteral nutrition，TPN)混合物的混合溶液，或者摄入混合物，诸如通过饲管(intake tube)递送的溶液(见Dudrick等，1998国际外科技术(Surg.Technol.Int).VII：174-184；Mohandas等，2003，全国医学杂志(Natl.Med.J.India)16(1)：2933；Bueno等，2003胃肠内镜(Gastrointest.Endosc).57(4)：536-40Shike等，1996，Gastrointest.Endosc.44(5)：536-40)。
吸入式给药时，本发明的肽和/或蛋白质通常是在气溶胶喷雾存在下或是以在容器中压有合适抛射剂的喷雾器递送的，所述抛射剂例如，诸如二氟二氯甲烷、氟三氯甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在压力气溶胶的情况下，其容量可能取决于阀门输送的重量。例如，可制备胶囊和胶质药筒供包含合适的粉末基质，例如乳糖或淀粉，以及这些化合物的粉末混合物的吸入器或吹入器使用。
本发明的滴眼剂可以是可溶解的眼用溶液、不溶的眼用溶液或眼用乳剂。本发明的滴眼剂可以通过将本发明中的肽溶解或悬浮在可溶解的溶剂，诸如灭菌的纯净水或生理盐水，以及不溶的溶剂，诸如包括棉籽油、豆油的植物油等中而制备得到。在这种情况下，必要时也可向其中添加等渗剂、pH调节剂、增稠剂、悬浮剂、乳化剂、防腐剂，以及等量的药学上可用添加剂。具体而言，等渗剂包括氯化钠、硼酸、硝酸钠、硝酸钾、D-甘露醇、葡萄糖等。pH调节剂的具体实例包括硼酸、无水硫酸钠、盐酸、柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸、乙酸钾、碳酸钠、硼砂等。增稠剂的具体实例包括甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、软骨素硫酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮等。悬浮剂的具体实例包括聚山梨醇酯80、聚氧化乙烯氢化蓖麻油等。乳化剂的具体实例包括但不局限于蛋黄卵磷脂、聚山梨醇酯80等。防腐剂的具体实例包括但不局限于氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、氯代丁醇、苯乙醇、p-邻羟基苯甲酸酯等。
本发明的组合物可施用给需要治疗血管相关疾病的受试者。药物组合物的毒性和治疗功效可根据实验动物标准药物操作，例如细胞培养或半数致死量(LD50)(一组中50％致死量)测量和半数有效剂量(ED50)(一组中50％有效量)测量确定。施用的组合物的毒性效应和治疗效果的比率称为治疗指数，而治疗指数可用LD50/ED50比值表示。具有高治疗指数的药物组合物是优选的。
在一个实施方案中，从细胞培养分析和动物研究得到的资料可用来确定应用于人的剂量。依据本发明的组合物的剂量优选在包括ED50值的循环密度范围以内此剂量的组合物无毒或几乎无毒。剂量也会随着所使用的成分的范围和给药途径而变化。在本发明方法中使用的组合物中，有效治疗剂量可以在最初通过细胞培养分析计算出来。为了获得包括IC50值(即试验材料显示一半极限抑制的量)的血浆浓度范围，在动物模型上对剂量进行了设计，如在细胞培养中测定的那样。该信息可用于更准确地确定人体用药的有效剂量。例如可通过高效液相色谱法确定血浆中测试材料的水平。
在另一个实施方案中，本发明包含肽和/或蛋白质的组合物的有效含量优选在约0.1μg至约10mg/kg病人体重范围内给药，更优选在约1至约1000μg/kg病人体重给药。所述肽和/或蛋白质的给药量是0.1μg、0.2μg、0.5μg、1μg、2μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、200μg、250μg、300μg、400μg、500μg或1000μg。
