CN110974938A - 整合素α1β1抑制剂在制备预防或治疗主动脉疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体是整合素α1β1抑制剂在制备预防或治疗主动脉疾病药物中的应用。本发明首次揭示了整合素α1β1的抑制物可特异性地抑制胸主动脉瘤管径的扩张以及减少弹力纤维的破坏，并且首次揭示了整合素α1β1的表达与主动脉疾病密切相关，从而为大血管疾病的防治提供了新的靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是整合素α1β1抑制剂在制备预防或治疗主动脉疾病药物中的应用。
背景技术
胸主动脉瘤(TAA)是一种隐匿但同时又十分凶险的疾病。TAA的进展需要时间但又很少表现出症状，故而常被忽视，最终它常常会伴以严重的并发症如夹层或破裂，就像一个“沉默的杀手”。TAA中多达21％伴有急性主动脉事件(包括夹层和破裂)的患者在接受治疗前死亡。与腹主动脉瘤(AAA)一起，主动脉瘤被认为是65岁以上人群中第17位最常见的死亡原因。据报道，在过去的几十年中，TAA的发病率正在逐渐增加。
TAA可以发生在任何年龄，任何性别，并且没有显著的心血管危险因素等人群中。目前TAA无直接的药物治疗。预防性切除手术可用于预防夹层或破裂等长期并发症，但TAA患者预后不良(手术后五年存活率为64％)。若使用非侵入性药物预防进一步的主动脉的扩张可以减轻手术负担并预防急性主动脉并发症。因此了解TAA发病机制以及药物预防十分必要。
整合素(integrin)是一类由α亚基和β亚基组成的异源二聚体跨膜蛋白,介导细胞与细胞，以及细胞与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)之间的黏附作用，进而参与细胞的增殖、迁移和分化。α和β亚基的功能各不相同，α亚基参与整合素与ECM蛋白的特异性结合，而β亚基与许多种细胞骨架蛋白相互作用，从而形成ECM-整合素-细胞骨架蛋白黏附物。整合素α1有且仅与整合素β1特异性结合，且整合素α1β1在血管平滑肌细胞中表达丰富。ECM的降解以及平滑肌细胞排列紊乱及丢失是胸主动脉瘤十分关键的病理基础。而整合素α1β1与ECM关系密切，据报道，整合素α1β1在血管平滑肌细胞的增殖、迁移中发挥重要作用。因此整合素α1β1与胸主动脉瘤的进展密切相关。
整合素α1β1抑制剂Obtustatin，是从Macrovipera lebetina obtusa(MLO)的蛇毒中分离出的迄今为止已知最短的KTS(Lys-Thr-Ser)单体解聚素，仅含有41个氨基酸。它包含与短解聚素echistatin和eristostatin类似的半胱氨酸模式，但在其活性位点环中含有序列KTS而不是RGD序列。Obtustatin是α1β1整合素的有效选择性抑制剂。它不抑制结构上紧密相关的胶原受体α2β1整联蛋白，也不抑制其他组合的整联蛋白，同时不抑制配体与整合素α1I结构域的结合。目前针对Obtustatin的研究集中在其抗肿瘤相关的生物学活性，既往研究报道了Obtustatin对肿瘤生长的抑制作用，其机理主要包括抑制血管再生，促肿瘤细胞的凋亡作用以及相关炎症反应。
在心血管系统中，整合素α1β1参与了心脏和血管的疾病发生调控过程。通常情况下α1β1主要维持平滑肌细胞的收缩表型，在AngII的刺激下，整合素α1β1表达明显增加，从而促进平滑肌细胞的表型转化。整合素α1β1在心血管领域的作用和巨大潜力不容小觑，其在大血管中的功能研究有助于我们更好的理解其发病机理，进一步找到大血管疾病相关的药物靶点，填补这一药物治疗的空白区，从而为这类疾病的预防或治疗提供行之有效的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供整合素α1β1抑制剂的新用途，以及一种防治主动脉疾病的新的方法和试剂。
为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供整合素α1β1抑制剂在制备预防或治疗主动脉疾病药物中的应用。
进一步的，所述的主动脉疾病为胸主动脉瘤。
