KR20190091621A - 벤조[d]싸이아졸 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

벤조[d]싸이아졸 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

화학식 1의 구조를 가지는 벤조[d]싸이아졸 유도체의 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다. 화학식 1의 화합물은 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며, 이에 따라 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방, 개선 및 치료 등에 있어서 매우 현저한 효과를 나타낸다.

Description

벤조[d]싸이아졸 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating immunocyte migration-related diseases comprising benzo[d]thiazole derivatives}
본 발명은, 본 발명에서 개시하는 특유의 구조를 가지는 벤조[d]싸이아졸 유도체들의 신규한 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 화학식 1의 구조를 가지는 벤조[d]싸이아졸 유도체의 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
체내의 여러 조직에서, 각각의 세포는 그들의 유전적 특성과 환경에 따라 다른 방식으로 이주한다. 통제되지 않은 세포 이동은 염증성 질환, 암 전이 등의 다양한 질병 상태들과 관계되나, 각각의 세포들이 지니는 이동 시그널링 및 메커니즘 특성이 완전히 규명되지 못한 상태이다. 특히, 각각의 세포에 따라서는 동일한 인자라도 관계하는 방식이 다른 것으로 보고되어 시그널링 과정 및 메커니즘 규명에 어려움이 더해지고 있는데, 일례로 AQP1(water channel aquaporin-1)은 상피 세포 등에서 세포의 이동을 촉진하는 것으로 알려져 있으며 특히 암 전이를 촉진시키는 것으로 알려졌지만(Hara-Chikuma M et al., Aquaporin-1 facilitates epithelial cell migration in kidney proximal tubule, J Am Soc Nephrol. 2006 Jan;17(1):39-45; Jiang Y, Aquaporin-1 activity of plasma membrane affects HT20 colon cancer cell migration, IUBMB Life. 2009 Oct;61(10):1001-9), 대식세포의 경우 상기 AQP1를 발현함에도 불구하고 이것이 대식세포의 이동을 억제하는 것으로 보고 되었다(Tyteca D et al., Regulation of Macrophage Motility by the Water Channel Aquaporin-1: Crucial Role of M0/M2 Phenotype Switch, PLoS One. 2015 Feb 26;10(2):e0117398). 이처럼 각 세포들은 이들이 이동에 여러 가지 방식 및 특성이 존재하기 때문에, 기존에 특정 세포의 이동을 방지하기 위해 설계된 약물들은 상당히 제한적이고 불충분한 효능을 보이고 있다. 따라서 세포의 이동성 스위치(migratory switch)를 제어하고 이주 관련 질병을 치료하는 새로운 전략을 모색하는 것이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 면역세포는 체내의 1차 방어망이기도 하지만, 최근 과도한 면역세포의 활성화가 주요한 발병 기전중의 하나임이 보고되고 있다. 염증성 면역세포의 활성화시 일반적으로 면역세포의 이동성 증가가 관찰되는데, 구체적으로 다음과 같은 질병들에서 이러한 면역세포 이동 및 침윤이 질병의 병리와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다.
일례로, 심혈관계 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환으로, 죽상동맥경화증과 관상동맥 질환 등이 포함된다(Ross R et al., New Engl J Med, 1999:340(2):115-26, Poli G et al., Redox Biol 2013;1(1):125-30, Libby P et al., Circulation 2002;5;105(9):1135-43). 죽상동맥경화증은 콜레스테롤에 의한 염증성 질환이고, 동맥 안쪽 막에 침착한 콜레스테롤과 혈액에서 동맥 안쪽으로 이동한 면역세포로 구성된 죽종에 의하여 발병한다. 즉, 콜레스테롤 산화물이 염증을 일으키고 있는 부위로 단핵구와 같은 면역세포가 이동하면서 죽종이 형성된다. 죽종이 형성될 경우 혈관의 내면은 껄끄러워지고 벽은 두꺼워지면서 혈액이 흐르는 내부의 지름이 좁아져 혈액순환에 장애가 생긴다. 죽종 주위를 둘러싼 섬유성막이 터지면 혈관 안에 혈전이 발생하고, 죽종 안으로 출혈이 일어나 혈관 내경이 급격하게 좁아지거나 막히게 된다. 주로 심장에 피를 공급하는 혈관, 뇌에 피를 공급하는 혈관, 콩팥에 피를 공급하는 혈관 및 말초혈관에 발생하여 허혈성 심장질환, 허혈성 뇌혈관질환(뇌졸중), 신부전, 사지 허혈성 동맥 질환을 일으킨다. 기존에 이러한 심혈관계 질환의 발생 및 발달에는 단핵구의 이동을 유도함으로써 염증반응을 일으키는 CCL2(CCChemokine ligand 2, MCP-1)가 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져, CCL2의 작용 및 이에 따른 단핵구의 이동을 억제함으로써 상기와 같은 심혈관계 질환을 치료하는 방법이 새로이 제시되기도 하였다(Gu L et al., Mol Cell, 1998;2(2):275-81, Aiello RJ et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19(6):1518-25, Gosling J1 et al., Clin Invest 1999;103(6):773-8, Harrington JR et al., Stem Cells 2000;18(1):65-6, Ikeda U et al., Clin Cardiol 2002;25(4):143-7). 또한 고혈압에서도 염증성 사이토카인을 분비하는 다양한 면역세포 등이 혈관으로 과도하게 이동하여 혈관벽이 두꺼워지고, 혈관의 탄력성을 상실하는 병리가 관계된다.
또한 폐동맥 고혈압(Pulmonary Arterial Hypertension, PAH)은 폐 고혈압 세계 보건기구 (WHO) 임상 분류 시스템 (ESC Guidelines, European Heart Journal 2015)의 Group 1으로 분류되며, 호흡곤란, 평균 폐동맥압 (mean pulmonary artery pressure, mPAP)의 상승 (mPAP > 25 mmHg) 및 우심실 기능부전을 공통적 임상특징으로 하는 희귀질환이다. 이러한 폐동맥 고혈압은 유전, 감염, 연관질환 등 여러 가지 선재요인이 관여하지만 혈관손상 (endothelial cell injury)에 따른 면역반응이 핵심 병리적 요인으로 작용하는 것으로 알려졌다(Huertas et al., Circulation, 129:1332-1340, 2014). 이러한 현상에는 면역세포의 침윤과 기능장애(dysfunction)에 따른 일련의 과정이 병리현상과 깊게 연관되어 있는 것으로 알려졌으며, 특히 PAH에서 면역세포와 혈관내피세포 상호작용이 중요한 것으로 알려졌다. 뿐만 아니라 최근 알포트 증후군(Alport syndrome)에 있어서도 단핵구, 대식세포의 침윤이 상기 병의 진행을 촉진시킨다는 보고가 있었다.
한편, 섬유화(fibrosis) 관련 질병에 있어서, 지속적인(만성적인) 염증반응이 상처치유 프로그램(wound-healing program)을 활성화시키게 되는데 이것이 섬유증(fibrosis)으로 이어지게 된다. 조직의 손상 후 단핵구/대식세포나 호중성 백혈구, 호산백혈구, 비만세포 등의 염증성 면역세포가 손상 부위로 빠르게 침투 하면서 활성화되며 여러 사이토카인을 분비하게 되고 이것들은 주위의 섬유아세포나 상피세포, 평활근세포를 다시 활성화 시켜 이들을 미요브라스트형의 세포로 활성화시키는데 이 미요브라스트형의 세포는 다량의 세포외 기질 단백질을 생산 분비하게 하여 궁극적으로 조직에 세포외 기질 단백질의 다량 축적을 초래하여 상처를 남기며 또한 조직의 섬유화나 비대화를 유도하게 된다 (Gurtner GC et al., Trends Cell Biol. 15 : 599-607, 2005). 이 병리 기전은 창상, 화상, 욕창등에 의한 피부 상처시 발생되는 피부 조직 내의 상흔 형성이나 간, 신장, 혈관, 폐 등의 조직의 경화성 섬유화 현상의 근본적인 원인중 하나이다. 또한 만성 자가면역 질환인 경피증 (scleroderma), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 크론 병 (Crohn’s disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus)에서도 섬유화는 주된 병리적 특성으로 나타난다. 아울러 아토피 질환, 천식 질환, COPD, 건선증, 켈로이드, 증식성 망막증등 에서도 염증성 면역세포의 활성화가 병리 현상에 기여한다고 알려져 있다.
특히, 상기 상처치유 프로그램(wound-healing program)에 있어서 미요브라스트형의 세포로 활성화된 섬유아세포를 myofibroblast(근섬유아세포)라고 한다. myofibroblast는 섬유화(fibrosis) 관련된 모든 질환병리의 중심에 있으므로 myofibroblast의 활성을 유도하는 분자생물학적 혹은 면역학적 기전을 제거하는 것이 질환치료의 핵심 요소가 된다. 많은 선천적 (innate immunity) 혹은 후천적 (adaptive immunity) 면역이 fibroblast의 활성과 분화에 중요하다는 사실은 널리 알려져 있으며, 이에 상처부위에서 염증반응을 제거하는 것이 섬유화로의 tissue remodeling 을 중단시키고 정상조직형태를 유지하는 핵심적 요소가 된다. 하지만 실제적으로 염증반응의 제거가 쉽게 이뤄지지 않으므로 선천적 후천적 면역의 기전을 이해하여 핵심 매개체(mediator)를 찾는 것이 섬유화를 늦추는데 중요하다.
단핵구, 대식세포 등은 wound healing에도 기여하는 부분이 있으나 reactive oxygen, nitrogen등을 분비하므로 주변 세포에 해로운 영향을 끼치게 된다. 따라서 단핵구, 대식세포의 신속한 제거가 없다면 조직 손상을 더 유발하게 되며 섬유화를 초래하게 된다. 따라서 상기 질병의 초기에 가장 먼저 반응하는 단핵구, 대식세포들을 제한하는 것은 다양한 만성 염증 및 섬유화 관련 질환에 있어서 하나의 치료적 전략으로 여겨진다.
상기 wound-healing 기전이 섬유화 반응을 촉발 시킬 때, 혈구 응집에 관련된 PDGF(platelet-derived growth factor)는 다른 염증반응 면역세포들을 상처부위로 불러들이고 TGF-β1은 국소 fibroblast로부터 세포외 기질 합성을 촉진시키는 것으로 알려졌다. 하지만 상기 혈구응집 반응에 관련된 요소들은 이들이 결핍된 경우에도 섬유화를 유도하는 결과를 보임이 보고되었다.
상기와 같이 과도한 면역세포 활성화가 문제되는 질환들에 있어서 기존에 면역세포들의 이동(및 침윤)을 막기 위한 타겟 인자(target factor)들이 제시되어왔고 이들을 대상으로 질병의 치료적 방법을 고안하는 시도가 이루어지고 있지만 각각의 한계점들이 보고되고 있는 실정이며, 이에 따라 효과적인 질병 치료를 위해 여전히 면역세포 이동에 있어서 핵심 매개체(mediator)가 무엇인지 이를 제어할 전략은 무엇인지를 찾는 것이 중요한 해결 과제로서 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 면역세포 이동(침윤) 관련 질환의 새로운 치료적 전략을 찾고자 연구하던 중, 면역세포(단핵구/대식세포)의 세포막 영역에 KRS 수준이 증가되는 현상이 면역세포 이동 및 침윤 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상임을 확인하였으며 이는 라미닌(특히, 라미닌 아형 α4β2γ1)과 특별한 연관성을 가지고, 화학식 1의 구조를 보유하는 특정 화합물들이 KRS의 세포막으로의 이동을 저해하여 면역세포의 세포막에 증가된 KRS 수준을 감소시키며 실제로 면역세포 이동 및 침윤을 억제하여 관련 질환을 치료하는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한는 것이다:
<화학식 1>
Figure pat00001
상기 식에서,
R1, R2, 및 R3는, 서로 독립적으로, 수소; 할로겐기; 니트로기; 아미노기; 할로겐으로 선택적으로 치환된 C1∼C6 알킬기; 또는 하이드록시카보닐기이고(단, R1,R2, 및 R3가 동시에 수소일 수는 없다),
R4, R5, 및 R6는, 서로 독립적으로, 수소; 할로겐기; C1∼C6 알킬기; C3∼C6사이클로알킬로 선택적으로 치환된 C1∼C6 알콕시기; C1∼C6 알킬설파닐기; 또는 모노- 혹은 다이-C1∼C6 알킬아미노기이고,
R7 및 R8은, 서로 독립적으로, 수소; 하이드록시기; 할로겐기; 또는 하이드록시카보닐기이고(단, R7 및 R8이 동시에 수소일 수는 없다),
R9는 수소 또는 C1∼C6 알킬기이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
<화학식 1>
Figure pat00002
상기 식에서,
R1, R2, 및 R3는, 서로 독립적으로, 수소; 할로겐기; 니트로기; 아미노기; 할로겐으로 선택적으로 치환된 C1∼C6 알킬기; 또는 하이드록시카보닐기이고(단, R1,R2, 및 R3가 동시에 수소일 수는 없다),
R4, R5, 및 R6는, 서로 독립적으로, 수소; 할로겐기; C1∼C6 알킬기; C3∼C6사이클로알킬로 선택적으로 치환된 C1∼C6 알콕시기; C1∼C6 알킬설파닐기; 또는 모노- 혹은 다이-C1∼C6 알킬아미노기이고,
R7 및 R8은, 서로 독립적으로, 수소; 하이드록시기; 할로겐기; 또는 하이드록시카보닐기이고(단, R7 및 R8이 동시에 수소일 수는 없다),
R9는 수소 또는 C1∼C6 알킬기이다.
정의
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); 및 Hale ＆ Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. 또한 다음의 정의는 본 발명의 실시를 위해 독자(reader)에게 도움을 주기 위해 제공된다.
본 발명에서 상기 용어 '알킬'은 지방족 탄화수소 라디칼을 의미하며, 직쇄상 또는 분지상의 탄화수소 라디칼을 모두 포함한다. 예를 들어 C1-C6 알킬은 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 지방족 탄화수소로서, 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, 아이소프로필, 아이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 네오펜틸, 아이소펜틸 등을 모두 포함한다.
또한, 용어 '알콕시'는 별도로 정의되지 않는 한 하이드록시 기의 수소 원자가 알킬로 치환된 라디칼을 의미하며, 예를 들어 C1-C6 알콕시는 메톡시, 에톡시,프로폭시, n-부톡시, n-펜틸옥시, 아이소프로폭시, sec-부톡시, tert-부톡시, 네오펜틸옥시, 아이소펜틸옥시 등을 모두 포함한다.
본 발명에서 "KRS 단백질"은 라이실 tRNA 합성효소로 알려져 있는 폴리펩티드를 의미한다. KRS는 아미노산 라이신(lysine)과 tRNA의 아미노아실레이션(aminoacylation) 반응을 매개하는 효소이다. 본 발명에서 KRS는 당업계에 라이실 티알엔에이 합성 효소로 알려진 것이라면 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명의 KRS는 인간(homo sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_005539.1 등으로 공지된 것을 포함한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 세포의 병리학적 이동 현상과에 대하여, 면역세포 이동 및 침윤 상태와 관련하여 KRS가 면역세포(특히, 단핵구/대식세포)의 세포질 대비 세포막에서 그 수준이 특이적으로 높아지는 것이 중요한 병리 현상임을 최초로 규명하였으며, 특히 LN421(라미닌 아형 α4β2γ1)과의 특별한 관련성을 가지고 면역세포(단핵구/대식세포) 이동에 있어서 KRS의 특이적 조절 기능을 확인하였다. 이에 화학식 1의 화합물이 KRS의 세포질로부터 세포막으로의 이동을 특이적으로 억제하여 세포막의 KRS 수준을 현저하게 감소시키며, 이에 따라 실제로 폐동맥 고혈압과 같이 기존에 면역세포의 이동 및 침윤의 병리현상과 깊게 연관된 질환들에 있어서 현저한 치료효과를 나타냄을 밝혔다.