在另一个实施方案中已经证实本发明组合物的有效量在静脉注射时为1μg至10mg/kg体重；眼部注射时为1ng至1mg/kg体重；眼用混悬液为1ng至10mg/ml。配好剂量的本发明的组合物优选使用皮内或皮下给药。可采用单次给药或多次分开给药：例如采用日服、隔天服用、周服、隔周服用或按月服用的形式施用所述组合物。
下文将对本发明进行描述。
本发明中首次证实含Xaa-Gly-Asp序列的肽用于治疗血管疾病，诸如用于治疗局部缺血是有效的，同时也首次显示血管疾病病变中存在血管生成素-1的分泌。已经证实在两个细胞系和小鼠角膜新生血管形成模型中，利用血管生成素-1的分泌可治疗与异常血管生成有关的疾病，同时也证实，含有序列Xaa-Gly-Asp的多肽与干细胞一起用于氧分压变化诱导的视网膜内血管生成小鼠模型时，能有效治疗异常血管生成相关疾病。
此外，已经证实在创伤-愈合小鼠模型中，当使用该多肽治疗伤口时，含有Xaa-Gly-Asp序列的多肽能有效地治疗小鼠皮肤创伤，这表明含有Xaa-Gly-Asp序列的多肽能用于治疗损伤、烧伤，预防和治疗脱发或正常毛细血管形成条件下的灰发症或与肥胖有关的心血管疾病、以及褥疮和慢性溃疡。
最新发现表明：当用合成并纯化的含有Xaa-Gly-Asp序列的多肽以不同密度处理两个细胞系时，多肽可以诱导血管生成素-1的分泌。在小鼠角膜新生血管形成模型中，也证实血管生成素-1的诱导分泌能够促进正常血管的形成，并能通过稳定血管结构减少含有异常血管结构的病态血管原管(angiogenicvessel)的血液渗漏。同时，可以观察到正常人细胞系的血小板衍生生长因子(PDGF)的分泌被抑制在血小板中，其中血小板衍生生长因子是血管生成的重要因素之一。在使用氧分压变化的视网膜内血管生成诱导小鼠模型中，同时给药含有干细胞的单核细胞(MNCs)和含有Xaa-Gly-Asp序列的多肽时，证实在异常血管生成中发现的血液渗漏和血管结构变化被抑制，正常血管形成，且血管结构稳定。所以，本发明的组合物优选用于治疗早产儿视网膜病、糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性等。早产儿视网膜病是在正常发育抑制中发展的眼部疾病之一，而糖尿病性视网膜病和老年性黄斑变性是由正常血管结构损伤而造成的异常血管生成相关疾病之一。
附图说明
本发明最优方案的这些及其他特征、方面和优点将在下文对照附图得到详细说明。在附图中：
图1是显示在利用血管生成因子诱导小鼠角膜血管生成的动物模型中，形成小鼠角膜袋和将VEGF团粒(pellet)注入小鼠角膜袋的操作的图像；
图2是显微镜图像，其显示在利用VEGF诱导小鼠角膜血管生成的动物模型中，当将含有RGD序列的多肽腹膜内给药至该动物模型中时，含有RGD序列的多肽诱导正常血管生成并抑制异常血管生成；
图3是使用荧光FITC-葡聚糖的图像，其显示在利用VEGF诱导小鼠角膜血管生成的动物模型中，当将含有RGD序列的多肽腹膜内给药至该动物模型中时，含有RGD序列的多肽诱导正常血管生成并抑制变异血管生成；
图4显示的是在利用VEGF诱导小鼠角膜血管生成的动物模型中，将含有RGD序列的多肽腹膜内给药时，通过该多肽数字化(digitalize)的血管生成的产生水平图表；
图5显示在利用高压氧处理(75％)后将高氧压降到标准氧分压来诱导小鼠视网膜血管生成的动物模型中，当小鼠视网膜暴露于高氧分压时，不表现正常血管生成的小鼠的视网膜(图5-A)与在标准氧分压下正常生长小鼠的视网膜(图5-B)对比图像；
图6是使用荧光FITC-葡聚糖的图像，其显示在利用高压氧处理(75％)后将高氧压降到标准氧分压来诱导小鼠视网膜血管生成的动物模型中，当将多肽腹膜内给药时，含有RAD序列的多肽(SEQ ID NO：3)不诱导正常血管生成(图6A)；但含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)诱导正常血管生成，并减少血液渗漏(图6的B和C)；