进一步的，所述的整合素α1β1抑制剂是指任何可降低整合素α1β1的活性、降低整合素α1β1的稳定性、抑制整合素α1β1的表达、减少整合素α1β1的有效作用时间、或抑制整合素α1β1的转录和加工的物质等。
进一步的，所述的整合素α1β1抑制剂包括但不限于：
特异性结合整合素α1β1的蛋白；
特异性干扰整合素α1β1基因表达、加工的小干扰分子，如siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸等；
整合素α1β1拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的整合素α1β1抑制剂选自目前最成熟的整合素α1β1抑制剂Obtustatin。其分子式：C184H284N52O；氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
CTTGPCCRQCKLKPAGTTCWKTSLTSHYCTGKSCDCPLYPG(SEQ ID NO.1)。
在本发明的另一优选实施方式中，所述的整合素α1β1抑制剂为整合素α1β1siRNA；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示：
ITGA1:5’-UCGAAUUCCUCUAAAUGCGCU-3’(SEQ ID NO.2)；
ITGB1:5’-UGUAAAUUCAUCUUUUCCGCG-3’(SEQ ID NO.3)。
进一步的，所述的整合素α1β1抑制剂特异性用于主动脉血管壁平滑肌细胞。
进一步的，所述的整合素α1β1抑制剂抑制AngII诱导的血管平滑肌细胞的增殖以及表型转化。
进一步的，所述的整合素α1β1抑制剂降低胸主动脉瘤管径的扩张直径以及弹性纤维的破坏。
本发明的第二方面，提供整合素α1β1抑制剂在制备AngII诱导的胸主动脉血管壁平滑肌细胞增殖、迁移和表型转化抑制剂中的应用。
本发明的第三方面，提供整合素α1β1抑制剂在制备改善胸主动脉血管壁的弹性纤维断裂的药物中的应用。
本发明的第四方面，提供整合素α1β1抑制剂在制备降低胸主动脉血管壁平滑肌细胞的胶原水平(COI、COIII)和MMP2的表达水平的药物中的应用。
本发明的第五方面，提供整合素α1β1抑制剂在制备降低胸主动脉血管壁平滑肌细胞ITGA1和ITGB1表达水平的药物中的应用。
本发明的第六方面，提供一种预防或治疗胸主动脉疾病的药物或试剂，其包含：治疗有效量的整合素α1β1抑制剂，以及药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的第七方面，提供一种筛选预防或治疗胸主动脉瘤疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)检测候选物质在主动脉疾病中的表达水平。
(2)用候选物质抑制剂处理主动脉血管平滑肌细胞。
(3)检测所述体系中平滑肌细胞相关生物活性指标的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低增殖以及迁移能力，同时降低平滑肌细胞分泌型标志物的表达并进一步降低候选疾病的发生，则表明该候选物质是预防或治疗胸主动脉疾病的潜在物质。
在一个优选例中，
步骤(1)包括：在测试组中，测试候选物质在体系中的表达水平；
步骤(2)包括：在测试组中，首先诱导平滑肌细胞向分泌型转化，再将候选物质加入到血管壁平滑肌的培养体系中；
步骤(3)包括：检测测试组的体系中平滑肌细胞分泌型标志物的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的培养体系；
如果测试组中平滑肌细胞分泌型标志物的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照组，就表明该候选物是预防或治疗胸主动脉疾病的潜在物质。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗胸主动脉疾病有用的物质。