따라서 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 바람직하게는 R1, R2, 및 R3는, 서로 독립적으로, 수소; 또는 할로겐기이고(단, R1, R2, 및 R3가 동시에 수소일 수는 없다),
R4, R5, 및 R6는, 서로 독립적으로, 수소; 할로겐기; 또는 C1∼C6 알콕시기이고(단, R4, R5, 및 R6가 동시에 수소일 수는 없다),
R7 및 R8은, 서로 독립적으로, 수소; 또는 하이드록시카보닐기이고(단, R7 및 R8이 동시에 수소일 수는 없다),
R9는 수소 또는 C1∼C6 알킬기이다.
본 발명의 상기 화학식 1의 화합물에 있어서, 바람직한 화합물 또는 이의 염은 다음과 같다:
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-(((2-클로로페닐에틸)(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노)메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-플루오로페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-{[[2-(4-클로로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
4-{[[2-(3-클로로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
4-(((7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)(4-메틸페닐에틸)아미노)메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-플루오로페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-{[[2-(4-에톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-프로폭시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-아이소프로폭시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-(메틸설파닐)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[3-(메틸설파닐)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
4-({[2-(2,5-다이메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(3,4-다이메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(2-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-아이소부톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-{[[2-(4-싸이클로프로필메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-(메틸아미노)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
4-{[{2-[4-(다이메틸아미노)페닐]에틸}(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)(2-페닐에틸)아미노]메틸}벤조산;
4-{[[2-(4-싸이클로헥실메톡시페닐)에틸]-(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
4-{[[2-(4-싸이클로부틸메톡시페닐)에틸]-(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
4-({[2-(4-에톡시-3-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(2-플루오로-4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(2,4-다이메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-플루오로-4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(3-클로로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-{[[2-(4-sec-부톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
4-{[[2-(4-에틸아미노페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
4-({[2-(4-에틸페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-(프로판-2-일)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
4-({[2-(2,3-다이플루오로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(2,5-다이플루오로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3,4,5-트라이플루오로페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(3-브로모-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(2,4-다이클로로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(2,4-다이플루오로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(2-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(2-플루오로페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(2,3-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-메톡시-2-메틸-5-(프로판-2-일)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
4-({[2-(2,5-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(2-클로로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,3-다이메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,5-다이메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-3-메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2-메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(2,6-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}프로필)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-플루오로-4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(3-브로모-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(2,4-다이플루오로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(2,3-다이플루오로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3,4,5-트라이플루오로페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(2,4-다이클로로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(2,3-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(2,5-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
4-{1-[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-메톡시-2-메틸-5-(프로판-2-일)페닐]에틸}아미노]에틸}벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,3-다이메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,5-다이메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-3-메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2-메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(2,6-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(2,3-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}프로필)벤조산;
4-(1-{[2-(2,5-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}프로필)벤조산;
4-(1-{[2-(2-클로로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}프로필)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,3-다이메틸페닐)에틸]아미노}프로필)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,5-다이메틸페닐)에틸]아미노}프로필)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-3-메틸페닐)에틸]아미노}프로필)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2-메틸페닐)에틸]아미노}프로필)벤조산;
4-(1-{[2-(2,6-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}프로필)벤조산;
4-{1-[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-메톡시-2-메틸-5-(프로판-2-일)페닐]에틸}아미노]프로필}벤조산;
4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)-2-하이드록시벤조산;
3-클로로-4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](6-나이트로-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](7-나이트로-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({(6-아미노-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-아미노-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(6-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(5-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(5,6-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-{[[2-(4-메톡시페닐)에틸](5,6,7-트라이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
4-({(6-클로로-7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-{[[2-(4-메톡시페닐)에틸](7-트라이플루오로메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
4-({(6,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)-[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(5-브로모-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(6-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(5,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({(7-플루오로-6-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미
노}메틸)벤조산;
4-({(4,6-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](7-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](6-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](5-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
4-(1-{(5,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(5,6-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸](5,6,7-트라이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(6-클로로-7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(5-브로모-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(6,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(7-플루오로-6-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸][7-(트라이플루오로메틸)-벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(5-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(6-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(7-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸](7-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸](6-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸](5-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(5-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{(4,6-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-({(6-브로모-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-(1-{(6-브로모-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
2-{(4-카복시벤질)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}벤조[d]싸이아졸-6-카르복실산;
2-{(4-카복시벤질)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}벤조[d]싸이아졸-7-카르복실산;
4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸][6-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}메틸)벤조산;
4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸][5-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}메틸)벤조산;
4-({[7-플루오로-6-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일][2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
4-(1-{(5,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-플루오로-4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸][6-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}에틸)벤조산;
4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸][5-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}에틸)벤조산; 및
4-(1-{[7-플루오로-6-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일][2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산.
본 발명에서 상기 화학식 1의 화합물의 더욱 바람직한 예는, 하기 화학식 1-1로 표시되는 구조를 가지는 화합물일 수 있다.
<화학식 1-1>
Figure pat00003
상기 화학식 1-1에서,
R1은 수소; 또는 할로겐기이고,
R4는 수소; 할로겐기; 또는 C1∼C6 알콕시기이고
R7은 수소; 또는 하이드록시카보닐기일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 화학식 1로 표시되는 화합물들 중에서도, 화학식 1-1의 구조를 공유하는 화합물, 특히 탁월한 효과를 보인 하기 화학식 2로 표시되는 4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산을 대표로 하여, 다양한 종류의 면역세포 이동(및 침윤) 관련 질환에 대한 in vivo 질병모델에 적용하여 이의 질환 예방 및 치료 효과를 확인한 바 있다. 하기 화학식 2의 화합물은 본 명세서에서 ‘BC-KI-00053’으로도 명명된다.
<화학식 2>
Figure pat00004
상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 비대칭 원자를 포함하는 치환기를 가질 수 있으며, 이 경우 화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 (R), (S), 또는 라세믹체(RS) 등의 광학 이성질체로 존재할 수 있다. 따라서, 달리 표기하지 않는 한, 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 (R), (S), 또는 라세믹체(RS) 등의 광학 이성질체를 모두 포함한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다. 상기 염은 통상의 산부가염, 예를 들어 염산, 브롬산, 황산 또는 인산과 같은 무기산으로부터 유도된 염 및 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 또는 아스파르트산과 같은 유기산으로부터 유도된 염을 포함한다. 또한, 상기 염은 통상의 금속염 형태, 예를 들어 리튬, 소듐, 또는 칼륨과 같은 알칼리 금속염; 칼슘 또는 마그네슘염과 같은 알카리 토금속염; 또는 크롬염을 포함한다. 또한 적당한 유기 리간드들로 형성된 염, 예를 들면 4차 암모늄염을 포함하며, 디사이클로헥실아민 또는 N-메틸-D-글루카민염과 아르기닌과 라이신 등으로 형성된 아미노산염을 포함한다.
본 발명에서 상기 용어 “면역 세포”는 바람직하게 단핵구 또는 대식세포를 의미한다.
본 발명에서 용어“면역세포 이동 관련 질환”은, 당업계에 과도한 면역세포 이동(또는/및 침윤)이 주요한 발병 기전인 것으로 공지된 것이라면 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를들어 심혈관 질환, 섬유화 질환, 염증성 질환 및 알포트 증후군(Alport syndrome) 으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 심혈관 질환은 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를들어 고혈압(고혈압에 의한 염증성 합병증 포함), 폐동맥 고혈압, 죽상동맥경화, 협심증, 심근경색증, 허혈성 뇌혈관질환, 세동맥 경화 및 중막 경화로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 섬유화 질환은 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 경피증(scleroderma), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 크론 병(Crohn’s disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 간 섬유증(hepathic fibrosis), 간경변증(liver cirrhosis), 신장 섬유증(kidney fibrosis), 사구체 경화증, 근섬유증(myofibrosis), 심장 섬유증, 간질성 섬유화증, 췌장 섬유화증, 비장 섬유화증, 종격막 섬유화증, 혈관 섬유화증, 피부 섬유화증, 눈 섬유화증, 황반 변성, 관절 섬유화증, 갑상선 섬유화증, 심내막심근 섬유화증, 복막 섬유화증, 복막후 섬유화증, 진행성 종괴성 섬유화증, 신원성 전신섬유화증, 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosu), 유전성 섬유증, 감염성 섬유증, 자극성 섬유증, 만성 자가면역에 의한 섬유증, 장기이식시 항원부적합에 의한 섬유증, 외과수술의 섬유성 합병증, 고지혈증에 의한 섬유증, 비만에 의한 섬유증, 당뇨성 섬유증, 고혈압에 의한 섬유증 및 스텐트삽입시 섬유화로 인한 폐색으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 그 종류가 특별히 제한되지는 않지만, 바람직하게는 자가 면역 질환, 염증성 장 질환, 피부염(예를들어 아토피성 피부염, 습진, 건선증 등), 당뇨성 안질환(당뇨병성 망막증 등), 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 비염, 부비동염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 졸중(卒中, 뇌졸중 등), 기관지염, 세기관지염, 간염(간경변, 무알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis) 등), 신장염(당뇨병성 신부전증 등), 관절염(건선성 관절염, 골관절염 등), 신경염(당뇨병성 신경병증 , 다발성 경화증 등), 통풍, 척추염, 라이터 증후군, 결절성 다발동맥염, 혈관염, 루게릭병, 베게너 육아종증, 과사이토카인 혈증(hypercytokinemia), 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(Charcot's joint), 출혈성관절증(hemarthrosis), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 말단거대증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 또한 만성 염증질환을 포함한다.
본 발명에서 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 건선, 천식, 궤양성 대장염, 베체씨병, 크론씨병, 다발성 경화증, 피부근염, 교원병, 혈관염, 관절염, 육아종증, 장기 특이적 자가면역병변, 궤양성 대장염 및 GvHD (이식편대 숙주 반응 질환: graft-versus-host disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 만성 염증 질환은 전술한 염증성 질환의 종류를 참조로 하여 이들이 만성(chronic)화 된 상태를 포함하는 의미이며, 이들의 바람직한 일례로는 천식, 아토피성 피부염, 습진, 건선증, 골관절염, 통풍, 건선성 관절염, 간경변, 무알콜성 지방간염, 만성폐쇄성 폐질환, 비염, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신부전증, 당뇨병성 신경병증 및 다발성 경화증 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어 정맥내, 복강내, 뇌내, 피하, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 비강내, 장관, 국소, 설하, 직장내 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 기재된 서방성 (sustained release) 시스템에 의한 주사 또는 주입일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 일례로 상기 화학식 1의 화합물은 전신으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
화학식 1의 화합물은 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며, 이에 따라 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방, 개선 및 치료 등에 있어서 매우 현저한 효과를 나타낸다.
도 1a는 면역세포(단핵구/대식세포) 이동에 대한 콜라겐(Col), 파이브로넥틴(FN) 및 라미닌(LN)의 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)로 비교한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 1b는 상기 도 1a 의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 2a는 면역세포(단핵구/대식세포) 이동에 대한 다양한 라미닌 아형(LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521)의 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)로 비교한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 2b는 도 2a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 3은 LN421 처리에 의하여 단핵구/대식세포 막에서 KRS가 증가하는 것을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a는 LN421에 특이적인 단핵구/대식세포 이동에 있어서 KRS 발현 여부에 따른 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이로 비교한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 4b는 도 4a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 5는 LN421의 처리에 의해 세포막 영역에서 KRS의 수준이 높아졌던 것이, 화학식 1의 구조를 보유하는 화합물들(대표적으로 BC-KI-00053 화합물) 처리에 따라 현저히 낮아짐을 웨스턴블롯을 통하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 6a는 화학식 1의 구조를 보유하는 화합물들(대표적으로 BC-KI-00053 화합물) 처리에 따라 농도 의존적으로 단핵구/대식세포의 이동이 현저히 저해되는 것을 트랜스웰 세포이동 어세이로 확인한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 6b는 도 6a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 7a은 급성 염증성 반응(ear skin wound 모델)에서 BC-KI-00053 화합물 처리에 따른 단핵구, 대식세포 및 랑게르한스 세포의 침윤 정도를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다(도면 상단부는 대조물질(vehicle) 투여군, 하단부는 BC-KI-00053 100 mg/kg 투여군을 나타냄. 녹색으로 표시된 부분이 단핵구, 대식세포 및 랑게르한스 세포를 나타내며, 붉은색으로 표시된 부분은 CD31에 대하여 표지된 혈관을 나타냄. 흰색 원은 skin wound 위치를 나타냄).
도 7b는 도 7a의 형광 현미경 이미지에서 푸른색 원으로 표시된 skin wound 주변부위의 단핵구/대식세포 침윤정도를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 8a는 간 허혈-재관류 손상 모델 제작을 위한 Triad(bile duct, hepatic artery, hepatic vein) occlusion procedure를 도식화 한 것이다.
도 8b는 간 허혈-재관류 손상 모델에서 BC-KI-00053 화합물 처리에 따른 단핵구, 대식세포 및 쿠퍼 세포의 침윤 정도를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다(도면 상단부는 대조물질(vehicle) 투여군, 하단부는 BC-KI-00053 100 mg/kg 투여군을 나타냄. 녹색으로 표시된 부분이 단색구, 대식세포 및 쿠퍼 세포를 나타내며, 붉은색으로 표시된 부분은 CD31에 대하여 표지된 혈관을 나타냄).
도 8c는 도 8b의 형광 현미경 이미지에서 단핵구/대식세포 침윤정도를 허혈-재관류 손상 후 시점 별로 정량화하여 나타낸 것이다. 적색 막대는 대조물질(vehicle) 투여군, 녹색 막대는 BC-KI-00053 100 mg/kg 투여군에서 각각 정량화한 결과이다.
도 9a는 CCl4(사염화탄소)로 간섬유화 동물모델을 제작하고 여기에 BC-KI-00053 화합물의 치료 효과를 평가하는 실험에 대하여, 실험방법 및 일정을 도식화하여 나타내었다.
도 9b는 CCl4(사염화탄소)에 의해 유도된 간 섬유화 동물모델에서 BC-KI-00053의 효과를 평가한 결과로서, 각 실험군에서 간 표면과 간 내부의 섬유화 정도를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다(각 도면에서 상단부는 간 표면을 영상화한 것이며, 하단부는 간 내부를 영상화한 것임. 녹색으로 표시된 부분은 콜라겐, 붉은색으로 표시된 부분은 간세포를 나타냄).
도 10a는 폐동맥 고혈압(PAH) 모델에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의한 우심실 수축기말 압력(right ventricular end-systolic pressure; RVESP) 변화를 나타낸다(MCT:monocrotaline 처리한 폐동맥 고혈압(PAH) 모델, Tx25mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 25mg/kg 투여, Tx50mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 50mg/kg 투여).
도 10b는 폐동맥 고혈압(PAH) 모델에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의한 좌심실 수축기말 압력(left ventricular end-systolic pressure; LVESP) 변화를 나타낸다(MCT:monocrotaline 처리한 폐동맥 고혈압(PAH) 모델 , Tx25mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 25mg/kg 투여, Tx50mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 50mg/kg 투여).
도 10c는 폐동맥 고혈압(PAH) 모델에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의해 폐 조직의 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 IHC 염색으로 확인한 결과이다.
도 11a는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군과 BC-KI-00053 처리군의 기본 체중 및 실험기간동안의 체중변화를 나타낸다(괄호안의 숫자는 각 그룹에서 평균 데이터를 산출하는데 사용된 실험동물 수를 나타냄. 이하 동일).