图7是使用荧光FITC-葡聚糖的图像，其显示在利用高压氧处理(75％)后将高氧压降到标准氧分压来诱导小鼠视网膜血管生成的动物模型中，当腹膜内给药含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)时，诱导了正常血管生成，并减少了血液渗漏(图7的A和B)；
图8是使用荧光FITC-葡聚糖的图像，其显示在利用高压氧处理(75％)后将高氧压降到标准氧分压来诱导小鼠视网膜血管生成的动物模型中，当腹膜内给药含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO：8)时，诱导了正常血管生成，并减少了血液渗漏；
图9是使用荧光FITC-葡聚糖的图像，其显示在利用高压氧处理(75％)后将高氧压降到标准氧分压来诱导小鼠视网膜血管生成的动物模型中，当腹膜内给药锯鳞肽(echistatin)和蝮蛇毒素时，诱导了正常血管生成，并减少了血液渗漏；
图10是H&E染色组织图像，其显示在利用高压氧处理(75％)后将高氧压降到标准氧分压来诱导小鼠视网膜血管生成的动物模型中，当膜内给药含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8)时，同阴性对照相比(图10B)，内部的神经节细胞层保持正常厚度而无任何肥大(图10C和D)，其水平与正常小鼠厚度类似(图10A)；
图11是显微镜图像，其显示了从小鼠骨髓分离并随后分别用荧光烟酸己可碱(Hoechst)-33342(图11A)、异硫氰酸荧光素(FITC)(图11B)染色的全部单核细胞(MNC)；
图12是使用荧光FITC-葡聚糖的图像，其显示在利用高压氧处理(75％)后将高氧压降到标准氧分压来诱导小鼠视网膜生成的动物模型中，当将含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO：5)和单核细胞单独(分别为图12的A和B)或联合(图12的C)腹膜内给药时，出生后20天可分离并观察到小鼠视网膜，其中单独给药单核细胞比它与含有RGD序列的多肽联合给药时，正常血管生成更容易被诱导同时血液渗漏更少；
图13是使用荧光FITC-葡聚糖的图像，其显示在利用高压氧处理(75％)后将高氧压降到标准氧分压来诱导小鼠视网膜生成的动物模型中，当将含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO：5)和单核细胞单独(分别为图13的A和B)或联合(图13的C)腹膜内给药时，出生后27天可分离并观察到小鼠视网膜，其中单独给药单核细胞比它与含有RGD序列的多肽联合给药时，正常血管生成更容易被诱导同时血液渗漏更少；
图14是显示在小鼠创伤-愈合模型中，利用含有RGD序列的多肽治疗损伤时，可使小鼠皮肤损伤比对照显著减轻的图像；
图15是显示在小鼠创伤-愈合模型中，利用含有RGD序列的多肽治疗损伤时，可使小鼠皮肤损伤比对照显著减轻的概要图表；
图16是H&E染色组织图像，其显示在小鼠创伤-愈合模型中，当利用含有RGD序列的多肽治疗损伤时，与对照相比，在损伤皮肤组织下形成的精细毛细血管长成如正常小鼠一样血管厚；
图17是显示使用含有RGD序列的多肽处理的肉瘤细胞系中的血管生成素-1得到分泌的图像；
图18是显示使用含有RGD序列的多肽处理的小鼠血浆中的血管生成素-1得到分泌的图像；
图19是显示使用含有KGD序列的多肽处理的肉瘤细胞系中的血管生成素-1得到分泌的图像；
图20是显示含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO：5)抑制血小板中血小板衍生生长因子(PDGF)产生的图表。
实施本发明的最佳方式
在下文中，将参照附图详细说明本发明中非限定性的优选实施方案。
实施例1：含有RGD序列的多肽在无血管眼角膜组织中对VEGF诱导的血管生成量的治疗效果