在一个更优选实施方式中，所述方法包括：
(1)检测所述疾病中整合素α1β1的表达；和(2)用整合素α1β1抑制剂处理表达整合素α1β1的主动脉疾病中胸主动脉瘤体系；其中，若所述候选物质可降低整合素α1β1的表达或活性并降低胸主动脉瘤管径的扩张直径以及弹性纤维的破坏，则表明该候选物质是预防或治疗胸主动脉瘤疾病的潜在物质。
本发明的另一方面，提供一种预防或治疗哺乳动物主动脉疾病的方法，所述方法包括：通过特异性抑制剂对所述哺乳动物体内整合素α1β1的表达水平进行下调以抑制胸主动脉瘤的发生。
整合素α1β1
整合素是在细胞表面表达的受体家族，其粘附于多个配体并介导细胞与细胞以及细胞与细胞外基质之间的相互作用。这些跨膜糖蛋白由两个非共价连接的亚基组成-α和β。8个β亚基可与18个α亚基组合形成24个不同的整联蛋白，其广泛分布于哺乳动物细胞中。其中，胶原受体是与不同类型的胶原特异性相互作用的功能亚类。胶原蛋白受体的α1，α2，α10或α11亚基与β1亚基缔合，在细胞表面形成活性复合物。α1β1整合素是IV型胶原的特异性受体，α2β1整合素是I型胶原的受体。α1β1主要在结缔组织表达，在平滑肌细胞中同样表达丰富，对IV型胶原蛋白的亲和力高于I型；而α2β1，主要是在上皮细胞上表达，上皮细胞基底膜中I型胶原的表达量高于IV型胶原。整合素α1β1通过其与细胞外基质以及下游信号的作用，影响疾病的发生和发展。
整合素α1β1的用途
目前发现整合素α1β1介导的信号转导具有双向性，既内向信号传导和外向信号传导内向信号传导是，整合素与其配体结合后，通过FAK-Ras-MAPK、FAK-STAT1等通路向细胞内传递信号，引起细胞质与胞内某些信号分子之间的相互作用，最后影响基因的表达，进而影响细胞的增殖、分化。外向信号传导是，将细胞本身功能状态的改变通过细胞骨架蛋白，如踝蛋白、纽蛋白等，将细胞内的信号通过整合素的胞内区传递到胞外，从而调节整合素分子的亲和力与整合素在膜上的聚集，进而影响整合素与配体的结合、细胞间的黏附
整合素α1β1抑制剂及其用途
整合素α1β1抑制剂可以同时抑制多种信号传导途径，另一方面，由于肿瘤细胞中整合素蛋白构象与正常细胞中的整合素蛋白构象有明显差异，整合素阻断剂对肿瘤细胞的膜上表达的α1β1有很高的亲和力，而对正常细胞的杀伤力较小，副作用相对较低，对肿瘤组织具有一定的靶向性。研究报道了obtustatin的抗血管生成作用及其对肿瘤生长的抑制作用。同时，已有研究将整合素α1β1抑制剂应用于抑制平滑肌细胞的增殖及迁移，但是，针对obtustatin抑制整合素α1β1这个靶点进行功能干预能否能运用于胸主动脉瘤疾病的治疗，目前国内外文献尚未见报导。在得知了整合素α1β1对于胸主动脉瘤疾病的作用后，可以推测整合素α1β1抑制剂防治主动脉疾病的潜在意义。因此，任何α1β1抑制剂都可用于本发明。根据整合素α1β1的特性，本领域人员可以获得多种α1β1的抑制剂。
本发明优点在于：
本发明经过深入的研究，首次揭示了整合素α1β1的抑制剂可特异性地抑制胸主动脉瘤管径的扩张以及减少弹力纤维的破坏，并且首次揭示了整合素α1β1的表达与主动脉疾病密切相关，另外证实了整合素α1β1抑制剂特异性地抑制主动脉血管平滑肌细胞的增殖以及表型转化，从而为主动脉疾病的防治提供了新的靶点。
附图说明
图1.定量PCR、免疫印迹及免疫组化对人主动脉组织整合素α1β1的表达进行分析，以期获得整合素α1β1在正常主动脉及胸主动脉瘤组织中的差异表达。A，定量PCR结果显示，与正常组织相比，胸主动脉瘤患者的主动脉组织ITGA1及ITGB1表达明显上升。B，免疫组织化学染色显示ITGA1及ITGB1阳性主要表达在血管壁中膜层血管平滑肌细胞。C、D，Westernblot结果显示胸主动脉瘤组织中ITGA1及ITGB1蛋白表达量明显高于正常组织，同时胸主动脉瘤组织中细胞外基质金属蛋白MMP2水平明显上升。E，Spearman相关性分析显示ITGA1及ITGB1的表达量与细胞外基质金属蛋白MMP2成正相关。
