ES2949348T3 - Un método para inducir la proliferación de cardiomiocitos y tratar enfermedades del corazón - Google Patents

Abstract

Se proporciona un péptido Agrin que induce la proliferación de cardiomiocitos para tratar una enfermedad cardíaca. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un método para inducir la proliferación de cardiomiocitos y tratar enfermedades del corazón

CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a métodos para inducir la proliferación de cardiomiocitos y a los métodos para tratar enfermedades del corazón.

Las enfermedades cardíacas y, en particular, el infarto de miocardio (MI), son la principal causa de muerte en el mundo. La gravedad de la enfermedad cardíaca se debe a la naturaleza post-mitótica de las células del músculo cardíaco adulto de los mamíferos: los cardiomiocitos (CMs) {Bergmann, 2009 #9; Senyo, 2013 #86} y su capacidad limitada para reponer el tejido dañado {Poss, 2007 #30; Ausoni, 2009 #17}. Por el contrario, la proliferación extensa de CM y, posteriormente, la regeneración cardíaca robusta se produce en vertebrados inferiores tales como el tritón {Ausoni, 2009 #17} y el pez cebra {Poss, 2007 #30; Jopling, 2010 #68; Ausoni, 2009 #17}. De manera similar, el reingreso de CM murino neonatal es suficiente para reparar el miocardio dañado después de una lesión; sin embargo, esta capacidad se ve muy disminuida durante la primera semana después del nacimiento {Porrello, 2011 #11; Porrello, 2012 #38}. Durante este tiempo, hay una transición en la ploidía de CM de mono a bi-nucleación, simultáneamente con un cambio de hiperplasia (aumento en el número de células) a hipertrofia (aumento en el tamaño de las células) {Li, 1996 #61; Soonpaa, 1998 #89}. La lesión cardíaca inducida en ratones el día del nacimiento da como resultado una regeneración casi completa; sin embargo, esta capacidad disminuye hacia el día 7. En este momento, la cicatriz fibrótica puntual domina la reposición del tejido muscular a través de la proliferación de CM {Porrello, 2011 #11}, lo que conduce a una función cardíaca deteriorada {Weisman, 1988 #90}. Muchos estudios se centran en la proliferación de CMs endógenos para contribuir a la regeneración del corazón. Recientemente, se demostró que los CMs adultos pueden volver a entrar en el ciclo celular y proliferar mediante la modulación de varias vías, tales como: FGF1 acompañado de inhibición de P38 {Engel, 2006 #127}, Periostina extracelular {Kuhn, 2007 #28}, NRG1 a través de Erbb2 {D'Uva, 2015 #99; Bersell, 2009 #128} Inhibición del Hippo {Heallen, 2013 #100} e inhibición del regulador del ciclo celular Meis1 {Mahmoud, 2013 #80}.

Las patologías del corazón, principalmente el MI, a menudo se acompañan de remodelación de la ECM, principalmente deposición de una cicatriz rígida que reduce la función cardíaca {Weisman, 1988 #90; Baum, 2011 #12; Bayomy, 2012 #3}. Las alteraciones en la estructura de la ECM después de una lesión se atribuyen a la actividad de las metaloproteasas de matriz (MMPs) {Phatharajaree, 2007 #92}, principalmente la familia de las gelatinasas, MMP2 y MMP9 {DeCoux, 2014 #91}. La eliminación de MMP2 {Hayashidani, 2003 #94} o MMP9 {Ducharme, 2000 #93} después del MI atenuó la remodelación de la ECM y mejoró la función cardíaca general. A pesar de los efectos adversos de la remodelación de la ECM después de una lesión cardíaca, la ECM juega un papel integral en la migración celular {Ridley, 2003 #95; Berk, 2007 #97}, la diferenciación {Shamis, 2011 #18; Streuli, 1999 #96} y la proliferación {Berk, 2007 #97} de cualquier tipo de célula.

Mediante la utilización de la descelularización de la ECM y la solubilización ácida de la ECM cardíaca fetal, neonatal y adulta, se demostró que la ECM cardíaca contribuye de manera significativa a la regulación de la proliferación de CM {Williams, 2014 #84}. Sembrada en células neonatales, la ECM derivada de edades fetales y neonatales mostró niveles de proliferación más altos en comparación con la ECM derivada de adultos {Williams, 2014 #84}. Aunque se demostró que la manipulación de los factores intrínsecos de CM expande la capacidad proliferativa del corazón de los mamíferos {D'Uva, 2015 #99; Mahmoud, 2013 #80; Heallen, 2013 #100}, las funciones del entorno extracelular o sus componentes en la regeneración cardiaca sigue sin estar clara.

La agrina es un proteoglicano de sulfato de heparán extracelular (HSPG) con un tamaño de proteína central de 210 kDa {Williams, 2008 #71}. La forma neural de la agrina (n-Agrin) ha sido ampliamente investigada debido a su participación en la agregación de los receptores de acetilcolina (AChRs) a través del complejo receptor Lrp4-(MuSK) de la quinasa específica del músculo {Burden, 2013 #76}. La expresión elevada de agrina no neuronal se ha correlacionado con varios tipos de carcinoma {Theocharis, 2010 #102} y, más recientemente, se ha implicado en la progresión del carcinoma hepatocelular (HCC) mediante el control de la motilidad y la proliferación de células a través de la interacción con Lrp4 {Chakraborty , 2015 n.° 101}. Además, se ha demostrado que un pequeño fragmento de agrina (el péptido C-terminal de 22 kDa, CAF22) se une e inhibe los canales de Na+ K+ que modulan el latido de CM {Hilgenberg, 2009 #103}, de manera similar a la digoxina, un fármaco comúnmente tomado después de varios episodios cardíacos {Hilgenberg, 2009 #103; Schwinger, 2003 #104}. Un estudio reciente se centró en la interacción de agrina con el complejo de distroglicano como un componente clave en los procesos de inmunidad innata, y es necesario para la diferenciación de monocitos y macrófagos a través de la interacción con Grb2 y la posterior activación de ERK {Mazzon, 2012 #73}.

El distroglicano comprende dos unidades (a y p) {Henry, 1996 #105} y actúa como un puente transmembrana que conecta los componentes de la ECM (tal como agrina, laminina y Perlecan) con el mioesqueleto interno de las células del músculo al interactuar con la Distrofina y su complejo asociado. {Henry, 1996 #105; Davies, 2006 #106; Ervasti, 1990 #108}. La interrupción del complejo de Distrofina es la principal causa de varias distrofias musculares, incluyendo la distrofia muscular de Duchenne {Davies, 2006 #106; Campbell, 1989 #107; Ervasti, 1990 #108}. Los ratones que carecen de Distrofina (Mdx), presentan un recambio de CM elevado en el modelo de cardiomiopatía no isquémica {Richardson, 2015 #110}; Por el contrario, un estudio reciente que empleó la resección del corazón el día 1 después del nacimiento en ratones Mdx reveló una respuesta regenerativa dañada y una fibrosis elevada en relación con los ratones de tipo nativo {Morikawa, 2015 #109}. No obstante, el papel de agrina, distroglicano y sus elementos posteriores nunca se ha estudiado en el contexto de la regeneración cardíaca.

Antecedentes de la técnica adicionales incluyen:

Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20070014871

Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20100095387

Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20060223753

Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20140377212

Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20110104120

Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20070014733

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un péptido de agrina para su uso como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y/o científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o en ensayos de realizaciones de la invención, a continuación, se describen métodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, prevalecerá la especificación de la patente, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitativos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIVERSAS VISTAS DE LOS DIBUJOS

Algunas realizaciones de la invención se describen en la presente memoria, sólo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de las realizaciones de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente a los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

Figuras 1A-M muestran que la ECM cardíaca en P1 aumenta reingreso en el ciclo celular de CM de una manera dependiente de MMP. (Figura 1A) Diseño experimental para la contribución de ECM al reingreso en el ciclo celular de CM en cultivos en P1 y P7. (Figura 1B) Las secciones del corazón se tiñeron con DAPI para evaluar la eliminación de células. (Figura 1C) Se tomaron imágenes de las secciones mediante SEM, las muestras tratadas están libres de componentes celulares. (Figura 1D) Campos representativos de cultivos de corazón teñidos con DAPI (azul) cTNT (verde) y Ki67 (rojo). Las flechas blancas muestran células Ki67+/cTNT+. (Figuras 1E-F) P1 (Figura 1E) o P7 (Figura 1F) porcentaje de proliferación de CMs en respuesta a la ECM del día 1 y el día 7. (Figuras 1G-H) P1 (Figura 1G) o P7 (Figura 1H) porcentaje de proliferación de células (Ki67+/cTNT+) de CM en respuesta a la ECM del día 1 y el día 7 con o sin inhibidor amplio de MMP (marimastat). (Figura 1I) Esquema de la contribución de fragmentos de ECM derivados de MMP a la actividad del ciclo celular de CM. (Figuras 1J-K) Porcentaje de CMs que proliferan en P1 (Figura 1J) o P7 (Figura 1K) en respuesta a la presencia de sustratos escindidos por MMP9/12 de fragmentos de ECM del día 1 y el día 7. (Figura 11) Diagrama de Van que muestra los resultados de LC/MS. (Figura 1M) Análisis de PCR cuantitativo (qPCR) de genes obtenidos de LC/MS en lisados de corazón completo en P1 y P7.

Figuras 1N-P muestran que ECM en P1 y P7 promueven una actividad de gelatinasa elevada. (Figura 1N) Un diagrama esquemático de ensayo de zimografía in situ (ISZ). (Figura 10) Evaluación de inmunofluorescencia de la degradación de Col1, Col4 y gelatina en respuesta a ECM en P1 y P7. (Figura 1P) Ensayo de cuantificación de ISZ.

Figuras 2A-I muestran que la agrina derivada del endocardio promueve la proliferación de CM. (Figura 2A) qPCR del gen de agrina de lisados cardíacos en P1 y P7. (Figura 2B) Análisis de transferencia Western de agrina de lisados cardíacos en P1 y P7. (Figura 2C) Imágenes de secciones de corazón en P1 y P7 teñidas para agrina (verde) cTnT (rojo) y contrateñidas con DAPI (azul). (Figura 2D) Análisis qPCR de 6 poblaciones celulares (FB, sin-FB, CM, sin-CM, EC, sin-EC) para agrina. Evaluación de inmunofluorescencia del número de CM en P1 y P7 (cTnT o tomato-aMHC) (Figura 2E), ciclo celular (Ki67; Figura 2F), mitosis (pH3; Figura 2G) o citocinesis (Aim1; Figura 2H) en respuesta a la administración de agrina in vitro. (Figura 2I) qPCR de genes del lisado de corazón en P1 y P8. Análisis qPCR de 6 poblaciones celulares (FB, sin-FB, CM, sin-CM, EC, sin-EC) para CD90 (marcador FB), aMHC (marcador CM) y Pecam (marcador EC).

