CN108495647B - 诱导心肌细胞增殖及治疗心脏病的方法 - Google Patents

Abstract

提供了诱导心肌细胞增殖用于治疗心脏病的聚集蛋白肽。

Description

诱导心肌细胞增殖及治疗心脏病的方法

发明领域和背景

本发明，在其一些实施方案中，涉及诱导心肌细胞增殖的方法和治疗心脏病的方法。

心脏病且特别是心肌梗塞(MI)，是世界上主要的死亡原因。心脏病的严重性是由于哺乳动物成年心脏肌肉细胞 –心肌细胞(CM)的有丝分裂后性质{Bergmann, 2009 #9;Senyo, 2013 #86}及其补充受损组织的有限的能力{Poss, 2007 #30; Ausoni, 2009 #17}所致。相反，广泛的CM增殖及随后强劲的心脏再生发生在低级脊椎动物例如蝾螈{Ausoni, 2009 #17}和斑马鱼{Poss, 2007 #30; Jopling, 2010 #68; Ausoni, 2009 #17}中。类似地，刚出生的鼠CM更新足以修复损伤后的受损心肌；然而这种能力在出生后第一周期间大大降低{Porrello, 2011 #11; Porrello, 2012 #38}。在此期间，CM倍性从单核到双核形成存在过渡，同时伴有从增生(细胞数量增加)到肥大(细胞尺寸增加)的转变{Li, 1996 #61; Soonpaa, 1998 #89}。在小鼠出生日诱导的心脏损伤导致几乎完全再生，然而这种能力到第7天减少。在这个时间点，纤维化疤痕超过了肌肉组织通过CM增殖的补充{Porrello, 2011 #11}，因此导致心脏功能受损{Weisman, 1988 #90}。许多研究集中在内源性CM的增殖以有利于心脏再生。最近，已显示出成年CM可通过调节几个途径例如：伴有P38抑制作用的FGF1 {Engel, 2006 #127}、细胞外骨膜蛋白(Periostin){Kuhn, 2007 #28}、经由Erbb2的NRG1 {D’Uva, 2015 #99; Bersell, 2009 #128}、Hippo抑制作用{Heallen, 2013 #100}和细胞周期调节剂Meis1的抑制作用{Mahmoud, 2013 #80}再次进入细胞周期并增殖。

心脏病变，主要是MI，往往伴有ECM重新塑造，主要是减低心脏功能的硬性疤痕的沉积{Weisman, 1988 #90; Baum, 2011 #12; Bayomy, 2012 #3}。损伤后ECM结构的改变归因于基质金属蛋白酶(MMP)的活性{Phatharajaree, 2007 #92}，主要是明胶酶家族，MMP2和MMP9 {DeCoux, 2014 #91}。MI后MMP2 {Hayashidani, 2003 #94}或者MMP9{Ducharme, 2000 #93}的缺失削弱了ECM重新塑造并改善总体心脏功能。尽管有心脏损伤后ECM重新塑造的不利作用，ECM在任何细胞类型的细胞迁移{Ridley, 2003 #95; Berk,2007 #97}、分化{Shamis、2011 #18; Streuli, 1999 #96}和增殖{Berk, 2007 #97}中扮演不可或缺的角色。

通过利用ECM去细胞化和胎儿、新生的和成年心脏ECM的酸溶解，心脏ECM显示明显促成CM增殖的调节{Williams, 2014 #84}。接种于新生儿细胞上，源自胎儿和新生儿年龄的ECM呈现出与源自成年的ECM相比更高的增殖水平{Williams, 2014 #84}。尽管CM内在因素的操纵显示扩大哺乳动物心脏的增殖能力{D’Uva, 2015 #99；Mahmoud, 2013 #80；Heallen, 2013 #100}，但细胞外环境或其成分在心脏再生中的作用仍不清楚。

聚集蛋白(Agrin)是具有210 kDa的核心蛋白大小的细胞外硫酸类肝素蛋白多糖(HSPG) {Williams, 2008 #71}。神经系统形式的聚集蛋白(n-聚集蛋白)由于其经由肌肉特异性激酶(MuSK)-Lrp4受体复合物参与乙酰胆碱受体(AChR)的聚集而被广泛地研究{Burden, 2013 #76}。非-神经元聚集蛋白的升高的表达与几种类型的癌相关{Theocharis, 2010 #102}，并且最近其通过与Lrp4的相互作用控制细胞的运动性和增殖而涉及肝细胞癌(HCC)的进展{Chakraborty, 2015 #101}。此外，聚集蛋白的小片段(c-末端22 kDa肽，CAF22)已显示结合和抑制调节CM搏动的Na+K+通道{Hilgenberg, 2009 #103}，类似于地高辛，一种通常在各种心脏病发作后服用的药物{Hilgenberg, 2009 #103;Schwinger, 2003 #104}。一项最近的研究聚焦于在先天免疫的过程中，聚集蛋白与作为关键成分的肌营养不良蛋白聚糖复合物的相互作用，并且为单核细胞和巨噬细胞通过与Grb2的相互作用和随后ERK激活的分化所需要{Mazzon, 2012 #73}。

肌营养不良蛋白聚糖包含两个单位(α和β) {Henry, 1996 #105}且通过与肌养蛋白及其相关复合物相互作用，用作连接ECM成分(例如聚集蛋白、层粘连蛋白和基底膜聚糖)与肌细胞内部肌肉骨骼的跨膜桥{Henry, 1996 #105; Davies, 2006 #106; Ervasti,1990 #108}。肌养蛋白复合物的干扰是各种肌肉营养不良包括杜氏肌肉营养不良的主要原因{Davies, 2006 #106; Campbell, 1989 #107; Ervasti, 1990 #108}。缺乏肌养蛋白的小鼠(Mdx)，在非-缺血性心肌病模型中表现出升高的CM更新{Richardson, 2015 #110}。相比之下，采用在出生后1天的Mdx小鼠心脏切除术的最近研究揭示再生反应受损和相对于野生型小鼠的升高的纤维化{Morikawa, 2015 #109}。尽管如此，聚集蛋白、肌营养不良蛋白聚糖及其下游元件的作用从未在心脏再生的背景下进行研究。

其它的背景技术包括：

美国申请号20070014871

美国申请号20100095387

美国申请号20060223753

美国申请号20140377212

美国申请号20110104120

美国申请号20070014733。

发明简述

根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了治疗有效量的诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽在制备用于治疗心脏病的药物中的用途。

根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了抑制心肌细胞上的肌营养不良蛋白聚糖复合物的药剂在制备用于治疗心脏病的药物中的用途。

根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种诱导心肌细胞增殖的方法，该方法包括使心肌细胞与有效量的诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽接触。

根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种诱导心肌细胞增殖的方法，该方法包括使心肌细胞与抑制心肌细胞上的肌营养不良蛋白聚糖复合物的药剂接触，从而诱导心肌细胞的增殖。

根据本发明的一些实施方案，所述药剂选自小分子和肽和多核苷酸。

根据本发明的一些实施方案，所述药剂包含诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽。

根据本发明的一些实施方案，所述药剂诱导Erk激活。

根据本发明的一些实施方案，所述药剂抑制肌节生成(sarcomerogenesis)。

根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗心脏病的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽，从而治疗心脏病。

根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种包含诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽的可植入装置。

根据本发明的一些实施方案，所述聚集蛋白肽不是融合多肽的部分。

根据本发明的一些实施方案，聚集蛋白肽呈可溶性形式。

根据本发明的一些实施方案，聚集蛋白肽包含层粘连蛋白G-样1结构域(G1)和层粘连蛋白G-样2结构域(G2)。

根据本发明的一些实施方案，所述聚集蛋白肽是90-110 KDa.

根据本发明的一些实施方案，所述聚集蛋白肽包含人聚集蛋白的片段。

根据本发明的一些实施方案，心肌细胞选自成年心肌细胞、幼稚心肌细胞和新生的心肌细胞。

根据本发明的一些实施方案，所述方法在体内进行。

根据本发明的一些实施方案，所述方法离体进行。

根据本发明的一些实施方案，所述方法在体外进行。

根据本发明的一些实施方案，心肌细胞被包含在组织中。

根据本发明的一些实施方案，心脏病是缺血性心脏病。

根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种分离的包含层粘连蛋白G-样2 (G2)结构域的肽，所述肽的长度不超过200个氨基酸。

根据本发明的一些实施方案，肽如SEQ ID NO: 8所示。

根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种包含所述肽的药用组合物。

除非另外限定，本文所用的所有的技术和/或科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意义。尽管类似或等同于本文描述的那些方法和材料可被用于本发明的实施方案的实践或测试中，但示例性方法和/或材料在下文描述。在有抵触的情况下，以专利说明书，包括定义为准。此外，材料、方法，和实施例仅仅是说明性的并不打算必然是限制性的。

附图说明

本发明的一些实施方案仅通过举例的方式，参考附图在本文描述。现在详细地具体参考附图，强调所示的细节是通过举例的方式并且是为了本发明的实施方案的示例性讨论的目的。在这点上，用附图进行描述使得可如何实施本发明的实施方案对本领域技术人员显而易见。