图2.AngII微量缓释泵构建小鼠胸主动脉瘤模型，HE&VB及免疫组化分析胸主动脉模型构建进程。A，HE&VB染色显示埋泵第4周，主动脉血管壁的弹力纤维明显遭到破坏，管腔明显扩大，标志着建模成功。B、C，PCR及免疫组化结果显示,第4周ITGA1、ITGB1以及细胞外基质金属蛋白MMP2表达明显增加；ITGA1及ITGB1在第1周表达水平即明显升高，MMP2在第二周表达水平开始明显升高。
图3.应用整合素α1β1抑制剂(Obtustatin)，能显著降低主动脉管腔最大直径大小，同时改善主动脉血管壁的破坏程度。A、B，Obtustatin给药组对比TAA模型组，显著降低TAA模型组主动脉管腔最大直径大小。C，HE&VB染色显示对比模型组，Obtustatin能显著改善主动脉血管壁的弹性纤维断裂情况。
图4.整合素α1β1抑制剂Obtustatin可抑制由AngII诱导的平滑肌细胞细胞外基质相关分泌蛋白水平的升高。A、B，免疫组化及PCR显示整合素α1β1抑制剂能减轻由AngII诱导的细胞外基质金属蛋白MMP2，以及COI和COIII的生成。
图5.整合素α1β1抑制剂Obtustatin及整合素α1β1 siRNA可抑制由AngII诱导的血管平滑肌细胞增殖以及表型转化。A，CCK8结果显示Obtustatin及整合素α1β1 siRNA可抑制AngII诱导的平滑肌细胞的增殖功能。B、C，Western blot显示整合素α1β1抑制剂能减轻由AngII诱导的表型转化，同时可减少由AngII诱导产生的MMP2，COI和COIII的表达水平。D，PCR结果显示整合素α1β1 siRNA可明显降低ITGA1及ITGB1的表达水平。E，Western blot显示整合素α1β1 siRNA能减轻由AngII诱导的表型转化，同时可减少由AngII诱导产生的MMP2，COI和COIII的表达水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
材料和方法：
RNA制备
人主动脉总RNA、小鼠组织以及培养细胞的总RNA用TRIzol(Invitrogen)抽提。
实时荧光定量PCR
常规方法抽提RNA，然后进行实时荧光定量PCR检测，以双标准曲线方法定量，分析各样本的RNA浓度，进行常规PCR扩增。
蛋白制备
人主动脉总蛋白、小鼠组织以及培养细胞的总蛋白用SDS裂解液提取。
Western Blot
BCA测定法调整蛋白浓度；配置分离胶和浓缩胶；电泳；转模；抗体敷育；显影。
人平滑肌细胞培养和表型转化模型
无菌条件下取器官捐献者胸主动脉，胰蛋白酶消化8小时后离心、收集下层细胞、计数并接种。以20％血清SMCM培养液培养2天后，观察细胞表型并进行鉴定、传代等。
小鼠胸主动脉瘤模型
选取重量为16-18克C57BL/6成年雄鼠，随机分为空白对照组，模型组及药物治疗组。常规饲料及常规饮用水喂养，TAA组及TAA+Obt组皮下植入已预装的AngII微量缓释泵(Alzet,10370)，并持续释放AngII 1000ng/(min·Kg)；1周后TAA+Obt组植入已预装的Obtustatin微量缓释泵(Alzet,10370)，并持续释放Obtustatin 20ng/(min·Kg)。分别在1周、2周、3周解剖模型组2只老鼠，观察建模情况。其余小鼠在模型建立结束后即进行解剖，标本分别行液氮保存及甲醛固定。
组织学常规染色分析
取空白组、模型组及药物治疗组小鼠胸主动脉，用4％多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋。石蜡切片(4μm)后用苏木精&伊红染色(H&E)及维多利亚兰染色(VB)，观察分析。
组织免疫组化及分析
采用链霉素抗生素蛋白-过氧化酶法。对石蜡切片进行常规脱蜡水化，柠檬酸盐缓冲液热修复抗原，依次滴加过氧化物酶阻断液(37℃封闭10min)、10％非免疫性动物血清(37℃孵育30min)、一抗(1:100稀释，4℃过夜)、生物素标记的二抗(37℃孵育1h)，DAB显色后行苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。结果判定标准：切片均采用双盲法由2位病理科医生独立阅片，细胞质内出现黄褐色颗粒者为阳性结果。
统计学分析