도 11b는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 MAP 변화를 측정한 결과이다.
도 11c는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 단백뇨(뇨중 단백질 배설 정도) 정도 변화를 측정한 결과이다.
도 11d는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 혈장 크레아티닌 농도 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 11e는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 사구체 현미경 이미지(상단이미지)와 사구체경화증 정도를 평가한 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 11f는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 피질 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지)와 피질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 11g는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 수질 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지)와 수질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 11h는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 심장 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지, 우심실 삽입 지점)와 심장 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프).
도 11i는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의해 신장 조직의 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 IHC 염색으로 확인한 결과이다.
도 12a는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 vehicle 처리군과 BC-KI-00053 처리군의 기본 체중 및 실험기간동안의 체중변화를 나타낸다(괄호안의 숫자는 각 그룹에서 평균 데이터를 산출하는데 사용된 실험동물 수를 나타냄. 이하 동일).
도 12b는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압을 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 MAP 변화를 측정한 결과이다.
도 12c는 high salt(HS) 식이를 통해 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 단백뇨(뇨중 단백질 배설 정도) 정도 변화를 측정한 결과이다.
도 12d는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 혈장 크레아티닌 농도 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 12e는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 사구체 현미경 이미지(상단이미지)와 사구체경화증 정도를 평가한 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 12f는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 피질 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지)와 피질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 12g는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 수질 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지)와 수질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 12h는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 심장 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지, 우심실 삽입 지점)와 심장 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프).
도 12i는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의해 신장 조직의 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 IHC 염색으로 확인한 결과이다.
도 13은 알포트 증후군 동물모델에서 대조물질 또는 BC-KI-00053 화합물을 처리했을 때 신장에서 백혈구의 침윤 및 섬유화 정도 감소를 평가한 결과이다. 백혈구 침윤의 마커인 CD45는 녹색으로, 섬유화의 마커인 콜라겐 I은 붉은색으로 염색이 되었다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
면역세포 이동 및 침윤에 있어서, 라미닌 신호의 역할 확인
여러 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)들 중에서, 어떤 것이 단핵구/대식세포의 이동 및 침윤을 촉진하는지 확인하였다. 세포외 기질로서 콜라겐(collagen, Col), 파이브로넥틴(fibronectin) 및 라미닌(laminin)을 사용하여 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였으며, 구체적인 실험방법은 다음과 같다. Transwell(Corning, #3421-5mm)을 gelatin (0.5mg/ml)으로 코팅한 후 RAW 264.7 cell(1 x 105 cells/well)을 top chamber에 분주(seeding)하였다. Laminin(laminin mixture, Biolamina社), Fibronectin 또는 Collagen을 각각 10μg/ml씩 포함하는 Serum Free DMEM(500μl)을 bottom chamber에 넣어주었다. 24시간 뒤에 70% methanol을 30min 처리하여 고정(fix)한 후, 50% Hematoxylin으로 30 min동안 염색하였다. membrane의 위쪽에 존재하는 non-migrating 세포를 면봉으로 제거한 뒤, membrane을 취하여 slide에 mounting하였다. membrane의 아랫면에 존재하는 migrating cell을 고배율 현미경에서 관찰하고 정량하였다.
실험결과 도 1a 및 도 1b에서 보는 바와 같이, 여러가지 세포외 기질 중 라미닌이 가장 강하게 단핵구/대식세포의 이동을 촉진함을 확인하였다. 즉, 단핵구/대식세포의 이동(migration)은 ECM(extracellular matrix) 중 라미닌 (LN) 신호에 가장 강하게 반응함을 확인하였다.
<실시예 2>
라미닌 아형(subtype)별 면역세포 이동 및 침윤 효과
면역세포 이동 및 침윤에 있어서, 라미닌 아형에 따른 효과를 평가하였다. 다양한 라미닌 아형 단백질(Biolamina로부터 구입)로서 LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521을 1μg/ml씩 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였다. 상기 라미닌 아형들의 구체적 서열은 각 라미닌 아형을 이루고 있는 사슬에 따라 서열번호 4의α4 사슬, 서열번호 10의 α2 사슬, 서열번호 11의 α5 사슬, 서열번호 6의 β2사슬, 서열번호 12의 β1 사슬, 서열번호 8의 γ1 사슬을 참조로 할 수 있다.
실험결과 도 2a 및 도 2b에서 보는 바와 같이, 단핵구/대식세포는 라미닌 중에서도 α4β2γ1 아형 (LN421)에 특이적으로 반응하여 이동함을 확인하였다. 즉, 단핵구/대식세포의 이동은 라미닌 중에서도 LN421에 특이적임을 확인하였다.
<실시예 3>
면역세포에 라미닌 처리에 따른 KRS의 세포막 이동
100 파이 플레이트에 RAW 264.7 cell(2 x 106cell)을 분주하고 18hr 동안 배양한 후, serum free-DMEM media에 LN421 1μg/ml 처리 후 0h, 12h, 24h에 harvest하였다. ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit(Calbiotech, cat# 539790)를 사용하여, RAW 264.7 cell protein을 cytosol과 membrane fraction으로 분리하였다. 얻어진 단백질을 전기 영동한 후 PVDF membrane (Milipore)에 옮겨 3% skim milk로 blocking 하였다. 이후 웨스턴 블롯으로 KRS를 검출하였다. 구체적으로 KRS polyclonal antibody(rabbit, Neomics, Co. Ltd. #NMS-01-0005) 항체를 첨가하여 1시간동안 결합시켰다. 결합하지 않은 항체를 제거하고, anti-rabbit 2차 항체(ThermoFisher Scientific, #31460)를 첨가하여 반응시켰다. 이차 항체를 반응시킨 후, 기질로 ECL reagent를 이용하여 암실에서 필름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 KRS의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였다. Na+/K+ ATPase(Abcam, ab76020)와 tubulin(Santa cruz SC-5286)에 대한 항체를 각각 plasma membrane과 cytosol 마커 확인용으로 사용하였다.
도 3에서 보는 바와 같이 단핵구/대식세포에 LN421을 처리할 경우 세포질(cytosol) 영역에서 KRS 검출량이 일부 감소되는 것과 대비하여 세포막 영역에 KRS 검출량이 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 단핵구/대식세포의 세포 내부에서 발현되어 일반적으로 세포질 영역에 존재하고 있는 KRS가 LN421처리에 의하여 세포막 영역으로 이동하는 것을 시사하며, 면역세포 막 영역에서 특이적으로 KRS가 증가되는 현상은 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상인 것으로 사료되었다.
<실시예 4>
LN421 의존적 면역세포 이동 및 침윤에 있어서 KRS의 효과
LN421에 특이적인 단핵구/대식세포 이동에 있어서 KRS가 영향을 주는지 알아보기 위하여, KRS가 과발현되도록 형질전환된 대식 세포 및 KRS 발현이 억제되도록 형질전환된 대식 세포 각각에 LN421을 처리하고, 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였다. 대조군으로는 KRS 유사 단백질인 leucyl-tRNA synthetase(LRS, 서열번호 3)를 사용하였다.
구체적으로, KRS 또는 LRS 과발현 대식세포는 다음과 같이 제작되었다: pCDNA3에 삽입된 KRS-Myc, LRS-Myc을 각각 Raw 264.7 cell에 Turbofect(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 트랜스펙션(48hrs)하였다. 음성대조군으로서 Ev(empty vector, pCDNA3)-Myc을 트랜스펙션한 세포를 제작하였다.
KRS 또는 LRS 발현억제 대식세포는 다음과 같이 제작되었다: Si-KRS(서열번호 13), Si-LRS(서열번호 14)를 각각 Raw 264.7 cell에 Lipofectamin(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 트랜스펙션(72hrs)하였다. 음성 대조군으로서 si-control(si-RNA duplex with medium GC content (Invitrogen, Cat No.12935-300))을 트랜스펙션한 세포를 제작하였다.
이렇게 제작된 형질전환세포들에서 각각 KRS 또는 LRS의 과발현이나 발현 억제가 제대로 수행되었는지는, 각각의 단백질에 대한 웨스턴블랏을 수행하여 확인되었다(데이터 미도시).
상기 형질전환된 각각의 대식세포에 대하여 Laminin 421을 1μg/ml 씩 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였다.
실험결과 도 4a 및 도 4b에서 보는 바와 같이, KRS 과발현은 LN421 특이적인 단핵구/대식세포 이동을 효과적으로 증가시켰으며, 반대로 si-RNA를 활용한 KRS 발현 감소는 LN421 특이적인 단핵구/대식세포 이동을 효과적으로 감소시켰다. 이에 반하여 KRS 유사 단백질인 leucyl-tRNA synthetase(LRS) 발현 변화는 단핵구/대식세포 이동에 영향을 미치지 않았다. 이는 단핵구/대식세포의 LN421의존적 이동(migration)은 KRS 발현량에 강하게 영향 받는 것을 시사한다.
<실시예 5>
부작용 없이 면역세포의 이동을 억제하는 화합물의 선별_KRS의 세포막으로의 이동 저해 화합물
상기 <실시예 3> 및 <실시예 4>의 결과로부터 단핵구/대식세포의 LN421 의존적 이동에 있어서 KRS의 발현량 뿐만아니라 KRS의 세포 내 행태가 중요하게 영향을 미치며, 특히 KRS가 세포막 쪽으로 이동하여 면역세포 막 영역에서 특이적으로 KRS가 증가되는 현상은 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상인 것으로 사료되었다. 따라서 KRS의 이러한 병리 행태를 억제하는 것이 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환의 치료적 전략 중의 하나로 적용 가능함을 검증하고자 하였다. 한편, 정상적인 상태에서 KRS는 세포 내에서 단백질을 합성하는데 필요한 기관이다. 따라서 단순히 KRS의 양을 증가하거나 감소시키는 전략은 신체 정상기능에 대한 부작용에 대한 우려로 인하여 실질적인 치료전략으로서 부적절할 가능성이 크다. 이에 본 발명자들은 기존에 KRS의 다양한 측면에서의 활성, 세포 내 동태 및 발현에 영향을 주는 것으로 알려진 다양한 공지의 화합물에 대하여, 부작용 없이 단핵구/대식세포에 이동을 특이적으로 억제 가능한지 검토하였다.
그 결과 본 발명자들은 화학식 1의 핵심 구조(core structure)를 보유하는 화합물들이 KRS의 세포막으로의 이동을 억제하여, LN431 특이적인 단핵구/대식세포 이동을 억제함을 확인하였다. 이의 확인은 구체적으로 다음과 같은 in vitro 실험으로 수행되었다. 본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물들은 대한민국 공개특허 10-2018-0006167 의 문헌에 따라 제조하여 준비하였다.
다양한 KRS 저해제에 대하여 KRS의 세포막으로의 이동 억제 효과 보유 여부를 확인하기 위해서, 100 파이 플레이트에 RAW 264.7 cell(2 x 106 cell)을 분주하고 18시간동안 배양한 후, serum free-DMEM media에 laminin 421 1μg/ml을 처리하고 다양한 KRS 저해제 각각을 100 nM 처리하여 12 h 배양하였다. harvest 후에 ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit(Calbiotech, cat# 539790)를 사용하여, RAW 264.7 cell protein을 cytosol과 membrane fraction으로 분리하였다. 얻어진 단백질을 전기 영동한 후 PVDF membrane (Milipore) 에 옮겨 3% skim milk로 blocking 하였다. 이후 웨스턴 블롯으로 KRS를 검출하였으며, 구체적인 방법은 <실시예 3>과 동일하게 수행되었다.
이렇게 KRS의 세포막으로의 이동을 억제하는 것으로 규명된 물질을 LN421을 처리한 대식세포에 처리하여, 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였다. 이를 통해 KRS의 세포막으로의 이동 저해에 의한 LN421 특이적인 단핵구/대식세포의 이동 억제효과를 보유하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, Transwell(Corning, #3421-5mm)을 gelatin (0.5mg/ml)으로 코팅한 후 RAW 264.7 cell(1 x 105 cells/well)을 top chamber에 분주(seeding)하였다. Laminin 421(LN421, Biolamina)을 1㎍/ml 포함하는 Serum Free DMEM 500μl을 bottom chamber에 넣어주었다. 그 후, Upper chamber에 DMSO, 또는 KRS 저해제 화합물 (in DMSO)을 여러 농도(각각 30nM, 100nM, 300nM, 1μM, 3μM)로 처리하였다. 24시간 뒤에 70% methanol을 30min 처리하여 고정(fix)한 후, 50% Hematoxylin으로 30 min동안 염색하였다. membrane의 위쪽에 존재하는 non-migrating 세포를 면봉으로 제거한 뒤, membrane을 취하여 slide에 mounting하였다. membrane의 아랫면에 존재하는 migrating cell을 고배율 현미경에서 관찰하고 정량하였다.
도 5 및 도 6은 상기 화학식 1의 핵심구조를 보유하는 화합물들 중에서도 특히 좋은 효과를 나타낸 BC-KI-00053 화합물(4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산)에 대한 결과를 대표적으로 나타낸다. 도 5에서 보는 바와 같이 LN421의 처리에 의해 세포막 영역에서 KRS의 수준이 높아졌던 것이, BC-KI-00053의 처리에 의하여 현저히 낮아짐을 확인하였다. 이는 라미닌(LN421)에 의해 단핵구/대식세포의 세포막으로 이동했던 KRS의 수준이 감소된 것을 뜻한다.
또한 도 6a 및 도 6b에서 보는 바와 같이, BC-KI-00053(KRS의 세포막으로의 이동저해 화합물)의 농도에 의존적으로 단핵구/대식세포의 이동이 현저히 저해되는 것이 확인되었다.
이하의, 면역세포 이동관련 질환에 대한 in vivo 실험에서는 상기 BC-KI-00053 화합물을 대표로하여 실험을 수행하였다.
<실시예 6>
in vivo 급성 염증성 반응에서 KRS 세포막 이동 저해제가 단핵구/대식세포 침윤에 미치는 영향
<6-1> ear skin wound 모델
급성 염증성 반응에서 단핵구의 침윤에 KRS 세포막 이동 저해제가 미치는 영향을 알아보기 위하여, CX3CR1-GFP 마우스(Stock no. #005582, Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA))를 이용한 ear skin wound 모델을 제작하였다. CX3R1-GFP 마우스에서 단핵구, 대식세포 및 랑게르한스 세포는 녹색으로 나타난다. 마우스에 vehicle 또는 BC-KI-00053(100 mg/kg, vehicle에 용해, 1일 1회 투여)를 영상화 2일전부터 총 4일간 경구로 투여하였다(D-2, D-1, D-0, D+1). Vehicle로는 Corn oil:Polyethylene glycol 400: Tween80: Methyl cellulose (1%) = 20: 30: 1: 49로 혼합한 것을 사용하였다. 31G 주사기로 귀 피부에 구멍을 내어(D-0 시점) 급성 염증반응을 유도하였다. Alexa Flour 555가 결합된 항-CD31 항체를 이용하여 혈관을 표지하였다(붉은색으로 확인 가능). 영상화 장비로는 공초점 현미경를 사용하였다.