在附图中：

图1A-M显示，P1心脏ECM以MMP依赖性方式增加CM细胞周期再进入。(图1A) ECM对在P1和P7培养物中CM细胞周期再进入的贡献的实验设计。(图1B)心脏切片用DAPI染色，以评价细胞的去除。(图1C)切片由SEM成像，经处理的样本不含细胞成分。(图1D)心脏培养物的代表性区域用DAPI (蓝色)、cTNT (绿色)和Ki67 (红色)染色。白色箭头显示Ki67⁺/cTNT⁺细胞。(图1E-F) P1 (图1E)或P7 (图1F)响应于第1天和第7天ECM的增殖CM的百分率。(图1G-H) P1 (图1G)或P7 (图1H)响应于第1天和第7天ECM (有或没有广泛MMP抑制剂(马立马司他))的增殖CM (Ki67⁺/cTNT⁺)细胞的百分率。(图1I)促成CM细胞周期活性的MMP衍生的ECM片段的流程。(图1J-K)响应于第1天和第7天ECM片段的MMP9/12裂解底物的存在的P1(图1J)或P7增殖CM百分比(图1K)。(图1l)提出LC/MS结果的范图(Van diagram)。(图1M)从P1和P7全心溶胞产物的LC/MS获得的基因的定量PCR (qPCR)分析。

图1N-P显示，P1和P7 ECM促进明胶酶活性升高。(图1N)原位酶谱法(ISZ)测定的示意图。(图1O)响应于P1和P7 ECM的Col1、Col4和明胶降解的免疫荧光评价。(图1P) ISZ测定的量化。

图2A-I显示，心内衍生的聚集蛋白促进CM增殖。(图2A)来自P1和P7心脏溶胞产物的聚集蛋白基因的qPCR。(图2B)来自P1和P7心脏溶胞产物的聚集蛋白的蛋白质印迹分析。(图2C)对聚集蛋白(绿色)、cTnT (红色)染色和用DAPI (蓝色)复染色的P1和P7心脏切片的图像。(图2D)聚集蛋白的6个细胞群(FB、非-FB、CM、非-CM、EC、非-EC)的qPCR分析。响应于聚集蛋白体外给予的P1和P7 CM (cTnT或番茄-αMHC)数量(图2E)、细胞周期(Ki67；图2F)、有丝分裂(pH3；图2G)或胞质分裂(Aim1；图2H)的免疫荧光评价。(图2I)来自P1和P8心脏溶胞产物的基因的qPCR。对于CD90 (FB标记)、αMHC (CM标记)和Pecam (EC标记)的6个细胞群(FB、非-FB、CM、非-CM、EC、非-EC)的qPCR分析。

图3A-O显示，聚集蛋白为外科切除术后P1心脏再生所需。(图3A)描述心脏限制的聚集蛋白敲除(聚集蛋白-cKO)小鼠生成的示意图。(图3B)在P1 WT和聚集蛋白-cKO心脏溶胞产物中的聚集蛋白和肌节(sarcomaric)蛋白水平的蛋白质印迹分析。(图3C)在P1 WT和聚集蛋白-cKO心脏溶胞产物中的聚集蛋白的qPCR。(图3D)在P1 WT和聚集蛋白-cKO中的聚集蛋白的免疫荧光分析。(图3E)在P1 WT和聚集蛋白-cKO中描述细胞大小变化的WGA膜染色的免疫荧光分析(图3F)。(图3G)在P1 WT和聚集蛋白-cKO心脏溶胞产物中的病理肥大性标记(即，Acta1)的qPCR分析。通过在WT和聚集蛋白-cKO左心室心脏切片的免疫荧光分析的P1CM细胞-周期再进入(Ki67；图3H)和胞质分裂(Aim1；图3I)的体内评价。(图3J) P1切除术实验的流程。(图3K)用马森氏三色(Masson's trichrome)和天狼星红(Sirius red)染色的P1WT和聚集蛋白-cKO的组织学切片。(图3L-M)切除术后4周基于WT和聚集蛋白-cKO心脏切片的马森氏三色染色的疤痕量化。(图3N、O)在从切除的WT和聚集蛋白-cKO心脏获取的切片中，通过Ki67 (图3N)或Aim1 (图3O)免疫荧光分析的CM细胞-周期再进入的体内评价。

图4A-I显示在MI后，聚集蛋白接种足以供心脏再生。(图4A)在幼稚和成年二者中描述LAD结扎实验的示意图。(图4B-4E)在幼稚(图4B、C)和成年(图4D、E)小鼠中，通过MI后7天心脏切片中Ki67 (图4B、D)或Aim1 (图4C、E)的免疫荧光分析的CM细胞-周期再进入的体内评价。(图4F、G)未受损的和受损的PBS和聚集蛋白处理的幼稚(图4F)和成年(图4G)小鼠在MI后，根据图4A的流程，射血分数(EF)、短轴缩短率(fractional shortening, FS)和壁厚的连续的超声心动图测量。(图4H、4I) 基于PBS和聚集蛋白处理的幼稚(图4H)和成年(图4I)小鼠心脏切片的马森氏三色染色的疤痕量化。

图5A-J显示，聚集蛋白通过Dag1和ERK激活促进CM增殖。(图5A)来自P1和P7心脏溶胞产物的Dag1基因的qPCR。(图5B)来自P1和P7心脏溶胞产物的Dag1的蛋白质印迹分析。(图5C)对于Dag1的6个细胞群(FB、非-FB、CM、非-CM、EC、非-EC)的qPCR分析。(图5D)在P7对照和聚集蛋白处理的培养物中磷-ERK (pERK)和一般-ERK (gERK)的蛋白质印迹分析。(图5E)通过对P7对照和聚集蛋白处理的培养物的pERK的免疫荧光染色进行的CM ERK激活分析。(图5F) P7对照、Dag1抑制、聚集蛋白和聚集蛋白伴随Dag1抑制处理的培养物中pERK和gERK的蛋白质印迹分析。(图5G-H)在伴随MEK抑制(图5G)或者Dag1抑制(图5H)的聚集蛋白处理后，通过免疫荧光染色的CM细胞周期活性分析。(图5I)在WT和mdx (体外)中响应于聚集蛋白给予的P7 CM细胞周期活性(Ki67)的免疫荧光评价。(图5J)用显示出抑制Na⁺/K⁺泵的各种化合物处理的番茄标记CM的系列免疫荧光计数。

图6A-D显示，体外聚集蛋白给予促进人iPSC-衍生的CM增殖。(图6A)响应于聚集蛋白给予的iPSC-CM细胞周期活性(Ki67)的系列免疫荧光评价。(图6B)细胞周期活性的第4天免疫荧光分析。(图6C-D)通过Ph3 (图6C)或者Aim1 (图6D)以剂量依赖性方式响应于人-聚集蛋白给予的iPSC-CM细胞周期活性的免疫荧光评价。

图7A-B说明聚集蛋白的蛋白结构(基于Singhal and Martin 2011 Develop.Neurol. 982-1005)及其在人(SEQ ID NO: 38)、大鼠(SEQ ID NO: 6)和重组聚集蛋白[R&DSystems 550-AG(Ala1153-Pro1959, del1788-1798)]中的比对。

图8A-H显示心肌梗塞的(MI)心脏的聚集蛋白转录作用。RNA测序在用聚集蛋白/PBS处理的MI心脏上进行，以评价聚集蛋白在梗塞的成年心脏中的转录作用。(图8A)描述实验设计的示意图：成年心脏经受LAD结扎，且经受PBS或者聚集蛋白注射。处理后3天，从聚集蛋白、PBS和假手术小鼠收集心脏，并纯化RNA和经受RNA-seq。(图8B)梗塞的聚集蛋白对比PBS (MI)处理的心脏的差异表达基因的火山图(Volcano plot)。将倍数表达变化针对p值作图。显著增加或减少的基因分别以红色或蓝色指示。实心圆表示已知参与心脏再生和免疫调节的重要途径的相关基因。(图8C)描述由聚集蛋白影响的差异表达基因的热图。RNA-seq基因表达数据与MI差异表达基因数据库1比较。对在目前的MI设置(PBS对比假手术组)和在早已存在的数据库中显示类似模式的差异表达基因进行比较。这些基因被称为“MI标志物”。这些基因在数据库MI (Ounzain，左图)、目前的MI (实验MI，中图)和用聚集蛋白处理的MI (聚集蛋白MI对比PBS MI，实验MI+聚集蛋白，右图)的相对表达。(图8D-E)在图8C中显示的基因使用独创途径分析软件分析。对于(图8D)规范的途径和(8E)上游调节剂显示了突出的显著富集的条目。(图8F-G)描述重要的(图8F)规范的途径和(图8G)上游调节剂中的相关基因相对表达的热图。(图8H)在(图8F)和(图8G)中所示的几种基因的实时验证。

本发明的具体实施方案的描述

本发明，在其一些实施方案中，涉及诱导心肌细胞增殖的方法和治疗心脏病的方法。

在详细地解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解本发明不必然使其应用受限于以下说明书中叙述或由实施例举例说明的细节。本发明能够以各种方式实践或执行其它实施方案。

心脏病，包括心肌梗塞(MI)，是世界上主要的死亡原因。心脏病的严重性是由于有丝分裂后成人心脏肌肉细胞性质 – 心肌细胞(CMs) {Bergmann, 2009 #9; Senyo, 2013#86}及其补充受损组织的有限的能力{Poss, 2007 #30; Ausoni, 2009 #17}所致。相比之下，新生鼠CM更新足以在损伤后修补损伤的心肌；然而这种能力在出生后第一周期间大大地降低。