分类数据显示为百分比，连续变量显示为平均值±标准误。Student’s t test用于检验连续变量；通过卡方检验或Fisher精确检验比较分类变量。Spearman检验进行相关性分析。SPSS21程序用于数据分析。P<0.05为显著差异。
实施例1：胸主动脉瘤患者标本收集及整合素α1β1表达水平
采用2017年12月至2018年12月，21例胸主动脉组织取自长海医院胸心外科因胸主动脉瘤行外科手术的患者术中切除的血管标本，9例正常对照组取自器官捐献者。取材后置于液氮中保存，取1cm大小的组织进行4％多聚甲醛固定，包埋蜡块，行组织化学染色及免疫组织化学染色，提取组织样本RNA行定量PCR、提取组织蛋白行Western blot。结果显示胸主动脉瘤组整合素α1β1水平显著高于正常对照组(图1A,1B,1C,1D)，western blot显示胸主动脉瘤组MMP2水平明显高于正常对照组(图1C和1D)，相关性分析提示ITGA1以及ITGB1的表达量与MMP2呈现正相关(图1E)。说明整合素α1β1可能参与胸主动脉瘤的病程进展中，同时细胞外基质金属蛋白MMP2在胸主动脉的发生发展中起着重要作用。
实施例2：胸主动脉瘤模型建立及验证
选取重量为16-18克C57BL/6成年雄鼠45只，采用标准饲料分笼进行适应性饲养1周。之后采用数字表法，将小鼠随机分为对照组(Control，n＝15)，模型组(TAA，n＝15)及药物干预组(TAA+Obt，n＝15)，常规饲料及常规饮用水喂养。TAA组及TAA+Obt组皮下植入已预装的AngII的微量缓释泵(Alzet,10370)，并持续释放AngII 1000ng/(min·Kg)；1周后TAA+Obt组皮下植入预装Obtustatin的微量缓释泵，并持续释放Obtustatin20ng/(min·Kg)(预实验表明模型组在给药第1周，ITGA1,ITGB1的水平明显升高)。小鼠在模型建立结束后即进行解剖，标本分别行液氮保存及甲醛固定，行病理切片及常规染色，结果显示埋泵第4周，主动脉血管壁的弹力纤维明显遭到破坏，管腔明显扩大，标志着建模成功(图2A)。PCR及免疫组化结果显示,从第1周至第4周，ITGA1、ITGB1以及细胞外基质金属蛋白MMP2表达明显增加(图2B和2C)。
实施例3：整合素α1β1抑制剂Obtustatin对胸主动脉瘤模型干预情况
应用整合素α1β1阻断剂(Obtustatin)，能显著改善主动脉血管壁的破坏程度。结果显示Obtustatin给药组对比TAA模型组，显著降低TAA模型主动脉管腔最大直径大小(图3A和3B)。HE&VB染色显示对比模型组，药物干预组主动脉组织的形态学也有了明显的改善，Obtustatin能显著改善主动脉血管壁的弹性纤维断裂情况(图3C)。
实施例4：模型组及药物干预后整合素α1β1，胶原水平以及MMP2表达对比
在组织学水平，我们首先通过Western blot进行了人主动脉组织中平滑肌细胞MMP2水平的检测，发现在胸主动脉瘤的疾病过程中，MMP2水平明显升高(图1C和1D)，进而我们通过Spearman相关性分析发现ITGA1以及ITGB1的表达量与MMP2呈现正相关(图1E)，而后在模型的干预部分，我们也进行了MMP2以及胶原水平的检测，模型组MMP2，COI及COIII水平明显升高，而Obtustatin组能在组织学水平抑制胶原水平以及MMP2的表达(图4A和4B)。
实施例5：抑制整合素α1β1对平滑肌细胞生物学功能的影响
在前期预实验及文献报道，整合素α1β1抑制剂对平滑肌细胞的生物学功能有显著影响，包括对增殖以及表型转化的影响。在AngII的诱导下，平滑肌细胞的增殖明显增加；同时主动脉平滑肌细胞会向着分泌型细胞转化，伴随着分泌型标志物的升高以及收缩型标志物的降低。应用Obtustatin和整合素α1β1 siRNA抑制了平滑肌细胞的增殖(图5A)，同时主动脉平滑肌细胞会向着收缩型细胞转化，伴随着收缩型标志物的升高以及分泌型标志物的降低。同时Obtustatin可减少平滑肌细胞的胶原(COI和COIII)以及mmp2的表达水平(图5B和5C)。另外，应用整合素α1β1 siRNA可明显降低ITGA1及ITGB1的表达水平(图5D)，在整合素α1β1 siRNA的作用下，主动脉平滑肌细胞会向着收缩型细胞转化，伴随着收缩型标志物的升高以及分泌型标志物的降低(图5E)。同时整合素α1β1 siRNA可减少细胞外基质相关蛋白的表达水平(COI、COIII、MMP2)(图5E)。