为了评价含有RGD序列的多肽如何影响眼睛血管发生，开发了在小鼠眼角膜中生成微袋(micropocket)的动物模型，然后注入含有300ngVEGF的团粒(pellet)以诱导血管生成(图1)。此时，为了测定多肽的功效，可以分别腹膜内给药1.3pmol(0.75ng/kg)和130pmol(75ng/kg)的多肽。腹膜内给药5天后，利用外科显微镜观察小鼠眼睛血管生成是否被诱导。结果显示在注入无VEGF的团粒时观察不到血管(图2和图3的A)，而在注入VEGF团粒的阳性对照中观察到了血管生成(图2和图3的B)。然而，已经证实，含RGD序列的多肽诱导血管的增殖，而不是抑制它们的生长，因为当分别将1.3pmol(图2和图3的C)和130pmol(图2和图3的D)含RGD序列的多肽腹膜内给药时，观察到微血管形成和血管网络(vascular networks)。当测量血管长度以量化血管生成时，阳性对照的血管总长度为0.43±0.02mm；分别用1.3pmol和130pmol环RGD(cyc RGD)处理组的总长分别为0.65±0.01mm和0.69±0.03mm，这表明其血管生成显著增加(图4)。
同时，在所有用于此实验的小鼠中都没有观察到副作用，例如含RGD序列的多肽引起的角膜混浊。
实施例2：含RGD序列的多肽(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)在使用氧分压诱导的视网膜血管生成小鼠模型中的效果
氧分压差异诱导的人工眼血管生成显示出与早产儿视网膜病及糖尿病性视网膜病相同的特征。实施该实验使用的原理即出生早期阶段暴露在高氧环境(75％)中的小鼠回复到正常氧分压环境中时可自发地诱导异常血管生成(Higgins RD.等，现有眼研究(Curr.Eye Res).18：20-27(1999)；Bhart N.等，儿科研究(Pediatric Res).46：184188(1999)；Gebarowska D.等，美国病理杂志(Am.J.Pathol.)160：307313(2002))。出于此目的，在一个可调整氧分压的仪器中，将一只出生7天的小鼠留在氧分压恒为75％的高氧环境5天后，再将其留在氧分压为20％的标准氧分压环境中。这时，每5天腹膜内给药含RGD的肽(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2)，观察小鼠眼内的血管生成是否被诱导。为了观察血管，将50毫克分子量为2X106的FITC-葡聚糖溶于1ml生理盐水中，然后将得到的溶液经左心室注入。注射后，立即取出小鼠眼球。用生理盐水清洗取出的眼球后，接着用浓度为4％的多聚甲醛固定4-24小时，然后从眼球上取出晶状体。最后，将得到的小鼠视网膜平坦地铺展在载玻片上并用甘油-明胶密封载玻片，接下来使用荧光显微镜进行观察。
观察到在正常氧分压下生长的小鼠的血管均匀分布在整个视网膜上(图5的B)，而经高压氧和然后盐水处理的小鼠中大多数血管生成是异常的，并且产生了局部缺血(图5的A)。此外，还观察到与正常小鼠相比，利用高压氧处理的小鼠视网膜在发育阶段不能形成正常的血管组织；而且在作为对照的使用含RAD序列的多肽处理的小鼠中，视网膜血管也不能正常形成(图6的A)。然而，显示出每日用1μg/kg的含有RGD序列的多肽处理的小鼠中未观察到异常血管生成(图6的B和C)，并且能观察到正常血管而无任何异常血管生成。含有RGD序列的多肽起着帮助正常血管生长的作用，这是一个非常有意思的结果，这表明此多肽可能可用于治疗如早产儿视网膜病之类的眼部疾病，因为在利用氧分压变化诱导视网膜血管生成的小鼠模型中，含RGD序列的多肽能够通过减少缺氧区而抑制病态的血管生成(morbid angiogenesis)，从而排除了血管生成的潜在病因。同样，从利用荧光FITC-葡聚糖的渗漏试验可以观察到血液没有发生渗漏，因为使用含RGD序列的多肽治疗后血管结构得以稳定。例如FITC照片中荧光渗漏和播散的区域代表血液通过血管小孔出现渗漏的区域。因此，可以理解，本发明的肽减少了荧光扩散的事实意味着血管损伤的防止与荧光扩散的减少一样多。