在寻找可以提高幼稚/成年CM的增殖性质的新治疗方式时，本发明人已采用一种新的用于鉴定促进CM增殖的鼠心脏ECM组合物的方法并鉴定聚集蛋白，一种在出生时由心脏内皮细胞表达的蛋白聚糖，但其水平在7天后下降。用重组聚集蛋白处理诱导CM细胞周期再进入和体外分裂。在出生时，聚集蛋白条件性敲除(cKO) CM显示成熟和更分化表型，伴有减少的增殖和受损的心脏再生。相比之下，心肌梗塞(MI)后的聚集蛋白给予在新生和成年小鼠中诱导导致减少疤痕和整体改善的心脏功能的CM增殖。机械地，本发明人提示聚集蛋白通过阻断肌节生成且不通过其规范的MuSK相关的信号传导，经由肌营养不良蛋白聚糖复合物的调节起作用。因此这些结果使CM中抑制肌营养不良蛋白聚糖复合物的任何药剂成为用于心脏病的潜在治疗。转录分析提示聚集蛋白不仅通过心肌细胞增殖，而且还通过免疫调节促进心脏再生，这可改变心肌细胞存活，从而减少梗塞和疤痕大小。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种诱导CM增殖的方法，该方法包括使心肌细胞与抑制CM上的肌营养不良蛋白聚糖复合物的药剂接触，从而诱导CM的增殖。

根据本发明的另一个方面，提供了一种诱导心肌细胞增殖的方法，该方法包括使心肌细胞与有效量的诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽接触。

如本文所用的“一个心肌细胞(cardiomyocyte)”或“多个心肌细胞(cardiomyocytes)” (缩写为CM、CMs)，也称为心肌细胞(myocardiocytes)或心脏肌细胞(cardiac myocytes)，是构成心脏肌肉的肌肉细胞(肌细胞)。该术语指任何物种包括哺乳动物，例如人在任何发育阶段的心肌细胞。根据一个具体的实施方案，心肌细胞是新生的CM(例如，对于出生后至多6个月的人)。根据一个具体的实施方案，心肌细胞是成人心肌细胞(例如，对于出生后至少16-18岁的人)。

因此，根据一个具体的实施方案，心肌细胞来自患有心脏病的受试者。

根据一个具体的实施方案，心肌细胞来自供体健康受试者。

根据一个具体的实施方案，心肌细胞可以是天然存在的。

根据一个具体的实施方案，CM已被离体分化为心肌细胞(例如，从多能干细胞例如，胚胎干细胞(hESC)和诱导多能干细胞(iPSC))。分化干细胞为CM的方法是本领域熟知的。例如，iPSC可与内脏的内胚层-样细胞共同培养(见，例如Mummery et al. (2003)Circulation 107: 2733)。在没有与饲养细胞或其他细胞的共同培养时，iPS细胞也可被诱导以经历心肌生成。例如，如在美国专利号7,297,539中所述。CM当与所述药剂(例如，聚集蛋白)接触时，可被完全分化。根据另一个实施方案，细胞定型为心脏谱系，并且将药剂(例如，聚集蛋白)在分化过程中或分化过程之后加入到培养物中。

根据一个具体的实施方案，心肌细胞是人CM。

根据一个具体的实施方案，CM是细胞系。

根据一个具体的实施方案，CM是原代CM。

如本文所用的术语“诱导增殖”指CM增殖的有统计学意义的增加(如与相同起源和发育阶段的未处理的细胞比较)并且是心肌细胞接触药剂如聚集蛋白的结果。

如所提及的，细胞与抑制CM上的肌营养不良蛋白聚糖复合物的药剂接触。我们的数据提示聚集蛋白与肌营养不良蛋白聚糖复合物相互作用，因为针对这种分子的抗体抑制聚集蛋白对CM增殖和ERK激活的诱导作用。备选地或另外地，所述药剂调节作为在CM细胞骨架和ECM之间的桥接分子的肌营养不良蛋白聚糖的结构活性，因而使得CM增殖。

如所提及的，本文描述的药剂能够诱导免疫调节(见图8A-H)，借此增加心肌细胞存活、抗炎和/或抗纤维化作用。

如本文所用的“免疫调节”指规范的途径基因 - 和/或上游调节剂(见图8A-H，其结合在本文中)的基因表达(例如，如通过RNA-Seq测定的RNA)的诱导变化。

如本文所用的，术语“药剂”指可具有生物学性质的物质，例如，蛋白性物质例如肽(例如，本文下面进一步描述)或抗体、核酸物质例如，多核苷酸或寡核苷酸，或具有化学性质的物质例如，小分子。

如本文所用的术语“多核苷酸”指被分离并以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，以上的组合)的形式提供的单链或双链核酸序列。

术语“分离的”指至少部分地从天然环境例如，从重组宿主细胞分离。

可用来抑制肌营养不良蛋白聚糖复合物的其它药剂可通过使药剂与表达肌营养不良蛋白聚糖复合物的心肌细胞接触并鉴定结合肌营养不良蛋白聚糖复合物和任选地诱导Erk激活并最终CM增殖或抑制肌节生成的药剂来鉴定。蛋白结合可使用许多本领域已知的测定，例如，ELISA测定、免疫共沉淀、膜结合、FRET、表面等离子体共振技术等测定。

备选地或另外地，和如所提及的，所述细胞接触“聚集蛋白肽”。

如本文所用的术语“聚集蛋白”指AGRN基因的蛋白产物。该术语意欲包括编码聚集蛋白的多核苷酸序列或作为RNA或蛋白的表达产物。

“聚集蛋白肽”指短于全长聚集蛋白(例如，在人聚集蛋白的情况下短于组成全长人聚集蛋白的2068/2045个氨基酸)并能够诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽。根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽以可溶性形式提供。

根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽来自人聚集蛋白NP_001292204 (SEQ IDNO: 4)或NP_940978 (SEQ ID NO: 5)或Uniprot O00468 SEQ ID NO: 38。

根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽具有人直向同源物例如，NP_786930 (SEQID NO: 6)。

应该理解，本申请教导涵盖用第二物种(例如，大鼠)的聚集蛋白肽处理一个物种(例如，人)，只要它们在处理的受试者/细胞上显示出所需活性(即，诱导CM增殖)。

根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽包含层粘连蛋G-样2 (G2)结构域和任选的层粘连蛋白G-样1 (G1)结构域。

因此根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽包含如SEQ ID NO: 8所示的G2结构域或如SEQ ID NO: 7所示的G1和G2。

因此，提供了一种分离的包含层粘连蛋白G-样2 (G2)结构域的肽，所述肽的长度不超过200个氨基酸。

根据一个具体的实施方案，所述肽如SEQ ID NO: 8所示。

不受理论的束缚，提示这样一种包含至少层粘连蛋白G-样2 (G2)和可能的G1和/或G3结构域的配置为α-肌营养不良蛋白聚糖/DAG1结合所需要。

根据一个具体的实施方案，这样一种聚集蛋白肽促进肌节解体和心肌细胞增殖，导致心脏再生。

根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽不经由结合MuSK受体发挥其功能。确实，没有MuSK受体在心脏中表达，如从RNA-seq概况所证实的[41]。

根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽是50-500个氨基酸长度。根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽是100-400个氨基酸长度。根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽是100-300个氨基酸长度。根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽是150-200个氨基酸长度。根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽是100-200个氨基酸长度。

根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽是80-150 kDa。根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽是80-120 kDa。根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽是80-110 kDa。根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽是90-110 kDa。

聚集蛋白肽可从R&D systems经市售获得例如，6624-AG、550-AG或550-AG/CF。

根据一个具体的实施方案，聚集蛋白肽经由层粘连蛋白G1-G2结构域结合肌营养不良蛋白聚糖复合物[42]。本发明人提示聚集蛋白抑制其活性，从而导致Erk激活并任选地抑制肌节生成(sarcromerogenesis)。

测定Erk (也称为细胞外-信号-调节的激酶(ERK)或经典的MAP激酶)激活的方法是本领域熟知的且包括，但不限于，体外激酶测定和抗-磷酸化MAPK抗体的使用。

根据一个具体的实施方案，聚集蛋白不是融合多肽的部分，其中聚集蛋白用作递送治疗有效肽的靶向部分。

根据另一个具体的实施方案，聚集蛋白是融合多肽的部分，其中聚集蛋白用作靶向部分和效应部分(即，用于诱导CM增殖)两者。

根据一个具体的实施方案，聚集蛋白以可溶性形式提供。因此，聚集蛋白不是细胞外基质组分的部分或连接于细胞外基质组分。

测定CM增殖的方法是本领域熟知的，并包括，但不限于，手动细胞计数、MTT测定和胸腺嘧啶掺入测定。根据一些实施方案，对细胞性质进行确定以及对其增殖进行测定。

例如，在一些实施方案中，增殖性心肌细胞的存在通过证实由细胞产生的至少一种心肌细胞-特异性标志物的表达来验证。例如，心肌细胞表达心脏转录因子、肌节蛋白，和缝隙连接蛋白。合适的心肌细胞-特异性蛋白包括，但不限于，心脏肌钙蛋白I、心脏肌钙蛋白-C、原肌球蛋白、小窝蛋白(caveolin)-3、GATA-4、肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链-2a、肌球蛋白轻链-2v、利阿诺定(ryanodine)受体，和心房钠尿肽。

作为另一个实例，在一些实施方案中，心肌细胞通过检测对药剂例如β-肾上腺素能激动剂(例如，异丙肾上腺素)、肾上腺素能β-拮抗剂(例如，艾司洛尔)、胆碱能激动剂(例如，carbochol)等的响应来确定。