Figuras 3A-O muestran que se requiere agrina para la regeneración cardíaca en P1 después de la resección quirúrgica. (Figura 3A) Un diagrama esquemático que representa la generación de ratones knockout para agrina con restricción cardíaca (Agrin-cKO). (Figura 3B) Análisis de transferencia Western de agrina y niveles de proteína sarcomárica en lisados de corazón WT y Agrin-cKO en P1. (Figura 3C) qPCR de agrina en lisados de corazón WT y Agrin-cKO en P1. (Figura 3D) Análisis de inmunofluorescencia de agrina de WT y Agrin-cKO en P1. (Figura 3E) Análisis de inmunofluorescencia de la tinción de la membrana WGA en de WT y Agrin-cKO en P1 que representa cambios en el tamaño celular (Figura 3F). (Figura 3G) Análisis qPCR de un marcador hipertrófico patológico (es decir, Acta1) en lisados de corazón de WT y Agrin-cKO en P1. Evaluación in vivo del reingreso del ciclo celular de CM en P1 (Ki67; Figura 3H) y citocinesis (Aim1; Figura 3I) mediante análisis de inmunofluorescencia en secciones del corazón del ventrículo izquierdo de WT y Agrin-cKO. (Figura 3J) Esquema del experimento de resección en P1. (Figura 3K) Secciones histológicas de WT y Agrin-cKO en P1 teñidas con la tinción tricrómica de Masson y rojo Sirio. (Figuras 3L-M) Cuantificación de cicatrices basada en la tinción tricrómica de Masson de secciones de corazón de 4 semanas después de la resección de WT y Agrin-cKO. (Figuras 3N,O) Evaluación in vivo del reingreso al ciclo celular de CM mediante análisis de inmunofluorescencia de Ki67 (Figura 3N) o Aim1 (Figura 3O) en secciones tomadas de corazones resecados de WT y Agrin-cKO.

Figuras 4A-I muestran que la inoculación de agrina es suficiente para la regeneración cardíaca después de un MI. (Figura 4A) Un diagrama esquemático que representa el experimento de ligadura LAD tanto en juveniles como en adultos. (Figura 4B-4E) Evaluación in vivo del reingreso al ciclo celular de CM mediante análisis de inmunofluorescencia de Ki67 (Figura 4 B, D) o Aim1 (Figura 4C, E) en secciones de corazón 7 días después del MI en ratones juveniles (Figura 4B, C) y adultos (Figura 4D, E). (Figura 4F, G) Mediciones ecocardiográficas en serie de la fracción de eyección (EF), el acortamiento fraccional (FS) y el grosor de la pared de ratones juveniles (Figura 4F) y adultos (Figura 4G) tratados con PBS y agrina ilesos y lesionados después de un MI, según el esquema en la Figura 4A. (Figura 4H, 4I) Cuantificación de cicatrices basada en la tinción tricrómica de Masson de secciones de corazón de ratones juveniles (Figura 4H) y adultos (Figura 4I) tratados con PBS y agrina.

Figuras 5A-J muestran que la agrina promueve la proliferación de CM a través de la activación de Dag1 y ERK. (Figura 5A) qPCR del gen Dag1 de lisados del corazón en P1 y P7. (Figura 5B) Análisis de transferencia Western de Dag1 de lisados del corazón en P1 y P7. (Figura 5C) Análisis qPCR de 6 poblaciones celulares (FB, sin-FB, CM, sin-CM, EC, sin-EC) para Dag1. (Figura 5D) Análisis de transferencia Western de fosfo-ERK (pERK) y ERK-general (gERK) en control en P7 y cultivos tratados con agrina. (Figura 5E) Análisis de activación de ERK de CM mediante tinción de inmunofluorescencia para pERK de control en P7 y cultivos tratados con agrina. (Figura 5F) Análisis de transferencia Western de pERK y gERK en cultivos tratados con control en P7, inhibición de Dag1, agrina y agrina con inhibición de Dag1. (Figura 5G-H) Análisis de la actividad del ciclo celular de CM mediante tinción de inmunofluorescencia después del tratamiento con agrina con inhibición de MEK (Figura 5G) o inhibición de Dag1 (Figura 5H). (Figura 5I) Evaluación de inmunofluorescencia de la actividad del ciclo celular de CM en P7 (Ki67) en respuesta a la administración de agrina en WT y mdx in vitro. (Figura 5J) Recuento de inmunofluorescencia en serie de CMs etiquetados de tomato tratados con varios compuestos demostrados que inhiben las bombas de Na+/K+.

Figuras 6A-D muestran que la administración in vitro de agrina promueve la proliferación de CMs derivadas de iPSC humanas. (Figura 6A) Evaluación de inmunofluorescencia en serie de la actividad del ciclo celular de iPSC-CM (Ki67) en respuesta a la administración de agrina. (Figura 6B) Análisis de inmunofluorescencia de la actividad del ciclo celular en el día 4. (Figuras 6C-D) Evaluación de inmunofluorescencia de la actividad del ciclo celular de iPSC-CM por Ph3 (Figura 6C) o Aim1 (Figura 6D) en respuesta a la administración de agrina humana de una manera dependiente de la dosis.

Figuras 7A-B ilustran la estructura proteica de la agrina (basada en Singhal and Martin 2011 Develop. Neurol. 982­ 1005) y su alineamiento en humanos, ratones y ratas (SEQ ID NOs: 38, 9, 6, respectivamente).

Figuras 8A-H muestran los efectos de transcripción de la agrina en corazones con mioinfarto (MI). La secuenciación del ARN se realizó en corazones MI tratados con Agrina/PBS, para evaluar los efectos transcripcionales de la agrina en el corazón adulto con infarto. (Figura 8A) Diagrama esquemático que representa el diseño experimental: los corazones adultos se sometieron a la ligadura de LAD y se sometieron a una inyección de PBS o agrina. 3 días después del tratamiento, se recogieron corazones de ratones operados con agrina, PBS y simulados, y el ARN se purificó y se sometió a ARN-seq. (Figura 8B) El diagrama volcano de genes expresados diferencialmente en corazones tratados con agrina frente a PBS infartados (MI). Se representa gráficamente el cambio de la expresión en veces frente al valor de p. Los genes aumentados o disminuidos significativos se indican en rojo o azul, respectivamente. Los círculos llenos indican genes relevantes que se sabe que participan en vías importantes en la regeneración del corazón y la modulación inmunitaria. (Figura 8C) Mapa de calor que representa los genes expresados diferencialmente afectados por agrina. Los datos de expresión génica de ARN-seq se compararon con una base de datos de genes expresados diferencialmente de MI. Se compararon los genes expresados diferencialmente que mostraron un patrón similar en el entorno de MI actual (PBS frente a simulado) y en la base de datos preexistente. Estos genes se denominan como "firma MI".

La expresión relativa de estos genes en la base de datos MI (Ounzain, panel izquierdo), el MI actual (MI experimental, panel central) y MI tratado con agrina (MI con agrina vs. MI con PBS, experimental MI+Agrin, panel derecho). (Figuras 8D-E) Los genes que se muestran en la Figura 8C se analizaron utilizando el software de análisis de vías de ingenio.

Se muestran términos prominentes significativamente enriquecidos para (Figura 8D) vías canónicas y (8E) reguladores anteriores. (Figuras 8F-G) Mapas de calor que representan la expresión relativa de genes relevantes en vías canónicas prominentes (Figura 8F) y reguladores anteriores (Figura 8G). (Figura 8H) Validación en tiempo real de varios genes que se muestran en la (Figura 8F) y la (Figura 8G).

DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ESPECÍFICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a métodos para inducir la proliferación de cardiomiocitos y métodos para tratar enfermedades del corazón.

Antes de explicar en detalle al menos una realización de la invención debe entenderse que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los Ejemplos. La invención es susceptible de otras realizaciones o de ser puesta en práctica o llevada a cabo de varias maneras.

La enfermedad cardíaca, incluyendo el infarto de miocardio (MI), es la principal causa de muerte en el mundo. La gravedad de la enfermedad cardíaca se debe a la naturaleza post-mitótica de las células del músculo cardíaco humano adulto: los cardiomiocitos (CMs) {Bergmann, 2009 #9; Senyo, 2013 #86} y su capacidad limitada para reponer el tejido dañado {Poss, 2007 #30; Ausoni, 2009 #17}. Por el contrario, el recambio de CM murino neonatal es suficiente para reparar el miocardio dañado después de una lesión; sin embargo, esta capacidad disminuye considerablemente durante la primera semana después del nacimiento.

Mientras buscaban nuevas modalidades de tratamiento que pudieran potenciar la naturaleza proliferativa de los CMs juveniles/adultos, los presentes inventores han empleado un método novedoso para identificar las composiciones de ECM cardíacas murinas que promueven la proliferación de CM e identificaron la agrina, un proteoglicano expresado por las células endoteliales cardíacas en el nacimiento, pero sus niveles disminuyen después de 7 días. El tratamiento con agrina recombinante induce el reingreso del ciclo celular de CM y la división in vitro. Al nacer, los CMs con knockout condicional de agrina (cKO) muestran un fenotipo maduro y más diferenciado acompañado de una proliferación reducida y una regeneración cardíaca deteriorada. Por el contrario, la administración de agrina después de un infarto de miocardio (MI) induce la proliferación de CM que conduce a una reducción de la cicatrización y a una mejora general de la función cardíaca tanto en ratones recién nacidos como adultos. De manera mecanicista, los presentes inventores sugieren que la agrina funciona a través de la modulación del complejo de Distroglicano al bloquear la sarcomerogénesis y no a través de su señalización canónica relacionada con MuSK. Estos hallazgos hacen que cualquier agente que inhiba el complejo de Distroglicano en los CMs sea una terapia potencial para las enfermedades del corazón. El análisis transcripcional sugiere que la agrina promueve la regeneración del corazón no solo a través de la proliferación de cardiomiocitos sino también a través de la modulación inmune, lo que podría cambiar la supervivencia de los cardiomiocitos, reduciendo así el tamaño del infarto y la cicatriz.

Así, según un aspecto de la invención, se proporciona un método para inducir la proliferación de CMs, comprendiendo el método poner en contacto los cardiomiocitos con un agente que inhibe el complejo de Distroglicano en los CMs, induciendo así la proliferación de CMs.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un método para inducir la proliferación de cardiomiocitos, comprendiendo el método poner en contacto los cardiomiocitos con una cantidad eficaz de un péptido de agrina que induce la proliferación de los cardiomiocitos.

Como se usa en la presente memoria, "un cardiomiocito'' o "cardiomiocitos" (abreviados como CM, CMs), también conocidos como miocardiocitos o miocitos cardíacos, son las células musculares (miocitos) que forman el músculo cardíaco. El término se refiere a cardiomiocitos de cualquier especie, incluyendo los mamíferos, por ejemplo, humanos en cualquier etapa de desarrollo. Según una realización específica, el cardiomiocito es un CM neonatal (por ejemplo, para humanos hasta 6 meses después del nacimiento). Según una realización específica, el cardiomiocito es un cardiomiocito adulto (por ejemplo, para humanos al menos 16-18 años después del nacimiento).

Así, según una realización específica, los cardiomiocitos son de un sujeto que tiene una enfermedad cardíaca.

Según una realización específica, los cardiomiocitos son de un sujeto sano donante.

Según una realización específica, los cardiomiocitos pueden ser de origen natural.

Según una realización específica, los CMs se han diferenciado ex vivo en cardiomiocitos (por ejemplo, a partir de células madre pluripotentes, por ejemplo, células madre embrionarias (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)). Los métodos para diferenciar células madre en CMs son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una iPSC se puede cocultivar con células similares al endodermo visceral (véase, por ejemplo, Mummery et al. (2003) Circulation 107:2733). También se puede inducir una célula iPS para que experimente cardiomiogénesis sin co-cultivo con una célula alimentadora u otra célula. Por ejemplo, como se describe en el documento de Patente U.S. Pat. No.

7,297,539. Los CMs pueden diferenciarse completamente cuando se ponen en contacto con el agente (por ejemplo, agrina). Según otra realización, las células están comprometidas con el linaje cardíaco y el agente (por ejemplo, agrina) se añade al cultivo durante o después del proceso de diferenciación.

Según una realización específica, los cardiomiocitos son CMs humanos.

Según una realización específica, los CMs son una línea celular.

Según una realización específica, los CMs son CMs primarios.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "que induce proliferación" se refiere a un aumento en la proliferación de CM que es estadísticamente significativo (en comparación con células no tratadas del mismo origen y etapa de desarrollo) y es el resultado de poner en contacto los cardiomiocitos con el agente, por ejemplo, agrina.

Como se mencionó, las células se ponen en contacto con un agente que inhibe el complejo de Distroglicano en los CMs. Nuestros datos sugieren que la agrina interactúa con el complejo de Distroglicano ya que un anticuerpo contra esta molécula inhibe los efectos inducidos por agrina sobre la proliferación de CM y la activación de ERK. Alternativa o adicionalmente, el agente modula la actividad estructural del Distroglicano como una molécula puente entre el citoesqueleto del CM y la ECM, lo que permite que el CM prolifere.

Como se mencionó, el agente descrito en la presente memoria es capaz de inducir la modulación inmunitaria (véanse las Figuras 8A-H) mediante la cual aumenta la supervivencia de los cardiomiocitos, los efectos antiinflamatorios y/o antifibróticos.

Como se usa en la presente memoria, "modulación inmunitaria" se refiere a cambios inducidos en la expresión génica (por ejemplo, ARN como se determina mediante ARN-Seq) de genes de vías canónicas y/o reguladores anteriores (véanse las Figuras 8A-H que se incorporan en la presente memoria).

Como se usa en la presente memoria, el término "agente" se refiere a una sustancia que puede ser de naturaleza biológica, por ejemplo, una sustancia proteinacea, por ejemplo, un péptido (por ejemplo, descrito más adelante en la presente memoria) o un anticuerpo, una sustancia de ácido nucleico, por ejemplo, un polinucleótido o un oligonucleótido, o una naturaleza química, por ejemplo, una molécula pequeña.

Como se usa en la presente memoria, el término "polinucleótido" se refiere a una secuencia de ácido nucleico monocatenaria o bicatenaria que se aísla y se proporciona en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótidos complementaria (cDNA), una secuencia de polinucleótidos genómicos y/o secuencias de polinucleótidos compuestas (por ejemplo, una combinación de los anteriores).

El término "aislado" se refiere al menos parcialmente separado del entorno natural, por ejemplo, de una célula huésped recombinante.

Se pueden identificar otros agentes que pueden usarse para inhibir el complejo de Distroglicano poniendo en contacto el agente con cardiomiocitos que expresan el complejo de Distroglicano e identificando un agente que se une al complejo de Distroglicano y opcionalmente induce la activación de Erk y finalmente la proliferación de CM o inhibe la sarcomerogénesis. La unión a proteínas se puede ensayar usando numerosos ensayos conocidos en la técnica, por ejemplo, el ensayo ELISA, co-inmunoprecipitación, unión a membrana, FRET, resonancia de plasmón de superficie y similares.

Alternativa o adicionalmente, y como se mencionó, las células se ponen en contacto con un "péptido de agrina".

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "agrina" se refiere al producto proteico del gen AGRN. El término pretende incluir secuencias de polinucleótidos que codifican agrina o productos de expresión como ARN o una proteína.

Un "péptido de agrina" se refiere a un péptido de agrina que es más corto que la agrina de cadena completa (por ejemplo, en el caso de la agrina humana más corto que los 2068/2045 aminoácidos que forman la agrina humana de cadena completa) y es capaz de inducir proliferación de cardiomiocitos. Según una realización específica, el péptido de agrina se proporciona en una forma soluble.

Según una realización específica, el péptido de agrina es de agrina humana NP_001292204 (SEQ ID NO: 4) o NP_940978 (SEQ ID NO: 5) o Uniprot O00468 SEQ ID NO: 38.

Según una realización específica, el péptido de agrina es de un ortólogo humano, por ejemplo, NP_786930 (SEQ ID NO: 6).

Se apreciará que las presentes enseñanzas contemplan el tratamiento de una especie (por ejemplo, humana) con un péptido de agrina de una segunda especie (por ejemplo, rata) siempre que muestren la actividad deseada (es decir, proliferación de CM inducida) en el sujeto/células tratadas.

Según una realización específica, el péptido de agrina comprende un dominio 2 (G2) similar a la laminina G y, opcionalmente, un dominio 1 (G1) similar a la laminina G.

Por lo tanto, según una realización específica, el péptido de agrina comprende el dominio G2 como se establece en SEQ ID NO: 8 o G1 y G2 como se establece en SEQ ID NO: 7.

Por consiguiente, se proporciona un péptido aislado que comprende el dominio 2 (G2) similar a la laminina G, teniendo el péptido no más de 200 aminoácidos de longitud.

Según una realización específica, el péptido es como se establece en SEQ ID NO: 8.

Sin pretender imponer ninguna teoría, se sugiere que se requiere dicha configuración que comprenda al menos los dominios 2 similar a Laminina G (G2) y posiblemente G1 y/o G3 para la unión de alfa-Distroglicano/DAG1.

Según una realización específica, dicho péptido de agrina promueve el desmontaje del sarcómero y la proliferación de cardiomiocitos que conducen a la regeneración del corazón.

Según una realización específica, el péptido de agrina no ejerce su función mediante la unión al receptor de MuSK. De hecho, ningún receptor de MuSK se expresa en el corazón, como se desprende de los perfiles de ARN-seq [41].

Según una realización específica, el péptido de agrina tiene una longitud de 50-500 aminoácidos. Según una realización específica, el péptido de agrina tiene una longitud de 100-400 aminoácidos. Según una realización específica, el péptido de agrina tiene una longitud de 100-300 aminoácidos. Según una realización específica, el péptido de agrina tiene una longitud de 150-200 aminoácidos. Según una realización específica, el péptido de agrina tiene una longitud de 100-200 aminoácidos.

Según una realización específica, el péptido de agrina es de 80-150 kDa. Según una realización específica, el péptido de agrina es de 80-120 kDa. Según una realización específica, el péptido de agrina es de 80-110 kDa. Según una realización específica, el péptido de agrina es de 90-110 kDa.

Los péptidos de agrina están disponibles comercialmente a partir de R&D systems, por ejemplo, 6624-AG, 550-AG o 550-AG/CF.

Según una realización específica, el péptido de agrina se une al complejo de Distroglicano a través de los dominios G1-G2 de Laminina [42]. Los inventores sugieren que la agrina inhibe su actividad, lo que conduce a la activación de Erk y, opcionalmente, inhibe la sarcromerogénesis.

Los métodos para determinar la activación de Erk (también conocidas como quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) o quinasas clásicas MAP) son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, ensayos de quinasa in vitro y el uso de anticuerpos de MAPK anti-fosforilados.

Según una realización específica, la agrina no es parte de un polipéptido de fusión donde la agrina sirve como un resto de direccionamiento para la administración de un péptido terapéuticamente eficaz.

Según otra realización específica, la agrina es una parte de un polipéptido de fusión en el que la agrina sirve tanto como un resto de direccionamiento como un resto efector (es decir, para inducir la proliferación de CM).

Según una realización específica, la agrina se proporciona en una forma soluble. En consecuencia, la agrina no forma parte ni está unido a una composición de matriz extracelular.

Los métodos para determinar la proliferación de CM son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, recuento celular manual, ensayo MTT y ensayo de incorporación de timidina. Según algunas realizaciones, se realiza tanto la determinación de la naturaleza de las células como la determinación de su proliferación.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presencia de cardiomiocitos proliferativos se valida confirmando la expresión de al menos un marcador específico de cardiomiocitos producido por la célula. Por ejemplo, los cardiomiocitos expresan factores de transcripción cardíacos, proteínas de sarcómero y proteínas de unión gap. Las proteínas específicas de cardiomiocitos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, troponina I cardíaca, troponina C cardíaca, tropomiosina, caveolina-3, GATA-4, cadena pesada de miosina, cadena ligera de miosina 2a, cadena ligera de miosina 2v, receptor de rianodina y factor natriurético auricular.

Como otro ejemplo, en algunas realizaciones, los cardiomiocitos se determinan mediante la detección de la capacidad de respuesta a agentes farmacológicos tales como agonistas beta-adrenérgicos (por ejemplo, isoprenalina), antagonistas beta adrenérgicos (por ejemplo, esmolol), agonistas colinérgicos (por ejemplo, carbochol) y similares.

Alternativa o adicionalmente, la validación de la naturaleza de los CMs se realiza mediante la detección de la actividad eléctrica de las células. La actividad eléctrica se puede medir mediante varios métodos, incluyendo el registro extracelular, el registro intracelular (por ejemplo, pinzamiento de parche) y el uso de colorantes sensibles al voltaje. Dichos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

El término "péptido", como se usa en la presente memoria, abarca péptidos nativos (ya sean productos de degradación, péptidos sintetizados sintéticamente o péptidos recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, péptidos sintetizados sintéticamente), así como peptoides y semipeptoides que son análogos de péptidos, que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que hacen que los péptidos sean más estables mientras están en un cuerpo o más capaces de penetrar en las células. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la modificación del extremo N, la modificación del extremo C, la modificación del enlace peptídico, las modificaciones del esqueleto y la modificación del residuo. Los métodos para preparar compuestos peptidomiméticos son bien conocidos en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992).

A continuación se proporcionan más detalles a este respecto. Según una realización específica, el péptido (o polipéptido) es un producto recombinante (es decir, de tecnología de ADN recombinante). Según una realización específica, la agrina tiene una pureza superior al 95 % (por ejemplo, no hay otras proteínas de ingrediente activo presentes en la formulación).

Los enlaces peptídicos (-CO-NH-) dentro del péptido pueden sustituirse, por ejemplo, por enlaces amida N-metilados (-N(CH₃)-CO-), enlaces éster (-C(=O)-O-), enlaces cetometileno (-CO-CH₂-), enlaces sulfinilmetileno (-S(=O)-CH₂-), enlaces a-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier alquilo (por ejemplo, metilo ), enlaces amina (-CH₂-NH-), enlaces sulfuro (-CH₂-S-), enlaces etileno (-CH₂-CH₂-), enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH₂-), enlaces tioamida (-CS -NH-), dobles enlaces olefínicos (-CH=CH-), dobles enlaces olefínicos fluorados (-CF=CH-), enlaces retro amida (-NH-CO-), derivados peptídicos (-N(R)-CH₂-CO-), en donde R es la cadena lateral "normal", presente de forma natural en el átomo de carbono.

Estas modificaciones se pueden producir en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídica e incluso en varios (2-3) enlaces al mismo tiempo.

Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tyr y Phe, pueden sustituirse por aminoácidos aromáticos no naturales tal como el ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (Tic), naftilalanina, derivados de Phe metilados en el anillo, derivados halogenados de Phe u O-metil-Tyr.

Los péptidos de algunas realizaciones de la invención también pueden incluir uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros que no son aminoácidos (por ejemplo, ácidos grasos, carbohidratos complejos, etc.).

Se entiende que el término "aminoácido" o "aminoácidos" incluye los 20 aminoácidos naturales; aquellos aminoácidos a menudo modificados después de la traducción in vivo, incluyendo, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales que incluyen, pero no se limitan a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina y ornitina. Además, el término "aminoácido" incluye tanto D- como L-aminoácidos.

Las Tablas 1 y 2 a continuación enumeran los aminoácidos naturales (Tabla 1) y los aminoácidos no convencionales o modificados (por ejemplo, sintéticos, Tabla 2) que se pueden usar con algunas realizaciones de la invención.

Tabla 1

Tabla 2

Los péptidos de algunas realizaciones de la invención se utilizan preferiblemente en una forma lineal, aunque se apreciará que en los casos en los que la ciclación no interfiere gravemente con las características del péptido, también se pueden utilizar formas cíclicas del péptido.

Dado que los presentes péptidos se utilizan preferiblemente en terapias o diagnósticos que requieren que los péptidos estén en forma soluble, los péptidos de algunas realizaciones de la invención incluyen preferiblemente uno o más aminoácidos polares naturales o no naturales, incluyendo, pero no limitado a, serina y treonina que son capaces de aumentar la solubilidad del péptido debido a su cadena lateral que contiene hidroxilo.

Los péptidos de algunas realizaciones de la invención se utilizan preferiblemente en una forma lineal, aunque se apreciará que en los casos en los que la ciclación no interfiere gravemente con las características del péptido, también se pueden utilizar formas cíclicas del péptido.

Se apreciará que los agentes proteináceos de algunas realizaciones de la invención también pueden utilizar homólogos funcionales que muestren la actividad deseada (es decir, proliferación inducida de CMs). Dichos homólogos pueden ser, por ejemplo, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o 100 % idénticos a la secuencia humana, por ejemplo, agrina humana, por ejemplo, SEQ ID NO: 4, 5, 7 u 8, como se determina usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencias de Wisconsin, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman, donde el peso de la brecha es igual a 50, el peso de la longitud es igual a 3, la coincidencia promedio es igual a 10 y la falta de coincidencia promedio es igual a -9.

Los péptidos de algunas realizaciones de la invención pueden sintetizarse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica de la síntesis de péptidos. Para la síntesis de péptidos en fase sólida, se puede encontrar un compendio de muchas técnicas en J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 y J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1973. Para la síntesis en solución clásica véase G. Schroder y K. Lupke, The Peptides, vol. 1, Academic Press (New York), 1965.

En general, estos métodos comprenden la adición secuencial de uno o más aminoácidos o aminoácidos adecuadamente protegidos a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, el grupo amino o carboxilo del primer aminoácido está protegido por un grupo protector adecuado. El aminoácido protegido o derivatizado puede unirse a un soporte sólido inerte o utilizarse en solución añadiendo el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido, en condiciones adecuadas para formar el enlace amida. Después, el grupo protector se elimina de este residuo de aminoácido recién añadido y después se añade el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido), y así sucesivamente. Después de que todos los aminoácidos deseados se hayan unido en la secuencia adecuada, cualquier grupo protector restante (y cualquier soporte sólido) se eliminan secuencial o simultáneamente para proporcionar el compuesto peptídico final.

Alternativamente, los péptidos se producen usando tecnología de ADN recombinante.

Se puede usar una variedad de células procarióticas o eucarióticas como sistemas de expresión del huésped para expresar los polipéptidos/péptidos de algunas realizaciones de la invención. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con un vector de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contiene la secuencia codificante; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen la secuencia codificante; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes, tal como el plásmido Ti, que contienen la secuencia codificante. Los sistemas de expresión de mamíferos también se pueden usar para expresar los polipéptidos de algunas realizaciones de la invención.

En aras de la simplicidad, la agrina y el agente se denominan colectivamente en la presente memoria como "un agente" o "agentes", aunque debe apreciarse que cada posibilidad de un agente representa una realización separada de la presente invención.

Según una realización específica, el agente proteináceo se puede unir (o conjugar) a restos no proteináceos que aumentan su biodisponibilidad y vida media en la circulación.

La frase "resto no proteináceo", como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que no incluye aminoácidos unidos a péptidos que se une a los agentes proteináceos descritos anteriormente. Ejemplos de restos no proteináceos y preferiblemente no tóxicos que pueden usarse según las presentes enseñanzas incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP), poli(estireno-anhídrido comaléico) (SMA) y Copolímero de divinil éter y anhídrido maleico (DIVEMA).

Dicha molécula es altamente estable (resistente a la actividad proteolítica in vivo probablemente debido al impedimento estérico conferido por el resto no proteináceo) y puede producirse utilizando métodos de síntesis en fase sólida comunes que son económicos y altamente eficientes, como se describe más adelante. Sin embargo, se apreciará que todavía se pueden usar técnicas recombinantes, mediante las cuales el producto peptídico recombinante se somete a modificación in vitro (por ejemplo, PEGilación).

Por lo tanto, dichos restos no tóxicos no proteináceos también se pueden unir a los agentes mencionados anteriormente para promover la estabilidad y posiblemente la solubilidad de las moléculas.

La bioconjugación de dicho resto no proteináceo (tal como la PEGilación) puede conferir estabilidad a la secuencia de aminoácidos de las proteínas (por ejemplo, frente a actividades de proteasa) y/o solubilidad (por ejemplo, dentro de un fluido biológico tal como sangre, fluido digestivo) mientras conserva su actividad biológica y prolonga su vida media.

La bioconjugación es particularmente ventajosa en casos de proteínas terapéuticas que muestran una vida media corta y una eliminación rápida de la sangre. El aumento de la vida media de las proteínas bioconjugadas en el plasma resulta del aumento del tamaño de los conjugados de proteínas (lo que limita su filtración glomerular) y la disminución de la proteólisis debido al impedimento estérico del polímero. En general, cuantas más cadenas de polímero se unen por péptido, mayor es la extensión de la vida media. Sin embargo, se toman medidas para no reducir la actividad específica de la proteína de la presente invención (por ejemplo, proliferación de CM).

La bioconjugación del agente proteináceo con PEG (es decir, PEGilación) puede efectuarse usando derivados de PEG tales como ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) de ácidos carboxílicos de PEG, monometoxiPEG²-NHS, éster succinimidílico de PEG carboximetilado (SCM-PEG), derivados de carbonato de benzotriazol de PEG, éteres glicidílicos de PEG, carbonatos de p-nitrofenilo de PEG (PEG-NPC, tal como metoxi PEG-NPC), aldehídos de PEG, PEG-ortopiridil-disulfuro, PEG activados por carbonildimidazol, PEG-tiol, PEG-maleimida. Dichos derivados de PEG están disponibles comercialmente en varios pesos moleculares [Véase, por ejemplo, Catalog, Polyethylene Glycol and Derivatives, 2000 (Shearwater Polymers, Inc., Huntsvlle, Ala.)]. Si se desea, muchos de los derivados anteriores están disponibles en forma de monometoxiPEG monofuncional (mPEG). En general, el PEG añadido a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti HER3 de la presente invención variaría desde un peso molecular (MW) de varios cientos de Dalton hasta aproximadamente 100 kDa (por ejemplo, entre 3 y 30 kDa). Se puede usar PEG de MW mayores, pero puede dar como resultado alguna pérdida de rendimiento de péptidos PEGilados. También debe observarse la pureza de las moléculas de PEG más grandes, ya que puede ser difícil obtener PEG de mayor MW con una pureza tan alta como la que se puede obtener con PEG de menor MW. Es preferible utilizar PEG de al menos un 85 % de pureza, y más preferiblemente de al menos un 90 % de pureza, un 95 % de pureza o superior. La PEGilación de moléculas se discute más en, por ejemplo, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press San Diego, Calif. (1996), at Chapter 15 y en Zalipsky et al., "Succinimidyl Carbonates of Polyethylene Glycol", en Dunn and Ottenbrite, eds., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, American Chemical Society, Washington, D.C. (1991).

Según una realización específica, los métodos descritos en la presente memoria para inducir la proliferación de CM se efectúan in vivo.

Según una realización específica, los métodos descritos en la presente memoria para inducir la proliferación de CM se efectúan in vitro.

Según una realización específica, los métodos descritos en la presente memoria para inducir la proliferación de CM se efectúan ex-vivo.

Según una realización específica, los cardiomiocitos están comprendidos en un tejido (un tejido vascularizado).

La capacidad para inducir la proliferación de CM hace que las presentes enseñanzas sean particularmente adecuadas para el tratamiento de enfermedades cardíacas en las que existe daño al tejido cardíaco o existe el riesgo de dicho daño.

Por tanto, según un aspecto de la invención, se proporciona el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de agrina que induce la proliferación de cardiomiocitos en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad cardiaca.

Alternativamente, según un aspecto de la invención, se proporciona el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de agrina que induce la proliferación de cardiomiocitos en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad cardiaca.

Alternativamente, según un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente que inhibe el complejo de Distroglicano en los cardiomiocitos en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad cardíaca.

Alternativamente, según un aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar una enfermedad cardiaca en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de agrina que induce la proliferación de cardiomiocitos, tratando así la enfermedad cardiaca.

Alternativamente, según un aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar una enfermedad cardíaca en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que inhibe el complejo de Distroglicano en los cardiomiocitos, tratando así la enfermedad cardiaca.

El término "tratar" se refiere a inhibir, prevenir o detener el desarrollo de una patología (es decir, enfermedad, trastorno o afección cardiaca, por ejemplo, enfermedad cardiaca isquémica) y/o provocar la reducción, remisión o regresión de una patología. Los expertos en la técnica comprenderán que se pueden usar varias metodologías y ensayos para evaluar el desarrollo de una patología y, de manera similar, se pueden usar varias metodologías y ensayos para evaluar la reducción, remisión o regresión de una patología.

Como se usa en la presente memoria, el término "prevenir" se refiere a evitar que ocurra una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto que puede estar en riesgo de padecer la enfermedad, pero que aún no ha sido diagnosticado como que tiene la enfermedad.

Como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" incluye mamíferos, preferiblemente seres humanos de cualquier edad que padecen la patología. Preferiblemente, este término abarca a individuos que están en riesgo de desarrollar la patología.

Según una realización específica, la enfermedad cardiaca es una enfermedad cardiaca isquémica.

Una enfermedad cardiaca isquémica se refiere a la falta de flujo de oxígeno al corazón o parte del mismo, lo que da como resultado un daño isquémico del miocardio. Como se usa en la presente memoria, la frase daño isquémico del miocardio incluye el daño provocado por la reducción del flujo sanguíneo al miocardio. Los ejemplos no limitantes de causas de una enfermedad cardiaca isquémica y un daño isquémico del miocardio incluyen: disminución de la presión diastólica aórtica, aumento de la presión intraventricular y contracción del miocardio, estenosis de la arteria coronaria (por ejemplo, ligadura coronaria, estenosis coronaria fija, cambio agudo de placa (por ejemplo, ruptura, hemorragia), trombosis de la arteria coronaria, vasoconstricción), estenosis y regurgitación de la válvula aórtica y aumento de la presión en la aurícula derecha. Los ejemplos no limitantes de efectos adversos de isquemia del miocardio y daño isquémico del miocardio incluyen daño de miocitos (por ejemplo, pérdida de células de miocitos, hipertrofia de miocitos, hiperplasia celular de miocitos), angina (por ejemplo, angina estable, angina variante, angina inestable, muerte cardíaca súbita), infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca congestiva. El daño debido a la isquemia del miocardio puede ser agudo o crónico, y las consecuencias pueden incluir formación de cicatrices, remodelación cardíaca, hipertrofia cardíaca, adelgazamiento de la pared, dilatación y cambios funcionales asociados. La existencia y etiología de daño del miocardio agudo o crónico y/o isquemia del miocardio puede diagnosticarse usando uno cualquiera de una variedad de métodos y técnicas bien conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, toma de imágenes no invasivas (por ejemplo, MRI, ecocardiografía), angiografía, pruebas de esfuerzo, análisis de proteínas cardíacas específicas, tales como la troponina cardíaca, y evaluación de los síntomas clínicos. Estos métodos y técnicas, así como otras técnicas apropiadas, pueden usarse para determinar qué sujetos son candidatos adecuados para los métodos de tratamiento descritos en la presente memoria.

Según una realización específica, la enfermedad cardiaca isquémica en la presente invención incluye, por ejemplo, arteriosclerosis coronaria, infarto agudo de miocardio (AMI), infarto de miocardio (MI), MI antiguo, angina de pecho (AP) que incluye angina estable, angina inestable, y angina de esfuerzo, cardiomiopatía isquémica, insuficiencia cardiaca y otras enfermedades que provocan necrosis del músculo cardiaco como resultado de una isquemia prolongada. A medida que avanza la necrosis del músculo cardíaco, el tejido del miocardio dañado se reemplaza con tejido fibroso, el grosor de la pared del miocardio en la zona del infarto se vuelve más delgado y la cavidad cardíaca interna se dilata, por lo que la función cardíaca, tal como la contractilidad, se deteriora y provoca insuficiencia cardíaca.

La arteriosclerosis coronaria se caracteriza por arteriosclerosis en la arteria coronaria que suministra nutrientes al corazón. La angina de pecho se caracteriza por ataques de dolor torácico provocados por un flujo sanguíneo deficiente en la arteria coronaria. El infarto de miocardio se caracteriza por necrosis de miocardio provocada por un flujo sanguíneo deficiente en la arteria coronaria y por complicaciones fatales que le acompañan tales como arritmia, insuficiencia cardiaca, rotura cardiaca y fallo de la bomba. El flujo de sangre deficiente al corazón, un órgano vital, es una característica esencial de estas enfermedades cardiacas isquémicas.

La "remodelación del miocardio posterior al infarto" se refiere a una serie de cambios, tales como la hipertrofia de las células miocárdicas en sitios no infartados, el aumento del tejido intersticial (matriz extracelular) y la dilatación del lumen cardíaco, que se producen en compensación por la reducción de la función cardíaca provocada por el engrosamiento en los sitios de infarto después de un infarto de miocardio. Dado que el pronóstico a largo plazo después de un infarto de miocardio se correlaciona con el grado de disfunción ventricular izquierda, la supresión de la remodelación del miocardio es importante para mantener y conservar la función del ventrículo izquierdo.

Los agentes (por ejemplo, péptido de agrina) de algunas realizaciones de la invención se pueden administrar a un organismo per se, o en una composición farmacéutica donde se mezcla con vehículos o excipientes adecuados.

Como se usa en la presente memoria, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en la presente memoria con otros componentes químicos tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

En la presente memoria, el término "ingrediente activo" se refiere al agente (por ejemplo, péptido de agrina) responsable del efecto biológico.

De aquí en adelante, las frases "vehículo fisiológicamente aceptable" y "vehículo farmacéuticamente aceptable" que pueden usarse indistintamente se refieren a un vehículo o diluyente que no provoca irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Bajo estas frases se incluye un adyuvante.

En la presente memoria, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de un ingrediente activo. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Las vías de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, administración oral, rectal, transmucosal, especialmente transnasal, intestinal o parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como inyecciones intratecales, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.

Alternativamente, se puede administrar la composición farmacéutica de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección de la composición farmacéutica directamente en una región de tejido de un paciente. Por ejemplo, por vía intraventricular directa, intracardíaca, por ejemplo, en la cavidad ventricular derecha o izquierda, en la arteria coronaria común. También se contempla la administración de la composición directamente al miocardio, por ejemplo, durante una cirugía a corazón abierto o guiada mediante formación de imágenes, por ejemplo, ultrasonido.

Las composiciones farmacéuticas de algunas realizaciones de la invención pueden fabricarse mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para su uso según algunas realizaciones de la invención pueden formularse así, de manera convencional, usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.

Para inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para la administración transmucosal, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a atravesar. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.

Para la administración oral, la composición farmacéutica se puede formular fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten formular la composición farmacéutica como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lodos, suspensiones y similares, para la ingestión oral por parte de un paciente. Las preparaciones farmacológicas para uso oral se pueden realizar utilizando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, añadiendo después auxiliares adecuados si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carbometil celulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.

Los núcleos de grageas están provistos de recubrimientos adecuados. Para este fin, se pueden utilizar soluciones de azúcar concentradas que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis del compuesto activo.

Las composiciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los ingredientes activos mezclados con rellenos tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los ingredientes activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosis adecuadas para la vía de administración elegida.

Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

Para la administración por inhalación nasal, los ingredientes activos para su uso según algunas realizaciones de la invención se administran convenientemente en forma de una presentación de aerosol desde un paquete presurizado o un nebulizador con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un dispensador que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

La composición farmacéutica descrita en la presente memoria puede formularse para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación única, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis con, opcionalmente, un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los ingredientes activos se pueden preparar como suspensiones de inyección a base de agua o aceite apropiados. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los ingredientes activos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, una solución a base de agua estéril y libre de pirógenos, antes de su uso.

La composición farmacéutica de algunas realizaciones de la invención también se puede formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, usando, por ejemplo, bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de algunas realizaciones de la invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el propósito previsto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de ingredientes activos (por ejemplo, péptido de agrina) eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de un trastorno (por ejemplo, enfermedad cardiaca isquémica) o prolongar la supervivencia del sujeto que se está tratando.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en la presente memoria.

Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro y de cultivos celulares. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr una concentración o título deseado. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en la presente memoria pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o animales de experimentación. Los datos obtenidos de estos ensayos in vitro y de cultivos celulares y estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosificación para su uso en humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico individual teniendo en cuenta la condición del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl, et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1).

La cantidad de dosificación y el intervalo pueden ajustarse individualmente para proporcionar, por ejemplo, niveles de tejido cardíaco del ingrediente activo que sean suficientes para inducir o suprimir el efecto biológico (concentración efectiva mínima, MEC). La MEC variará para cada preparación, pero se puede estimar a partir de datos in vitro. Las dosis necesarias para lograr la MEC dependerán de las características individuales y la vía de administración. Pueden utilizarse ensayos de detección para determinar las concentraciones en plasma.

Dependiendo de la gravedad y la capacidad de respuesta de la afección a tratar, la dosificación puede ser de una sola o una pluralidad de administraciones, con un curso de tratamiento que dura desde varios días hasta varias semanas o hasta que se efectúa la curación o se logra la disminución del estado de la enfermedad.

La cantidad de una composición a administrar dependerá, por supuesto, del sujeto a tratar, la gravedad de la afección, la forma de administración, el criterio del médico que prescribe, etc.

El agente se administra mediante un medio apropiado al sitio del defecto (por ejemplo, como se describe anteriormente). El sitio y el sujeto se observan y analizan para la regeneración del miocardio defectuoso para determinar que se ha administrado una cantidad eficaz de la composición, particularmente para observar el crecimiento de tejido nuevo y también para determinar que el tejido nuevo tiene la contractilidad necesaria para que funcione útilmente como miocardio. El crecimiento y la contractilidad del tejido se pueden probar y observar por medios estándar, por ejemplo, como se describe en Badylak et al, The Heart Surgery Forum, Extracellular Matrix for Myocardial Repair 6(2) E20-E26 (2003).

Las composiciones de algunas realizaciones de la invención pueden, si se desea, presentarse en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contengan el ingrediente activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o de plástico, tal como un paquete de burbujas. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones de administración. El paquete o dispensador también puede ser acomodado por un aviso asociado con el envase en un formulario prescrito por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, aviso que refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones o la administración humana o veterinaria. Dicho aviso, por ejemplo, puede ser una etiqueta aprobada por la U.S. Food and Drug Administration para fármacos prescritos o un prospecto de producto aprobado. Las composiciones que comprenden una preparación de la invención formulada en un vehículo farmacéutico compatible también se pueden preparar, colocar en un recipiente apropiado y etiquetar para el tratamiento de una afección indicada, como se detalla anteriormente.

Los agentes, como se describe en la presente memoria, también se pueden inmovilizar en un implante (por ejemplo, un stent) donde se pueden liberar lentamente del mismo.

El agente como se describe en la presente memoria se puede combinar con otras modalidades de tratamiento. Estos otros tratamientos incluyen medicamentos (por ejemplo, medicamentos para la presión arterial, bloqueadores de los canales de calcio, digitálicos, antiarrítmicos, inhibidores de ACE, anticoagulantes, inmunosupresores, analgésicos, vasodilatadores, etc.), angioplastia, colocación de stent, injerto de derivación de arteria coronaria, dispositivo de asistencia cardíaca (por ejemplo, dispositivo de asistencia ventricular izquierda, bomba de globo), colocación de marcapasos, trasplante de corazón, etc. En ciertas realizaciones, el agente proporciona un puente para recuperarse para un sujeto que espera someterse a un trasplante de corazón.

Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye, pero no se limita a".

El término "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".

El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura pueden incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicadas.

Como se usa en la presente memoria, la forma singular "un", "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

A lo largo de esta solicitud, se pueden presentar varias realizaciones de esta invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. En consecuencia, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha descrito específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo tal como del 1 al 6 tiene subintervalos descritos específicamente tal como del 1 al 3, del 1 al 4, del 1 al 5, del 2 al 4, del 2 al 6, del 3 al 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Siempre que se indique un intervalo numérico en la presente memoria, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccional o entero) dentro del intervalo indicado. Las frases "que oscila/oscila entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que oscila/oscila desde" un primer número indicado "hasta" un segundo número indicado se usan indistintamente en la presente memoria y pretenden incluir el primer y el segundo número indicados y todos los números fraccionarios y enteros entre ellos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "método" se refiere a formas, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea determinada, incluyendo, pero no limitado a, aquellas formas, medios, técnicas y procedimientos conocidos o desarrollados fácilmente a partir de formas, medios, técnicas y procedimientos por profesionales de las técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.

Cuando se hace referencia a listados de secuencias particulares, se debe entender que dicha referencia también abarca secuencias que corresponden sustancialmente a su secuencia complementaria, incluyendo variaciones menores de secuencia, que resultan, por ejemplo, de errores de secuenciación, errores de clonación u otras alteraciones que resultan en la sustitución de bases, eliminación de bases o adición de bases, siempre que la frecuencia de dichas variaciones sea inferior a 1 en 50 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 100 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 200 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 500 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 1000 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 5000 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 10000 nucleótidos.

Se aprecia que ciertas características de la invención, que se describen, para mayor claridad, en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una sola realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como sea adecuada en cualquier otra realización descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de varias realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización sea inoperante sin esos elementos.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención, tal y como se trazaron anteriormente y se reivindicaron en la sección de reivindicaciones a continuación, encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores muestran algunas realizaciones de la invención de manera no limitante.

Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente memoria y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988)); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)); metodologías establecidas en los documentos de Patente U.S. Pat. Nos.

4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animals Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); Los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía científica y de patentes, véase, por ejemplo, los documentos de Patente U.S. Pat. Nos.

3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,9 96,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D. and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, Rhode Island, ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996).

A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Se cree que los procedimientos de la presente memoria descritos son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para comodidad del lector.

EJEMPLO 1

Materiales y métodos

Aislamiento de células cardíacas

Se aislaron células cardíacas primarias de ratones ICR de 1 día (P1) y 7 días (P7) utilizando un kit de disociación neonatal (gentleMACS), según las instrucciones del fabricante, y se cultivaron en pocillos recubiertos de gelatina (0,02 %, G1393, Sigma) con medio DMEM/F12 suplementado con L-glutamina, Na-piruvato, aminoácidos no esenciales, penicilina, estreptomicina, suero de caballo al 5% y FBS al 10% a 37°C y 5 % de CO². En experimentos que implicaron la administración de agrina recombinante c-terminal (550-AG) (R&D Systems), fragmentos de ECM o inhibidores amplios de MMP (GM6001, Marimastat), se permitió que las células se adhirieran durante 48 h antes del tratamiento. Posteriormente, el medio se reemplazó por un medio libre de FBS que contenía suero de caballo al 5 % y las dosis de tratamiento indicadas durante 72 h. Las células se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4 % y se tiñeron para marcadores de interés.

Preparación de ECM derivada del corazón

Se tomaron corazones de ratones ICR (1 y 7 días de edad) y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los corazones se incrustaron en una solución óptima de temperatura de corte (OCT, tejido-tek) y se congelaron a -20°C. Los corazones se cortaron transversalmente en fragmentos de 100 gm usando un criostato. Los fragmentos de órganos se sumergieron en una solución de Triton X-100 al 2 % y EDTA 20 mM en agua bidestilada (DDW) durante la noche a temperatura ambiente. Después se lavaron las matrices con PBS y posteriormente se colocaron en Solución de Penicilina-Estreptomicina Anfotericina B al 10 % (Biological industries) para su esterilización hasta su colocación con las células. Antes de la administración de la matriz, los fragmentos se lavaron con un medio de cultivo celular sin FBS (como se describió anteriormente) y se homogeneizaron utilizando tubos GentleMACS M (Miltenyi Biotec Inc). A continuación, la matriz se añadió a los cultivos celulares.

Inmunotinción de cultivo de tejidos

Las células adherentes se cultivaron en una placa de 96 pocillos recubiertos de gelatina. Las células se fijaron con PFA al 4 % en PBS durante 10 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % en PBS durante 5 minutos. Las células se bloquearon mediante incubación en PBS que contenía Triton al 0,1 % y BSA al 3 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la inmunotinción, las células se incubaron durante 2 horas con los siguientes anticuerpos monoclonales diluidos en la solución de bloqueo: se usaron anticuerpos anti-cTnT (1:200, ab33589, Abcam) y anticTnI (1:200, ab47003, Abcam) para identificar los CMs. El Anticuerpo anti-Ki67 (1:200, 275R, Cell Marque), los anticuerpos anti-histona3 fosforilada (pH3) (1:200, SC-8656-R, Santa Cruz Biotechnology) y anti-aurora B (Aim1, 1:100, 611082, BD T ransduction Laboratories) se utilizaron para analizar el reingreso en el ciclo celular, la síntesis de ADN, la cariocinesis y la citocinesis, respectivamente. A continuación, las células se lavaron 3 veces con PBS y se tiñeron durante 45 minutos a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario adecuado. Esto fue seguido por 5 minutos de tinción con DAPI (dihidrocloruro de 4,6-diamidino-2-fenilindol). Las células se observaron bajo un microscopio de fluorescencia Nikon.

RT-PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN total se aisló usando el kit nucleospin ARN II (Macherey Nagel) según el protocolo del fabricante. El cDNA se sintetizó utilizando el kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems) según el protocolo del fabricante. La qRT-PCR se realizó utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) en el sistema Steponeplus Real-Time PCR (Applied Biosystems). Los valores para los genes específicos se normalizaron con respecto al control de mantenimiento de HPRT. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3

Análisis de la transferencia de Western

La transferencia de Western se realizó con el sistema de electroforesis SDS-PAGE. Se prepararon extractos de tejido cardíaco total y se transfirieron a membranas de PVDF. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-Agrn (sc-374117, Santa Cruz), anti-alfa-distroglicano (05-298, Millipore), anti-Gapdh (2118, Cell signaling technologies), Anti-cTnT (ab33589, Abcam) y anti-cTnI (ab47003, Abcam), anti-ERK₂ (sc-154, Santa Cruz), anti-fosfo-ERK (no.4370, Cell Signaling), anti-alfa-tubulina (T5168, Sigma-Aldrich). Se utilizó como anticuerpo secundario una peroxidasa de rábano picante anti-ratón, anti-conejo o anti-cabra (Sigma).

Análisis de inmunofluorescencia

Las secciones de corazón se sometieron a desparafinización y recuperación de antígenos por microondas en EDTA o tampón de ácido cítrico, seguido de enfriamiento gradual. Las muestras se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % en PBS durante 5 min y se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 5 % en PBS que contenía Triton al 0,1 % durante 1 h a temperatura ambiente. Después, las muestras se incubaron durante la noche a 4°C con los siguientes anticuerpos diluidos en solución de bloqueo de BSA al 3 % y suero de caballo al 1 %. Se usaron los anticuerpos anticTnT (1:200, ab33589, Abcam) y anti-cTnI (1:200, ab47003, Abcam) para identificar CMs. El Anticuerpo anti-Ki67 (1:200, 275R, Cell Marque), los anticuerpos anti-fosforilada-histona3 (pH3) (1:200, SC-8656-R, Santa Cruz Biotechnology) y anti-aurora B (Aim1, 1:100, 611082, BD Transduction Laboratories) se utilizaron para analizar el reingreso en el ciclo celular, la síntesis de ADN, la cariocinesis y la citocinesis, respectivamente. Otros anticuerpos utilizados en el estudio: anti-Agrn (1:200, sc-374117, Santa Cruz), anti fosfo-ERK₂ (1:200, M8159, Sigma Aldrich). Después de tres lavados con PBS, 10 min cada uno, las muestras se tiñeron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios fluorescentes (Abcam) seguidos de 10 min de tinción con DAPI (dihidrocloruro de 4',6-diamidino-2-fenilindol) para la visualización de núcleos. Los portaobjetos se montaron con Immu-mount (9990412, Thermo Scientific) y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Nikon Intensilight o Nikon eclipse 90i, Nikon) o un microscopio confocal de disco giratorio (Carl Zeiss).

Experimentos con ratones

Los experimentos fueron aprobados por el Animal Care and Use Committee of the Weizmann Institute of Science. Para realizar un seguimiento del linaje de las células del músculo cardíaco, aMHC-Cre y ROSA26-tdTomato los ratones se entrecruzaron. Los ratones aMHC-Cre llevan la secuencia codificante Cre insertada después del promotor de la cadena pesada de alfa miosina (aMHC), que puede impulsar la recombinación de genes de alta eficiencia en los CMs. Los ratones indicadores ROSA26-tdTomato albergan un alelo variante de proteína fluorescente roja condicional que requiere una recombinación mediada por CRE para su expresión. Este sistema permitió una visualización clara de los CMs etiquetados con RFP en cultivo. Los ratones ROSA26-tdTomato y aMHC-Cre se mantuvieron en un fondo C57BL/6. Para probar el efecto de agrina en la regeneración cardíaca Agrnflox/fox (43) se entrecruzaron para Agrnflox,flox; los ratones Mesp1-Cre (44). Mesp1 se expresa en el mesodermo naciente durante la gastrulación temprana y marca la mayoría de las poblaciones de progenitores cardíacos que incluyen la mayoría de las células cardíacas (CMs, fibroblastos y células endoteliales). El ratón knockout condicional permitió comprender la contribución de agrina a la regeneración cardíaca en crías neonatales (P1).

Infarto de miocardio

Se indujo infarto de miocardio en estadios P7 o adultos mediante ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda. Los ratones en P7 se anestesiaron enfriándolos en una cama de hielo durante 4 min, mientras que los ratones adultos se sedaron con isoflurano (Abbott Laboratories) y, tras la intubación traqueal, se ventilaron artificialmente. La toracotomía lateral en el tercer espacio intercostal se realizó mediante disección roma de los músculos intercostales después de la incisión en la piel. Después de la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda, se administraron inyecciones intramiocárdicas de agrina (50 gl a 20 gg/ml) o PBS. Después del tratamiento, las incisiones de la pared torácica se suturaron con suturas de seda no absorbibles 6.0 y la herida de la piel se cerró utilizando un adhesivo para la piel. Después, los ratones se calentaron durante varios minutos hasta que se recuperaron.

Ecocardiografía

La función cardíaca se evaluó mediante ecocardiografía transtorácica realizada en ratones sedados (isoflurano, Abbott Laboratories) utilizando un dispositivo Vevo 770 VisualSonics.

Histología

Se fijaron tejidos de corazón de ratón en paraformaldehído (PFA) al 4 % y se seccionaron. Para el análisis de la regeneración cardíaca juvenil y adulta después del procedimiento de infarto de miocardio, se cortaron secciones de parafina a través de todo el ventrículo desde el vértice hasta la base en secciones en serie con intervalos de 0,4 mm. Para el análisis de la regeneración cardíaca neonatal tras la resección, se cortaron frontalmente secciones de parafina para incluir desde la base hasta el vértice en cada sección. Se realizaron tinciones con hematoxilina-eosina (H&E), tricrómico de Masson y rojo Sirio según procedimientos estándar y se usaron para la detección de fibrosis. El tamaño de la cicatriz se cuantificó en la sección que contenía la región del músculo papilar utilizando el software ImageJ basado en la tinción tricrómica de Masson. El tamaño de la cicatriz adulta y juvenil se calculó como el tamaño de la cicatriz en relación con el tamaño total de la sección, mientras que el tamaño de la cicatriz neonatal se calculó como el tamaño de la cicatriz en relación con el tamaño del LV.

EJEMPLO 2

La ECM cardíaca en P1 aumenta la proliferación de CM de manera dependiente de MMP

Se determinó el efecto de la ECM cardiaca en el reingreso de CM durante el período de tiempo regenerativo en ratones {Porrello, 2011 #11}. Para ese propósito, los corazones de P1 y P7 se sometieron a descelularización (Figura 1A) para producir fragmentos de ECM libres de células, según lo confirmado por tinción con DAPI y microscopía electrónica de barrido (Figuras 1B-C). La administración de fragmentos de ECM de P1 in vitro promovió un aumento en la actividad del ciclo celular de CM tanto en P1 como P7, mientras que los fragmentos de ECM de P7 redujeron el reingreso al ciclo celular (Figuras 1D-F).

Para obtener más información sobre el mecanismo por el cual ECM de P1 induce la proliferación de CM, se administró al cultivo un inhibidor amplio de MMP (Marimastat). La adición del inhibidor a cultivos de CM que contenían fragmentos de ECM derivados de corazones de P1 suprimió la activación de la proliferación de CM por los explantes de ECM de P1 (Figuras 1G-H). La adición del inhibidor a cultivos de control o a cultivos con fragmentos de ECM derivados de corazones de P7 no influyó en la tasa de proliferación de CM (Figuras 1G-H).

Para validar la participación de MMP2/9 en la liberación de péptidos relacionados con ECM que inducen la proliferación de CM, se utilizó un ensayo de zimografía in situ (ISZ) que mide la escisión de sustratos, colágeno tipo 1 (Coll), colágeno tipo 4 (Col4) o gelatina en una señal fluorescente en presencia de fragmentos de ECM (Figura 1N). El mayor cambio observado entre los tres sustratos fue para Col4 y gelatinas, lo que sugiere una participación de la familia de MMPs gelatinasa, MMP2/9 (Figuras 1O-P).

A continuación, para probar si un ligando/péptido específico en la ECM de P1 escindida por MMP2/9 es suficiente para promover la proliferación de CM, la ECM de P1 se incubó con MMP2, MMP9 o MMP12 (Figura 11). Los explantes de ECM de P1 digeridos con MMP2/9 dieron como resultado un aumento sorprendente en la proliferación de CM de las células de P1 (Figura 1J) o de P7 (Figura 1K), mientras que los ligandos escindidos por MMP12 dieron como resultado un aumento en la proliferación de CM, aunque menor.

Para identificar proteínas únicas asociadas a ECM de P1 que contribuyan a la proliferación mejorada de CM, se analizaron proteínas relacionadas con ECM de P1 y de P7 escindidas con MMP9 mediante espectroscopia de masas (LC/MS) (Figura 1L). Esta técnica identificó una contribución previamente reportada de Tgfbi, un parálogo de Periostina que se demostró que promueve la proliferación de CM [12,45]. Otras proteínas de ECM que se enriquecieron en P1 frente a P7 incluyen Col18a1 (Endostatina) y Vcan (Figura 1M). Además, la agrina, un HSPG de ECM, se identificó como enriquecido en P1 en relación con los explantes de ECM en P7 (Figura 1M). Finalmente, los cambios observados en los niveles de expresión fueron validados por qRT-PCR en corazones enteros en P1 y en P7, que son consistentes con los resultados del análisis proteómico (Figura 1M). En conjunto, se demostró una metodología novedosa para diseccionar las moléculas promotoras de la proliferación de CM relacionadas con la ECM y la remodelación de MMP2/9 de la ECM cardiaca en P1, pero no en P7, puede conducir a la liberación posterior de estos ligandos que promueven la proliferación de CM in vitro.

EJEMPLO 3

Agrina derivada del endocardio/endotelio promueve la proliferación de CM

Después se probaron los niveles de expresión de la agrina en el corazón {Moll, 2001 #111; McKee, 2009 #112}. El análisis de inmunofluorescencia validó el hallazgo anterior que mostraba la regulación posterior de la expresión de agrina (ARN y proteína) en corazones de P7, en comparación con P1 (Figuras 2A-C). A continuación, se identificó la población celular que produce agrina. Para ello, las células cardíacas de P1 se separaron en 3 poblaciones diferentes: CMs, fibroblastos (FB) y células endoteliales (ECs). El enriquecimiento de las poblaciones de células CMs, FB y ECs se confirmó utilizando qPCR para marcadores conocidos de cada población celular (aMHC, CD90 y CD31, respectivamente, Figura 2I). La expresión de mRNA de la agrina se enriqueció significativamente en la población de EC en relación con todos los demás tipos de células (Figura 2D). La reducción de la expresión de la agrina durante la primera semana de vida se correlaciona con la pérdida de la respuesta regenerativa cardíaca en ratones, por lo tanto, puede sugerir un papel para la agrina durante el proceso de regeneración (como se muestra en las Figuras 3A-O).

Después se determinó la capacidad de la agrina para inducir la proliferación de CM en cultivo. El tratamiento con agrina dio como resultado un aumento dependiente de la dosis en la proliferación de CM, medido por tinción de inmunofluorescencia para marcadores de actividad del ciclo celular (Ki67), mitosis (fosfohistona H3) y citocinesis (Aurora B quinasa), y mediante el recuento del número de CM recién formados en P1 y P7 (Figuras 2E-H).

EJEMPLO 4

La agrina es necesaria para la regeneración cardíaca en ratones neonatales

Para comprender si se requiere agrina para la regeneración cardíaca al nacer después de la técnica de resección quirúrgica {Porrello, 2011 #11;Porrello, 2012 #38}, se eliminó condicionalmente la agrina en la mayoría de las poblaciones de células cardíacas cruzando ratones Mesp1-Cre+/-; Agrinflox/+ {Harvey, #113; Kitajima, 2006 #114} con Agrinflox/flox (Figura 3A). El análisis de la proteína agrina y la expresión de mRNA en corazones Mespl-Cre+/- ;Agrinflox/flox (Agrin-cKO) confirmaron que el alelo Agrin flox se eliminó eficientemente en el corazón (Figuras 3B-D). Curiosamente, en P1, los ratones Agrin-cKO expresaron proteínas sarcoméricas elevadas (cTnT y cTnI) (Figura 3C) con un marcado aumento en la organización sarcomérica como se ve en la tinción de cTnT (Figura 3H). La tinción de la membrana WGA reveló un pequeño aumento en el tamaño de las células cardíacas (Figuras 3E-F) que era consistente con la hipertrofia patológica elevada {Houweling, 2005 #115;Ye, 2003 #116}{Baum, 2011 #12} Marcador, actina esquelética (Acta1) {Black, 1991 #117} (Figura 3G). Además, la actividad del ciclo celular de CM se redujo significativamente en ratones Agrin-cKO después del nacimiento (Figuras 3H-I). Estos hallazgos sugieren que la agrina suprime los procesos de maduración de CM y, en ausencia de agrina, los CMs muestran un mecanismo compensatorio para la hipertrofia cardíaca y un aumento de la diferenciación.

A continuación, se investigó la cuestión de si la regeneración cardíaca se ve afectada en ratones Agrin-cKO. Para ello, los ratones de P1 se sometieron a resección cardíaca y se evaluó la regeneración cardíaca después de 1 y 4 semanas (por proliferación o por fibrosis respectivamente) (Figura 3J). El examen histológico usando tricrómico de Mason y tinción con rojo sirio mostró una fibrosis elevada en los ratones Agrin-cKO en relación con los compañeros de camada de tipo nativo (Figuras 3K-il). De acuerdo con estos hallazgos, la proliferación de CM se redujo significativamente en ratones Agrin cKO (Figura 3N). Tomados en conjunto, los presentes resultados sugieren que la agrina es un componente crucial durante la regeneración cardíaca y sugiere que puede desempeñar un papel como inhibidor de la diferenciación de CM durante la primera semana postnatal.

EJEMPLO 5

El tratamiento con agrina promueve la regeneración cardíaca después de un MI

A continuación, se investigó la cuestión de si la agrina podría promover de manera similar la proliferación de CM y la regeneración cardíaca en etapas juveniles y adultas. En consecuencia, los ratones de P7 y de P85 se sometieron a ligadura permanente de la arteria descendente anterior izquierda (LAD) que se trataron con agrina o PBS (Figura 4A). La inyección intramiocardial de agrina (1 gg en 50 gl) indujo el reingreso en el ciclo celular de CM en el miocardio sano adyacente a la región infartada de corazones tanto juveniles como adultos (Figuras 4B-E). Una sola inyección de agrina después del MI fue suficiente para mejorar la recuperación de la función cardíaca, como lo demuestra la ecocardiografía, tanto en modelos juveniles como adultos (Figuras 4F-G). Además, los ratones tratados con agrina tanto juveniles como adultos mostraron una retención significativa del grosor de la pared y protección de la cardiomiopatía dilatada, en contraste con los ratones tratados con PBS (Figuras 4F-G). Los análisis histológicos tanto en juveniles como en adultos revelaron una reducción significativa de la fibrosis, aunque el tejido fibrótico estaba presente en ambos tratamientos (Figuras 4H-I). Tomados en conjunto, los presentes resultados demuestran que la reintroducción de la agrina en corazones defectuosos facilita la regeneración cardíaca como resultado del aumento de la actividad del ciclo celular de CM y la citocinesis y la reducción posterior de la cicatrización y una mejor función cardíaca.

EJEMPLO 6

La agrina promueve la proliferación de CM a través de la activación de Dag1 y ERK

Informes anteriores sobre la señalización de agrina han implicado la inhibición de las bombas de Na+/K+, Lrp4-Musk o a-Distroglicano como posibles receptores moduladores de su actividad. Un trabajo anterior que se centró en la regeneración cardíaca en ratones después de un MI ha establecido que los niveles de transcripción del mRNA cardíaco de Lrp4 y MuSK son muy bajos {Haubner, 2012 #130}. Además, se ha demostrado que la agrina puede inhibir las bombas de Na+/K+ mediante la interacción directa con el fragmento CAF22 y, por lo tanto, afecta el latido de CM {Hilgenberg, 2009 # 103}. La mejora en la función cardíaca se puede atribuir a varios aspectos, uno de los cuales es la sincronización del latido del miocardio {Abraham, 2002 #118; Sullivan, 1989 #119}, así como la proliferación de CM adultas. No se observó ningún aumento en la proliferación de CM al inhibir la bomba (Figura 5J). Por lo tanto, se sugiere que la señalización de agrina está mediada por Dag1 en CMs. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que la señalización de agrina está mediada por Dag1 en CMs. Por eso, los presentes inventores intentaron identificar la población de células que expresan Dag1 que interactúan potencialmente con la agrina. El uso de qPCR para Dag1 reveló la expresión en todos los tipos de células aisladas de corazones de P1, sin embargo, su expresión fue particularmente enriquecida en CMs, este enriquecimiento se volvió más llamativo en cultivos de corazón de P8 (Figuras 5A-C). La actividad de la agrina se ha asociado con la activación de ERK durante la maduración de los monocitos {Aurora, 2014 #125}. De manera similar, los presentes inventores observaron la activación transitoria de ERK después del tratamiento con agrina in vitro, alcanzando un máximo a los 5 minutos con activación sostenida hasta 15 minutos después del tratamiento en cultivo de células cardíacas, medido por transferencia Western e inmunofluorescencia (Figuras 5D-E). A continuación, se examinó la cuestión de la interacción de la agrina con Dag1 y su requisito para la activación de ERK. De hecho, la adición de un anticuerpo de bloqueo (IIH6C4) dirigido contra el sitio de unión de Dag1-Agrin {Aurora, 2014 #125} disminuyó la activación de ERK inducida por la agrina (Figura 5F). Además, para comprender si se requería la interacción de la agrina con Dag1 y la posterior activación de ERK para la proliferación inducida por agrina; se añadieron el anticuerpo IIH6C4 y el inhibidor de MEK (PD0325901) a cultivos de células CM de P7 y se analizó la proliferación de CM (Figuras 5G-H). Como se esperaba, la inhibición de la activación de ERK o de la interacción Dag1-Agrin suprimió la proliferación de CM inducida por agrina.

Después de esto, los presentes inventores querían examinar si la señal de agrina-distroglicano se propagaba a través de la distrofina, para lo cual se usaron ratones mdx [55] en los que se abolió la expresión de distrofina.

Se cultivaron células cardíacas de ratones control y Mdx y se trataron con agrina. La proliferación de CM inducida por agrina no cambió entre los dos tipos de ratones (Figura 5I). En conjunto, la agrina indujo la proliferación de CM a través de la interacción con Dag1 y la posterior activación de ERK, de manera independiente a la distrofina.

EJEMPLO 7

La administración in vitro de agrina promueve la proliferación de CMs derivadas de iPSC humanas

Para comprender si la agrina podría promover la proliferación de CM en células derivadas de tejidos humanos, se añadió agrina a CMs derivados de iPSC humanas (hiPSC-CM) y se examinó mediante marcadores de proliferación. La administración in vitro de agrina promovió un aumento dependiente de la dosis de la actividad del ciclo celular de hiPSC-CM (Figuras 6A-B). Asimismo, la administración in vitro de agrina humana promovió un aumento dependiente de la dosis de la actividad del ciclo celular de hiPSC-CM (Figuras 6C-D).

EJEMPLO 8

ARN-seq de corazones tratados con agrina revela implicaciones para el mecanismo relacionado con la inmunidad de la agrina

Para evaluar el amplio efecto transcripcional del genoma de agrina en los corazones con infarto, se realizó un análisis de ARN-seq de corazones MI tratados con agrina. Se sometieron ratones adultos (3 meses) a ligadura de LAD o a operación simulada (véase Figura 4A). A los animales ligados con LAD se les inyectó de manera epimiocardial con agrina o PBS (vehículo) inmediatamente después del MI (Figura 8A). Los corazones se recogieron 3 días después del tratamiento y las muestras de ARN se purificaron y se sometieron a ARN-seq. Se comparó la expresión amplia del genoma de corazones con infarto tratados con PBS o agrina. Se expresaron diferencialmente 175 genes (umbral de cambio de veces > 1,5, valor de p < 0,05, véase la Figura 8B). Para centrarse en el efecto transcripcional relevante, los datos actuales se compararon con un ARN-seq previamente establecido de corazones infartados de tipo nativo, realizado por Ounzain et al. El perfil de todo el genoma del transcriptoma cardíaco después de un infarto de miocardio identifica nuevos RNAs largos no codificantes específicos del corazón. Eur Heart J 36, 353-368a, doi:10.1093/eurheartj/ehu180 (2015).

Esta comparación permitió definir los genes comunes que se expresan diferencialmente en corazones no tratados con infarto, sirviendo como una "firma MI". Se encontró que 558 genes se expresaron diferencialmente (en su mayoría regulados) en corazones con infarto en comparación con corazones operados de forma simulada, tanto en la configuración actual como en los conjuntos de datos de Ounzain (Figura 8C). Al observar estos genes en los corazones con infarto tratados con agrina, se encontró que la mayoría de ellos mostraban la tendencia opuesta en los corazones tratados con agrina en comparación con los corazones tratados con PBS (Figura 8C), lo que indica que estos genes comprenden la red transcripcional afectada por la agrina.

Para obtener información sobre los procesos celulares y moleculares que representa este conjunto de genes, el conjunto de genes se analizó utilizando el software de análisis de vías de ingenio (IPA). Curiosamente, al observar tanto las vías canónicas (Figura 8D) como los reguladores anteriores (Figura 8E), se encontró que muchos se relacionan con la modulación de la respuesta inmune relacionada con MI; es decir, se sabe que I16 promueve la apoptosis de los cardiomiocitos, Tgf-beta está bien establecido como un promotor de fibrosis y varias vías canónicas que regulan la migración y maduración de las células inmunitarias (señalización de extravasación de leucocitos, maduración de células dendríticas) también estuvieron implicadas. En las Figuras 8F-H se dan ejemplos de genes implicados en los diferentes términos enriquecidos. En conjunto, estos datos sugirieron que la agrina promueve la regeneración del corazón no solo a través de la proliferación de cardiomiocitos sino también mediante la modulación inmunológica, lo que podría cambiar la supervivencia de los cardiomiocitos, reduciendo así el tamaño del infarto y la cicatriz.

Aunque la invención se ha descrito junto con realizaciones específicas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

REFERENCIAS

(otras referencias se citan a lo largo de la solicitud)

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Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido de agrina que induce la proliferación de cardiomiocitos para su uso en el tratamiento de una enfermedad cardiaca, en el que dicho péptido de agrina no forma parte de un polipéptido de fusión y en el que dicho péptido de agrina comprende un dominio 1 similar a la laminina G (G1) y un dominio 2 similar a la laminina G (G2).

2. Un dispositivo implantable que comprende un péptido de agrina que induce la proliferación de cardiomiocitos, en el que dicho péptido de agrina no forma parte de un polipéptido de fusión y en el que dicho péptido de agrina comprende un dominio 1 similar a la laminina G (G1) y un dominio 2 similar a la laminina G (G2).

3. El péptido para uso o dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicho péptido de agrina está en una forma soluble.

4. El péptido para uso o dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho péptido de agrina comprende un fragmento de agrina humana.

5. El péptido para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha enfermedad cardiaca es una enfermedad cardiaca isquémica.

6. El péptido para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho péptido de agrina es de 80-110 kDa.