由于视网膜血管中存在与脑血管的血脑屏障(BBBs)相同的血液视网膜屏障(BRBs)，因此大分子不容易通过视网膜血管。实验证明以下事实，诸如FITC-葡聚糖的分子量较大的分子渗入视网膜意味着视网膜血管的微观结构受到极大的损害，而含有RGD序列的多肽引起血管生成素的分泌则能防止视网膜血管的损害。因此，含有RGD序列的多肽可被用作为治疗如糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性的疾病的治疗剂，因为即使是由于血管中血液渗漏发展的疾病，所述多肽也能够在疾病早期维持血管结构(在疾病早期，血管生成不被诱导)。
实施例3：含RGD序列的多肽(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)在使用氧分压诱导的视网膜血管生成小鼠模型中的效果
在实施例3中，采用实施例2中描述的氧分压诱导的人工视网膜血管生成小鼠模型证实了含RGD序列的多肽(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)的效果。已经证实，如实施例6(图5的B)中描述的一样，在标准氧分压环境中生长的小鼠中血管均匀地分布在整个视网膜上，而经高压氧及然后盐水处理后的小鼠中绝大多数血管生成发生异常并且形成局部缺血(图5的A)。显示出每日用1μg/kg含有RGD序列的多肽处理的小鼠中，未观察到异常血管生成(图7的A和B)，并且能观察到正常血管而无任何异常血管生成。正如实施例2描述的一样，这意味着含RGD序列的多肽具有帮助正常血管生长的功能。因此，含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)可被用作为治疗如糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性的疾病的治疗剂，因为即使是由于血管中血液渗漏发展的疾病，所述多肽也能够在疾病早期维持血管结构(在疾病早期，血管生成不被诱导)。
实施例4：含RGD序列的多肽(SEQ ID NO：8)在使用氧分压诱导的视网膜血管生成小鼠模型中的效果
在实施例4中，采用实施例2中描述的氧分压诱导的人工视网膜血管生成小鼠模型证实了含RGD序列的多肽(SEQ ID NO：8)的效果。显示出每日用1μg/kg含有RGD序列的多肽处理的小鼠中，未观察到异常血管生成，并且能观察到正常血管而无任何异常血管(图8)。正如实施例2描述的一样，这意味着含RGD序列的多肽具有帮助正常血管生长的功能。因此，含有RGD序列的多肽可被用作为治疗如糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性的疾病的治疗剂，因为即使是由于血管中血液渗漏发展的疾病，所述多肽也能够在疾病早期维持血管结构(在疾病早期，血管生成不被诱导)。
实施例5：锯鳞肽(SEQ ID NO：9)和蝮蛇毒素(SEQ ID NO：10)在使用氧分压诱导的视网膜血管生成小鼠模型中的效果
在实施例5中，采用实施例2描述的氧分压诱导的人工视网膜血管生成小鼠模型证实了含RGD序列的多肽锯鳞肽和蝮蛇毒素的效果。已经证实，正如实施例2所述(图5的B)，在标准氧分压下生长的小鼠中血管均匀分布在整个视网膜上，而经高压氧后又经盐水处理的小鼠的大多数血管生成发生异常并产生局部缺血(图5的A)。显示出每日用1μg/kg锯鳞肽和蝮蛇毒素处理的小鼠中，未观察到异常血管生成，并且能观察到正常血管而无任何异常血管(图9)。正如实例2描述的一样，这意味着含RGD序列的多肽具有帮助正常血管生长的功能。
实施例6：含RGD序列的多肽(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8)在使用氧分压诱导的视网膜血管生成小鼠模型的组织学照片中的效果