备选地或另外地，CM的性质的验证通过检测细胞的电活性进行。电活性可通过各种方法，包括细胞外记录、细胞内记录(例如，贴片钳位)，和使用电压敏感染料来测量。这样的方法是本领域技术人员熟知的。

如本文所用的术语"肽"涵盖天然肽(降解产物、经合成的合成肽或重组肽)和拟肽(peptidomimetic) (通常地，经合成的合成肽)，以及为肽类似物的类肽(peptoid)和半类肽(semipeptoid)，其可具有例如，使肽在体内时更稳定或更能够渗透进入细胞的修饰。这样的修饰包括，但不限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰、骨架修饰，和残基修饰。制备拟肽化合物的方法是本领域熟知的且例如，在量化药物设计(Quantitative Drug Design),C.A. Ramsden Gd., 17.2章, F. Choplin Pergamon Press (1992)中有详细说明，其通过引用结合到本文中，如同在在此完全阐述一样。这个方面的进一步细节在下文提供。根据一个具体的实施方案，肽(或多肽)是(即，重组DNA技术的)重组产物。根据一个具体的实施方案，聚集蛋白是约95%纯的(例如，没有其它活性成分蛋白存在于制剂中)。

肽内的肽键(-CO-NH-)可以例如，被N-甲基化酰胺键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(=O)-O-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、亚磺酰亚甲基键(-S(=O)-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)替代，其中R是任何烷基(例如，甲基)、胺键(-CH2-NH-)、硫键(-CH2-S-)、亚乙基键(-CH2-CH2-)、羟亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯属双键(-CH=CH-)、氟代烯属双键(-CF=CH-)、逆酰胺(retro amide)键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是天然存在于碳原子上的"正"侧链。

这些修饰可在沿着肽链的任何键并且甚至同时在几个(2-3)键上发生。

天然芳族氨基酸，Trp、Tyr和Phe，可被非-天然芳族氨基酸例如1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)、萘丙氨酸、Phe的环-甲基化衍生物、Phe或O-甲基-Tyr的卤化衍生物取代。

本发明的一些实施方案的肽也可包括一个或多个修饰的氨基酸或一个或多个非-氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。

术语"氨基酸"或"多个氨基酸"应理解为包括20个天然存在的氨基酸；在体内通常经翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如，羟脯氨酸、磷丝氨酸和磷苏氨酸；及其它不常见的氨基酸包括，但不限于，2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正-缬氨酸、正-亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语"氨基酸"包括D-和L-氨基酸二者。

下表1和2列出天然存在的氨基酸(表1)，和非-常规或修饰的氨基酸(例如，合成的，表2)，其可用于本发明的一些实施方案。

表1

表2

本发明的一些实施方案的肽优选地以线性形式利用，虽然应理解，在其中环化不严重干扰肽的特性的情况下，也可利用环化形式的肽。

由于本发明的肽优选地用于需要肽为可溶形式的治疗或诊断中，本发明的一些实施方案的肽优选地包含一个或多个非-天然或天然极性氨基酸，包括，但不限于丝氨酸和苏氨酸，其由于它们的含羟基侧链而能够增加肽的溶解性。

本发明的一些实施方案的肽优选地以线性形式利用，虽然应理解，在其中环化不严重干扰肽的特性的情况下，也可利用环化形式的肽。

应该理解，本发明的一些实施方案的蛋白质药剂，也可利用显示出所需的活性(即，诱导CM增殖)的功能同源物。这样的同源物可以与人序列例如，人聚集蛋白例如，SEQID NO: 4、5、7或8具有例如，至少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少81 %、至少82%、至少83 %、至少84 %、至少85 %、至少86 %、至少87 %、至少88 %、至少89 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99%或100 %的相一性，如使用Wisconsin序列分析包的BestFit软件，利用Smith和Waterman算法测定的，其中间隙权重等于50，长度权重等于3，平均匹配等于10和平均错配等于-9。

本发明的一些实施方案的肽可通过肽合成领域技术人员熟知的任何技术合成。对于固相肽合成，许多技术的概述可参见J. M. Stewart和J. D. Young, Solid PhasePeptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963和J. Meienhofer,Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, p. 46, Academic Press (New York),1973。对于经典溶液合成，参见G. Schroder和K. Lupke，(The Peptides), vol. 1,Academic Press (New York), 1965。

一般来说，这些方法包括顺序加入一个或多个氨基酸或适当的保护的氨基酸至生长的肽链中。正常地，第一个氨基酸的氨基或者羧基被合适的保护基团保护。保护的或衍生的氨基酸然后可连接于惰性固体载体或者在适合形成酰胺键的条件下，通过加入下一个氨基酸在具有适当地保护的互补(氨基或羧基)基团的序列中用于溶液中。然后从这个新加入的氨基酸残基除去保护基团，并随后加入下一个氨基酸(适当保护的)，等等。在全部所需的氨基酸以正确的序列连接后，任何剩余的保护基团(和任何固体载体)被依序或同时除去，以提供最终肽化合物。

备选地，肽使用重组DNA技术生产。

各种原核细胞或真核细胞可用作宿主表达系统以表达本发明的一些实施方案的多肽/肽。这些包括，但不限于，微生物，例如用含有编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)，CaMV；烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)，TMV)感染或用含有编码序列的重组质粒表达载体，例如Ti质粒转化的植物细胞系统。哺乳动物表达系统也可用来表达本发明的一些实施方案的多肽。

为了简单起见，聚集蛋白和药剂在本文统称为“药剂”，虽然应该理解，药剂的每个可能性代表本发明的独立实施方案。

根据一个具体的实施方案，蛋白质药剂可连接(或缀合)于非-蛋白质部分，其增加它们在循环中的生物利用度和半衰期。

如本文所用的短语“非-蛋白质部分”指不包括肽键合氨基酸的连接于上述蛋白质药剂的分子。可根据本申请教导使用的示例性非-蛋白质且优选的非-毒性部分包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚(苯乙烯-马来酸酐)共聚物(SMA)，和乙烯醚和马来酸酐共聚物(DIVEMA)。

这样一种分子是高度稳定的(抵抗体内蛋白水解活性，很可能是由于由非蛋白质部分赋予的空间位阻所致)并可使用普通的固相合成方法生产，该方法是低成本且高效率的，如在下文进一步描述的。然而，应理解还可采用重组技术，由此重组肽产物经受体外修饰(例如，PEG化)。

因此，这样的非-蛋白质非-毒性部分也可连接于以上提及的药剂，以促进分子的稳定性和可能的溶解性。

这样一种非-蛋白质部分的生物缀合(例如，PEG化)可赋予蛋白氨基酸序列稳定性(例如，对抗蛋白酶活性)和/或溶解性(例如，在生物流体例如血液、消化液内)，同时保留其生物学活性并延长其半衰期。

生物缀合是有利的，特别是在显示短的半衰期和从血液的快速清除的治疗性蛋白的情况下。生物缀合的蛋白在血浆中的半衰期增加起因于蛋白缀合物的大小增加(其限制它们的肾小球过滤)和由于聚合物空间位阻而降低蛋白水解。一般来说，连接于每个肽的聚合物链越多，半衰期的延长就越长。然而，采取措施以不减少本发明的蛋白的特异性活性(例如，CM增殖)。

蛋白质药剂与PEG的生物缀合(即，PEG化)可使用PEG衍生物进行，例如PEG羧酸的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、单甲氧基PEG₂-NHS、羧基甲基化PEG的琥珀酰亚胺酯(SCM-PEG)、PEG的苯并三唑碳酸酯衍生物、PEG的缩水甘油醚、PEG对-硝基苯基碳酸酯(PEG-NPC，例如甲氧基PEG-NPC)、PEG醛、PEG-邻二硫吡啶、羰基二咪唑-激活的PEG、PEG-硫醇、PEG-马来酰亚胺。各种分子量的这样的PEG衍生物是可市售获得的[见，例如目录，PolyethyleneGlycol and Derivatives 2000 (Shearwater Polymers, Inc., Huntsvlle, Ala.)]。如果需要，许多以上衍生物可以单官能的一甲氧基PEG (mPEG)形式获得。一般来说，加入到本发明的抗HER3抗体氨基酸序列中的PEG的分子量(MW)范围应在从数百道尔顿至约100 kDa(如，在3-30 kDa之间)。可使用较大的MW PEG，但可能导致PEG化肽的得率的某些损失。较大的PEG分子的纯度也应监视，因为要获得与对较低的MW PEG可获得的同样高的纯度的较大MW PEG，可能是困难的。优选使用至少85 %纯度，和更优选至少90 %纯度、95 %纯度，或更高纯度的PEG。分子的PEG化在例如Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic PressSan Diego, Calif. (1996), 第15章和Zalipsky et al., "Succinimidyl Carbonatesof Polyethylene Glycol,", Dunn和Ottenbrite, eds., Polymeric Drugs and DrugDelivery Systems, American Chemical Society, Washington, D.C. (1991)中进一步讨论。

根据一个具体的实施方案，本文描述的用于诱导CM增殖的方法在体内进行。

根据一个具体的实施方案，本文描述的用于诱导CM增殖的方法在体外进行。

根据一个具体的实施方案，本文描述的用于诱导CM增殖的方法离体进行。

根据一个具体的实施方案，心肌细胞被包含在组织(血管化组织)内。

诱导CM增殖的能力使得本申请教导特别适合于治疗其中对心脏组织有损伤或有此类损伤的风险的心脏病。

因此，根据本发明的一个方面，提供了治疗有效量的诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽在制备用于治疗心脏病的药物中的用途。