本发明首先通过定量PCR检测到，整合素α1β1在胸主动脉瘤中表达上调，同时通过western blot进行了进一步验证。同时通过免疫组织化学染色，我们将整合素α1β1的表达定为于血管壁中膜层的平滑肌细胞，通过对整合素α1β1表达变化检测及既往对胸主动脉瘤可能涉及的病理机制研究中，旨在将整合素α1β1的表达异常与胸主动脉瘤的病理进程联系起来，得出整合素α1β1的过度表达可能与胸主动脉瘤病理过程有着重要的联系。
本发明的体内和体外实验表明，AngII的刺激下平滑肌细胞中的整合素α1β1的阻断保留了它们的收缩型表型并阻碍其向合成型表型的转化。在这种表型转变过程中，平滑肌细胞表现出收缩蛋白含量降低，分泌蛋白，胶原和基质金属蛋白分泌增加，从而促进主动脉的不良重塑。由于整合素α1β1具有选择性结合胶原蛋白的特性，因此其具有促进平滑肌细胞增殖和动脉僵硬的特性，因此在其病理过程中，应当存在相关的表型转变和增殖过程，从而促进主动脉的僵硬及不良重塑。本发明通过对21例主动脉夹层患者组织学蛋白表达量进行了Spearman相关性分析，结果显示整合素α1β1的表达量与MMP2呈现正相关，因此我们有理由相信整合素α1β1影响了MMP2的表达水平从而进一步在胸主动脉瘤疾病的过程中起到了重要的作用，另外动物模型的免疫组化及细胞水平的研究都表明，Obtustatin可通过抑制平滑肌细胞的表型转化，减少MMP2以及胶原的水平，进而影响胸主动脉瘤的发生发展。
整合素α1β1阻断剂Obtustatin是一种非常有效的α1β1选择性抑制剂。它不抑制结构上紧密相关的胶原受体α2β1整联蛋白。同时在其他细胞粘附测定中，Obtustatin也不抑制aIIbβ3，vβ3整联蛋白，以及四种β1整联蛋白(a4，a5，a6和a9)或a4β7整联蛋白。整合素a1β1含有一个所谓的“插入”或I-结构域，它存在于亚基中，含有200个氨基酸残基，位于NH2末端附近，具有高度保守性，在和配体结合中其中起着必要和直接的作用。研究发现Obtustatin在浓度≤1uM时不抑制重组1亚基I结构域与胶原蛋白IV的结合。该结果表明a1β1整联蛋白可含有胶原蛋白IV的第二结合位点，两个结合位点包括胃蛋白酶衍生的三螺旋结构域和非螺旋NC1(非胶原)结构域。目前认为NC1片段的结合不是通过I结构域发生的，而是通过与Obtustatin共同的另一个位点发生的。既往对于Obtustatin的动物实验研究仅限于肿瘤，本发明的研究有望为Obtustatin在胸主动脉瘤的治疗进展中提供新的方向。
在Obtustatin治疗胸主动脉瘤的小鼠模型中，Obtustatin可以有效缓解胸主动脉的扩张并维持弹性纤维的完整性。既往Obtustatin治疗小鼠黑色素瘤的动物模型表明，Obtustatin的治疗效果特别显著。研究指出，Obtustatin的半衰期为30分钟。虽然基于个体治疗的潜在有害副作用，半衰期短意味着药物可从机体中快速清除并易于控制，同时为患者提供更好的保护。但是，活性药物化合物的低半衰期也影响了治疗效率。这也是我们在小鼠模型中选择装有Obtustatin的渗透微型泵的原因，它可以降低有效剂量并提高治疗效率。Obtustatin抑制黑素瘤生长的机制主要在于其抗血管生成能力，抑制血管生成导致肿瘤组织缺氧。在缺氧条件下，缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)被激活，增强了HIF-1α依赖的VEGF转录激活，VEGF表达增加。另外Obtustatin处理的小鼠S-180肉瘤模型表明，1mg/kg/day的Obtustatin可明显抑制小鼠S-180肉瘤生长，并无相关毒副作用，同时Obtustatin在肉瘤治疗中没有诱导任何凋亡的迹象。值得提出的是，在体外，Obtustatin即使在90μM的高浓度下也没有细胞毒性，这也为Obtustatin的应用提供可能性。