在实施例6中，采用实施例2中描述的氧分压诱导的人工视网膜血管生成小鼠模型通过利用组织染色证实了含RGD序列的多肽(SEQ ID NO：6和SEQID NO：8)的效果。如实施例2所述，在一个可调整氧分压的仪器中，将一只出生7天的小鼠C57BL/6留在氧分压恒为75％的高氧环境5天后，再将其留在氧分压为20％的正常氧分压环境中5天。这时，每五天分别腹膜内给药含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8)一次，然后从所述C57BL/6小鼠的眼睛中取出视网膜，用石蜡固定，切成6-μm的石蜡横切片，用H&E染色剂对其进行组织学染色，接下来使用显微镜观察染色的石蜡横切片。结果显示正常小鼠视网膜的内部神经节细胞层维持正常细胞厚度而没有任何肥大(图10的A)。而在阴性对照中，氧分压差异导致视网膜的内部神经节细胞层异常肥大(图10的B)。与阴性对照相比，用含有RGD序列的多肽(SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8)治疗的小鼠的内部神经节细胞层的厚度维持在与正常小鼠一样的正常水平而无任何肥大(图10的C和D)。正如实施例3和实施例4所述，这意味着含RGD序列的多肽具有帮助正常血管生长的功能，同时也能通过维持内部神经节细胞层厚度在正常水平且无任何肥大而使视网膜保持在正常水平。作为另外一个结果，其表明含有RGD序列的多肽(SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8)可被用作为治疗如糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性的疾病的治疗剂，因为即使是由于血管中血液渗漏发展的疾病，所述多肽也能够在疾病早期保持血管结构(在疾病早期，血管生成不被诱导)。
实施例7：含RGD序列的多肽和单核细胞(MNC)在使用氧分压诱导的视网膜血管生成小鼠模型中的效果
单核细胞群的制备
为了分离单核细胞群，先从C57BL/6小鼠的两条腿中分离股骨和胫骨，再将其放入到含50单位肝素的DMEM培养基中。为了从分离的股骨和胫骨中获得骨髓细胞，将分离骨的头部和骺(epiphyses)切下以暴露髓腔，使用针22G向暴露的髓腔中注入10ml的DMEM培养基以分离骨髓细胞。为使脂肪和肌肉组织从分离到的骨髓细胞中分离，使用70μm尼龙网眼细胞过滤器过滤骨髓细胞悬液。向骨髓细胞混悬液中加入其体积1.5倍的菲科帕克(Ficoll-Paque)Plus(密度为1.077mg/ml)，并在室温条件下以3,000rpm的速度离心处理20分钟，进而分离处于Ficoll-Paque和培养基分界面的单核细胞群。将分离的单核细胞群用DMEM培养基洗涤两次，然后使之悬浮在1ml含2％胎牛血清和1mM HEPES的DMEM培养基中。分离的单核细胞群具有1.1-3.2X106细胞/小鼠的密度，使用Hoechst 33342对单核细胞进行染色，然后进行观察(图11的A)。
诱导视网膜血管生成的试验
在实施例7中，采用了实施例2中描述的氧分压诱导的人工视网膜血管生成小鼠模型，在下表1中列出的条件下，在出生20天(PN20)和27天(PN27)的小鼠中证实了单核细胞群和/或含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO：5)的效果。
表1
用于诱导视网膜血管生成测试中的单核细胞的细胞数量
Figure BSA00000558088300181
正如表1所列，显示出与单独使用单核细胞群或单独使用含有RGD序列的多肽处理的小鼠相比(图12、图13的C)，同时使用单核细胞群和含有RGD序列的多肽处理的小鼠(图12、图13的B)，出生后20天(PN20)和出生后27天(PN27)都未观察到异常血管生成，但能观察到正常血管而无任何异常血管。因此，可以看出，如果干细胞同含有RGD序列的多肽一起使用，得到的混合物可被用作为治疗如糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性的疾病的治疗剂，因为即使是由于血管中血液渗漏发展的疾病，所述多肽也能够在疾病早期维持血管结构(在疾病早期，血管生成不被诱导)。