备选地，根据本发明的一个方面，提供了治疗有效量的诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽在制备用于治疗心脏病的药物中的用途。

备选地，根据本发明的一个方面，提供了抑制心肌细胞上的肌营养不良蛋白聚糖复合物的药剂在制备用于治疗心脏病的药物中的用途。

备选地，根据本发明的一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗心脏病的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽，从而治疗心脏病。

备选地，根据本发明的一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗心脏病的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的抑制心肌细胞上的肌营养不良蛋白聚糖复合物的药剂，从而治疗心脏病。

术语“治疗”指抑制、预防或阻止病变(即，心脏病、障碍或病症，例如缺血性心脏病)的发展和/或导致病变的减轻、减退或消退。本领域技术人员应该理解，各种方法和测定可用来评价病变的发展，并且类似地，各种方法和测定可用来评价病变的减轻、减退或消退。

如本文所用的，术语“预防”指在可处于疾病的风险，但尚未被诊断为患有疾病的受试者中阻止疾病、障碍或病症的发生。

如本文所用的，术语“受试者”包括哺乳动物，优选罹患病变的任何年龄的人。优选地，该术语涵盖处于发生病变的风险中的个体。

根据一个具体的实施方案，心脏病是缺血性心脏病。

缺血性心脏病指缺乏流向心脏或其部分的氧，导致心肌缺血性损伤。如本文所用的，短语心肌缺血性损伤包括通过减少流向心肌的血液引起的损伤。缺血性心脏病和心肌缺血性损伤的病因的非-限制性实例包括：主动脉舒张压降低、心室内压和心肌收缩力增加、冠状动脉狭窄(例如，冠状动脉结扎、固定冠状动脉狭窄、急性斑块改变(例如，破裂，出血)、冠状动脉血栓形成、血管收缩)、主动脉瓣狭窄和回流，和右心房压力增加。心肌缺血和心肌缺血性损伤的不利作用的非-限制性实例包括肌细胞损伤(例如，肌细胞细胞损失、肌细胞肥大、肌细胞细胞性增生)、心绞痛(例如，稳定性心绞痛、变异型心绞痛、不稳定性心绞痛、心源性猝死)、心肌梗塞，和充血性心力衰竭。由于心肌缺血的损伤可以是急性或慢性的，且后果可包括疤痕形成、心脏重新塑造、心脏肥大、壁变薄、扩张，及相关功能变化。急性或慢性心肌损伤和/或心肌缺血的存在及病因可使用本领域熟知的各种方法和技术的任何一种诊断，包括，例如非-侵入性成像(例如，MRI、超声心动图)、血管造影、压力测试、心脏-特异性蛋白例如心脏肌钙蛋白测定，及临床症状评价。这些方法和技术以及其它适宜的技术可用来确定哪些受试者是用于本文描述的治疗方法的合适候选者。

根据一个具体的实施方案，本发明的缺血性心脏病包括，例如，冠状动脉硬化、急性心肌梗塞(AMI)、心肌梗塞(MI)、陈旧性MI、心绞痛(AP)包括稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛，和劳力性心绞痛、缺血性心肌病、心力衰竭，及导致因长期缺血造成的心脏肌肉坏死的其它疾病。随着心脏肌肉坏死的进展，损伤的心肌组织被纤维组织替代，梗死区心肌壁厚度变薄，因而心脏内腔扩张，因此心脏功能例如收缩性下降并导致心力衰竭。

冠状动脉硬化以供应营养至心脏的冠状动脉的动脉硬化为特征。心绞痛以由冠状动脉的血流受损而引起的胸痛发作为特征。心肌梗塞以由冠状动脉的血流受损和由伴随而来的致命并发症例如心律失常、心力衰竭、心脏破裂，和泵衰竭引起的心肌坏死为特征。流向心脏(一个至关重要的器官)的血流受损是这些缺血性心脏病的基本特征。

"梗死后心肌重新塑造"指诸如非-梗塞部位的心肌细胞肥大，间质组织(细胞外基质)增加，和心腔扩大的一系列变化，这作为补偿由心肌梗塞后的梗塞部位增厚导致的心脏功能降低而发生。由于心肌梗塞后的长期预后与左心室功能不全的程度相关，心肌重新塑造的抑制对于维持和保留左心室的功能是重要的。

本发明的一些实施方案的药剂(例如，聚集蛋白肽)可本身，或以其与合适的载体或赋形剂混合的药用组合物给予生物体。

如本文所用的"药用组合物"指本文描述的一种或多种活性成分与其它化学组分例如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药用组合物的目的是促进化合物给予生物体。

本文术语"活性成分"指对生物效应负责的药剂(例如，聚集蛋白肽)。

下文可互换使用的短语"生理学上可接受的载体"和"药学上可接受的载体"指对生物体不引起显著刺激作用且不消除所给予化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。辅助剂被包括在这些短语中。

本文术语"赋形剂"指加入到药用组合物以进一步促进活性成分的给予的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

用于配制和给予药物的技术可以参见“Remington’s PharmaceuticalSciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版，其通过引用结合到本文中。

合适的给药途径可，例如，包括口服、直肠、经粘膜，特别是经鼻、肠内或胃肠外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、静脉内、腹膜内、鼻内，或眼内注射。

或者，可以局部而非全身方式给予药用组合物，例如，药用组合物经由直接注射进入患者的组织区域。例如通过直接心室内、心内，例如，至右或左心室腔内，至总冠状动脉内。也涵盖直接给予组合物至心肌例如，或者在开心脏术期间或者通过例如超声成像引导。

本发明的一些实施方案的药用组合物可通过本领域熟知的方法，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、封装、包埋或冻干方法制备。

因此，根据本发明的一些实施方案使用的药用组合物可以常规的方式，使用一或多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和辅助剂)配制，所述载体有利于将活性成分加工成可在药学上使用的制剂。合适的制剂取决于所选择的给药途径。

对于注射，药用组合物的活性成分可配制在水性溶液中，优选地在生理学上相容的缓冲液例如Hank’s溶液、Ringer’s溶液，或生理盐缓冲液中。对于经粘膜给药，适宜于待透过屏障的渗透剂被用于制剂中。这样的渗透剂一般是本领域已知的。

对于口服给药，药用组合物可通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体混合而容易地配制。这样的载体能够将药用组合物配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液剂、混悬剂等，用于由患者口服摄入。口服使用的药物制剂可使用固体赋形剂制得，任选地研磨生成的混合物，并在加入合适的辅助剂(如果需要)后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣片芯。合适的赋形剂尤其是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇，或山梨醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或藻酸或其盐例如藻酸钠。

糖衣片芯提供有合适的包衣。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可被加入到片剂或糖衣丸包衣中，用于鉴定或辨别活性化合物剂量的不同的组合。

可口服使用的药用组合物，包括由明胶制得的推入配合(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂，例如甘油或山梨醇制得的软的、密封胶囊。推入配合胶囊可含有与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉，润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可溶于或悬浮于合适的液体，例如脂肪油、液体石蜡，或液体聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。用于口服给予的所有制剂应呈适合于所选择的给药途径的剂量。

对于含服给药，组合物可采取以常规方式配制的片剂或糖锭剂的形式。

对于经鼻吸入给药，根据本发明的一些实施方案使用的活性成分以使用合适的抛射剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯-四氟乙烷或二氧化碳)，从加压包或喷雾器呈递的气溶胶喷雾剂的形式常规地递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供递送计量的量的阀确定。例如，用于分配器的明胶胶囊和药筒可被配制为含有化合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本文描述的药用组合物可被配制用于胃肠外给予，例如通过大剂量推注或连续的输注。用于注射的制剂可以单位剂型，例如以任选地加入防腐剂的安瓿或以多计量容器呈现。组合物可以是在油性或水性媒介中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并可含有配制剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

用于胃肠外给予的药用组合物包括水溶性形式的活性制剂的水性溶液。另外地，活性成分的混悬剂可制备为适宜的油基或水基注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂的粘性的物质，例如羧基甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，混悬剂也可含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解性的试剂，以使得制剂为高度浓缩的溶液。

备选地，活性成分可呈现为粉末形式，以在使用前用合适的媒介，例如无菌、无热原的水基溶液构成。

本发明的一些实施方案的药用组合物也可使用例如常规的栓剂基质例如可可酯或其它甘油酯配制成直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂。

适合用于本发明的一些实施方案背景中的药用组合物包括活性成分以有效实现预定目的的量包含于其中的组合物。更特别地，治疗有效量指活性成分(例如，聚集蛋白肽)有效预防、缓解或改善障碍(例如，缺血性心脏病)的症状或延长受治疗的受试者的存活的量。

治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。

对于用于本发明的方法的任何制剂，治疗有效量或剂量可最初从体外和细胞培养测定来估算。例如，剂量可在动物模型中配制以获得所需浓度或滴度。这样的信息可被用来更精确地确定在人中的有用的剂量。

本文描述的活性成分的毒性和治疗功效可由标准药物程序在体外、在细胞培养或实验动物中测定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。剂量可根据所用的剂型和所用的给药途径而变化。精确的制剂、给药途径和剂量可由个体医生根据患者的状况选择(见例如，Fingl, et al., 1975, "ThePharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1)中。

给药的量和间隔可单独调整以提供例如足以诱导或抑制生物学作用(最小有效浓度，MEC)的活性成分的心脏组织水平。对于每一制剂，MEC将是变化的，但可从体外数据估算。获得MEC所必需的剂量将取决于个体特征和给药途径。检测分析可被用来测定血浆浓度。

取决于要治疗的病症的严重性和响应，剂量可以单次或多次给予，疗程持续从几天至几周或直到实现治愈或实现疾病状态减轻。

要给予的组合物的量当然将取决于受治疗的受试者，病痛的严重性，给药方式，开具处方的医师的判断等。

所述药剂通过适宜方式递送给缺陷部位(例如，如上所述)。观察和测试所述部位和受试者的有缺陷心肌的再生以确定有效量的组合物已经递送，特别是观察新组织生长，并且还确定新组织具有使其可用作心肌起作用所必需的收缩性。组织生长和收缩性可通过标准手段，例如如在Badylak et al, The Heart Surgery Forum, Extracellular Matrixfor Myocardial Repair 6(2) E20-E26 (2003)中所述测试和观察。

本发明的一些实施方案的组合物，如果需要，可呈现在包装或分配器装置中，例如FDA批准的药剂盒，其可含有含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可附有给药说明书。包装或分配器也可容纳与容器相关的、由管控药物的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的告示，该告示反映所述机构对组合物形式或人或兽医给药的批准。这样的告示，例如，可以是由美国食品和药品管理局对处方药批准的标签或批准的产品插页。也可制备在相容的药用载体中配制的包含本发明制剂的组合物，置于适宜的容器中，并对适应病症治疗贴标签，如在上文进一步详述的。

如本文描述的药剂也可固定在其可以从中缓慢释放的植入物(例如，支架)上。

如本文描述的药剂可与其它治疗形式合并。这些其它治疗包括药物治疗(例如，降压药、钙通道阻断剂、洋地黄、抗-心律失常药、ACE抑制剂、抗-凝血剂、免疫抑制剂、止痛药、血管扩张剂等)、血管成形术、支架放置、冠状动脉搭桥移植、心脏辅助装置(例如，左心室辅助装置、球囊泵)、起搏器放置、心脏移植等。在某些实施方案中，药剂为等待接受心脏移植的受试者提供了康复的桥梁。

术语"包含"、"含有"、"包括"、"包括在内"、“具有”及其变化意指"包括，但不限于"。

术语“由…组成”意指“包括且限于”。

术语"基本上由…组成"意指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部件，但只有当另外的成分、步骤和/或部件不会实质性地改变所要求的组合物、方法或结构的基本和新颖特性时。

如本文所用的，单数形式"一个"、"一种"和"该"包括复数指代，除非文中另外清楚地指明。例如，术语"一种化合物"或"至少一种化合物"可包括多种化合物，包括其混合物。

贯穿本申请，本发明的各个实施方案可以范围形式呈现。应该理解，在范围形式中的描述仅仅是为了方便和简明，而不应被解释为对本发明范围的硬性限制，因此，范围的描述应被认为已具体公开所有的可能的子范围以及在该范围内的各个数值。例如，范围例如从1至6的描述应被认为已具体公开例如从1至3，从1至4，从1至5，从2至4，从2至6，从3至6等的子范围，以及在该范围内的各个数值，例如，1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度，这都适用。

每当本文指明数值范围时，则意味着包括在该指明的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一次指明的数字和第二次指明的数字“之间的范围”和“范围从”第一次指明的数字“至”第二次指明的数字在本文可互换使用并意欲包括第一次和第二次指明的数字以及在其之间的所有分数和整数数值。

如本文所用的，术语"方法"指完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括，但不限于，化学、药学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员已知，或所述专业人员从已知的方式、手段、技术和程序容易地开发的那些方式、手段、技术和程序。

当引用特定的序列表时，这样的引用应被理解为也涵盖基本上对应于其互补序列的序列，如包括由例如测序错误、克隆错误，或其它导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的改变生成的微小序列变异，只要这样的变异的频率少于1/50的核苷酸，或者少于1/100的核苷酸，或者少于1/200的核苷酸，或者少于1/500的核苷酸，或者少于1/1000的核苷酸，或者少于1/5,000的核苷酸，或者少于1/10,000的核苷酸。

要理解，为了清楚起见在分开实施方案的背景下描述的本发明的某些特征也可在单一实施方案中组合提供。反过来，为了清楚起见在单一实施方案的背景下描述的本发明的各个特征也可分开地或以任何合适的亚组合或作为适合于任何其它描述的本发明实施方案提供。在各个实施方案的背景下描述的某些特征并不认为是那些实施方案的必要特征，除非没有那些要素，所述实施方案无法实施。

如上文描述的和如在所附权利要求书部分所要求的本发明的各个实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。

实施例

现在与以上描述一起，参照以下实施例，以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。

一般来说，本文所用的命名和本发明所用的实验程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中有充分的解释。参见例如"Molecular Cloning: Alaboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in MolecularBiology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "CurrentProtocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons,New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books,New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series",Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；如在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中提出的方法；"CellBiology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique", Freshney, Wiley-Liss,N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-IIIColigan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and ClinicalImmunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell andShiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman andCo., New York (1980)；可获得的免疫分析在专利和科学文献中有广泛的描述，参见例如美国专利号3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517;3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876;4,879,219; 5,011,771和5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed.(1984); “Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds.(1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds.(1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cellsand Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal, B., (1984)和"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCRProtocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego,CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification andCharacterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；所有文献通过引用结合到本文中，如同在本文中全面阐明一样。本文通篇提供其它一般的参考。其中的程序相信是本领域熟知的并为读者方便而提供。其中含有的所有信息通过引用结合到本文中。

实施例1

材料和方法

心脏细胞的分离

根据制造商的说明书，使用新生儿解离试剂盒(gentleMACS)从ICR 1-天龄(P1)和7-天龄(P7)小鼠分离原代心脏细胞，并于37℃和5 % CO₂下，在明胶-涂布的(0.02 %,G1393, Sigma)孔中，用补充有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非-必需氨基酸、青霉素、链霉素、5 %马血清和10 % FBS的DMEM/F12培养基培养。在涉及给予或者c-末端重组聚集蛋白(550-AG)(R&D Systems)、ECM片段或者广泛MMP抑制剂(GM6001, 马立马司他)的实验中，在处理前使细胞粘附48 h。随后，用不含FBS的培养基(含5 %马血清和指定的处理剂量)替换所述培养基，持续72 h。细胞在4 %多聚甲醛(PFA)中固定并对关注的标记物染色。

心脏衍生的ECM的制备

从ICR小鼠(1和7天龄)取出心脏，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。使心脏包埋在最适切割温度溶液(OCT, tissue-tek)中并于-20℃冷冻。使用低温恒温器(cryostat)将心脏横切成100 µm片段。于室温下，将器官片段浸没在双蒸馏水(DDW)中的2 % Triton X-100和20 mM EDTA溶液中过夜。然后用PBS洗涤基质，随后为灭菌置于10 %青霉素-链霉素两性霉素B溶液(Biological industries)中，直至放置细胞。在基质给予之前，片段用不含FBS的细胞培养基(如前所述)洗涤并使用gentleMACS M管(Miltenyi Biotec Inc)匀化。然后将基质加入到细胞培养物中。

组织培养物免疫染色

使粘附的细胞在明胶-涂布的96孔板上生长。用在PBS中的4 % PFA固定细胞10分钟并用在PBS中的0.2 % Triton X-100渗透5分钟。于室温下，通过在含0.1 % Triton和3 %BSA的PBS中孵育1小时封闭细胞。对于免疫染色，使细胞与在封闭液中稀释的以下单克隆抗体一起孵育2小时：抗-cTnT (1:200, ab33589, Abcam)和抗-cTnI (1:200, ab47003,Abcam)抗体被用来鉴定CM。抗-Ki67 抗体(1:200, 275R, Cell Marque)、抗-磷酸化-组蛋白3 (pH3) (1:200, SC-8656-R, Santa Cruz Biotechnology)和抗-aurora B (Aim1, 1:100, 611082, BD Transduction Laboratories)抗体被分别用来分析细胞-周期再进入、DNA合成、核分裂和胞质分裂。然后用PBS洗涤细胞3次并于室温下用合适的第二抗体染色45分钟。随后用DAPI (4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)染色5分钟。细胞在Nikon荧光显微镜下观察.

定量实时RT-PCR-

根据制造商的方案，使用nucleospin RNA II试剂盒(Macherey Nagel)分离总RNA。根据制造商的方案，通过使用High Capacity cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems)合成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)在Steponeplus实时PCR系统(Applied Biosystems)上执行qRT-PCR。对特异性基因的值归一化为HPRT管家对照。引物序列在下表3中提供。

表3

蛋白质印迹分析

蛋白质印迹用SDS-PAGE电泳系统(SDS-PAGE Electrophoresis System)执行。制备总心脏组织提取物，并转移至PVDF膜。使用以下第一抗体：抗-Agrn (sc-374117, SantaCruz)、抗α-肌营养不良蛋白聚糖(05-298, Millipore)、抗-Gapdh (2118, Cellsignaling technologies)、抗-cTnT (ab33589, Abcam)和抗-cTnI (ab47003, Abcam)、抗-ERK2 (sc-154, Santa Cruz)、抗-磷酸-ERK (no. 4370, Cell signaling)、抗α-微管蛋白(T5168, Sigma-Aldrich)。辣根过氧化物酶抗-小鼠、抗-兔或抗-山羊(Sigma)被用作第二抗体。

免疫荧光分析

心脏切片在EDTA或柠檬酸缓冲液中进行去石蜡化和微波抗原修复，接着逐渐冷却。样本用在PBS中的0.5 % Triton X-100渗透5 min并于室温下用含0.1 % Triton的PBS中的5 %牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h。然后于4℃使样本与在3 % BSA封闭液和1 %马血清中稀释的以下抗体一起孵育过夜。抗-cTnT (1:200, ab33589, Abcam)和抗-cTnI (1:200,ab47003, Abcam)抗体被用来鉴定CM。抗-Ki67抗体(1:200, 275R, Cell Marque)、抗-磷酸化-组蛋白3 (pH3) (1:200, SC-8656-R, Santa Cruz Biotechnology)和抗-aurora B(Aim1, 1:100, 611082, BD Transduction Laboratories)抗体被分别用来分析细胞-周期再进入、DNA合成、核分裂和胞质分裂。用于该研究的其它抗体有：抗-Agrn (1:200, sc-374117, Santa Cruz)、抗磷酸-ERK2 (1:200, M8159, Sigma Aldrich)。用PBS洗涤3次(每次10 min)后，于室温下用荧光第二抗体(Abcam)染色样本1 h，接着为了核可视化，用DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)染色10 min。玻片用Immu-mount (9990412, ThermoScientific)封固并在荧光显微镜(Nikon Intensilight或Nikon eclipse 90i, Nikon)或旋转盘共焦显微镜(Carl Zeiss)下观察。

小鼠实验

实验由魏茨曼科学研究所动物护理和使用委员会(Animal Care and UseCommittee of the Weizmann Institute of Science)批准。为追踪心脏肌肉细胞谱系，使αMHC–Cre和ROSA26–tdTomato小鼠杂交。αMHC-Cre小鼠携带在α肌球蛋白重链启动子(αMHC)后插入的Cre编码序列，所述启动子可驱动CM中的高效基因重组。ROSA26–tdTomato指示剂小鼠具有有条件的红色荧光蛋白变异等位基因，其需要CRE-介导重组用于表达。这个系统使得培养物中RFP-标记的CM清晰可视化。ROSA26–tdTomato和αMHC-Cre小鼠维持在C57BL/6背景上。为测试聚集蛋白在心脏再生中的作用，使Agrn ^flox/flox (43)与Agrn ^flox/flox杂交；Mesp1-Cre小鼠(44)。Mesp1在早期原肠胚形成过程中在新生的中胚层中表达并且标记包括绝大多数心脏细胞(CM、成纤维细胞和内皮细胞)的大多数心脏的祖先群体。条件性敲除小鼠允许了解聚集蛋白对新生幼崽(P1)的心脏再生的贡献。

心肌梗塞

在P7或成年阶段的心肌梗塞是由左前降支冠状动脉结扎引起的。通过在冰床上冷却4 min麻醉P7小鼠，而成年小鼠用异氟烷(Abbott Laboratories)镇静，气管插管后，进行人工通气。经皮肤切开后，通过肋间肌肉的钝器解剖在第三肋间隙进行侧胸切开术。在左前降支冠状动脉结扎后，心肌内注射聚集蛋白(50 µl，20 µg/ml)或给予PBS。处理后，胸壁切口用6.0不可吸收的丝线缝合，而皮肤伤口使用皮肤粘合剂封闭。然后温热小鼠几分钟直至恢复。

超声心动图

心脏功能通过使用Vevo 770 VisualSonics装置，对服用镇静剂的小鼠(异氟烷,Abbott Laboratories)执行经胸廓超声心动图来评价。

组织学

将小鼠心脏组织在4 %多聚甲醛(PFA)中固定并切片。为了分析心肌梗塞手术后幼稚和成年心脏再生，将石蜡切片从顶端到基部贯穿整个心室切割成0.4 mm间隔的系列切片。为了分析切除术后的新生鼠心脏再生，从正面切割石蜡切片，在每个切片中包括基部至顶端。苏木精-曙红(H&E)、马森氏三色和天狼星红染色根据标准程序执行并用来检测纤维化。疤痕大小在包含乳头肌区域的切片中，使用基于马森氏三色染色的ImageJ软件量化。成年和幼稚疤痕大小被计算为相对于总切片大小的疤痕大小，而新生疤痕大小被计算为相对于LV大小的疤痕大小。

实施例2

P1心脏ECM以MMP依赖性方式增加CM增殖

在小鼠中的再生时间框架期间，测定心脏ECM对CM更新的影响{Porrello, 2011 #11}。为了该目的，使P1和P7心脏经历去细胞化(图1A)以产生无细胞的ECM片段，如经DAPI染色和扫描电镜所证实的(图1B-C)。体外给予P1 ECM片段促进P1和P7 CM细胞-周期活性的增加，而P7 ECM片段减少细胞周期再进入(图1D-F)。

为了更深入地了解P1 ECM诱导CM增殖的机制，将广泛MMP抑制剂(马立马司他)施用于培养物。将该抑制剂加入到含从P1心脏衍生的ECM片段的CM培养物中，通过P1 ECM外植体破坏CM增殖的激活(图1G-H)。将抑制剂加入到对照培养物或者具有从P7心脏衍生的ECM片段的培养物中，并不影响CM增殖率(图1G-H)。

为证实MMP2/9涉及释放诱导CM增殖的ECM-相关肽，采用在ECM片段的存在下将底物胶原1型(Col1)、胶原4型(Col4)或明胶的裂解测量成荧光信号的原位酶谱法(ISZ)测定(图1N)。在3种底物中观察到的最高变化是Col4和明胶，提示涉及到MMP、MMP2/9的明胶酶家族(图1O-P)。

其次，为测试由MMP2/9裂解的P1 ECM中的特定配体/肽是否足以促进CM增殖，使P1ECM与MMP2、MMP9或MMP12一起孵育(图1I)。用MMP2/9消化的P1 ECM外植体导致P1 (图1J)或者P7 (图1K)细胞的CM增殖的显著增加，而MMP12裂解的配体导致CM增殖的增加，尽管较低。

为鉴定对CM增殖增加有贡献的独特的P1 ECM相关蛋白，MMP9裂解的P1和P7 ECM相关蛋白通过质谱(LC/MS)分析(图1L)。这种技术鉴定了先前报道的Tgfbi的贡献，一种显示促进CM增殖的骨膜蛋白(Periostin)的旁系同源物[12,45]。在P1对比P7中富集的其它ECM蛋白包括Col18a1 (内皮抑素)和Vcan (图1M)。此外，聚集蛋白，一种ECM HSPG，被鉴定为相对于P7 ECM外植体在P1中富集(图1M)。最后，观察到的表达水平的变化通过qRT-PCR在P1和P7全心脏中验证，这与蛋白质组分析的结果一致(图1M)。综合来说，一种剖析ECM相关的CM增殖-促进分子的新方法被证实，且P1而不是P7心脏ECM的MMP2/9重新塑造可导致这些促进体外CM增殖的配体的随后释放。

实施例3

心内/内皮衍生的聚集蛋白促进CM增殖

然后测试聚集蛋白在心脏中的表达水平{Moll, 2001 #111; McKee, 2009 #112}。免疫荧光分析验证了先前的结果，显示P7心脏与P1比较的聚集蛋白表达(RNA和蛋白)的下调(图2A-C)。其次，产生聚集蛋白的细胞群被鉴定。为做到这一点，将P1心脏细胞分离为3个不同的群：CM、成纤维细胞(FB)和内皮细胞(EC)。使用对每个细胞群的已知标志物(分别为αMHC, CD90和CD31，图2I)的qPCR证实CM、FB和EC细胞群的富集。在EC群体中的聚集蛋白mRNA表达相对于所有其它细胞类型显著更富集(图2D)。在生命第一周期间的聚集蛋白表达的减少与小鼠中心脏再生响应的丧失有关，因此，可提示聚集蛋白在再生过程期间的作用(如在图3A-O中所示)。

然后测定聚集蛋白诱导培养物中的CM增殖的能力。聚集蛋白处理导致CM增殖的剂量-依赖性增加，如通过对细胞-周期活性(Ki67)、有丝分裂(磷酸-组蛋白H3)和胞质分裂(Aurora B激酶)的标志物的免疫荧光染色，和通过在P1和P7新形成的CM的计数所测量的(图2E-H)。

实施例4

聚集蛋白为新生小鼠心脏再生所需要

为了解出生时在外科切除术后聚集蛋白是否为心脏再生所需{Porrello, 2011 #11; Porrello, 2012 #38}，在大多数心脏细胞群中，通过使Mesp1-Cre ^+/- ；聚集蛋白 ^flox/+ {Harvey, #113; Kitajima, 2006 #114}与聚集蛋白 ^flox/flox 小鼠(图3A)杂交有条件地缺失聚集蛋白。聚集蛋白蛋白和mRNA在Mesp1-Cre ^+/- ；聚集蛋白 ^flox/flox (聚集蛋白-cKO)心脏中的表达的分析证实聚集蛋白flox等位基因在心脏中被有效地缺失(图3B-D)。有趣的是，在P1时，聚集蛋白-cKO小鼠表达升高的肌节蛋白(cTnT和cTnI) (图3C)，伴有如通过cTnT染色所示的肌节组构的显著增加(图3H)。WGA膜染色揭示心脏细胞尺寸有小的增加(图3E-F)，其与病理性肥大{Houweling, 2005 #115; Ye, 2003 #116}{Baum, 2011 #12}标志物、骨骼-肌动蛋白(Acta1) {Black, 1991 #117} (图3G)升高一致。而且，CM细胞周期活性在聚集蛋白-cK小鼠出生后显著减少(图3H-I)。这些结果提示聚集蛋白抑制CM成熟化过程并在聚集蛋白缺乏时，CM显示用于心脏肥大和增加分化的补偿机制。

其次，研究了心脏再生是否在聚集蛋白-cKO小鼠中受损的问题。为此，对经受心脏切除术和心脏再生的P1小鼠在1和4周后进行评价(分别通过增殖或通过纤维化) (图3J)。使用马森氏三色和天狼星红染色的组织学检查显示出聚集蛋白-cKO小鼠相对于野生型同窝出生仔鼠的纤维化升高(图3K-M)。根据这些结果，CM增殖在聚集蛋白cKO小鼠中显著地减少(图3N)。总起来说，本结果提示聚集蛋白作为心脏再生期间的至关重要的成分并提示它可在出生后的第一周期间作为CM分化的抑制剂发挥作用。

实施例5

聚集蛋白处理促进MI后的心脏再生

其次，研究了聚集蛋白是否可类似地促进幼稚和成年阶段中CM增殖和心脏再生的问题。因此，P7和P85小鼠经受用聚集蛋白或PBS处理的左前降支动脉(LAD)的永久结扎(图4A)。心肌内注射聚集蛋白(1 µg在50 µl中)在邻近幼稚和成年心脏梗塞区域的健康心肌内诱导CM细胞周期再进入(图4B-E)。在MI后，单次聚集蛋白注射足以在幼稚和成年二种模型中改善心脏功能的恢复，如通过超声心动图所显示的(图4F-G)。此外，幼稚和成年聚集蛋白处理的小鼠都显示出壁厚的显著保持力并防止扩大的心肌病，与PBS处理的小鼠相反(图4F-G)。幼稚和成年二者的组织学分析揭示纤维化的显著减少，虽然纤维化组织存在于两种处理中(图4H-I)。总起来说，本结果表明，将聚集蛋白再引入衰弱心脏促使心脏再生，由于增加CM细胞周期活性和胞质分裂及随之而来的疤痕减少和更好的心脏功能。

实施例6

聚集蛋白通过Dag1和ERK激活促进CM增殖

先前有关聚集蛋白信号传导的报道暗示Na⁺/K⁺泵、Lrp4-Musk或α-肌营养不良蛋白聚糖抑制作为调节其活性的可能的受体。聚焦于小鼠MI后的心脏再生的早期工作已经确立，Lrp4和MuSK的心脏mRNA转录水平是非常低的{Haubner, 2012 #130}。而且，已显示聚集蛋白可经由与CAF22片段的直接相互作用抑制Na⁺/K⁺泵，因而影响CM搏动{Hilgenberg,2009 #103}。心脏功能的改善可归因于几个方面，其中之一是心肌搏动的同步性{Abraham,2002 #118; Sullivan, 1989 #119}，以及成年CM增殖。未观察到通过抑制泵所致的CM增殖增加(图5J)。因此提示聚集蛋白信号传导由CM中的Dag1介导。因此推测聚集蛋白信号传导由CM中的Dag1介导。为此，本发明人打算鉴定表达潜在与聚集蛋白相互作用的Dag1的细胞群。对于Dag1，使用qPCR揭示在从P1心脏分离的所有细胞类型中的表达，然而其表达尤其在CM中富集，这种富集在P8心脏培养物中变得更加明显(图5A-C)。聚集蛋白活性在单核细胞成熟化期间已与ERK激活相关{Aurora, 2014 #125}。类似地，本发明人观察到在体外聚集蛋白处理后的短暂ERK激活，在5分钟时达到高峰，在心脏细胞培养物处理后持续激活至多15分钟，如通过蛋白质印迹法和免疫荧光测定的(图5D-E)。其次，检查了聚集蛋白与Dag1的相互作用及其对ERK激活的需要的问题。确实，加入针对Dag1-聚集蛋白结合位点的封闭抗体(IIH6C4) {Aurora, 2014 #125}减少聚集蛋白-诱导的ERK激活(图5F)。此外，为了解聚集蛋白与Dag1的相互作用和随后的ERK激活是否为聚集蛋白诱导的增殖所需，将IIH6C4抗体和MEK抑制剂(PD0325901)加入到P7 CM细胞培养物中并分析CM增殖(图5G-H)。如所预期的，ERK激活或Dag1-聚集蛋白相互作用的抑制阻止了聚集蛋白诱导的CM增殖。

此后，本发明人需要检查聚集蛋白-肌营养不良蛋白聚糖信号是否通过肌养蛋白扩大，为此采用其中肌养蛋白表达被消除的mdx小鼠[55]。

来自对照和Mdx小鼠的心脏细胞经培养并用聚集蛋白处理。由聚集蛋白诱导的CM增殖在两种类型的小鼠之间没有变化(图5I)。总起来说，聚集蛋白以肌养蛋白-非依赖性方式，经由与Dag1的相互作用和随后的ERK激活而诱导CM增殖。

实施例7

体外聚集蛋白给予促进人iPSC-衍生的CM增殖

为了解聚集蛋白是否可促进从人体组织衍生的细胞中的CM增殖，将聚集蛋白加入到人iPSC衍生的CM (hiPSC-CM)中并通过增殖标志物检查。体外给予聚集蛋白促进hiPSC-CM细胞-周期活性的剂量-依赖性增加(图6A-B)。同样，体外给予人聚集蛋白促进hiPSC-CM细胞-周期活性的剂量-依赖性增加(图6C-D)。

实施例8

聚集蛋白处理的心脏的RNA-seq揭示聚集蛋白免疫-相关机制的牵连

为评价聚集蛋白在梗塞的心脏中的基因组范围的转录作用，执行聚集蛋白处理的MI心脏的RNA-seq分析。成年(3月龄)小鼠经受LAD结扎或假手术(见图4A)。LAD结扎的动物在MI后立即用聚集蛋白或者PBS (媒介)经心外肌膜(epimyocardialy)注射(图8A)。在处理后3天收集心脏，并纯化RNA样本和经受RNA-seq。对用PBS或聚集蛋白处理的梗塞心脏的基因组范围的表达进行比较。175个基因为差异表达(倍数变化的阈值>1.5, p-值<0.05, 见图8B)。为聚焦于相关的转录作用，本数据与先前建立的、由Ounzain et al执行的野生型梗塞心脏的RNA-seq比较。心肌梗塞后心脏转录组的基因组范围的概况分析鉴定了新的心脏-特异性的非-编码长RNA。Eur Heart J 36, 353-368a, doi: 10.1093/eurHeartj/ehu180(2015)。

这种比较允许定义在未处理的梗塞心脏中差异表达的普通基因，用作“MI标志物”。已发现558个基因在梗塞的心脏中差异表达(大多数上调) (与假手术心脏比较)，二者均在当前的设置和Ounzain’s数据集内(图8C)。考虑到在用聚集蛋白处理的梗塞心脏中的这些基因，发现它们中的大多数在聚集蛋白处理的心脏中显示出与PBS处理的心脏比较的相反趋势(图8C)，指示这些基因包含聚集蛋白-影响的转录的网络。

为洞察这种基因集描绘的细胞和分子过程，使用创新途径分析(IPA)软件分析基因集。有趣地，考虑到两种规范的途径(图8D)和上游调节剂(图8E)，发现许多与MI-相关的免疫响应的调节相关；即，已知Il6促进心肌细胞凋亡，Tgf-β已完全确立为纤维化促进剂，并且也涉及调节免疫细胞迁移和成熟(白细胞外渗信号传导、树突状细胞成熟)的几种规范途径。涉及不同的富集条目的基因的实例在图8F-H中给出。总起来说，该数据提示聚集蛋白不仅通过心肌细胞增殖，而且还通过免疫调节促进心脏再生，这可改变心肌细胞存活，从而减少梗塞和疤痕大小。

虽然本发明已结合其特定实施方案进行了描述，显然许多备选、修饰和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，打算涵盖所有这样的落入所附权利要求书的精神和宽泛范围内的备选、修饰和变化。

本申请提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体在此结合到说明书中，如同各个独立的出版物、专利或专利申请特别地和单独地指明通过引用结合到本文中的程度一样。此外，本申请中的任何参考文献的引用和标识不应视为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术获得。对于章节标题使用的程度，不应将它们视为必要的限制。

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Claims (6)

1.治疗有效量的诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽在制备用于治疗心脏病的药物中的用途，其中所述聚集蛋白肽不是融合多肽的部分并且其中所述聚集蛋白肽包含层粘连蛋白G-样1结构域(G1)、层粘连蛋白G-样2结构域(G2)和层粘连蛋白G-样3结构域(G3)。

2.权利要求1的用途，其中所述聚集蛋白肽呈可溶性形式。

3.权利要求1或2的用途，其中所述心脏病是缺血性心脏病。

4.一种包含诱导心肌细胞增殖的聚集蛋白肽的可植入装置，其中所述聚集蛋白肽不是融合多肽的部分并且其中所述聚集蛋白肽包含层粘连蛋白G-样1结构域(G1)、层粘连蛋白G-样2结构域(G2)和层粘连蛋白G-样3结构域(G3)。

5.权利要求4的装置，其中所述聚集蛋白肽诱导免疫调节。

6.权利要求4或5的装置，其中所述聚集蛋白肽呈可溶性形式。

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