도 7a 및 도 7b에서 보는 바와 같이, vehicle 처리된 대조군에서는 하얀색 원으로 표시한 상처 부위(귀 구멍 부위) 주변에 단핵구와 대식세포들이 모여들어 높은 수준으로 상당히 넓은 범위에 걸쳐 침윤된 것을 확인할 수 있었다(파란색 원). 이에 대하여, BC-KI-00053을 투여한 마우스에서는 단핵구와 대식세포 침윤 정도가 현저히 감소된 것으로 나타났다. 한편, 도 7a 및 도 7b에서 주요 환부(파란색 원)가 아닌 일반 조직 주위에 흩뿌려진 듯이 나타나는 녹색 점들은 resident macrophage인 Langerhans cell로서, 대조군(vehicle)과 BC-KI-00053 처리군에서 모두 Langerhans cell의 수에는 영향을 미치지 않았으므로, BC-KI-00053의 처리에 의해 migratory macrophage의 이동만이 저해된 것으로 판단되었다. 상기 결과로부터 급성염증반응으로 인한 면역세포들의 이동 및 침윤이 KRS 세포막 이동저해제(특히, BC-KI-00053) 투여에 의해 저해가 된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 곧 본 발명의 화합물이 전-염증성 사이토카인을 분비하는 면역세포들의 과도한 이동을 저해하여 염증성 질환에 대해 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.
<6-2> 간 허혈-재관류 손상 모델(Liver Ischemia-Reperfusion Injury Model)
허혈성 면역반응에서 단핵구의 침윤에 KRS 세포막 이동 저해제가 미치는 영향을 알아보기 위하여, CX3CR1-GFP 마우스를 이용하여 간 허혈-재관류 손상 모델(Liver Ischemia-Reperfusion Injury Model)을 제작하였다. CX3CR1-GFP 마우스에서 단핵구, 대식세포 및 쿠퍼 세포(kupffer cell)는 녹색으로 나타난다. 마우스에 vehicle 또는 BC-KI-00053(100 mg/kg, vehicle에 용해, 1일 1회 투여)를 영상화 2일전부터 총 3일간 경구투여하였다(D-2, D-1, D-0). vehicle로는 Corn oil(Polyethylene glycol 400: Tween80: Methyl cellulose (1%) = 20: 30: 1: 49)을 사용하였다. 경구투여 3일째(D-0)에 6-0 봉합사(suture)를 사용하여, 도 8a에서 보는 바와 같이 Triad(bile duct, hepatic artery, hepatic vein) occlusion을 수행하였다. 급성염증 유도를 위해 Triad occlusion을 30분 동안 수행하였으며, 이때 봉합사의 양끝에는 3g의 Eppendorf tube를 매달아두었다. 봉합사를 제거하여 재관류(reperfusion) 직후(0h) 및 24h 후에 허혈성 염증부위를 관찰하였으며, 이때 반복 이미징을 위해 Alexa Flour 555가 결합된 항-CD31 항체를 이용하여 혈관을 표지하였다(붉은색으로 확인 가능). 영상화 장비로는 이광자 현미경을 사용하였다.
실험결과 도 8b 및 도 8c에서 보는 바와 같이, vehicle만 처리한 control mouse의 경우 재관류(reperfusion) 24시간 후에 많은 수의 단핵구/대식세포가 상처부위(폐색부위)로 모여들어(recruitment) 침윤된 것이 확인되었다. 반면 BC-KI-00053을 처리한 실험군에서는, 단핵구와 대식세포 침윤 정도가 현저히 감소된 것으로 나타났다. 도 8c 에서 적색 막대는 대조물질(vehicle) 투여군, 녹색 막대는 BC-KI-00053 100 mg/kg 투여군에서 각각 정량화한 결과이다. 한편, 도 8b에서 재관류 0h에서 주로 보이는 일반 조직 주위에 흩뿌려진 듯이 나타나는 매우 밝은 녹색의 세포들은 resident macrophage인 kupffer cell로서, 재관류 24h 후에도 대조군(vehicle)과 BC-KI-00053 처리군에서 모두 kupffer cell의 수에는 영향을 미치지 않았으므로, BC-KI-00053의 처리에 의해 migratory macrophage의 이동만이 저해된 것으로 판단되었다. 즉, KRS 세포막 이동 저해제(특히, BC-KI-00053)는 허혈로 유도된 간으로 이동하는 단핵구/대식세포 침윤만을 저해하는 효과가 탁월하다.
<실시예 7>
In vivo 간 섬유화에 대한 KRS 세포막 이동 저해제의 약리 효과 확인
Actin-DsRed(Stock no. #006051, Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA)) 마우스에서 간세포(hepatocyte)는 붉은 색으로 나타난다. 상기 마우스의 간 섬유화를 유도하기 위하여 CCl4(사염화탄소)를 콘 오일(corn oil)에 녹여 20%의 농도로 주 2회, 총 6주간, 복강내주사(Intraperitoneal injection)하였다. CCl4 투여 개시후 3주가 경과한 시점부터 대조물질(vehicle)과 BC-KI-00053(100 mg/kg)을 매일, 경구로, 3주간 투여하였다. Vehicle로는 Corn oil:Polyethylene glycol 400: Tween80: Methyl cellulose (1%) = 20: 30: 1: 49로 혼합한 것을 사용하였다. 동물군은 하기 표 1과 같이 구성하였다.
간 표면 및 내부(30 내지 50㎛ 깊이의 영역)의 섬유화 정도를 intravial imaging의 SHG (Second Harmonic Generation) 기법으로 검출하였다(Excitation : 780 nm, Detection : 390 nm).
구분 물질 처리 상태 실험 동물
마리 수
대조군 (1) 콘 오일 투여동물(정상동물) + 대조물질(vehicle) 투여 1
(2) 콘 오일 투여동물(정상동물) + BC-KI-00053 투여 1
실험군 (3) CCl4 간 섬유화 동물모델 + 대조물질(vehicle) 투여 2
(4) CCl4 간 섬유화 동물모델 + BC-KI-00053 투여 3
정상동물에 BC-KI-00053를 투여한 군(표 1에서 (2)번 동물)에서는 체중감소가 나타나지 않았고, 또한 간에서 다른 증상이 야기되지 않았다. 따라서 BC-KI-00053 화합물은 in vivo 상에서 무해한 것으로 사료되었다. 섬유화 동물모델에 대조물질(vehicle)을 투여한 군(표 1에서 (3)번 동물들)은 실험개시 후 4주째에 CCl4의 독성으로 인해 조기에 폐사했다. 구체적으로 도 9a에서 보는 바와 같이 총 6주간의 실험기간 중 1마리는 24일째에, 다른 1마리는 32일째에 사망했으며, 이들은 현저한 체중 감소를 보였다. 상기 조기 폐사된 실험군은 이들이 폐사 되기 전에 각각 2주째 및 4주째에 수득한 간 표면 및 내부 섬유화 데이터를 이용하여, 모든 실험이 종료된 후의 데이터 비교에 이용하였다.
일반적으로 심각한 섬유화는 동그랗게 말린(curly) 모습이 아니라 선형(linear)의 형상으로 관찰된다. 도 9b에서 보는 바와 같이, CCl4를 2주 또는 4주간 투여한 결과 간의 표면(도 9b의 상단부(0㎛))에서 상당한 섬유화가 관찰이 되었으며, 특히 CCl4를 4주간 투여한 군에서 선형의 형상이 더욱 많이 나타났으며 격벽(portal-portal septa)이 발견되어 심각한 섬유화가 상당히 진행된 것을 확인할 수 있었다. 또한 간 내부(도 9b의 하단부(30~48㎛))에서도 이와 유사한 섬유화 양상이 나타났으며, 또한 간세포(hepatocyte)가 심각한 수준으로 괴사(necrosis)된 것을 확인하였다. 반면 CCl4를 6주간 투여하는 과정 중 BC-KI-00053을 3주간 처리한 동물군(표 1의 (4)번 동물군)에서는 간 표면 및 내부의의 섬유화가 CCl4 2주 투여군보다도 현저히 감소하여 거의 정상 개체와 유사한 양상의 capsular collagen이 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 간세포 괴사도 현저히 감소된 것을 확인하였다. 도 9b에서 녹색은 콜라겐(섬유화)을, 붉은색은 간세포를 나타낸다. 이러한 실험결과는 본 발명에서 제공하는 KRS 세포막 이동 억제제(특히, BC-KI-00053)가 섬유화 억제능이 우수함을 나타낸다.
<실시예 8>
In vivo 폐동맥 고혈압( PAH )에 대한 KRS 세포막 이동 저해제의 약리 효과 확인
[실험방법]
1. 폐동맥 고혈압(PAH) 모델 제작 및 시험물질 투여
6주령 암컷 SD rat(오리엔트바이오)에 PAH를 유도하기 위하여, 폐동맥의 선택적 손상을 통해 폐동맥고혈압을 유발하는 물질인 MCT(monocrotaline) 60 mg/kg를 피하주사하였다. 이후 4개의 군으로 나누고(각 군당 5마리로 실험), rat에 vehicle, sildenafil(25 mg/kg, 1일 1회 투여) 또는 BC-KI-00053(25 또는 50 mg/kg, vehicle에 용해, 1일 1회 투여)를 3주간 경구투여하였다. Vehicle로는 Corn oil:Polyethylene glycol 400: Tween80: Methyl cellulose (1%) = 20: 30: 1: 49로 혼합한 것을 사용하였다.
2. 혈류 및 혈압 측정
3주 후 rat를 isoflurane으로 마취하고, 동물용 초정밀공압측정시스템(MPVS Cardiovascular Pressure and Volume system, 모델명: MPVS Ultra, 제조사명: Millar Instruments)을 이용하여 혈류와 압력을 측정하였다. 우심실 수축기말 압력 (RVESP) 및 이완기말 압력, 좌심실 수축기말 압력 및 이완기말 압력은 전용 카테터(Mikro-Tip®ratpressurecatheter, 제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정하였다. 심박출량은 혈관주위(perivascular) 혈류 탐침자(Transonic®Flowprobes, 제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정하였으며, 이에 대한 실험기법은 하기 문헌에 기재된 것과 동일한 방법으로 수행되었다:Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai S, Kass DA. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc 2008;3(9):1422-34.
3. 면역조직화학염색(immunohistochemistry, IHC)
각 실험군의 폐 조직을 이용하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행하였다. 채취한 폐를 통상적인 과정에 따라 PFA(paraformaldehyde)에 고정시킨 후 수세, 탈수, 투명 과정을 거쳐 파라핀 침투시켜 포매하였다. Rat의 폐조직 파라핀 블록을 6μm 두께로 박절하고 슬라이드를 제작하였다. 그 후 다음과 같이 같이 염색을 수행하였다. 먼저 5분간 3회 xylene 처리 후, 100 % 에탄올에서 2분씩 2번, 95 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올, DW 순으로 2분 간 처리하고 PBS로 5분간 washing하였다(2번). 0.3 % H2O2의 처리 후(10분), 샘플을 PBS로 5분 동안 2회 washing하였다. Microwave를 사용하여 pH 6.0의 0.01M citrate buffer에 담가 3분 30초 동안 가열 후, 10초 식히고 10초 가열을 10분간 반복(antigen retrieval) 후 상온에서 20분 cooling하였다. 이후 PBS-T(0.03% Triton-X)로 5분씩 3번 씻어냈다. 이후 30분간 4℃에서 blocking(2 % BSA & 2 % goat serum in PBS)하였다. 항-CD68 항체(1 : 200, Abcam, ab31630)를 4℃에서 overnight 처리하였다. PBS-T로 5분간 3회 세척한 후, polymer-HRP amti-mouse envision kit(DAKO)로 4℃에서 1 시간 처리하였다. PBS-T로 5분씩 3회 세척한 후, DAB substrate buffer 1ml 및 DAB chromogen 20ul 섞어 조직에 처리하고 10분 후에 발색되었을때 3차 D.W로 2분씩 두 번 씻어주었다. 염색 된 조직을 1 분간 Mayer’s hematoxylin(Sigma)으로 처리 한 다음, 70% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올 순서로 각각 2분간 2회 처리하였다. 마지막으로 5분간 3회 xylene 처리한 후 Mounting solution을 이용하여 Mounting 처리하고, 광학현미경으로 관찰하였다.
[실험결과]
폐동맥 고혈압은 폐동맥이 좁아짐으로 인하여 우심실 압력이 상승하며, 결과적으로 우심실 부전을 초래한다. 또한 지속적인 고혈압으로 그 보상 기전이 파괴되면 우심실 비대에 이어 우심실 확장이 일어나게 된다. 이는 심실중격의 이동으로 인한 좌심실의 압박을 가져오게 되고 좌심실의 확장기말 용적 및 심박출량의 감소를 가져오게 된다(이우석 et al., 중증 폐동맥 고혈압 환자의 임상적 특징과 예후 예측 인자, Korean Circulation J 2007;37 :265-270). 결과적으로 폐동맥 고혈압은 주로 우심실과 관계되지만 좌심실의 기능과도 연관된다.
도 10a에서 보는 바와 같이, PAH 동물 모델에서 RVESP(우심실 수축기말 압력)가 증가되어 있는 것을 확인하였으며 이에 대하여 BC-KI-00053의 처리는 농도 의존적으로 유의하게 RVESP를 감소시켰다. 특히 BC-KI-00053 50 mg/kg 처리군에서의 RVESP 강하 효과는 기존 표준 치료제 중 하나인 sildenafil의 효과와 비슷한 수준인 것으로 나타났다.
또한 BC-KI-00053의 처리에 따른 좌심실 수축기말 압력(LVESP) 감소는 관찰되지 않았으며, 오히려 BC-KI-00053 50 mg/kg 투여 군에서는 도 10b에서 보는 바와 같이 LVESP가 증가되는 결과를 보였으나 통계적으로 유의한 수준은 아니었다. 이는 기존 폐동맥 고혈압의 치료제로 사용되고 있는 sildenafil의 경우 폐동맥의 확장뿐만 아니라, 전신동맥의 확장도 유발하여 전신 혈압(systemic blood pressure)을 저하시킬 위험이 있는 것과 대비되는 것이다. 즉, BC-KI-00053는 sildenafil과 비교하여 전신 동맥압(systemic artery pressure)에 미치는 영향이 낮은 경향성을 보이는 것을 확인하였으며, 이러한 효과는 임상현장에서 sildenafil 투여 시 저혈압 발생 위험을 염려하는 상황이 있음을 고려하였을 때, 치료약제의 유리한 특성이 될 것으로 사료되었다. 뿐만 아니라, 폐동맥 고혈압이 심한 경우 우심실 부전(right ventricular failure)이 발생함에 따라, 낮은 심박출량(cardiac output) 및 전신 저혈압(systemic hypotension)이 동반될 수 있다. 이에 대하여 BC-KI-00053을 더 높은 농도로 이용해 폐동맥 고혈압을 호전시키는 치료에 의해 심박출량(cardiac output)과 전신 혈압(systemic blood pressure)이 상승되는 효과를 발휘할 수 있을 수 있을 것으로 예상된다. 심박출량 및 전신 혈압이 저하되면 환자가 전신 쇠약감이나 어지러움을 호소할 수 있기 때문에, 심박출량과 전신 혈압의 호전을 통해 이러한 증상의 개선 또한 기대할 수 있다.
종합하여, 이로서 본 발명에서 제공하는 KRS 세포막 이동 저해제(특히 BC-KI-00053)의 투여는 PAH 치료 효과 및 증상 완화를 보일 뿐 아니라 기존 치료 약물이 지니는 부작용의 발생 위험이 상대적으로 적을 수 있음을 확인하였다.
또한 도 10c에서 보는 바와 같이 각 실험군의 폐 조직을 이용하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행한 결과, 폐동맥고혈압(PAH) 마우스의 폐에는 단핵구/대식세포 침윤이 높은 수준으로 일어나 있는 것을 확인하였다. 이에 대하여 본 발명에서 제공하는 KRS 세포막 이동 억제제(특히, BC-KI-00053)의 처리는 단핵구/대식세포의 폐 조직 침윤을 명확하게 감소시켰음을 확인하였으며, 이러한 효과는 기존에 폐동맥고혈압에 치료 효과가 있는 것으로 알려진 sildenafil 보다 현저히 우수함을 확인하였다.
<실시예 9>
in vivo 고혈압 유발성 단백뇨, 사구체 경화증, 신장 및 심장 섬유증에 대한 KRS 세포막 이동 저해제의 약리 효과 확인
<9-1> 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 KRS 세포막 이동 저해제가 고혈압 신장손상, 심장손상 및 섬유화 발달에 미치는 영향
[실험방법]
실험은 9-12 주령의 수컷 FHH 래트(rat)를 이용하여 수행되었다. 이들 실험동물은 University of Mississippi Medical Center에서 제공받았고, American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)로부터 승인을 받았다. 모든 프로토콜(protocol)들은 Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Mississippi Medical Center의 승인을 받았다. 랫트들은 음식과 물이 자유급식되었으며, 이들 랫트들은 이유(weaning) 후에 0.4% NaCl(Dyets, Bethlehem, PA)을 함유하는 정제된 AIN-76 설치류 사료가 제공되었다. fawn-hooded hypertensive (FHH) rat은 사구체 과여과 및 단백뇨와 관련된 자발절 고혈압의 유전적 모델이다. 상기 래트에서 사구체 손상을 촉진시키기 위하여, 단일(한쪽)신장적출을 수행한 후 DOCA strip을 이식하였다.
구체적으로, FHH 래트를 isoflurane으로 마취시키고 telemetry transmitter(모델 TA11PAC40, Data Sciences International, St. Paul, MN)를 ‘Williams, J. M. et al. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol(2012)’에 기술된 대로 이식하였다. 간략히 설명하면, 수술은 2~3% isoflurane-O2 하에서 수행되었고, 장치의 카테터는 왼쪽 대퇴 동맥에 삽입되어 대동맥으로가는 상류로 향하게되었다(guided). telemetry unit의 몸체를 왼쪽 다리의 측면 공간(lateral cavity)에 위치시키고 근육 조직으로 봉합했다. 그 후 피부를 봉합하였다. 감염을 예방하기 위해 동물에게 Baytril(10 mg/kg)을 제공하고 수술적 통증을 조절하기 위해 장시간 지속되는 진통제인 Rimadyl(5 mg/kg)을 제공하였다. 수술 후, 래트들은 12:12-h의 명암 사이클의 조용한 항온항습실(air-conditioned room) 환경인 개별 케이지에 수용되었고 수술로부터 완전히 회복하기까지 1 주일이 걸렸다. 그런 다음, 래트들을 metabolic cage에 수용하기 전에 기본 MAP(mean arterial blood pressure)와 단백뇨를 4시간(오전 10시 부터 오후 2시 까지)동안 측정하였다. 단백뇨는 Bradford 방법과 BSA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 표준으로 사용하여 측정되었다.
transmitter 삽입 1주일 후, 래트들은 Wang, X. et al. Am J Physiol Renal Physiol(2016)에 기재된 바와 같이 단일 신장 적출(uninephrectomize)되었다. 간략하게, 래트들을 2~3% isoflurane-O2로 마취시키고, 무균 상태에서 오른쪽 옆구리를 절개했다. 우측 신장을 부드럽게 들어올리고, 신장 혈관과 요관 주위에 실을 단단히 묶었다. 신장 혈관과 요관의 말단 부분을 잘라내어 신장을 적출하였다. 절개된 부분을 연속적인 피하 스티치(stitch)로 봉합하고, 그 후 피부를 추가로 봉합하였다. 쥐의 우측 신장이 제거 된 후, DOCA 펠렛(200 mg, Innovative Research of America)을 목 부위에 피하 이식하였다.
단일 신장 적출 및 DOCA 이식 수술 후, 래트들은 3일 동안 회복시간을 가졌다. 그런 다음, 기존에 래트들에 증류수를 제공했던 것을, 1 % NaCl을 함유한 물로 전환하여 제공하고 무작위로 두 개의 실험군으로 나누었다: Group 1(n = 15)은 위장관 직접 투여(gavage)를 통해 BC-KI-00053(매일 25mg/kg)이 처리되었다; Group 2(n = 15)는 동일한 부피(하루 2.5ml/kg)의 vehicle(corn oil, polyethylene glycol 400, Tween 80 and methylcellulose)이 위장관 직접 투여되었다. 상기 실험군에서 혈압과 단백뇨를 3주 동안 매주 측정 하였다. 실험 종료 시점에서, 래트들을 isoflurane으로 마취시키고 혈액 샘플을 채취하여 크레아티닌 수치를 측정하였다. 그런 다음 래트들은 대동맥을 통해 0.9 % NaCl 50ml로 플러시되었고(flushed), 4 % 파라 포름 알데히드 20ml로 관류고정시켰다. 조직학적 평가를 위해 신장과 심장을 수집하였다.
3μm 두께로 제작된 파라핀 절편을 Masson's trichrome으로 염색하여 사구체 손상 및 신장 간질 섬유화(renal interstitial fibrosis)의 정도를 측정하였다. 이미지는 Nikon DS-Fi1 컬러 카메라(Nikon, Melville, NY) 및 NIS-Elements D 3.0 소프트웨어가 있는 Nikon Eclipse 55i 현미경을 사용하여 수득하였다. 사구체 손상의 정도는 30-40 사구체/절편에 대하여 실험자가 선입견 없이 0 내지 4+ 로 평가하였다. 0은 정상 사구체를 나타내며, 1+는 1-25% 손실을 나타내고, 2+는 26-50% 손실을 나타내며, 3+는 51-75 % 손실을 나타내고, 4+는 다발(tuft) 내의 모세혈관 손실이 75 % 이상인 것을 나타낸다. 피질 및 수질 섬유증은 파란색으로 염색 된 이미지의 백분율을 측정하기 위해 thresholding 후 NIS-Elements 자동 측정 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 또한 신장 조직에 대하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 면역조직화학염색(IHC)은 상기 실시예 8과 같은 방법으로 수행되었다.
통계: 각 데이터들은 mean±SEM으로 나타내었다. 각 그룹간의 비교는 two-tailed test에 의하여 분석되었다. P value<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
[실험결과]
Vehicle 처리군과 BC-KI-00053 처리군(대조군 309.57 ± 4.14 g, 실험군 304.7 ± 5.39 g, P> 0.05) 사이의 기본 체중에는 차이가 없었다. 연구 기간 동안 vehicle 또는 BC-KI-00053 처리한 래트들에서 체중은 약 10 % 감소했지만 두 그룹간에 통계적으로 차이는 없었다(도 11a).
대조군 및 실험군 FHH 래트에서 telemetry를 통해 측정된 MAP 데이터가 도 11b에 제시되어있다. 두 군 간의 기본 MAP에는 차이가 없었다 (대조군 120.50 ± 0.91mmHg, 실험군 120.1 ± 0.62mmHg, P> 0.05). 단일신장절제술 후 DOCA 펠렛 삽입술과 함께 1 % NaCl 급수로 전환 된 후에, 양 군에서 MAP가 급속히 증가 하였다. Vehicle 처리군은 BC-KI-00053 처리군에 비해 MAP가 더 큰 격차로 증가되었다. 처리 1주 후, BC-KI-00053 처리군의 MAP는 vehicle 처리군보다 통계적으로 낮았다(대조군 184.34 ± 2.46 mmHg, 실험군 174.4 ± 3.83 mmHg, P <0.05). 처리 2주 후에 vehicle 처리군에서의 MAP 결과는 첫번째 주의 결과와 비교하여 상대적으로 안정한 것으로 보였다. BC-KI-00053 투여군의 MAP는 일시적이지만 더욱 감소한 것으로 나타 났으며 두 군간에 유의 한 차이를 보였다 (대조군 184.22 ± 4.21 mmHg, 실험군 168.8 ± 3.74 mmHg, P <0.05). 3 주 후, 두 그룹 간의 평균 MAP 차이가 더 벌어졌다(대조군 195.30 ± 3.68 mmHg, 실험군 176.9 ± 5.83 mmHg, P <0.05).
대조군 및 실험군 FHH 래트에서 단백뇨에 대한 데이터가 도 11c에 제시되어있다. 두 군 사이의 기본(baseline) 단백뇨 정도에는 차이가 없었다.(대조군 52.75 ± 6.99 mg/day, 실험군 51.0 ± 4.9 mg mg/day, P> 0.05). 단일신장절제술 후 DOCA 펠렛 삽입술과 함께 1 % NaCl 급수로 전환 된 후에, 양 군에서 단백뇨가 일정하게 증가하였다. 시험물질 처리 2 주 후에, BC-KI-00053 처리군에서의 단백뇨는 vehicle 처리군과 비교하여 통계적으로 낮아졌으며(대조군 472.99 ± 53.81 mg/day, 실험군 285.5 ± 47.48mg/day, P<0.05 ), 연구 종료까지 계속되었다(대조군 675.61±49.91 mg/day, 대조군 433.1±60.59 mg/day, P <0.05)
대조군 및 실험군 FHH 래트에서 혈장 크레아티닌 농도에 대한 데이터가 도 11d에 제시되어있다. Vehicle 처리군에서의 혈장 크레아티닌 농도는 BC-KI-00053 처리군보다 유의하게 높았다(대조군 0.65±0.04 mg/dL, 실험군 0.48±0.02 mg/dL, P <0.05).
FHH rat에 단일신장절제술 후 DOCA 펠렛 삽입술과 함께 1 % NaCl 급수로 전환한 것은, 형태학적으로 사구체 및 관상 손상에 상당한 영향을 주었다(도 11e, 도 11f, 도 11g). 평균 사구체 손상 점수(score)는 BC-KI-00053을 처리한 래트에서 손상 정도가 유의하게 감소되었음을 보여주었다(대조군 3.16 ± 0.04, 실험군 1.49 ± 0.05, P <0.05). 또한 vehicle 처리군에서 상당한 섬유화가 진행된 것과 달리 BC-KI-00053 처리군에서는 섬유화가 유의하게 현저히 감소되었다. 구체적으로 BC-KI-00053 처리된 래트에서 피질의 섬유화가 현저히 적은 것으로 나타났으며(대조군 19.46±1.18%, 실험군 5.79±0.48%, P <0.05), 신장 수질 섬유화 및 관상 손상에있어서 직혈관 모세혈관 손실이 현저히 감소된 것으로 나타났다(대조군 17.69±1.07%, 실험군 7.40±0.56%, P <0.05).
Sirius red로 염색한 절편시료(도 11h)에서 보는 바와 같이, 대조군 랫트는 특히 우심실 삽입 지점에서 현저한 심장 섬유증을 나타내었다. 이에 대하여 BC-KI-00053을 처리한 랫트에서는 심장 섬유화의 비율이 유의하게 감소되었다(대조군31.97±2.62%, 실험군 9.14±2.18%, P<0.05).
또한 대식세포 침윤 정도를 확인한 결과 도 11i에서 보는 바와 같이, 신장조직을 이용하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행한 결과, 대조군(vehicle 처리)의 신장조직에서는 단핵구/대식세포 침윤이 높은 수준으로 일어나 있는 것을 확인하였다. 이에 대하여 본 발명에서 제공하는 KRS 세포막 이동 억제제(특히, BC-KI-00053)의 처리는 단핵구/대식세포의 신장 조직 침윤을 현저하게 감소시킴을 확인하였다.
<9-2> SS 래트에서 KRS 세포막 이동 저해제가 고혈압 신장손상, 심장손상 및 섬유화 발달에 미치는 영향
9-12주령의 수컷 SS 래트를 이용하여 실험을 수행하였다. 이들 실험동물은 University of Mississippi Medical Center에서 제공받았고, American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)로부터 승인을 받았다. 모든 프로토콜(protocol)들은 Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Mississippi Medical Center의 승인을 받았다. 랫트들은 음식과 물이 자유급식되었으며, 이들 랫트들은 이유(weaning) 후에 0.4% NaCl(Dyets, Bethlehem, PA)을 함유하는 정제된 AIN-76 설치류 사료가 제공되었다. Dahl salt-sensitive (SS) rat는 high salt(HS) 식이를 하였을 때 심한 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 빠르게 유발하는 동물 모델이다.
SS 래트를 isoflurane으로 마취시키고 telemetry transmitters(모델 TA11PAC40, Data Sciences International, St. Paul, MN)를 전술한 바와 동일한 방법으로 무균적으로 이식하였다. 수술 후, 래트들은 12:12-h의 명암 사이클의 조용한 항온항습실(air-conditioned room) 환경인 개별 케이지에 수용되었고 수술로부터 완전히 회복하기까지 1 주일이 걸렸다. 그런 다음, 뇨단백 배설을 측정하기 위해 래트들을 metabolic cage에 수용하기 전에 기본 MAP(mean arterial blood pressure)를 측정하였다. 단백뇨는 Bradford 방법과 BSA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 표준으로 사용하여 측정되었다.
그리고나서 래트들을 무작위 두 개의 실험군으로 나누었다: Group 1(n = 15)은 위장관 직접 투여(gavage)를 통해 BC-KI-00053(매일 25mg/kg)이 처리되었다; Group 2(n = 15)는 동일한 부피(하루 2.5ml/kg)의 vehicle(corn oil, polyethylene glycol 400, Tween 80 and methylcellulose)이 위장관 직접투여되었다. 상기 물질처리와 동시에 사료를 8% NaCl을 포함하는 HS 사료(Dyets, Bethlehem, PA)로 바꾸었고, HS 사료 급여 후 7, 14 및 21일째에 혈압 및 단백뇨를 측정하였다. 실험 종료 시점에서, 래트들을 isoflurane으로 마취시키고 혈액 샘플을 채취하여 크레아티닌 수치를 측정하였다. 그런 다음 래트들은 대동맥을 통해 0.9 % NaCl 50ml로 플러시되었고(flushed), 4 % 파라포름알데히드 20ml로 관류고정시켰다. 조직학적 평가를 위해 신장과 심장을 수집하였다.
파라핀 절편 제작 및 이들로부터 사구체 손상 정도, 피질 및 수질 섬유증에 대한 평가는 전술한 바와 동일하게 수행되었다. 또한 신장 조직에 대하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 면역조직화학염색(IHC)은 상기 실시예 8과 같은 방법으로 수행되었다.
통계: 각 데이터들은 mean±SEM으로 나타내었다. 각 그룹간의 비교는 two-tailed test에 의하여 분석되었다. P value<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
[실험결과]
Vehicle 처리군과 BC-KI-00053 처리군 사이의 기본 체중에는 차이가 없었다(대조군 337.92±9.86 g, 실험군 350.13±9.173 g, P> 0.05). Vehicle 또는 BC-KI-00053 처리한 래트들에서 체중이 유지되거나 또는 다소 증가하였지만 전체 연구 기간동안 두 그룹간에 통계적으로 차이는 없었다(도 12a).
대조군 및 실험군 SS 래트에서 telemetry를 통해 측정된 MAP 데이터가 도 12b에 제시되어있다. 두 군 간의 기본 MAP에는 차이가 없었다 (대조군 122.13±2.31 mmHg, 실험군 123.45±2.36 mmHg, P> 0.05). SS 래트의 사료를 HS 사료로 바꾸었을 때 양 군에서 MAP가 지속적으로 증가하였다. Vehicle 처리군은 BC-KI-00053 처리군에 비해 MAP가 더 큰 격차로 증가되었다. 처리 2주 후, BC-KI-00053 처리군의 MAP가 vehicle 처리군보다 통계적으로 감소된 것을 확인하였고(대조군 178.51±3.71 mmHg, 실험군 164.43±3.00 mmHg, P <0.05), 이러한 효과는 실험이 종료될때까지 계속되었다(대조군 201.65±2.54 mmHg, 178.48±3.49 mmHg, P <0.05).
대조군 및 실험군 SS 래트에서 단백뇨에 대한 데이터가 도 12c에 제시되어있다. 두 군 사이의 기본(baseline) 단백뇨 정도에는 차이가 없었다(대조군 133.82±10.50 mg/day, 실험군 113.27±8.06 mg/day, P> 0.05). SS 래트의 사료를 HS 사료로 바꾸자 양 군에서 단백뇨가 급격하게 증가하였다. 특히 vehicle 처리군에서는 BC-KI-00053 처리군과 비교하여 단백뇨가 현저하게 높은 수준으로 증가된 것을 확인하였다. 시험물질 처리 1주일 후 BC-KI-00053 처리군에서의 단백뇨는 vehicle 처리군과 비교하여 통계적으로 낮아진 것을 확인하였다(대조군 469.08±24.82 mg/day, 실험군 302.86±29.76 mg/day, P<0.05). 시험물질 처리 2 주 후에도, BC-KI-00053 처리군과 vehicle 처리군에서의 단백뇨 수준이 여전히 명확히 차이났으며(대조군 675.61±59.67 mg/day, 실험군 510.64±42.42 mg/day, P<0.05), 연구 종료까지 계속되었다(대조군 752.97±57.80 mg/day, 대조군 524.55±44.70 mg/day, P <0.05)
대조군 및 실험군 SS 래트에서 혈장 크레아티닌 농도에 대한 데이터가 도 12d에 제시되어있다. Vehicle 처리군에서의 혈장 크레아티닌 농도는 BC-KI-00053 처리군보다 유의하게 높았다(대조군 0.60±0.02 mg/dL, 실험군 0.55±0.01 mg/dL, P <0.05).
HS diet를 제공한 것은, SS rat에 형태학적으로 사구체 및 관상 손상에 상당한 영향을 주었다(도 12e, 도 12f, 도 12g). 평균 사구체 손상 점수(score)는 BC-KI-00053을 처리한 래트에서 손상 정도가 유의하게 감소되었음을 보여주었다(대조군 2.82±0.05, 실험군 1.34±0.04, P <0.05). 또한 vehicle 처리군에서 상당한 섬유화가 진행된 것과 달리 BC-KI-00053 처리군에서는 섬유화가 유의하게 현저히 감소되었다. 구체적으로 BC-KI-00053 처리된 래트에서 피질의 섬유화가 현저히 적은 것으로 나타났으며(대조군 19.48±0.96%, 실험군 6.47±0.46%%, P <0.05), 신장 수질 섬유화 및 관상 손상에있어서 직혈관 모세혈관 손실이 현저히 감소된 것으로 나타났다(대조군 23.49±0.99%, 실험군 12.33±0.78%, P <0.05).
Sirius red로 염색한 절편시료(도 12h)에서 보는 바와 같이, 대조군 랫트는 특히 우심실 삽입 지점에서 현저한 심장 섬유증을 나타내었다. 이에 대하여 BC-KI-00053을 처리한 랫트에서는 심장 섬유화의 비율이 유의하게 감소되었다(대조군18.60±0.93%, 실험군 6.63±0.94%, P<0.05).
또한 대식세포 침윤 정도를 확인한 결과 도 12i에서 보는 바와 같이, 신장조직을 이용하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행한 결과, 대조군(vehicle 처리)의 신장조직에서는 단핵구/대식세포 침윤이 높은 수준으로 일어나 있는 것을 확인하였다. 이에 대하여 본 발명에서 제공하는 KRS 세포막 이동 억제제(특히, BC-KI-00053)의 처리는 단핵구/대식세포의 신장 조직 침윤을 현저하게 감소시킴을 확인하였다.
<실시예 10>
KRS 세포막 이동 저해제가 in vivo 알포트 증후군 동물모델에서의 신장의 섬유화와 면역세포의 침윤에 미치는 영향
실험은 129 Sv/J 마우스(Boys town hospital)를 이용하여 진행하였다. 실험동물은 (i) 129 Sv/J 야생형 마우스 대조물질(0.5% 메틸셀룰로오스 현탁액) 투여군, (ii) 129 Sv/J 알포트 마우스(COL4A3 knockout mouse. Cosgrove D et al., Genes Dev. 1996 Dec 1;10(23):2981-92 참조하여 수득)에 대조물질(0.5% 메틸셀룰로오스 현탁액) 투여군 및 (iii) 129 Sv/J 알포트 마우스에 BC-KI-00053 투여군으로 구성하였다. 각각의 투여군은 두 마리로 이루어져 있다. BC-KI-00053 투여군의 경우 0.5% 메틸셀룰로오스 현탁액에 녹여 100 mg/kg의 농도로 경구 투여를 진행하였으며, 신장의 섬유화와 면역세포의 침윤을 평가하였다. 각각의 동물군은 3주령 때부터 매일 1회씩 총 4주간 대조물질 또는 약물을 처리하였다. 4주간의 약물처리 이후에, 신장 파라핀 절편을 콜라겐 I(섬유화의 마커) 및 CD45로 염색하여 백혈구의 침윤의 정도를 관찰하였다. 섬유화 및 침윤 확인은 전술한 실시예들에서 사용한 방법과 동일하게 수행되었다.
도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 알포트 마우스에 대조물질(vehicle, 0.5% 메틸셀룰로오스)을 투여한 군에서는 신장에서 백혈구의 침윤과 섬유화가 현저하게 진행된 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, BC-KI-00053을 처리한 알포트 마우스 신장에서는 정상(야생형 마우스-대조물질 투여군)수준으로 백혈구의 침윤이 줄어들고 섬유화도 감소한 것을 확인할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은, 본 발명에서 개시하는 특유의 구조를 가지는 벤조[d]싸이아졸 유도체들의 신규한 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 화학식 1의 구조를 가지는 벤조[d]싸이아졸 유도체의 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다. 화학식 1의 화합물은 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며, 이에 따라 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방, 개선 및 치료 등에 있어서 매우 현저한 효과를 나타내므로 의약 산업 등에서 산업상 이용가능성이 높다.
<110> Medicinal Bioconvergence Research Center Korea Advanced Institute of Science and Technology SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating immunocyte migration-related diseases comprising benzo[d]thiazole derivatives <130> NP17-0123 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 597 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of KRS (Homo sapiens) <400> 1 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys 20 25 30 Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val 50 55 60 Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val Asp Pro Asn Gln Tyr Tyr Lys Ile Arg 65 70 75 80 Ser Gln Ala Ile His Gln Leu Lys Val Asn Gly Glu Asp Pro Tyr Pro 85 90 95 His Lys Phe His Val Asp Ile Ser Leu Thr Asp Phe Ile Gln Lys Tyr 100 105 110 Ser His Leu Gln Pro Gly Asp His Leu Thr Asp Ile Thr Leu Lys Val 115 120 125 Ala Gly Arg Ile His Ala Lys Arg Ala Ser Gly Gly Lys Leu Ile Phe 130 135 140 Tyr Asp Leu Arg Gly Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Met Ala Asn Ser 145 150 155 160 Arg Asn Tyr Lys Ser Glu Glu Glu Phe Ile His Ile Asn Asn Lys Leu 165 170 175 Arg Arg Gly Asp Ile Ile Gly Val Gln Gly Asn Pro Gly Lys Thr Lys 180 185 190 Lys Gly Glu Leu Ser Ile Ile Pro Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Ser Pro 195 200 205 Cys Leu His Met Leu Pro His Leu His Phe Gly Leu Lys Asp Lys Glu 210 215 220 Thr Arg Tyr Arg Gln Arg Tyr Leu Asp Leu Ile Leu Asn Asp Phe Val 225 230 235 240 Arg Gln Lys Phe Ile Ile Arg Ser Lys Ile Ile Thr Tyr Ile Arg Ser 245 250 255 Phe Leu Asp Glu Leu Gly Phe Leu Glu Ile Glu Thr Pro Met Met Asn 260 265 270 Ile Ile Pro Gly Gly Ala Val Ala Lys Pro Phe Ile Thr Tyr His Asn 275 280 285 Glu Leu Asp Met Asn Leu Tyr Met Arg Ile Ala Pro Glu Leu Tyr His 290 295 300 Lys Met Leu Val Val Gly Gly Ile Asp Arg Val Tyr Glu Ile Gly Arg 305 310 315 320 Gln Phe Arg Asn Glu Gly Ile Asp Leu Thr His Asn 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540 ataattggag ttcaggggaa tcctggtaaa accaagaagg gtgagctgag catcattccg 600 tatgagatca cactgctgtc tccctgtttg catatgttac ctcatcttca ctttgggctc 660 aaagacaagg aaacaaggta tcgccagaga tacttggact tgatcctgaa tgactttgtg 720 aggcagaaat ttatcatccg ctctaagatc atcacatata taagaagttt cttagatgag 780 ctgggattcc tagagattga aactcccatg atgaacatca tcccaggggg agccgtggcc 840 aagcctttca tcacttatca caacgagctg gacatgaact tatatatgag aattgctcca 900 gaactctatc ataagatgct tgtggttggt ggcatcgacc gggtttatga aattggacgc 960 cagttccgga atgaggggat tgatttgacg cacaatcctg agttcaccac ctgtgagttc 1020 tacatggcct atgcagacta tcacgatctc atggaaatca cggagaagat ggtttcaggg 1080 atggtgaagc atattacagg cagttacaag gtcacctacc acccagatgg cccagagggc 1140 caagcctacg atgttgactt caccccaccc ttccggcgaa tcaacatggt agaagagctt 1200 gagaaagccc tggggatgaa gctgccagaa acgaacctct ttgaaactga agaaactcgc 1260 aaaattcttg atgatatctg tgtggcaaaa gctgttgaat gccctccacc tcggaccaca 1320 gccaggctcc ttgacaagct tgttggggag ttcctggaag tgacttgcat caatcctaca 1380 ttcatctgtg atcacccaca gataatgagc cctttggcta aatggcaccg ctctaaagag 1440 ggtctgactg agcgctttga gctgtttgtc atgaagaaag agatatgcaa tgcgtatact 1500 gagctgaatg atcccatgcg gcagcggcag ctttttgaag aacaggccaa ggccaaggct 1560 gcaggtgatg atgaggccat gttcatagat gaaaacttct gtactgccct ggaatatggg 1620 ctgcccccca cagctggctg gggcatgggc attgatcgag tcgccatgtt tctcacggac 1680 tccaacaaca tcaaggaagt acttctgttt cctgccatga aacccgaaga caagaaggag 1740 aatgtagcaa ccactgatac actggaaagc acaacagttg gcacttctgt ctag 1794 <210> 3 <211> 1176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LRS (Homo sapiens) <400> 3 Met Ala Glu Arg Lys Gly Thr Ala Lys Val Asp Phe Leu Lys Lys Ile 1 5 10 15 Glu Lys Glu Ile Gln Gln Lys Trp Asp Thr Glu Arg Val Phe Glu Val 20 25 30 Asn Ala Ser Asn Leu Glu Lys Gln Thr Ser Lys Gly Lys Tyr Phe Val 35 40 45 Thr Phe Pro Tyr Pro Tyr Met Asn Gly Arg Leu His Leu Gly His Thr 50 55 60 Phe Ser Leu Ser Lys Cys Glu Phe Ala Val Gly Tyr Gln Arg Leu Lys 65 70 75 80 Gly Lys Cys Cys Leu Phe 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gtggccgact ggtaattgat ggtctccgag tcctagaaga aagtcttcct 4740 cctactgaag ctacctggaa aatcaagggt cccatttatt tgggaggtgt ggctcctgga 4800 aaggctgtga aaaatgttca gattaactcc atctacagtt ttagtggctg tctcagcaat 4860 ctccagctca atggggcctc catcacctct gcttctcaga cattcagtgt gaccccttgc 4920 tttgaaggcc ccatggaaac aggaacttac ttttcaacag aaggaggata cgtggttcta 4980 gatgaatctt tcaatattgg attgaagttt gaaattgcat ttgaagtccg tcccagaagc 5040 agttccggaa ccctggtcca cggccacagt gtcaatgggg agtacctaaa tgttcacatg 5100 aaaaatggac aggtcatagt gaaagtcaat aatggcatca gagatttttc cacctcagtt 5160 acacccaagc agagtctctg tgatggcaga tggcacagaa ttacagttat tagagattct 5220 aatgtggttc agttggatgt ggactctgaa gtgaaccatg tggttggacc cctgaatcca 5280 aaaccaattg atcacaggga gcctgtgttt gttggaggtg ttccagaatc tctactgaca 5340 ccacgcttgg cccccagcaa acccttcaca ggctgcatac gccactttgt gattgatgga 5400 cacccagtga gcttcagtaa agcagccctg gtcagcggcg ccgtaagcat caactcctgt 5460 ccagcagcct ga 5472 <210> 6 <211> 1798 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Laminin subunit beta-2 (Homo sapiens) <400> 6 Met Glu Leu Thr Ser Arg Glu Arg Gly Arg Gly Gln Pro Leu Pro Trp 1 5 10 15 Glu Leu Arg Leu Gly Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ala Thr Leu Ala 20 25 30 Gln Ala Pro Ala Pro Asp Val Pro Gly Cys Ser Arg Gly Ser Cys Tyr 35 40 45 Pro Ala Thr Gly Asp Leu Leu Val Gly Arg Ala Asp Arg Leu Thr Ala 50 55 60 Ser Ser Thr Cys Gly Leu Asn Gly Pro Gln Pro Tyr Cys Ile Val Ser 65 70 75 80 His Leu Gln Asp Glu Lys Lys Cys Phe Leu Cys Asp Ser Arg Arg Pro 85 90 95 Phe Ser Ala Arg Asp Asn Pro His Ser His Arg Ile Gln Asn Val Val 100 105 110 Thr Ser Phe Ala Pro Gln Arg Arg Ala Ala Trp Trp Gln Ser Glu Asn 115 120 125 Gly Ile Pro Ala Val Thr Ile Gln Leu Asp Leu Glu Ala Glu Phe His 130 135 140 Phe Thr His Leu Ile Met Thr Phe Lys Thr Phe Arg Pro Ala Ala Met 145 150 155 160 Leu Val Glu Arg Ser Ala Asp Phe Gly Arg Thr Trp His Val Tyr Arg 165 170 175 Tyr Phe Ser Tyr Asp Cys Gly Ala Asp Phe Pro Gly Val Pro Leu Ala 180 185 190 Pro Pro Arg His Trp Asp Asp 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ggcaccagcc 900 catgctgagg gcatggtgca cggagcttgc atctgcaaac acaacacacg tggcctcaac 960 tgcgagcagt gtcaggattt ctatcgtgac ctgccctggc gtccggctga ggacggccat 1020 agtcatgcct gtaggaagtg tgagtgccat gggcacaccc acagctgcca cttcgacatg 1080 gccgtatacc tggcatctgg caatgtgagt ggaggtgtgt gtgatggatg tcagcataac 1140 acagctgggc gccactgtga gctctgtcgg cccttcttct accgtgaccc aaccaaggac 1200 ctgcgggatc cggctgtgtg ccgctcctgt gattgtgacc ccatgggttc tcaagacggt 1260 ggtcgctgtg attcccatga tgaccctgca ctgggactgg tctccggcca gtgtcgctgc 1320 aaagaacatg tggtgggcac tcgctgccag caatgccgtg atggcttctt tgggctcagc 1380 atcagtgacc gtctgggctg ccggcgatgt caatgtaatg cacggggcac agtgcctggg 1440 agcactcctt gtgaccccaa cagtggatcc tgttactgca aacgtctagt gactggacgt 1500 ggatgtgacc gctgcctgcc tggccactgg ggcctgagcc acgacctgct cggctgccgc 1560 ccctgtgact gcgacgtggg tggtgctttg gatccccagt gtgatgaggg cacaggtcaa 1620 tgccactgcc gccagcacat ggttgggcga cgctgtgagc aggtgcaacc tggctacttc 1680 cggcccttcc tggaccacct aatttgggag gctgaggaca cccgagggca ggtgctcgat 1740 gtggtggagc gcctggtgac ccccggggaa actccatcct ggactggctc aggcttcgtg 1800 cggctacagg aaggtcagac cctggagttc ctggtggcct ctgtgccgaa ggctatggac 1860 tatgacctgc tgctgcgctt agagccccag gtccctgagc aatgggcaga gttggaactg 1920 attgtgcagc gtccagggcc tgtgcctgcc cacagcctgt gtgggcattt ggtgcccaag 1980 gatgatcgca tccaagggac tctgcaacca catgccaggt acttgatatt tcctaatcct 2040 gtctgccttg agcctggtat ctcctacaag ctgcatctga agctggtacg gacaggggga 2100 agtgcccagc ctgagactcc ctactctgga cctggcctgc tcattgactc gctggtgctg 2160 ctgccccgtg tcctggtgct agagatgttt agtgggggtg atgctgctgc cctggagcgc 2220 caggccacct ttgaacgcta ccaatgccat gaggagggtc tggtgcccag caagacttct 2280 ccctctgagg cctgcgcacc cctcctcatc agcctgtcca ccctcatcta caatggtgcc 2340 ctgccatgtc agtgcaaccc tcaaggttca ctgagttctg agtgcaaccc tcatggtggt 2400 cagtgcctgt gcaagcctgg agtggttggg cgccgctgtg acctctgtgc ccctggctac 2460 tatggctttg gccccacagg ctgtcaagcc tgccagtgca gccacgaggg ggcactcagc 2520 agtctctgtg aaaagaccag tgggcaatgt ctctgtcgaa ctggtgcctt 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atacagtcca 2160 tgtgtgcttt gcgcctgcaa tggacacagc gagacctgtg atcctgagac aggtgtttgt 2220 aactgcagag acaatacggc tggcccgcac tgtgagaagt gcagtgatgg gtactatgga 2280 gattcaactg caggcacctc ctccgattgc caaccctgtc cgtgtcctgg aggttcaagt 2340 tgtgctgttg ttcccaagac aaaggaggtg gtgtgcacca actgtcctac tggcaccact 2400 ggtaagagat gtgagctctg tgatgatggc tactttggag accccctggg tagaaacggc 2460 cctgtgagac tttgccgcct gtgccagtgc agtgacaaca tcgatcccaa tgcagttgga 2520 aattgcaatc gcttgacggg agaatgcctg aagtgcatct ataacactgc tggcttctat 2580 tgtgaccggt gcaaagacgg attttttgga aatcccctgg ctcccaatcc agcagacaaa 2640 tgcaaagcct gcaattgcaa tctgtatggg accatgaagc agcagagcag ctgtaacccc 2700 gtgacggggc agtgtgaatg tttgcctcac gtgactggcc aggactgtgg tgcttgtgac 2760 cctggattct acaatctgca gagtgggcaa ggctgtgaga ggtgtgactg ccatgccttg 2820 ggctccacca atgggcagtg tgacatccgc accggccagt gtgagtgcca gcccggcatc 2880 actggtcagc actgtgagcg ctgtgaggtc aaccactttg ggtttggacc tgaaggctgc 2940 aaaccctgtg actgtcatcc tgagggatct ctttcacttc agtgcaaaga 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ggactctgag 3840 acactggaga atgaagcaaa taacataaag atggaagctg agaatctgga acaactgatt 3900 gaccagaaat taaaagatta tgaggacctc agagaagata tgagagggaa ggaacttgaa 3960 gtcaagaacc ttctggagaa aggcaagact gaacagcaga ccgcagacca actcctagcc 4020 cgagctgatg ctgccaaggc cctcgctgaa gaagctgcaa agaagggacg ggatacctta 4080 caagaagcta atgacattct caacaacctg aaagattttg ataggcgtgt gaacgataac 4140 aagacggccg cagaggaggc actaaggaag attcctgcca tcaaccagac catcactgaa 4200 gccaatgaaa agaccagaga agcccagcag gccctgggca gtgctgcggc ggatgccaca 4260 gaggccaaga acaaggccca tgaggcggag aggatcgcga gcgctgtcca aaagaatgcc 4320 accagcacca aggcagaagc tgaaagaact tttgcagaag ttacagatct ggataatgag 4380 gtgaacaata tgttgaagca actgcaggaa gcagaaaaag agctaaagag aaaacaagat 4440 gacgctgacc aggacatgat gatggcaggg atggcttcac aggctgctca agaagccgag 4500 atcaatgcca gaaaagccaa aaactctgtt actagcctcc tcagcattat taatgacctc 4560 ttggagcagc tggggcagct ggatacagtg gacctgaata agctaaacga gattgaaggc 4620 accctaaaca aagccaaaga tgaaatgaag gtcagcgatc ttgataggaa 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3460 3465 3470 Pro Ala Ser Ser His Ser Ser Lys Leu Pro Val Thr Val Gly Phe Ser 3475 3480 3485 Gly Cys Val Lys Arg Leu Arg Leu His Gly Arg Pro Leu Gly Ala Pro 3490 3495 3500 Thr Arg Met Ala Gly Val Thr Pro Cys Ile Leu Gly Pro Leu Glu Ala 3505 3510 3515 3520 Gly Leu Phe Phe Pro Gly Ser Gly Gly Val Ile Thr Leu Asp Leu Pro 3525 3530 3535 Gly Ala Thr Leu Pro Asp Val Gly Leu Glu Leu Glu Val Arg Pro Leu 3540 3545 3550 Ala Val Thr Gly Leu Ile Phe His Leu Gly Gln Ala Arg Thr Pro Pro 3555 3560 3565 Tyr Leu Gln Leu Gln Val Thr Glu Lys Gln Val Leu Leu Arg Ala Asp 3570 3575 3580 Asp Gly Ala Gly Glu Phe Ser Thr Ser Val Thr Arg Pro Ser Val Leu 3585 3590 3595 3600 Cys Asp Gly Gln Trp His Arg Leu Ala Val Met Lys Ser Gly Asn Val 3605 3610 3615 Leu Arg Leu Glu Val Asp Ala Gln Ser Asn His Thr Val Gly Pro Leu 3620 3625 3630 Leu Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro Ala Pro Leu Tyr Leu Gly Gly Leu 3635 3640 3645 Pro Glu Pro Met Ala Val Gln Pro Trp Pro Pro Ala Tyr Cys Gly Cys 3650 3655 3660 Met Arg Arg Leu Ala Val Asn Arg Ser Pro Val Ala Met Thr Arg Ser 3665 3670 3675 3680 Val Glu Val His Gly Ala Val Gly Ala Ser Gly Cys Pro Ala Ala 3685 3690 3695 <210> 12 <211> 1786 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Laminin subunit beta-1 (Homo sapiens) <400> 12 Met Gly Leu Leu Gln Leu Leu Ala Phe Ser Phe Leu Ala Leu Cys Arg 1 5 10 15 Ala Arg Val Arg Ala Gln Glu Pro Glu Phe Ser Tyr Gly Cys Ala Glu 20 25 30 Gly Ser Cys Tyr Pro Ala Thr Gly Asp Leu Leu Ile Gly Arg Ala Gln 35 40 45 Lys Leu Ser Val Thr Ser Thr Cys Gly Leu His Lys Pro Glu Pro Tyr 50 55 60 Cys Ile Val Ser His Leu Gln Glu Asp Lys Lys Cys Phe Ile Cys Asn 65 70 75 80 Ser Gln Asp Pro Tyr His Glu Thr Leu Asn Pro Asp Ser His Leu Ile 85 90 95 Glu Asn Val Val Thr Thr Phe Ala Pro Asn Arg Leu Lys Ile Trp Trp 100 105 110 Gln Ser Glu Asn Gly Val Glu Asn Val Thr Ile Gln Leu Asp Leu Glu 115 120 125 Ala Glu Phe His Phe Thr His Leu Ile Met Thr Phe Lys Thr Phe Arg 130 135 140 Pro Ala Ala Met Leu Ile Glu Arg Ser Ser Asp Phe Gly Lys Thr Trp 145 150 155 160 Gly Val Tyr Arg Tyr Phe Ala Tyr Asp Cys Glu Ala Ser Phe Pro Gly 165 170 175 Ile Ser Thr Gly Pro Met Lys Lys Val Asp Asp Ile Ile Cys Asp Ser 180 185 190 Arg Tyr Ser Asp Ile Glu Pro Ser Thr Glu Gly Glu Val Ile Phe Arg 195 200 205 Ala Leu Asp Pro Ala Phe Lys Ile Glu Asp Pro Tyr Ser Pro Arg Ile 210 215 220 Gln Asn Leu Leu Lys Ile Thr Asn Leu Arg Ile Lys Phe Val Lys Leu 225 230 235 240 His Thr Leu Gly Asp Asn Leu Leu Asp Ser Arg Met Glu Ile Arg Glu 245 250 255 Lys Tyr Tyr Tyr Ala Val Tyr Asp Met Val Val Arg Gly Asn Cys Phe 260 265 270 Cys Tyr Gly His Ala Ser Glu Cys Ala Pro Val Asp Gly Phe Asn Glu 275 280 285 Glu Val Glu Gly Met Val His Gly His Cys Met Cys Arg His Asn Thr 290 295 300 Lys Gly Leu Asn Cys Glu Leu Cys Met Asp Phe Tyr His Asp Leu Pro 305 310 315 320 Trp Arg Pro Ala Glu Gly Arg Asn Ser Asn Ala Cys Lys Lys Cys Asn 325 330 335 Cys Asn Glu His Ser Ile Ser Cys His Phe Asp Met Ala Val Tyr Leu 340 345 350 Ala Thr Gly Asn Val Ser Gly Gly Val Cys Asp Asp Cys Gln His Asn 355 360 365 Thr Met Gly Arg Asn Cys Glu Gln Cys Lys Pro Phe Tyr Tyr Gln His 370 375 380 Pro Glu Arg Asp Ile Arg Asp Pro Asn Phe Cys Glu Arg Cys Thr Cys 385 390 395 400 Asp Pro Ala Gly Ser Gln Asn Glu Gly Ile Cys Asp Ser Tyr Thr Asp 405 410 415 Phe Ser Thr Gly Leu Ile Ala Gly Gln Cys Arg Cys Lys Leu Asn Val 420 425 430 Glu Gly Glu His Cys Asp Val Cys Lys Glu Gly Phe Tyr Asp Leu Ser 435 440 445 Ser Glu Asp Pro Phe Gly Cys Lys Ser Cys Ala Cys Asn Pro Leu Gly 450 455 460 Thr Ile Pro Gly Gly Asn Pro Cys Asp Ser Glu Thr Gly His Cys Tyr 465 470 475 480 Cys Lys Arg Leu Val Thr Gly Gln His Cys Asp Gln Cys Leu Pro Glu 485 490 495 His Trp Gly Leu Ser Asn Asp Leu Asp Gly Cys Arg Pro Cys Asp Cys 500 505 510 Asp Leu Gly Gly Ala Leu Asn Asn Ser Cys Phe Ala Glu Ser Gly Gln 515 520 525 Cys Ser Cys Arg Pro His Met Ile Gly Arg Gln Cys Asn Glu Val Glu 530 535 540 Pro Gly Tyr Tyr Phe Ala Thr Leu Asp His Tyr Leu Tyr Glu Ala Glu 545 550 555 560 Glu Ala Asn Leu Gly Pro Gly Val Ser Ile Val Glu Arg Gln Tyr Ile 565 570 575 Gln Asp Arg Ile Pro Ser Trp Thr Gly Ala Gly Phe Val Arg Val Pro 580 585 590 Glu Gly Ala Tyr Leu Glu Phe Phe Ile Asp Asn Ile Pro Tyr Ser Met 595 600 605 Glu Tyr Asp Ile Leu Ile Arg Tyr Glu Pro Gln Leu Pro Asp His Trp 610 615 620 Glu Lys Ala Val Ile Thr Val Gln Arg Pro Gly Arg Ile Pro Thr Ser 625 630 635 640 Ser Arg Cys Gly Asn Thr Ile Pro Asp Asp Asp Asn Gln Val Val Ser 645 650 655 Leu Ser Pro Gly Ser Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg Pro Val Cys Phe 660 665 670 Glu Lys Gly Thr Asn Tyr Thr Val Arg Leu Glu Leu Pro Gln Tyr Thr 675 680 685 Ser Ser Asp Ser Asp Val Glu Ser Pro Tyr Thr Leu Ile Asp Ser Leu 690 695 700 Val Leu Met Pro Tyr Cys Lys Ser Leu Asp Ile Phe Thr Val Gly Gly 705 710 715 720 Ser Gly Asp Gly Val Val Thr Asn Ser Ala Trp Glu Thr Phe Gln Arg 725 730 735 Tyr Arg Cys Leu Glu Asn Ser Arg Ser Val Val Lys Thr Pro Met Thr 740 745 750 Asp Val Cys Arg Asn Ile Ile Phe Ser Ile Ser Ala Leu Leu His Gln 755 760 765 Thr Gly Leu Ala Cys Glu Cys Asp Pro Gln Gly Ser Leu Ser Ser Val 770 775 780 Cys Asp Pro Asn Gly Gly Gln Cys Gln Cys Arg Pro Asn Val Val Gly 785 790 795 800 Arg Thr Cys Asn Arg Cys Ala Pro Gly Thr Phe Gly Phe Gly Pro Ser 805 810 815 Gly Cys Lys Pro Cys Glu Cys His Leu Gln Gly Ser Val Asn Ala Phe 820 825 830 Cys Asn Pro Val Thr Gly Gln Cys His Cys Phe Gln Gly Val Tyr Ala 835 840 845 Arg Gln Cys Asp Arg Cys Leu Pro Gly His Trp Gly Phe Pro Ser Cys 850 855 860 Gln Pro Cys Gln Cys Asn Gly His Ala Asp Asp Cys Asp Pro Val Thr 865 870 875 880 Gly Glu Cys Leu Asn Cys Gln Asp Tyr Thr Met Gly His Asn Cys Glu 885 890 895 Arg Cys Leu Ala Gly Tyr Tyr Gly Asp Pro Ile Ile Gly Ser Gly Asp 900 905 910 His Cys Arg Pro Cys Pro Cys Pro Asp Gly Pro Asp Ser Gly Arg Gln 915 920 925 Phe Ala Arg Ser Cys Tyr Gln Asp Pro Val Thr Leu Gln Leu Ala Cys 930 935 940 Val Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg Cys Asp Asp Cys Ala Ser 945 950 955 960 Gly Tyr Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val Gly Gly Ser Cys Gln Pro Cys 965 970 975 Gln Cys His Asn Asn Ile Asp Thr Thr Asp Pro Glu Ala Cys Asp Lys 980 985 990 Glu Thr Gly Arg Cys Leu Lys Cys Leu Tyr His Thr Glu Gly Glu His 995 1000 1005 Cys Gln Phe Cys Arg Phe Gly Tyr Tyr Gly Asp Ala Leu Gln Gln Asp 1010 1015 1020 Cys Arg Lys Cys Val Cys Asn Tyr Leu Gly Thr Val Gln Glu His Cys 1025 1030 1035 1040 Asn Gly Ser Asp Cys Gln Cys Asp Lys Ala Thr Gly Gln Cys Leu Cys 1045 1050 1055 Leu Pro Asn Val Ile Gly Gln Asn Cys Asp Arg Cys Ala Pro Asn Thr 1060 1065 1070 Trp Gln Leu Ala Ser Gly Thr Gly Cys Asp Pro Cys Asn Cys Asn Ala 1075 1080 1085 Ala His Ser Phe Gly Pro Ser Cys Asn Glu Phe Thr Gly Gln Cys Gln 1090 1095 1100 Cys Met Pro Gly Phe Gly Gly Arg Thr Cys Ser Glu Cys Gln Glu Leu 1105 1110 1115 1120 Phe Trp Gly Asp Pro Asp Val Glu Cys Arg Ala Cys Asp Cys Asp Pro 1125 1130 1135 Arg Gly Ile Glu Thr Pro Gln Cys Asp Gln Ser Thr Gly Gln Cys Val 1140 1145 1150 Cys Val Glu Gly Val Glu Gly Pro Arg Cys Asp Lys Cys Thr Arg Gly 1155 1160 1165 Tyr Ser Gly Val Phe Pro Asp Cys Thr Pro Cys His Gln Cys Phe Ala 1170 1175 1180 Leu Trp Asp Val Ile Ile Ala Glu Leu Thr Asn Arg Thr His Arg Phe 1185 1190 1195 1200 Leu Glu Lys Ala Lys Ala Leu Lys Ile Ser Gly Val Ile Gly Pro Tyr 1205 1210 1215 Arg Glu Thr Val Asp Ser Val Glu Arg Lys Val Ser Glu Ile Lys Asp 1220 1225 1230 Ile Leu Ala Gln Ser Pro Ala Ala Glu Pro Leu Lys Asn Ile Gly Asn 1235 1240 1245 Leu Phe Glu Glu Ala Glu Lys Leu Ile Lys Asp Val Thr Glu Met Met 1250 1255 1260 Ala Gln Val Glu Val Lys Leu Ser Asp Thr Thr Ser Gln Ser Asn Ser 1265 1270 1275 1280 Thr Ala Lys Glu Leu Asp Ser Leu Gln Thr Glu Ala Glu Ser Leu Asp 1285 1290 1295 Asn Thr Val Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Glu Phe Ile Lys Asn Ser 1300 1305 1310 Asp Ile Arg Gly Ala Leu Asp Ser Ile Thr Lys Tyr Phe Gln Met Ser 1315 1320 1325 Leu Glu Ala Glu Glu Arg Val Asn Ala Ser Thr Thr Glu Pro Asn Ser 1330 1335 1340 Thr Val Glu Gln Ser Ala Leu Met Arg Asp Arg Val Glu Asp Val Met 1345 1350 1355 1360 Met Glu Arg Glu Ser Gln Phe Lys Glu Lys Gln Glu Glu Gln Ala Arg 1365 1370 1375 Leu Leu Asp Glu Leu Ala Gly Lys Leu Gln Ser Leu Asp Leu Ser Ala 1380 1385 1390 Ala Ala Glu Met Thr Cys Gly Thr Pro Pro Gly Ala Ser Cys Ser Glu 1395 1400 1405 Thr Glu Cys Gly Gly Pro Asn Cys Arg Thr Asp Glu Gly Glu Arg Lys 1410 1415 1420 Cys Gly Gly Pro Gly Cys Gly Gly Leu Val Thr Val Ala His Asn Ala 1425 1430 1435 1440 Trp Gln Lys Ala Met Asp Leu Asp Gln Asp Val Leu Ser Ala Leu Ala 1445 1450 1455 Glu Val Glu Gln Leu Ser Lys Met Val Ser Glu Ala Lys Leu Arg Ala 1460 1465 1470 Asp Glu Ala Lys Gln Ser Ala Glu Asp Ile Leu Leu Lys Thr Asn Ala 1475 1480 1485 Thr Lys Glu Lys Met Asp Lys Ser Asn Glu Glu Leu Arg Asn Leu Ile 1490 1495 1500 Lys Gln Ile Arg Asn Phe Leu Thr Gln Asp Ser Ala Asp Leu Asp Ser 1505 1510 1515 1520 Ile Glu Ala Val Ala Asn Glu Val Leu Lys Met Glu Met Pro Ser Thr 1525 1530 1535 Pro Gln Gln Leu Gln Asn Leu Thr Glu Asp Ile Arg Glu Arg Val Glu 1540 1545 1550 Ser Leu Ser Gln Val Glu Val Ile Leu Gln His Ser Ala Ala Asp Ile 1555 1560 1565 Ala Arg Ala Glu Met Leu Leu Glu Glu Ala Lys Arg Ala Ser Lys Ser 1570 1575 1580 Ala Thr Asp Val Lys Val Thr Ala Asp Met Val Lys Glu Ala Leu Glu 1585 1590 1595 1600 Glu Ala Glu Lys Ala Gln Val Ala Ala Glu Lys Ala Ile Lys Gln Ala 1605 1610 1615 Asp Glu Asp Ile Gln Gly Thr Gln Asn Leu Leu Thr Ser Ile Glu Ser 1620 1625 1630 Glu Thr Ala Ala Ser Glu Glu Thr Leu Phe Asn Ala Ser Gln Arg Ile 1635 1640 1645 Ser Glu Leu Glu Arg Asn Val Glu Glu Leu Lys Arg Lys Ala Ala Gln 1650 1655 1660 Asn Ser Gly Glu Ala Glu Tyr Ile Glu Lys Val Val Tyr Thr Val Lys 1665 1670 1675 1680 Gln Ser Ala Glu Asp Val Lys Lys Thr Leu Asp Gly Glu Leu Asp Glu 1685 1690 1695 Lys Tyr Lys Lys Val Glu Asn Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Glu Ser 1700 1705 1710 Ala Asp Ala Arg Arg Lys Ala Glu Met Leu Gln Asn Glu Ala Lys Thr 1715 1720 1725 Leu Leu Ala Gln Ala Asn Ser Lys Leu Gln Leu Leu Lys Asp Leu Glu 1730 1735 1740 Arg Lys Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Tyr Leu Glu Asp Lys Ala Gln Glu 1745 1750 1755 1760 Leu Ala Arg Leu Glu Gly Glu Val Arg Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ser 1765 1770 1775 Gln Lys Val Ala Val Tyr Ser Thr Cys Leu 1780 1785 <210> 13 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence of KRS <400> 13 agaaguuuuc aucuaugaac auggc 25 <210> 14 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence of LRS <400> 14 ccuugcaugg aucaugauag acaaa 25

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    <화학식 1>
    Figure pat00005

    상기 식에서,
    R1, R2, 및 R3는, 서로 독립적으로, 수소; 할로겐기; 니트로기; 아미노기; 할로겐으로 선택적으로 치환된 C1∼C6 알킬기; 또는 하이드록시카보닐기이고(단, R1,R2, 및 R3가 동시에 수소일 수는 없다),
    R4, R5, 및 R6는, 서로 독립적으로, 수소; 할로겐기; C1∼C6 알킬기; C3∼C6사이클로알킬로 선택적으로 치환된 C1∼C6 알콕시기; C1∼C6 알킬설파닐기; 또는 모노- 혹은 다이-C1∼C6 알킬아미노기이고,
    R7 및 R8은, 서로 독립적으로, 수소; 하이드록시기; 할로겐기; 또는 하이드록시카보닐기이고(단, R7 및 R8이 동시에 수소일 수는 없다),
    R9는 수소 또는 C1∼C6 알킬기이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은
    R1, R2, 및 R3는, 서로 독립적으로, 수소; 또는 할로겐기이고(단, R1, R2, 및 R3가 동시에 수소일 수는 없다),
    R4, R5, 및 R6는, 서로 독립적으로, 수소; 할로겐기; 또는 C1∼C6 알콕시기이고(단, R4, R5, 및 R6가 동시에 수소일 수는 없다),
    R7 및 R8은, 서로 독립적으로, 수소; 또는 하이드록시카보닐기이고(단, R7 및 R8이 동시에 수소일 수는 없다),
    R9는 수소 또는 C1∼C6 알킬기인 것을 특징으로 하는
    면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-(((2-클로로페닐에틸)(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노)메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-플루오로페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-{[[2-(4-클로로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-{[[2-(3-클로로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-(((7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)(4-메틸페닐에틸)아미노)메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-플루오로페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-{[[2-(4-에톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-프로폭시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-아이소프로폭시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-(메틸설파닐)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
    4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[3-(메틸설파닐)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
    4-({[2-(2,5-다이메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(3,4-다이메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(2-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-아이소부톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-{[[2-(4-싸이클로프로필메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-(메틸아미노)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
    4-{[{2-[4-(다이메틸아미노)페닐]에틸}(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)(2-페닐에틸)아미노]메틸}벤조산;
    4-{[[2-(4-싸이클로헥실메톡시페닐)에틸]-(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-{[[2-(4-싸이클로부틸메톡시페닐)에틸]-(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-({[2-(4-에톡시-3-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(2-플루오로-4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(2,4-다이메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-플루오로-4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(3-클로로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-{[[2-(4-sec-부톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-{[[2-(4-에틸아미노페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-({[2-(4-에틸페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-(프로판-2-일)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
    4-({[2-(2,3-다이플루오로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(2,5-다이플루오로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3,4,5-트라이플루오로페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(3-브로모-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(2,4-다이클로로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(2,4-다이플루오로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(2-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(2-플루오로페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(2,3-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-메톡시-2-메틸-5-(프로판-2-일)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
    4-({[2-(2,5-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(2-클로로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,3-다이메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,5-다이메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-3-메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2-메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(2,6-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}프로필)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-플루오로-4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(3-브로모-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,4-다이플루오로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,3-다이플루오로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3,4,5-트라이플루오로페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,4-다이클로로페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,3-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,5-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-{1-[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-메톡시-2-메틸-5-(프로판-2-일)페닐]에틸}아미노]에틸}벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,3-다이메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,5-다이메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-3-메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2-메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,6-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,3-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}프로필)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,5-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}프로필)벤조산;
    4-(1-{[2-(2-클로로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}프로필)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,3-다이메틸페닐)에틸]아미노}프로필)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,5-다이메틸페닐)에틸]아미노}프로필)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-3-메틸페닐)에틸]아미노}프로필)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2-메틸페닐)에틸]아미노}프로필)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,6-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}프로필)벤조산;
    4-{1-[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-메톡시-2-메틸-5-(프로판-2-일)페닐]에틸}아미노]프로필}벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)-2-하이드록시벤조산;
    3-클로로-4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](6-나이트로-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](7-나이트로-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({(6-아미노-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-아미노-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(6-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(5-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(5,6-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-{[[2-(4-메톡시페닐)에틸](5,6,7-트라이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-({(6-클로로-7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-{[[2-(4-메톡시페닐)에틸](7-트라이플루오로메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-({(6,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)-[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(5-브로모-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(6-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(5,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로-6-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(4,6-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](7-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](6-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](5-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-(1-{(5,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(5,6-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸](5,6,7-트라이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(6-클로로-7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(5-브로모-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(6,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로-6-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸][7-(트라이플루오로메틸)-벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(5-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(6-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸](7-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸](6-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸](5-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(5-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(4,6-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-({(6-브로모-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-(1-{(6-브로모-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    2-{(4-카복시벤질)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}벤조[d]싸이아졸-6-카르복실산;
    2-{(4-카복시벤질)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}벤조[d]싸이아졸-7-카르복실산;
    4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸][6-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸][5-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[7-플루오로-6-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일][2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-(1-{(5,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-플루오로-4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸][6-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸][5-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}에틸)벤조산; 및
    4-(1-{[7-플루오로-6-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일][2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산
    으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-(((2-클로로페닐에틸)(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노)메틸)벤조산;
    4-(((7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)(4-메틸페닐에틸)아미노)메틸)벤조산;
    4-{[[2-(4-에톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-(메틸설파닐)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
    4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[3-(메틸설파닐)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
    4-({[2-(3,4-다이메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-{[[2-(4-싸이클로프로필메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-{[(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일){2-[4-(메틸아미노)페닐]에틸}아미노]메틸}벤조산;
    4-{[{2-[4-(다이메틸아미노)페닐]에틸}(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(2-플루오로-4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-플루오로-4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(3-클로로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(4-에틸페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(2,3-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(2,5-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,5-다이메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-3-메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2-메틸페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(2,6-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}프로필)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,3-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,5-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,3-다이메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2,5-다이메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-3-메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시-2-메틸페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,6-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}에틸)벤조산;
    4-(1-{[2-(2,3-다이플루오로-4-메톡시페닐)에틸](7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}프로필)벤조산;
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)-2-하이드록시벤조산;
    3-클로로-4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](6-나이트로-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸](7-나이트로-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노}메틸)벤조산;
    4-({(6-아미노-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-아미노-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(6-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(5-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(5,6-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-{[[2-(4-메톡시페닐)에틸](5,6,7-트라이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-({(6-클로로-7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-{[[2-(4-메톡시페닐)에틸](7-트라이플루오로메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)아미노]메틸}벤조산;
    4-({(6,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)-[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(5-브로모-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(6-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(5,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-플루오로-6-메틸-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(4,6-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-(1-{(7-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산;
    4-({[2-(4-메톡시페닐)에틸][5-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}메틸)벤조산;
    4-(1-{(5,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(3-플루오로-4-메톡시페닐)에틸]아미노}에틸)벤조산; 및
    4-(1-{[2-(4-메톡시페닐)에틸][5-(트라이플루오로메틸)벤조[d]싸이아졸-2-일]아미노}에틸)벤조산
    으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은
    4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산;
    4-({(7-클로로-벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산; 및
    4-({(5,7-다이플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산
    으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 면역세포 이동과 관련된 질환은 심혈관 질환, 섬유화 질환, 염증성 질환 및 알포트 증후군(Alport syndrome) 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 고혈압, 폐동맥 고혈압, 죽상동맥경화, 협심증, 심근경색증, 허혈성 뇌혈관질환, 세동맥 경화 및 중막 경화로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 섬유화 질환은 경피증(scleroderma), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 크론 병 (Crohn’s disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 간 섬유증(hepatic fibrosis), 간경변증(liver cirrhosis), 신장 섬유증(kidney fibrosis), 사구체 경화증, 근섬유증(myofibrosis), 심장 섬유증, 간질성 섬유화증, 췌장 섬유화증, 비장 섬유화증, 종격막 섬유화증, 혈관 섬유화증, 피부 섬유화증, 눈 섬유화증, 황반 변성, 관절 섬유화증, 갑상선 섬유화증, 심내막심근 섬유화증, 복막 섬유화증, 복막후 섬유화증, 진행성 종괴성 섬유화증, 신원성 전신섬유화증, 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 유전성 섬유증, 감염성 섬유증, 자극성 섬유증, 만성 자가면역에 의한 섬유증, 장기이식시 항원부적합에 의한 섬유증, 외과수술의 섬유성 합병증, 고지혈증에 의한 섬유증, 비만에 의한 섬유증, 당뇨성 섬유증, 고혈압에 의한 섬유증 및 스텐트삽입시 섬유화로 인한 폐색으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 염증성 질환은 자가 면역 질환, 염증성 장 질환, 피부염, 당뇨성 안질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 비염, 부비동염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 졸중, 기관지염, 세기관지염, 간염, 신장염, 관절염, 신경염, 통풍, 척추염, 라이터 증후군, 결절성 다발동맥염, 혈관염, 루게릭병, 베게너 육아종증, 과사이토카인 혈증(hypercytokinemia), 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염, 신경병증성 관절 질환(Charcot's joint), 출혈성관절증(hemarthrosis), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 말단거대증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 건선, 천식, 궤양성 대장염, 베체씨병, 크론씨병, 다발성 경화증, 피부근염, 교원병, 혈관염, 관절염, 육아종증, 장기 특이적 자가면역병변, 궤양성 대장염 및 이식편대 숙주 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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