实施例8：含有RGD序列的多肽对小鼠伤口愈合的效果
为了检验含有RGD序列的多肽治愈伤口的效果，从距小鼠身体约0.5-1.0cm的尾部背侧切开了一个10×3mm的全层皮肤伤口(图14)。对伤口施压以止血，利用喷涂膜法预防伤口感染。同时，为了确定多肽的功效，每天一次通过两种给药途径以1μg/kg的浓度给药多肽，共给药四周。一种给药途径为直接将含多肽溶液滴在外伤上，另一种给药途径为腹膜内注射含多肽的溶液。为了确认试验结果，每周对小鼠尾部伤口的大小进行测量，并且每两周从小鼠尾部取一次组织样品，并将其包埋在石蜡块中，然后用HE染色以便观察组织变化。结果，从照片可证实，与对照相比(图14)，不论经何种给药途径将多肽施用给小鼠，给药所述多肽的小鼠的伤口在腹膜内给药三周后显著减小，小鼠伤口的减小被量化并显示在图表中(图15)。此外，通过HE染色观察组织的变化时，与在对照伤疤下的组织中只发现少量纤细的毛细血管相比，给药所述多肽两周后的小鼠组织中观察到大量厚血管(图16)。可以预料含RGD序列的多肽可能具有疗效通过稳定血管生成进而形成正常毛囊，从而治疗脱发、灰发症；预防和治疗肥胖相关的动脉硬化及心肌梗塞，并愈合损伤或烧伤以及治疗和预防诸如褥疮和慢性溃疡的疾病。
实施例9：含RGD序列的多肽诱导的纤维肉瘤细胞系内的血管生成素-1的分泌
纤维肉瘤细胞培养
在37℃下，在二氧化碳为5％的孵育器中用补充了10％FBS的MEM孵育纤维肉瘤细胞(人)。此处使用的纤维肉瘤细胞在培养皿中至少要长到90％融合。
分泌的血管生成素-1的测量
使用0-100μg/ml含RGD序列的多肽处理在6孔板内生长至密度为2×105的纤维肉瘤细胞。处理后，诱导血管生成素-1的分泌12小时。此时，利用蛋白质印迹法(western blotting method)来测量分泌的血管生成素-1的量(图17)。
实施例10：含RGD序列的多肽(SEQ ID NO：5)诱导的小鼠血浆中血管生成素-1的分泌
为测定含有RGD序列的多肽诱导小鼠时血浆中血管生成素-1的分泌，所述实验使用以下原理实施，即将出生早期阶段的小鼠置于高氧(75％)环境后回复到标准氧分压时自发诱导异常的血管生成(Higgins RD.等，Curr.Eye Res.18：20-27(1999)；Bhart N.等，Pediatric Res.46：184-188(1999)；Gebarowska D.等，Am.J.Pathol.160：307-313(2002))。为此目的，在一个可调整氧分压的仪器中，将一只出生7天的小鼠留在氧分压恒为75％的高氧环境5天后，再将其留在氧分压为20％的正常氧分压环境中。这时，将1μg/kg含RGD序列的多肽腹膜内给药以诱导血管生成素-1的分泌。然后，在预定时间点分离血浆，接着采用Western印迹法测量血管生成素-1的量(图18)。
实施例11：含KGD序列的多肽(SEQ ID NO：4)诱导的纤维肉瘤细胞
系中血管生成素-1的分泌
培养纤维肉瘤细胞
在37℃下，在二氧化碳为5％的孵育器中用补充了10％FBS的MEM孵育纤维肉瘤细胞(人)。此处使用的纤维肉瘤细胞在培养皿中至少要长到90％融合。
分泌的血管生成素-1的测量
使用0-100μg/ml含RGD序列的多肽处理6孔板内生长至密度为2×105的纤维肉瘤细胞。处理后，诱导血管生成素-1的分泌12小时。此时，利用Western印迹法来测量分泌的血管生成素-1的量(图19)。
实施例12：含RGD序列的多肽抑制血小板中PDGF(血小板衍生的生长因子)表达的效果
血小板的制备
从健康献血者身上抽取全血并装入含有3.8％的柠檬酸钠作为抗凝剂的真空容器内，然后以1,200rpm的速度离心以分离富含血小板的血浆(PRP)。在存在1mM前列腺素El的情况下，以1200rpm的速度离心处理富含血小板的血浆(PRP)以得到血小板沉淀(pellet)。再次使血小板沉淀重悬在改良的Tyrode′s-HEPES缓冲液中(140mM氯化钠、2.9mM氯化钾、1mM氯化镁、5mM葡萄糖、10mM HEPES、pH7.4)。