目前关于整合素α1β1的下游分子机制的研究指出，整合素α1β1激活ILK(整合素连接激酶)，诱导相关炎性因子NOX2活化，进而通过PI3K-PDK-AKT等途径，调控相关生物学功能，从而促进平滑肌细胞的增殖和迁移。另有研究指出，在AngII的作用下，平滑肌细胞通过整合素α1β1与胶原I粘附，并通过PI3K-ERK路径，调控平滑肌细胞的增殖功能。应用整合素α1β1抑制剂Obtustatin，可影响相关PI3K-PDK-AKT等下游通路，进而减少平滑肌细胞的增殖，迁移以及表型转化。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 上海长海医院
<120> 整合素α1β1抑制剂在制备预防或治疗主动脉疾病药物中的应用
<130> /
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
Cys Thr Thr Gly Pro Cys Cys Arg Gln Cys Lys Leu Lys Pro Ala Gly
1 5 10 15
Thr Thr Cys Trp Lys Thr Ser Leu Thr Ser His Tyr Cys Thr Gly Lys
20 25 30
Ser Cys Asp Cys Pro Leu Tyr Pro Gly
35 40
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
ucgaauuccu cuaaaugcgc u 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
uguaaauuca ucuuuuccgc g 21
Claims (10)
1.整合素α1β1抑制剂在制备预防或治疗主动脉疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的整合素α1β1抑制剂在制备预防或治疗主动脉疾病药物中的应用，其特征在于，所述的主动脉疾病为胸主动脉瘤。
3.根据权利要求1所述的整合素α1β1抑制剂在制备预防或治疗主动脉疾病药物中的应用，其特征在于，所述的整合素α1β1抑制剂是指任何可降低整合素α1β1的活性、降低整合素α1β1的稳定性、抑制整合素α1β1的表达、减少整合素α1β1的有效作用时间、或抑制整合素α1β1的转录和加工的物质。
4.根据权利要求1所述的整合素α1β1抑制剂在制备预防或治疗主动脉疾病药物中的应用，其特征在于，所述的整合素α1β1抑制剂包括但不限于：
特异性结合整合素α1β1的蛋白；
特异性干扰整合素α1β1基因表达、加工的siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸；
整合素α1β1拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂。
5.根据权利要求1所述的整合素α1β1抑制剂在制备预防或治疗主动脉疾病药物中的应用，其特征在于，所述的整合素α1β1抑制剂选自整合素α1β1抑制剂Obtustatin；所述的整合素α1β1抑制剂为整合素α1β1siRNA。
6.整合素α1β1抑制剂在制备AngII诱导的胸主动脉血管壁平滑肌细胞增殖、迁移和表型转化抑制剂中的应用。
7.整合素α1β1抑制剂在制备改善胸主动脉血管壁的弹性纤维断裂的药物中的应用。
8.整合素α1β1抑制剂在制备降低胸主动脉血管壁平滑肌细胞的胶原水平和MMP2的表达水平的药物中的应用。
9.整合素α1β1抑制剂在制备降低胸主动脉血管壁平滑肌细胞ITGA1和ITGB1表达水平的药物中的应用。
10.一种预防或治疗胸主动脉疾病的药物或试剂，其特征在于，其包含：治疗有效量的整合素α1β1抑制剂，以及药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200410 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |