JP6162759B2

JP6162759B2 - ペプチドを有効成分とする血管関連疾患の治療剤組成物

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Description

本発明は、血管の新生及び保持において、血管壁を安定化して血液漏れを防ぎ、正常な血管の成長を助けることにより、浮腫及び虚血、並びにこれに関する血管疾患を治療する物質に関する。より詳細には、塩基性アミノ酸−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むペプチド及び／又は幹細胞を用いて正常な血管を生成及び維持することにより、血液漏れを防ぎ、血管関連疾患の治療剤として使用することに関する。

血管疾患の１つである虚血は、血管の狭窄、収縮、血栓、塞栓などにより、組織への血液供給が中断されて細胞損傷が起きる部分的な血液不足の症状である。

１９６１年、Ｍａｊｎｏ氏やＰａｌａｄｅ氏は、血液漏れが、ヒスタミン、ブラジキニン、セロトニンによる炎症反応によって小静脈の血管内皮細胞の間に生じる小さな空間（ギャップ）が生じて発生すると報告した(Majno G., Palade G. E., J. Biophys. Biochem. Cytol.11:571-605 (1961); Majno G., Palade G. E., Schoefl G. I., J. Biophys. Biochem. Cytol. 11:607-625 (1961))。

この血管内皮細胞間の空間は、炎症誘発物質のみならず、複数のサイトカイン(Claudio
L. et al., Lab Invest. 70:850-861 (1994); Wu N. Z., Baldwin A. L. Am. J. Physiol. 262:H1238-1247 (1992))、プロテアーゼ(Volkl K. P., Dierichs R. Thromb. Res. 42:11-20 (1986))、低温火傷(Clough G. et al., J. Physiol. 395:99-114 (1988))にさら
されて発生することが知られている。また、様々な種類の癌でもこのような現象が発見された(Hobbs S. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4607-4612 (1998); Roberts
W. G. et al., Am. J. Pathol. 153:807-830 (1998); Nishio S. et al., Acta. Neuropathol. (Berl) 59:1-10 (1983))が、癌以外にも、人間からは、喘息(Laitinen A., Laitiene L. A. Allergy Proc. 15:323-328 (1994))、色素性じんましん(Ludatscer R. M. Microrasc. Res. 31:345-355 (1986))、リウマチ(Schumacher H.R. Jr. Ann. N. Y. Acad. Sci. 256:39-64 (1975))などからも発見された。

血管の特性は非常に多様であるが、例えば、慢性炎症の場合は、血管拡張及び血管新生を含む血管の変形に関連づけられている。このとき、血管は、正常でない、異常な特徴を有する形に変形するが、マウスの慢性気道炎症モデルにおいて、血管の直径が増加し、フォンヴィレブランド因子（ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄＦａｃｔｏｒ）及びＰ−セレクチン（Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）に対する免疫反応が増加することが発見された。このように、変形した血管は、正常マウスに比べて免疫誘発物質の反応に弱いことがわかった。

このような理由から、血管の異常な成長や血液漏れを抑制又は減少させる物質が開発されている。ミスチクシンは、合成された合成物質であって、血管内皮細胞のギャップの形成を抑制せずに血液漏れを防ぐことが報告されている(Blauk P., et al., J. Pharmacol.
Exp. Ther., 284:693-699 (1998))。また、ベータ２−アドレナリン受容体作動薬フォルモテロールは、血管内皮細胞のギャップの形成を抑制すると、血液漏れを減少させるという結果が知られている(Blauk P. and McDonald D. M., Am. J. Physiol., 266:L461-468 (1994))。

このように、血管の形態的変化を起こす物質に関する研究が進められており、その１つであるアンジオポイエチンが注目されるようになった。アンジオポイエチン−１は、血管を安定させ(Thurston G. et al., Nat. Med. 6 (4): 460-3 (2000))、ＶＥＧＦの血管新
生を安定化する役割を果たし、結果的に、血液漏れを抑制する。この機序を用いて、慢性糖尿における抹消血管障害による網膜症などの疾患や、血管異形成による未熟児網膜症などの治療への適用に関する報告があった(Joussen A. M. et al., Am. J. Pathol. 160 (5): 1683-93 (2002))。しかし、組み換えアンジオポイエチン−１は、安定性や溶解度などの問題のため直接使用には限界があり、その代案として、アンジオポイエチン−１の活性を有する代替物質の開発が試みられている(Koh G. Y. et al., Exp. Mol. Med. 34 (1): 1-11 (2002))。最近、血小板は、血管形成時に形成された血管を安定化させるために活性化され、アンジオポイエチン−１を放出することが知られている(Huang et al., Blood 95:1993-1999 (2000))。また、血小板からアンジオポイエチン−１を放出するための血小
板の活性化にはトロンビンが関与することが報告されている(Li et al., Throm. Haemost. 85:204-206(2001))。しかし、トロンビンのこのような機能は、血管を安定化するため
にアンジオポイエチン−１のみを放出させるのではなく、血小板が凝固して発生する現象の一部でもある。そのため、トロンビンを用いてアンジオポイエチン−１の放出を調節することは困難であり、血液凝固による副作用が予想される。このほか、アンジオポイエチン−１の分泌を誘導する物質を探索しているが、それに関する報告はない。

従来のＲＧＤ及びＫＧＤモチーフを有するペプチドは、血管新生の形成を抑制することが知られている(Victor I. R. and Michael S.G. Prostate 39:108-118 (1999); Yohei M. et. al., J. of Biological Chemistry 276:3:31959-31968 (2001))。この効能は、Ｒ
ＧＤ及びＫＧＤモチーフを有するペプチドが血管内皮細胞のαｖβ３インテグリンに結合して生じると報告されている(Pasqualini R. et al., Nat. Biotechnol. 15 (6): 542-6 (1997))。インテグリンは、一般的に、細胞−細胞、細胞−基質間の媒介体であって、血
管内皮細胞の成長に欠かせないため(Brian P. Eliceiri, Circ. Res. 89:1104-1110 (2001))、インテグリンに結合してインテグリンの役割を抑制するディスインテグリンは、そ
のほとんどが、フィブリノーゲンの構造モチーフであるＲＧＤモチーフ又はＫＧＤモチーフを含む。このような理由から、多くのＲＧＤ及びＫＧＤモチーフを含むペプチドがインテグリンに結合して血管内皮細胞の成長及び移動を妨げることにより、血管新生の形成を抑制するという研究が行われている。また、国際特許ＷＯ９５／２５５４３（１９９５）の場合、組織内の脈管形成は、インテグリンαｖβ３を必要とし、これを抑制するＲＧＤ及びＫＧＤモチーフを含むペプチドを用いて脈管形成を抑制することにより、結果的に、血管新生を抑制し死滅させ、血液供給の低下を図っている。米国特許５，７６６，５９１（１９９８）においても、インテグリンαｖβ３の拮抗剤として、ＲＧＤ及びＫＧＤモチーフを含むペプチドを用いて血管新生の生成を抑制することにより、固形癌の増殖を抑制するとの内容が開示されている。

最近では、心臓疾患に使用するため、インテグリン中のフィブリノーゲンをリガンドとするαＩＩｂβ３に結合してこれを阻害する阻害剤を開発するための試みがあった(Topol
et al., Lancet 353:227-231(1999); Lefkovits et al., N. Eng. J. Med. 23: 15530-1559 (1995); Coller BS J. Clin. Invest. 99: 1467-1471))。しかし、このような試みは、成功していないとの結果も報告されている(O'Neill et al., N. Eng. J. Med. 342: 1316-1324 (2000); Cannon et al., Circulation 102: 149-156 (2000))。その理由として
、従来のＲＧＤ及びＫＧＤモチーフを含むペプチドは、インテグリンに結合してインテグリンの活性を抑制する機能があるだけでなく、濃度に応じてインテグリンを活性化させ、結局、血小板の活性を誘導することがある(Karlheinz et al., Throm. Res. 103: S21-27
(2001); Karlheinz et al., Blood 92 (9): 3240-3249 (1998))。インテグリンには、リガンドによって誘導される結合部位（Ｌｉｇａｎｄ−ＩｎｄｕｃｅｄＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ，ＬＩＢＳ）が存在するが、ＲＧＤ及びＫＧＤペプチドの結合は、インテグリンの構造的変化を誘導してＬＩＢＳを露出させ、露出したＬＩＢＳにリガンドが結合して血小板の活性が生じるとした(Leisner et al., J. Biol. Chem. 274:12945-12949(1999))。これは、低濃度で生じる現象であり、高濃度では生じない現象であると報告された。この
方法により、ＲＧＤ及びＫＧＤが血小板を活性化させ得る場合、活性時に分泌されるサイトカイン（例：エンジオポイエチン−１）によって血管形成が阻害されるというよりは、増加及び安定化に寄与することができる。

本発明では、前述したように、血管新生を抑制し死滅して血液の供給を低下させるというより、正常な血管の形成に寄与し、形成された血管を安定化させて血液漏れを抑制して血液供給を円滑にするという非常に相違する結果が得られた。これは、ＲＧＤ及びＫＧＤモチーフを含むペプチドがインテグリンに直接作用して血管新生の生成を抑制するのではなく、ＲＧＤ及びＫＧＤモチーフを含むぺプチドによる２次反応として、異常な血管新生の生成を抑制しつつ、正常な血管を形成して安定化させるだけでなく、血液漏れを防ぎ、眼球内疾患である糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、年齢関連黄斑変性症など、眼球内疾病の治療に効果的な上に、傷、火傷及び褥瘡、慢性潰瘍の治療及び予防に効果的であることを確認した。

また、脱毛症や白毛症の場合、血管と接触する毛包は、毛髪を形成する毛髄質、毛皮質、毛表皮を形成する役割を果たす。このとき、異常な血管の形成は、血液漏れなどにより血液供給が円滑でなければ、毛包の形成、つまり、毛髪が形成されないばかりか、毛幹を構成する毛根細胞内のメラニン小体の形成が正常になされず、髪色が白色に変化する白毛症を誘導することになる。このような症状も、本発明で提供される組成物により血管の形成を安定化することによって、血液漏れを抑制して血液の供給を円滑にすれば、治療及び予防に効果的であると予想される。このほか、肥満による心血管疾患、人工皮膚及び移植用血管治療剤、並びに虚血症などにも効果的であると予想される。

他の方法では、血管が損傷する段階において、正常な血管を新たに生成してその後に発生する病状の進行を防ぐ方法がある。ここでは、幹細胞を用いた眼球血管疾患の治療が試みられている。骨髄には、新しい血管を形成し得る血管内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌ、ＥＰＣ）を含むことが知られており、網膜血管を新生させるため、骨髄造血幹細胞を注入して造血幹細胞が血管内皮前駆細胞として作用することが報告されている(Grant M. B. et al., Nature Med. 8:607-612 (2002))。このような血管内皮前駆細胞は、循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）ＥＰＣ（ｃＥＰＣ）に変化し得、これらが血管新生に関与する。このほかにも、造血幹細胞（ＨＳＣ)、造血前駆細
胞（ＨＰＣ）などが新しい血管を形成し保持することに関与するとの報告があった(Rafii
S. et al., Nature Med. 9:7027-712 (2003))。治療目的のために、マウスの目の硝子体に骨髄由来造血幹細胞を投与することにより、造血幹細胞が網膜の血管生成の前駆体として作用し得ることが報告された(Otani A. et al., Nature Med. 9:1004-1010 (2002))。
幹細胞は、造血幹細胞のほか、胚性幹細胞、間充織幹細胞など、多様な種類の幹細胞が報告されている。造血幹細胞は、自家移植の場合は問題がないものの、同種又は異種間の移植には免疫拒絶反応を引き起こすという欠点があるが、これを解決する方法は未だ報告されていない。

そこで、本発明は、上記の問題を解決し、上記の必要性に応じてなされたものであって、その目的は、特定の配列を含むペプチドを用いて正常な血管を誘導する治療剤を提供することにある。

上記の目的を達成するため、本発明は、Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むペプチドを有効成分とする、浮腫及び／又は血管関連疾患の治療用組成物を提供する。

本発明において、前記ペプチドのＸａａアミノ酸は、Ａｒｇ又はＬｙｓであることが好ましく、前記ペプチド配列は、配列番号１又は配列番号２に記載のものが最も好ましい。

また、本発明において、前記ペプチド配列は、配列番号４、及び配列番号６〜配列番号１０に記載のものからなる群から選択される１つのペプチド配列を有することを特徴とする。

本発明の血管関連疾患は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、年齢関連黄斑変性症、緑内障、糖尿病による足の壊疽、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、皮弁の再生、心不全、急性後肢虚血、傷や火傷の治癒及び褥瘡、慢性潰瘍、毛細血管の形成を用いた脱毛症又は白毛症、肥満による心血管疾患、人工皮膚及び移植用血管治療剤、並びに虚血症からなる群から選択される疾患であることを含むが、これらに限定されない。

更に、ＲＧＤ及びＫＧＤモチーフを含むペプチドが、血液の浮腫及び虚血による傷や火傷の治癒及び褥瘡、慢性潰瘍の治療及び予防に効果的であることを確認できるだけでなく、毛細血管の形成を用いた脱毛症又は白毛症、肥満による心血管疾患の治療に効果的であると予想される。

また、本発明の前記ペプチドは、アンジオポイエチン−１の分泌を誘導することを特徴とする。

更に、アンジオポイエチン−１の変形であるＣＯＭＰ−Ａｎｇ１が、一側尿管結紮（
ＵＵＯ）モデルにおいて、腎臓の血管内皮細胞を保護することにより、単球やマクロファージの浸透を防いで炎症反応を抑制し、ＴＧＦ−β１の組織内の量を減少させることで、Ｓｍａｄ２／３のリン酸化を抑制させ、Ｓｍａｄ７を活性化させ、腎臓の繊維化を減少させることが報告された(Kim et al., J. Am. Soc. Nephrol. 17: 2474-2483 (2006))。こ
れは、アンジオポイエチン−１が腎臓繊維化疾患において血管内皮細胞に特異的に作用することにより、腎臓疾患を治癒できる治療剤として使用可能であることを示している。本発明で示しているＲＧＤ又はＫＧＤを含むポリペプチドも、生体内で間接的にアンジオポイエチン−１の放出を誘導することにより、腎臓疾患の治療に有用であると考えられる。

本発明は、Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むポリペプチド単独、若しくはＶＥＧＦ(Benest et al., Microcirculation. 13:423-437(2006))又はｂＦＧＦと共に使用した場合
、更に効果的であり得る。

また、本発明は、前記ペプチドに、幹細胞を更に含むことを特徴とする、血管関連疾患の治療用組成物を提供する。

本発明において、前記幹細胞は、少なくとも血管内皮細胞に分化し得る能力を有する幹細胞、例えば、胚性幹細胞、間充織幹細胞、造血幹細胞であることが好ましい。

更に、本発明の幹細胞を含む組成物で治療可能な血管関連疾患は、肺高血圧、虚血性心筋症、皮弁の再生、心不全、急性後肢虚血、又は眼球疾患であることを特徴とするが、これらに限定されない。

本発明に記載の虚血による疾患の治療効果を有するペプチドは、Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むペプチド又は機能的にこれと同じ効果を有する切片、変異体などを含み、幹細胞を用いた治療の場合、Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むポリペプチドと共に使用することが好ましい。

本発明のタンパク質及び幹細胞により治療又は予防可能な血管新生疾患は、肺高血圧(pulmonary hypertension;Ann Thorac Surg 2004 feb 77 (2) 449-56)、虚血性心筋症(ischemic myocardium with VEGF; Biochem Biophys Res Commun. 2003 Oct 24;310 (3):1002-9)、皮弁の再生(skin flap survival;Microsurgery. 2003;23 (4):374-80)、心不全(heart failure; Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2002;67:417-27)、急性後肢虚血(acute hindlimb ischemia (with VEGF); Life Sci 2003 jun 20;73 (5):563-79)などのように、アンジオポイエチン−１の分泌を誘発して血管新生の安定化を治療機序とする疾患が好ましく、眼球疾患が更に好ましい。

本発明において適用可能な眼球疾患は、特に、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、緑内障などである。

本発明の薬学的に受容可能な組成物は、例えば、受容可能な希釈剤、添加剤、又は担体を含む。

本発明の薬学的に受容可能な組成物は、体内組織又は体外組織、又は器官への運搬又は投与に適した薬学的に受容可能な組成物に、前記ペプチドを含む。

前記薬学的組成物は、例えば、本発明のペプチド及び／又はタンパク質が、酸性及び／又は塩基性末端及び／又は側鎖を含むことができるため、遊離酸又は塩基の形態、又は薬学的に受容可能な塩形態の薬学的組成物として含み得る。薬学的に受容可能な塩は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸及びそれらの誘導体などの無機酸；並びに、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタリンスルホン酸、スルファニル酸及びそれらの誘導体などの有機酸を含む本発明のペプチド及び／又はタンパク質と塩を形成し得る適当な酸を含み得る。対象タンパク質と塩を形成し得る適当な塩基は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム及びそれらの誘導体などの無機塩基；並びに、モノ−、ジ−及びトリ−アルキルアミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン及びそれらの誘導体）及び選択的に置換されたエタノールアミン（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン及びそれらの誘導体）などの有機塩基を含み得る。

前記薬学的組成物は、非経口、経腸、局所又は吸入を含むが、これらに限定されない、あらゆる投与経路に適した様々な形態であり得る。非経口投与は、注射投与（すなわち、静脈内、筋肉内及び下記に記載したものと類似のもの）を含むが、これらに限定されない、消化管を通さないあらゆる投与経路を意味する。経腸投与は、錠剤、カプセル、経口溶液、懸濁液、スプレー及びその類似体を含むが、これらに限定されない、経口投与のあらゆる形態を意味する。このため、経腸投与は、直腸及び膣内投与の経路を意味する。局所投与は、クリーム、軟膏、ゲル、そして、経皮パッチを含むが、これらに限定されない、皮膚を通したあらゆる投与経路を意味する(また、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th eds. Gennaro, et al., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania, 1990参照)。

本発明の非経口的薬学組成物は、例えば、静脈（静脈内に）、動脈（動脈内に）、筋肉（筋肉内に）、皮膚（皮下又はデポ組成物内に）下、心嚢、管状動脈に、注射により、又は組織又は器官への運搬用溶液として用いられ投与可能である。

注射可能な組成物は、静脈内、動脈内、管状血管内、心膜、血管周辺、筋肉内、皮下及び関節を含むが、これらに限定されない、注射投与の経路に適した薬学的組成物であり得る。注射可能な薬学的組成物は、心臓、心嚢又は管状動脈への直接投与に適した薬学的組
成物であり得る。

経口投与のため、前記薬学製剤は、例えば、結合剤（例えば、プリゼラチン化したトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース又はカルシウム水素リン酸塩）；潤滑剤（例えば、マグネシウムステアリン酸塩、滑石又はシリカ）；分解剤（例えば、ジャガイモ澱粉又はグリコール酸澱粉ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓｔａｒｃｈｇｌｙｃｏｌａｔｅ））；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に受容可能な添加剤及び通常の方法によって製造された錠剤又はカプセルの形で摂取可能である。前記錠剤は、当業界における周知の方法によってコーティングされ得る(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th eds. Gennaro et al., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania, 1990参照）。

経口投与用の薬学組成物溶液は、例えば、溶液、シロップ又は懸濁液の形で摂取され得るか、若しくはこれらを使用する前に水又は他の適当な担体及び構成のための乾燥産物であり得る。そのような薬学組成物溶液は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化した食用脂肪）；エマルジョン化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；不溶性担体（例えば、アーモンド油、オイルエステル、エチルアルコール又は分画化した植物油）；並びに、保存剤（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）のような薬学的に受容可能な添加剤及び通常の方法によって製造可能である。

前記薬学組成物は更に、必要に応じて、緩衝塩、香料、色素及び甘味料を含むことができる。

経腸用の薬学組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、又はドロップ（ｌｏｚｅｎｇｅ）の形で経口投与に適合可能である。直腸及び膣内投与経路のため、本発明のペプチド及び／又はタンパク質は、溶液（浣腸乳脂）、座薬又は軟膏として製造可能である。経腸薬学組成物は、高カロリー輸液（ＴＰＮ）混合物又は摂取チューブによる運搬用のような摂取混合物の混合液に適合可能である(Dudrick et al., 1998, Surg. Technol. Int. VII: 174-184; Mohandas et al., 2003, Natl. Med.J. India 16 (1): 29-33; Bueno et al., 2003, Gastrointest. Endosc. 57 (4): 536-40; Shike et al., 1996, Gastrointest. Endosc. 44 (5): 536-40参照)。

吸入による投与のため、本発明のペプチド及び／又はタンパク質は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適当なガスのような適した推進剤で加圧された容器から、通常、エアロゾールスプレーの存在又はネブライザの形で運搬可能である。加圧されたエアロゾールの場合、前記容量単位は、計量された量を運搬するバルブを提供して決定され得る。乳糖又は澱粉のような適当な粉末ベースと前記化合物の粉末混合物を含む吸入剤又は吹入器に用いるため、カプセル、及び、例えば、ゼラチンカートリッジを製剤化することができる。

本発明の点眼剤は、水溶性点眼液、不溶性点眼液又は点眼エマルジョンであり得る。本発明の点眼剤は、本発明のペプチドを、水溶性溶媒で滅菌された精製水又は生理食塩水、不溶性溶媒により、綿実油、大豆油などの植物油に溶解したり懸濁させて製造する。この場合、必要に応じて、等張化剤、ｐＨ調節剤、増粘剤、懸濁剤、エマルジョン化剤、保存剤、及びこれらと類似の薬学的に受容可能な添加剤が添加され得る。詳細には、前記等張化剤は、塩化ナトリウム、ホウ酸、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、Ｄ−マンニトール、ブドウ糖などを含む。ｐＨ調節剤の特定例としては、ホウ酸、無水硫酸ナトリウム、塩酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸カリウム、炭酸ナトリウム、ホウ砂などを
含む。増粘剤の特定例としては、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどを含む。懸濁剤の特定例としては、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン水素化ひまし油などを含む。エマルジョン化剤の特定例としては、ヨークレシチン、ポリソルベート８０などを含むが、これらに限定されない。保存剤の特定例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼソニウム、クロロブタノール、フェニルエチルアルコール、パラオキシ安息香酸エステルなどを含むが、これらに限定されない。

本発明の組成物は、血管関連疾患の治療が必要な対象に投与される。そのような組成物の毒性及び治療学的有効性は、細胞培養又はＬＤ_５０（一群の５０％致死量）の測定及びＥＤ_５０（一群の５０％が治療学的に有効な量）の測定といった、実験動物において標準薬学的手順によって決定可能である。毒性効果と治療学的効果との投与量の割合は治療係数であり、それは、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０の割合で表示され得る。大きな治療係数を有する組成物が好ましい。

一実施例において、細胞培養分析及び動物研究から得られたデータは、人間に適用するための投与量の範囲を設計するのに利用可能である。本発明の組成物の投与量は、好ましくは、毒性がないか、若しくはほとんどないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、この範囲内で適用された剤形及び利用された投与経路によって多様である。本発明の方法で使用された組成物において、治療学的に有効な投与量は、初期に細胞培養分析から測定され得る。投与量は、細胞培養で決定されたように、ＩＣ_５０（すなわち、５０％阻害濃度）を含む血漿濃度範囲を得るため、動物モデルから設計される。このような情報は、人間にとって有用な投与量をより正確に決定するために使用され得る。血漿内レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによっても決定可能である。

他の実施例において、本発明のペプチド及び／又はタンパク質を含む組成物の有効量は、ヒト患者に対して体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜約１０ｍｇの範囲で投与され、好ましくは、約１μｇ〜約１０００μｇの範囲で投与され得る。投与されるペプチド及び／又はタンパク質の量は、０．１，０．２，０．５，１，２，５，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，２００，２５０，３００，４００，５００又は１０００μｇである。

更に他の実施例において、本発明の組成物の有効量は、血管注射の場合、体重１ｋｇあたり１μｇ〜１０ｍｇの範囲であり、眼球注射の場合、ヒトの眼球あたり１ｎｇ〜１ｍｇの範囲であり、点眼剤の場合、点眼液１ｍｌあたり１ｎｇ〜１０ｍｇの範囲であることを確認した。このような服用量は、好ましくは、皮内又は皮下投与される。このような投与量は、１回又は毎日、隔日、毎週、隔週又は毎月のように繰り返し投与され得る。

以下、本発明を説明する。

本発明では、Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むペプチドが、虚血による血管疾患に有効であることを初めて確認し、この過程で、アンジオポイエチン−１の分泌が起こり得ることを初めて確認した。異常な血管新生の形成に関する疾患の治療の可能性を、２つの細胞株に対するアンジオポイエチン−１の分泌及び角膜血管新生のマウスモデルなどで確認し、幹細胞とＸａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むポリペプチドとを同時に用いて、異常な血管新生に関する治療の可能性について、酸素分圧の変化を用いた網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルからその効果を確認した。

また、創傷治癒のマウスモデルにおいて、Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むポリペプチドを処理した結果、創傷治癒に効果的であることを確認しており、これは、傷、火傷の
治癒、褥瘡及び慢性潰瘍だけでなく、正常な毛細血管の形成を利用した脱毛症又は白毛症、肥満による心血管の治療及び予防に使用可能であることを示している。

合成製剤したＸａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むポリペプチドを、２つの細胞株に各濃度で処理した結果、Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含むポリペプチドは、アンジオポイエチン−１の分泌を誘導するという新たな現象を発見した。このような作用は、角膜血管新生の動物モデルにおいて、正常血管の形成を助け、血管の構造を安定化させることにより、異常な血管構造の特徴を有する病的な血管新生の血管の血液漏れの現象を減少させることが確認できた。また、血管新生の重要な因子である血小板におけるヒト正常細胞株の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の分泌を抑制することを確認できた。更に、幹細胞を含む単核細胞群（Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ，ＭＮＣｓ）とＸａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むポリペプチドとを同時に投与する実験を行った結果、酸素分圧の変化を用いた網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルにおいて、異常な血管の生成からみられる血液漏れ及び血管構造の変異を抑制し、正常な血管を生成し、血管の構造を安定化させることを確認した。したがって、本発明は、眼球疾患のうち、血管の正常発生抑制過程によって発生する疾患である未熟児網膜症、正常血管構造の破壊などによって発生する異常な血管新生に関する疾患である糖尿病性網膜症及び年齢関連黄斑変性症などに用いられることが好ましい。

図１は、血管生成因子によるマウスの角膜血管新生の生成を誘発させる動物モデルにおいて、マウスの角膜にポケットを設け、ＶＥＧＦペレットを注入する過程を示す写真である。図２は、ＶＥＧＦによってマウスの角膜血管新生の生成を誘発させる動物モデルにおいて、腹腔注射したＲＧＤ配列を有するポリペプチドによって正常血管の生成を向上させ、異常血管は抑制することを、解剖顕微鏡で観察した写真である。図３は、ＶＥＧＦによってマウスの角膜血管新生の生成を誘発させる動物モデルにおいて、腹腔注射したＲＧＤ配列を有するポリペプチドによって正常血管の生成を向上させ、異常血管は抑制することを、蛍光物質のＦＩＴＣ−デキストランを用いて観察した写真である。図４は、ＶＥＧＦによってマウスの角膜血管新生の生成を誘発させる動物モデルにおいて、腹腔注射したＲＧＤ配列を有するポリペプチドによる血管の生成を数値化したグラフである。図５は、高圧酸素処理（７５％）後、正常酸素分圧に低下させて網膜血管新生を誘発させる動物モデルにおいて、高酸素圧にさらされて正常な血管が新生されないマウスの網膜（Ａ）と、正常酸素分圧で生育したマウス（Ｂ）の網膜とを比較した写真である。図６は、高圧酸素処理（７５％）後、正常酸素分圧に低下させて網膜血管新生を誘発させる動物モデルにおいて、腹腔注射したＲＡＤ配列（配列番号３）を有するポリペプチドでは、血管の生成が正常に行われていない反面（Ａ）、ＲＧＤ配列を有するポリペプチド（ポリペプチド１、２）によって正常な血管が生成され、血管の血液漏れが減少していること（Ｂ、Ｃ）を、蛍光物質のＦＩＴＣ−デキストランを用いて観察した写真である。図７は、高圧酸素処理（７５％）後、正常酸素分圧に低下させて網膜血管新生を誘発させる動物モデルにおいて、腹腔注射したＲＧＤ配列を有するポリペプチド（配列番号６、７−Ａ、Ｂ）によって正常な血管が生成され、血管の血液漏れが減少していることを、蛍光物質のＦＩＴＣ−デキストランを用いて観察した写真である。図８は、高圧酸素処理（７５％）後、正常酸素分圧に低下させて網膜血管新生を誘発させる動物モデルにおいて、腹腔注射したＲＧＤ配列を有するポリペプチド（配列番号８）によって正常な血管が生成され、血管の血液漏れが減少していることを、蛍光物質のＦＩＴＣ−デキストランを用いて観察した写真である。図９は、高圧酸素処理（７５％）後、正常酸素分圧に低下させて網膜血管新生を誘発させる動物モデルにおいて、腹腔注射したエキスタチン（ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）、キストリン（ｋｉｓｔｒｉｎ）によって正常な血管が生成され、血管の血液漏れが減少していることを、蛍光物質のＦＩＴＣ−デキストランを用いて観察した写真である。図１０は、高圧酸素処理（７５％）後、正常酸素分圧に低下させて網膜血管新生を誘発させる動物モデルにおいて、腹腔注射したＲＧＤ配列を有するポリペプチド（配列番号６、８）によって内側の神経節（ｇａｎｇｌｉｏｎ）細胞層が、陰性対照群（Ｂ）と比較して、正常マウス（Ａ）のように肥厚せずに正常な厚さを維持していること（Ｃ、Ｄ）を、Ｈ＆Ｅ染色組織を用いて観察した写真である。図１１は、マウスの骨髄から単核細胞全体を分離した後、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）−３３３４２（Ａ）及びＦＩＴＣ（Ｂ）で蛍光染色した後、顕微鏡で観察した写真である。図１２は、高圧酸素処理（７５％）後、正常酸素分圧に低下させて網膜血管新生を誘発させる動物モデルにおいて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号５）の単独投与（Ａ）、単核細胞の単独投与（Ｂ）、及びＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号５）と単核細胞とを同時に腹腔注射した後、生後２０日目の網膜を分離して観察したもの（Ｃ）であり、単核細胞を単独投与したものに比べて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドを同時に投与したとき、正常な血管が生成され、血管の血液漏れが減少していることを、蛍光物質のＦＩＴＣ−デキストランを用いて観察した写真である。図１３は、高圧酸素処理（７５％）後、正常酸素分圧に低下させて網膜血管新生を誘発させる動物モデルにおいて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号５）の単独投与（Ａ）、単核細胞の単独投与（Ｂ）、及びＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号５）と単核細胞とを同時に腹腔注射した後、生後２７日目の網膜を分離して観察したもの（Ｃ）であり、単核細胞を単独投与したものに比べて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドを同時に投与したとき、正常な血管が生成され、血管の血液漏れが減少していることを、蛍光物質のＦＩＴＣ−デキストランを用いて観察した写真である。図１４は、創傷のマウスモデルにおいて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドを処理した結果、対照群に比べて、傷の大きさが有意に減少していることを示す写真である。図１５は、創傷のマウスモデルにおいて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドを処理した結果、対照群に比べて、傷の大きさが有意に減少していることを図式化したグラフである。図１６は、創傷のマウスモデルにおいて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドを処理した結果、対照群に比べて、傷組織の下に、正常マウスのように小さな毛細血管が太い血管で形成されていることを示すＨ＆Ｅ染色組織写真である。図１７は、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドを処理した肉腫細胞株においてアンジオポイエチン−１の分泌を示す写真である。図１８は、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドを処理したマウス血清においてアンジオポイエチン−１の分泌を示す写真である。図１９は、ＫＧＤ配列を有するポリペプチドを処理した肉腫細胞株においてアンジオポイエチン−１の分泌を示す写真である。図２０は、血小板からＲＧＤ配列を有するポリペプチド（配列番号５）による血小板由来成長因子の生成抑制を測定したグラフである。

［実施例］
以下、非限定的な実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。

実施例１：無血管組織である眼球角膜組織において、ＶＥＧＦによって誘導された血管新生の容量に応じたＲＧＤ配列を含むポリペプチドの処理効果
ＲＧＤ配列を含むポリペプチドの眼球内血管新生の生成にどのような影響を与えるのかを調べるため、マウスの角膜にマイクロポケットを設け、ＶＥＧＦ３００ｎｇを含むペレットを挿入して血管新生を誘導させるモデルを作成した（図１）。このとき、ポリペプチドの効能を確認するため、ポリペプチド１．３ｐｍｏｌ（０．７５ｎｇ／ｋｇ）、１３０ｐｍｏｌ（７５ｎｇ／ｋｇ）を腹腔注射した。それから５日後、血管新生が生成されているか否かを観察するため、マウスの目を解剖顕微鏡で観察した。その結果、ＶＥＧＦを含まないペレットを挿入したマウスの場合（図２及び図３のＡ）、血管が観察されず、ＶＥＧＦペレットを挿入した陽性対照群では、血管の生成を観察することができた（図２及び図３のＢ）。しかし、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドの腹腔注射時に、それぞれ１．３ｐｍｏｌ（図２及び図３のＣ）、１３０ｐｍｏｌで微細血管の生成及び血管網の構成が観察されることにより、成長の抑制ではない、血管の増殖を誘導することを確認した（図２及び図３のＤ）。血管の生成を定量化するため、各群の血管の長さを測定したとき、陽性対照群の場合、血管の全長が０．４３±０．０２ｍｍであり、ｃｙｃＲＧＤの場合、１．３ｐｍｏｌ処理群は、０．６５±０．０１ｍｍ、１３０ｐｍｏｌ処理群の場合は、０．６９±０．０３ｍｍであって、有意な増加を確認することができた（図４）。

一方、実験に用いられたマウスにおいて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドによる角膜混濁のような副作用は全く見受けられなかった。

実施例２：酸素分圧の変化を用いた網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルにおいて、ＲＧＤ配列を有するポリペプチド（配列番号１、２）の効果
酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成は、人間の未熟児網膜症や糖尿病性網膜症のような様相を示している。出生初期に高酸素環境（７５％）にさらしたマウスを、再び正常酸素分圧（２０％）に復帰させると、異常な血管新生を自発的に生成する原理を用いて実験を行った(Higgins RD. et al., Curr. Eye Res. 18:20-27 (1999); Bhart N. et al., Pediatric Res. 46:184-188 (1999); Gebarowska D. et al., Am. J. Pathol.
160:307-313 (2002))。このため、酸素分圧を調節可能な装置にて、生後７日後、７５％の酸素分圧を維持する高圧酸素環境で５日間放置した後、正常酸素分圧である２０％の酸素圧で５日間更に放置する。このとき、５日間、１日に１回、ＲＧＤ配列を含むペプチド（配列番号１又は配列番号２）を、マウスに腹腔内投与して網膜内血管新生を観察した。血管を観察するため、生理食塩水１ｍｌに２×１０^６分子量のＦＩＴＣ−デキストラン５０ｍｇを溶解した溶液を、左心室から注入した。注入後、直ちにマウスの眼球を摘出した。摘出した眼球は、生理食塩水で洗浄した後、４％のパラホルムアルデヒドで４時間〜２４時間固定した後、眼球からレンズを除去し、網膜をスライドガラス上に平らに広げた後、グリセリン−ゼラチンでシールし、蛍光顕微鏡を用いて観察した。

正常酸素分圧で生育したマウスの場合、網膜全般にわたって均一な血管の分布を確認することができた（図５のＢ）が、高圧酸素処理後、生理食塩水のみで処置したマウスの場合、血管新生の形はそのほとんどが異常であり、虚血が発生したことを観察した（図５のＡ）。また、高圧酸素処理したマウスは、正常なマウスに比べて、発生段階の正常網膜の血管組織が正常に発生しておらず、対照群として用いられたＲＡＤ配列を含むポリペプチドの処理時にも、網膜血管が正常に形成されていないことを観察した（図６のＡ）。しかし、ＲＧＤ配列を有するポリペプチド１μｇ／ｋｇ／ｄａｙ（図６のＢ、Ｃ）では、異常な血管新生の形態的特徴は観察されず、正常発生する血管が正常に形成されていることが観察された。これは、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドが正常血管の成長を助ける役割を果たすことから、非常に興味深い結果であって、酸素分圧の変化を用いた網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルにおいて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドは、低酸素領域を
縮小し、結局、血管新生の生成原因を除去することにより、病的な血管形成阻害効果を示し、未熟児網膜症のような眼球疾患の治療剤として使用可能であることを示している。また、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドの処理が血管の構造を安定化させて血液漏れが生じないことを、ＦＩＴＣ−デキストランという蛍光物質の漏洩検査によって観察した。ＦＩＴＣ写真において、蛍光漏れによって浸出して見える部分は、つまり、血管に穴があいて血液が漏れることを意味する。結局、蛍光が浸出する現象が本発明のペプチドによって減少したことは、その分、血管の損傷を防止したと解釈される。

網膜血管には、脳血管の血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ−Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）のような血液網膜関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｒｅｔｉｎａ−Ｂａｒｒｉｅｒ：ＢＲＢ）があるため、大きな分子は血管を通りにくい。ＦＩＴＣ−デキストランのような比較的高分子が網膜から浸出したということは、網膜血管の微細構造に大きな損傷があったことを意味し、ＲＧＤを含むポリペプチドによるエンジオポイエチンの分泌がその損傷を防止したことを、実験によって証明した。したがって、糖尿病性網膜症及び年齢関連黄斑変性症のような疾患の初期（初期には血管新生が発生しない）に血管の血液漏れなどの異常により疾患が発生した場合も、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドが血管構造を保持させることにより、これら疾患の初期治療剤として使用可能である。

実施例３：酸素分圧の変化を用いた網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルにおいて、ＲＧＤ配列を有するポリペプチド（配列番号６、７）の効果
実施例３は、実施例２で述べているように、酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルを用いて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号６、７）の効果を確認した。実施例２のように、正常酸素分圧で生育したマウスの場合、網膜全般にわたって均一な血管の分布を確認することができ（図５のＢ）、高圧酸素処理後、生理食塩水のみで処置したマウスの場合、血管新生の形はそのほとんどが異常であり、虚血が発生したことを観察した（図５のＡ）。ＲＧＤ配列を有するポリペプチド１μｇ／ｋｇ／ｄａｙ（図７のＡ、Ｂ）では、異常な血管新生の形態的特徴は観察されず、正常発生する血管が正常に形成されていることが観察された。これは、実施例２のように、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドが正常血管の成長を助ける役割を果たすことを意味する。ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号６，７）は、糖尿病性網膜症及び年齢関連黄斑変性症のような疾患の初期（初期には血管新生が発生しない）に血管の血液漏れなどの異常により疾患が発生した場合、血管構造を保持させることにより、これら疾患の初期治療剤として使用可能である。

実施例４：酸素分圧の変化を用いた網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルにおいて、ＲＧＤ配列を有するポリペプチド（配列番号８）の効果
実施例４は、実施例２で述べているように、酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルを用いて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号８）の効果を確認した。ＲＧＤ配列を有するポリペプチドを１μｇ／ｋｇ／ｄａｙで処理した結果、異常な血管新生の形態的特徴は観察されず、正常発生する血管が正常に形成されていることが観察された（図８）。これは、実施例２のように、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドが正常血管の成長を助ける役割を果たすことを意味する。ＲＧＤ配列を含むポリペプチドは、糖尿病性網膜症及び年齢関連黄斑変性症のような疾患の初期（初期には血管新生が発生しない）に血管の血液漏れなどの異常により疾患が発生した場合、血管構造を保持させることにより、これら疾患の初期治療剤として使用可能である。

実施例５：酸素分圧の変化を用いた網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルにおい
て、エキスタチン（配列番号９）及びキストリン（配列番号１０）の効果
実施例５は、実施例２で述べているように、酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルを用いて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドであるエキスタチン及びキストリンの効果を確認した。実施例２のように、正常酸素分圧で生育したマウスの場合、網膜全般にわたって均一な血管の分布を確認することができ（図５のＢ）、高圧酸素処理後、生理食塩水のみで処置したマウスの場合、血管新生の形はそのほとんどが異常であり、虚血が発生したことを観察した（図５のＡ）。エキスタチン及びキストリン１μｇ／ｋｇ／ｄａｙ（図９）では、異常な血管新生の形態的特徴は観察されず、正常発生する血管が正常に形成されていることが観察された。これは、実施例６のように、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドが正常血管の成長を助ける役割を果たすことを意味する。

実施例６：酸素分圧の変化を用いた網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルの組織写真において、ＲＧＤ配列を有するポリペプチド（配列番号６、８）の効果
実施例６は、実施例２で述べているように、酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルを用いて、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号６、８）の効果を組織染色して確認した。実施例２のように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、酸素分圧を調節可能な装置にて、生後７日後、７５％の酸素分圧を維持する高圧酸素環境で５日間放置した後、正常酸素分圧である２０％の酸素圧で５日間更に放置する。このとき、５日間、１日に１回、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号６、８）をマウスに腹腔内投与して網膜を摘出した後、６μｍのパラフィン切断（ｐａｒａｆｆｉｎｃｒｏｓｓｓｅｃｔｉｏｎ）を行いＨ＆Ｅ組織染色し、顕微鏡で観察した。正常マウスの場合、網膜層の内側の神経節細胞層が肥厚せずに正常な厚さを維持していることを示し（図１０のＡ）、陰性対照群として、酸素分圧の差により網膜層の内側の神経節細胞層が異常に肥厚していることを観察した（図１０のＢ）。ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号６、８）を処理した場合は、正常マウスと同様に、陰性対照群と比較して、網膜層の内側の神経節細胞層が肥厚せずに正常な厚さを維持していることを示している（図１０のＣ、Ｄ）。これは、実施例３、４のように、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドが正常血管の成長を助ける役割を果たすことを意味するだけでなく、網膜層の内側の神経節細胞層が肥厚せずに正常な厚さを形成して網膜が正常に維持されることを意味する。この結果も、ＲＧＤ配列を有するポリペプチド（配列番号６、８）は、糖尿病性網膜症及び年齢関連黄斑変性症のような疾患の初期（初期には血管新生が発生しない）に血管の血液漏れなどの異常により疾患が発生した場合、血管構造を保持させることにより、これら疾患の初期治療剤として使用可能であるという更なる証拠を示している。

実施例７：酸素分圧の変化を用いた網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルにおいて、ＲＧＤ配列を有するポリペプチド及び単核細胞群の効果
単核細胞群の準備
単核細胞群を分離するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両側の大腿骨と脛骨とを分離して、５０ユニットのヘパリンを含むＤＭＥＭ培地に浸漬した。分離された大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を得るため、分離された骨の骨頭及び骨端部位を切断して骨髄腔を露出させた後、２２Ｇ注射針を用いて、露出した骨髄腔内に１０ｍｌのＤＭＥＭ培地を流入させて骨髄細胞を分離した。分離された骨髄細胞から脂肪及び筋肉組織を分離するため、骨髄細胞懸濁液を７０μｍのナイロンメッシュセルストレーナー（ｎｙｌｏｎｍｅｓｈｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒ）を用いてろ過した。骨髄細胞懸濁液の１．５倍の量でＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰｌｕｓ（１．０７７ｍｇ／ｍｌの濃度）を添加し、常温、３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅと培地との界面に存在する単核細胞群を分離した。分離された単核細胞群をＤＭＥＭ培地で２回洗浄した後、２％のウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）と１ｍＭのＨＥＰＥＳとを添加
したＤＭＥＭ培地１ｍｌに懸濁した。分離された単核細胞群は、１．１〜３．２×１０^６セル／マウスであり、細胞を観察するため、ヘキスト３３３４２を用いて染色して観察した（図１１のＡ）。
網膜内血管新生の生成を誘導する実験
実施例７は、実施例２で述べているように、酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルを用いて、単核細胞群及び／又はＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号５）を、下記表のように用いて、生後２０日目（ＰＮ２０）及び２７日目（ＰＮ２７）の効果を確認した。

表１のように、単核細胞群を処理した結果、生後２０日目と２７日目の両方で単独処理したもの（図１２及び図１３のＢ）に比べて、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドと同時に投与したとき（図１２及び図１３のＣ）、異常な血管新生の形態的特徴は観察されず、正常発生する血管が正常に形成されていることが観察された。この結果は、幹細胞を用いたとき、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドを同時に用いた場合、糖尿病性網膜症及び年齢関連黄斑変性症のような疾患の初期（初期には血管新生が発生しない）に血管の血液漏れなどの異常により疾患が発生した場合、血管構造を保持させることにより、これら疾患の初期治療剤として使用可能であることを示す。

実施例８：マウスを用いたＲＧＤ配列を含むポリペプチドの創傷治癒効果
ＲＧＤ配列を含むポリペプチドの創傷治癒効果を調べるため、マウスの体部から約０．５〜１．０ｃｍ離れた地点の尾の背面に１０×３ｍｍ大の全層創傷（ｆｕｌｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓｗｏｕｎｄ）を作成した（図１４）。傷の作成時において、出血は、圧迫法によって止血し、スプレーコーティングにより創傷面を感染から保護した。一方、ポリペプチドの効能を確認するため、４週間、毎日１回、ポリペプチドを１μｇ／ｋｇの濃度で、２つの経路により投与した。一つの経路は、傷に直接点滴する方法であり、もう一つの経路は、腹腔注射する方法である。結果判定のため、マウスの尾に設けられた傷の大きさ
を毎週測定し、２週に１回、尾組織を採取してパラフィンブロックを作成した後、ＨＥ染色を行い、組織学的変化を観察した。その結果、３週後からは、投与経路にかかわらず、ポリペプチドを投与したマウスの傷の大きさが、対照群の傷の大きさより有意に減少したことを、写真から確認し（図１４）、これを数値化してグラフで図式化した（図１５）。また、ＨＥ染色による組織学的変化の観察においても、投与２週後から傷（ｓｃａｒ）の下方組織において小さな毛細血管が少数見受けられた対照群とは異なり、ポリペプチドを投与したマウスの組織においては太い血管が多数見受けられた（図１６）。これは、傷や火傷の治癒、褥瘡及び慢性潰瘍のような疾患の治療及び予防に使用できるだけでなく、毛包を正常に形成するための血管形成を安定化させることにより、脱毛症又は白毛症の治療、肥満による動脈硬化、心筋梗塞のような疾患の治療及び予防にも効果があると予想される。

実施例９：ＲＧＤ配列を含むポリペプチドによる線維肉腫（ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）細胞株におけるアンジオポイエチン−１の分泌
線維肉腫細胞の培養
線維肉腫細胞（ヒト）を、１０％のＦＢＳを含むＭＥＭで、５％のＣＯ_２、３７℃の培養器にて培養した。シャーレで９０％以上成長した細胞を用いた。
アンジオポイエチン−１の分泌の測定
６ウェルプレートに、細胞が２×１０^５となるように培養された線維肉腫細胞に、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドを０〜１００μｇ／ｍｌで処理した。処理後１２時間、アンジオポイエチン−１の分泌を誘導した。このとき、生成されたアンジオポイエチン−１の量をウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）法にて測定した（図１７）。

実施例１０：ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号５）によるマウス血清におけるアンジオポイエチン−１の分泌
ＲＧＤ配列を含むポリペプチドによるマウス血清内におけるアンジオポイエチン−１の分泌を測定するため、出生初期に高酸素環境（７５％）にさらしたマウスを、再び正常酸素分圧（２０％）に復帰させると、異常な血管新生を自発的に生成する原理を用いて実験を行った(Higgins RD. et al., Curr. Eye Res. 18:20-27 (1999); Bhart N. et al., Pediatric Res. 46:184-188 (1999); Gebarowska D. et al., Am. J. Pathol. 160:307-313
(2002))。このため、マウスを、酸素分圧を調節可能な装置にて、生後７日後、７５％の酸素分圧を維持する高圧酸素環境で５日間放置した後、正常酸素分圧である２０％の酸素圧で更に放置する。このとき、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド１μｇ／ｋｇを腹腔投与してアンジオポイエチン−１の分泌を誘導した。その後、時間別に血清を分離してアンジオポイエチン−１の量をウェスタンブロット法にて測定した（図１８）。

実施例１１：ＫＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号４）による線維肉腫細胞株におけるアンジオポイエチン−１の分泌
線維肉腫細胞の培養
線維肉腫細胞（ヒト）を、１０％のＦＢＳを含むＭＥＭで、５％のＣＯ_２、３７℃の培養器にて培養した。シャーレで９０％以上成長した細胞を用いた。
アンジオポイエチン−１の分泌の測定
６ウェルプレートに、細胞が２×１０^５となるように培養された線維肉腫細胞に、ＫＧＤ配列を含むポリペプチドを０〜１００μｇ／ｍｌで処理した。処理後１２時間、アンジオポイエチン−１の分泌を誘導した。このとき、生成されたアンジオポイエチン−１の量をウェスタンブロット法にて測定した（図１９）。

実施例１２：血小板におけるＲＧＤ配列を含むポリペプチドの血小板由来成長因子の発現抑制効果
血小板の準備
健康な供血者から、抗凝固剤として、３．８％のクエン酸ナトリウムを含む真空採血管で全血を採血した後、１，２００ｒｐｍで遠心分離を行い、血小板濃縮プラズマ（ＰｌａｓｍａＲｉｃｈＰｌａｓｍａ；ＰＲＰ）を分離した。血小板は、１ｍＭのプロスタグランジンＥ１の存在下、１，２００ｒｐｍで遠心分離を行い、ペレットとして得た。血小板ペレットは、変形したＴｙｒｏｄｅ’ｓ−ＨＥＰＥＳバッファ(１４０ｍＭの塩化ナト
リウム、２．９ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４)に再懸濁した。
コラーゲンによる血小板の活性
１回水洗した血小板浮遊液（２×１０^８／ｍｌ）を、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（配列番号５）があるかないかの状態で、１０分間、室温にて前処理した後、コラーゲン（２μｇ／ｍｌ）を処理して活性化させた。室温にて２時間血小板を活性化させた後、１，５００ｒｐｍで、５分間、４℃にて遠心分離を行った。上澄液を採取した後、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の分泌をＥＩＡ法にて定量した。その結果、ポリペプチドの処理により有意に減少していることを確認した（図２０）。

最近、血小板からアンジオポイエチン−１が分泌されているとの報告があり、これは、血小板の活性が血管新生に重要な役割を果たしているという数多くの証拠の１つである。このようなＲＧＤを含むポリペプチドによるＰＤＧＦの分泌抑制は、血小板の凝集を防止して血管新生を防ぐ本来のディスインテグリンの機能に関連づけて説明することができ、併せて、低濃度での処理時に、血小板の凝集による血小板間の相互作用を抑制することにより、正常な血管新生のためのアンジオポイエチン−１の分泌を誘導するものと判断される。

本発明は、従来、外科的手術のみに頼っていた血管新生関連眼科疾患の治療方法のほか、治療薬物による新たな治療法を提示している。外科的手術には、多くの費用と、全ての患者に適用できないという限界があったが、本発明は、血管新生関連眼科疾患の治療における画期的な方法であって、失明の予防が可能となる。本発明における特定のアミノ酸配列を含むポリペプチドによるアンジオポイエチン−１の分泌は、既存の正常血管及び新たに形成される発生段階の正常な血管新生の形成に何ら影響を与えない。むしろ発生段階において正常血管の生成を助けることにより、未熟児網膜症のような発生段階にある患者にとって非常に有用であるという長所がある。また、造血幹細胞以外の幹細胞が、Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むポリペプチドと共に、正常な血管新生の形成に寄与することがわかった。仮に全ての血管新生を抑制すると、未熟児網膜症には適用できない。したがって、Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むポリペプチド及び／又は幹細胞は、未熟児網膜症の治療剤としての利用価値は非常に高い。更に、糖尿病性網膜症の場合、初期には血管の構造を保護することにより、根本的な治療を可能にする。また、年齢関連黄斑変性症においても、Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むポリペプチドが血管構造の正常化を助けることにより、異常な血管の成長を抑制すると考えられる。

Claims

配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする血管関連疾患の治療用医薬組成物であって、
前記血管関連疾患が、血管壁の血液漏れ又は血管損傷に起因する浮腫；糖尿病による足の壊疽；火傷；褥瘡；慢性潰瘍；及び正常な毛細血管の形成の不具合に起因する脱毛症又は白毛症からなる群から選ばれる一種又はそれ以上の疾患である治療用医薬組成物。