用胶原激活血小板
被洗涤一次的血小板悬液(2×108/ml)在室温条件下经过含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO：5)和/或不经过此多肽的预处理10分钟后，通过用胶原(2μg/ml)处理而激活该血小板悬液。在室温下使血小板悬液活化2小时后，在4℃下以1500rpm离心处理5分钟。收集离心后的上清液，然后使用EIA法测量分泌的血小板衍生的生长因子(PDGF)的量。结果证实所述多肽处理显著降低了分泌的血小板衍生生长因子的量(图20)。
近年来，据报道血管生成素-1是在血小板中分泌的，这是血小板活化对血管生成起重要作用的众多证据之一。含RGD序列的多肽对PDGF分泌的抑制可以说与通过防止血小板凝固以抑制血管生成的解聚素的内在功能有关，另外还认为由于用低密度的含RGD序列的多肽处理血小板时，多肽抑制血小板凝固引发的血小板间的相互作用，因此血管生成素-1也被认为是为诱导正常血管生成而分泌的。
工业实用性
依据本发明，除了主要依赖常规外科手术的治疗血管生成相关眼部疾病的治疗方法之外，提出了使用治疗剂的新治疗方法。外科手术费用昂贵，并且难以用于所有病人，但是本发明的方法开创了治疗与血管生成相关的眼部疾病和预防视力衰退的新纪元。本发明中含有特殊氨基酸序列的多肽诱导分泌的血管生成素-1不影响现存的正常血管和发育阶段新生的正常血管。相反，由于在发育阶段血管生成素-1的分泌能够帮助正常血管的形成，因此血管生成素-1的分泌对患有早产儿视网膜病的初期患者非常有效。此外，已知干细胞而非造血干细胞与含Xaa-Gly-Asp序列的多肽一起作用以形成正常血管。如果多肽抑制所有的血管生成，那么就不能用它治疗早产儿视网膜病。因此，含Xaa-Gly-Asp序列的多肽和/或干细胞作为治疗剂能够非常有效地治疗早产儿视网膜病。此外，可以看出，含Xaa-Gly-Asp序列的多肽能够通过保护糖尿病性视网膜病早期的血管结构，进而从根本上治疗糖尿病性视网膜病。并且，通过帮助血管结构正常化，含Xaa-Gly-Asp序列的多肽能够抑制老年性黄斑变性中异常血管的生长。
Figure ISA00000558088500031
Figure ISA00000558088500041

Claims (6)

1.一种用于治疗血管相关疾病的药物组合物，其包含具有Xaa-Gly-Asp序列的肽作为有效成分，其中，所述肽的氨基酸Xaa是精氨酸或赖氨酸，所述血管相关疾病是选自由以下疾病所组成的组中的一种或多种疾病：(i)血管壁血液渗漏，(ii)血管损伤，(iii)由于血管壁血液渗漏或血管损伤引起的局部缺血性血管相关疾病，(iv)由于血管壁血液渗漏或血管损伤引起的水肿，
其中，所述由于血管壁血液渗漏或血管损伤引起的局部缺血性血管相关疾病是选自由以下疾病所组成的组中的一种或多种疾病：与糖尿病性视网膜病有关的血管壁血液渗漏或血管损伤、与早产儿视网膜病有关的血管壁血液渗漏或血管损伤、与老年性黄斑变性有关的血管壁血液渗漏或血管损伤、与青光眼有关的血管壁血液渗漏或血管损伤、糖尿病足溃疡、损伤、灼伤、褥疮、慢性溃疡、脱发或正常毛细血管形成下的灰发症。
2.根据权利要求1所述的用于治疗血管相关疾病的药物组合物，其中，所述肽的剂量范围是0.1μg～10mg/kg的总组合物。
3.根据权利要求1所述的用于治疗血管相关疾病的药物组合物，其中，所述肽由3～73个氨基酸组成。
4.根据权利要求1所述的用于治疗血管相关疾病的药物组合物，其中，所述肽的氨基酸Xaa是精氨酸。
5.根据权利要求1所述的用于治疗血管相关疾病的药物组合物，其中，所述肽包括选自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所列出的肽序列所组成的组中的一个肽序列。
6.根据权利要求1所述的用于治疗血管相关疾病的药物组合物，所述组合物还进一步包含干细胞。
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