JP2009523787A - ペプチドを有効成分とする血管関連疾患の治療剤組成物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
[実施例]
以下、非限定的な実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。
RGD配列を含むポリペプチドの眼球内血管新生の生成にどのような影響を与えるのかを調べるため、マウスの角膜にマイクロポケットを設け、VEGF300ngを含むペレットを挿入して血管新生を誘導させるモデルを作成した(図1)。このとき、ポリペプチドの効能を確認するため、ポリペプチド1.3pmol(0.75ng/kg)、130pmol(75ng/kg)を腹腔注射した。それから5日後、血管新生が生成されているか否かを観察するため、マウスの目を解剖顕微鏡で観察した。その結果、VEGFを含まないペレットを挿入したマウスの場合(図2及び図3のA)、血管が観察されず、VEGFペレットを挿入した陽性対照群では、血管の生成を観察することができた(図2及び図3のB)。しかし、RGD配列を含むポリペプチドの腹腔注射時に、それぞれ1.3pmol(図2及び図3のC)、130pmolで微細血管の生成及び血管網の構成が観察されることにより、成長の抑制ではない、血管の増殖を誘導することを確認した(図2及び図3のD)。血管の生成を定量化するため、各群の血管の長さを測定したとき、陽性対照群の場合、血管の全長が0.43±0.02mmであり、cycRGDの場合、1.3pmol処理群は、0.65±0.01mm、130pmol処理群の場合は、0.69±0.03mmであって、有意な増加を確認することができた(図4)。
酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成は、人間の未熟児網膜症や糖尿病性網膜症のような様相を示している。出生初期に高酸素環境(75%)にさらしたマウスを、再び正常酸素分圧(20%)に復帰させると、異常な血管新生を自発的に生成する原理を用いて実験を行った(Higgins RD. et al., Curr. Eye Res. 18:20-27 (1999); Bhart N. et al., Pediatric Res. 46:184-188 (1999); Gebarowska D. et al., Am. J. Pathol. 160:307-313 (2002))。このため、酸素分圧を調節可能な装置にて、生後7日後、75%の酸素分圧を維持する高圧酸素環境で5日間放置した後、正常酸素分圧である20%の酸素圧で5日間更に放置する。このとき、5日間、1日に1回、RGD配列を含むペプチド(配列番号1又は配列番号2)を、マウスに腹腔内投与して網膜内血管新生を観察した。血管を観察するため、生理食塩水1mlに2×106分子量のFITC−デキストラン50mgを溶解した溶液を、左心室から注入した。注入後、直ちにマウスの眼球を摘出した。摘出した眼球は、生理食塩水で洗浄した後、4%のパラホルムアルデヒドで4時間〜24時間固定した後、眼球からレンズを除去し、網膜をスライドガラス上に平らに広げた後、グリセリン−ゼラチンでシールし、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
実施例3は、実施例2で述べているように、酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルを用いて、RGD配列を含むポリペプチド(配列番号6、7)の効果を確認した。実施例2のように、正常酸素分圧で生育したマウスの場合、網膜全般にわたって均一な血管の分布を確認することができ(図5のB)、高圧酸素処理後、生理食塩水のみで処置したマウスの場合、血管新生の形はそのほとんどが異常であり、虚血が発生したことを観察した(図5のA)。RGD配列を有するポリペプチド1μg/kg/day(図7のA、B)では、異常な血管新生の形態的特徴は観察されず、正常発生する血管が正常に形成されていることが観察された。これは、実施例2のように、RGD配列を含むポリペプチドが正常血管の成長を助ける役割を果たすことを意味する。RGD配列を含むポリペプチド(配列番号6,7)は、糖尿病性網膜症及び年齢関連黄斑変性症のような疾患の初期(初期には血管新生が発生しない)に血管の血液漏れなどの異常により疾患が発生した場合、血管構造を保持させることにより、これら疾患の初期治療剤として使用可能である。
実施例4は、実施例2で述べているように、酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルを用いて、RGD配列を含むポリペプチド(配列番号8)の効果を確認した。RGD配列を有するポリペプチドを1μg/kg/dayで処理した結果、異常な血管新生の形態的特徴は観察されず、正常発生する血管が正常に形成されていることが観察された(図8)。これは、実施例2のように、RGD配列を含むポリペプチドが正常血管の成長を助ける役割を果たすことを意味する。RGD配列を含むポリペプチドは、糖尿病性網膜症及び年齢関連黄斑変性症のような疾患の初期(初期には血管新生が発生しない)に血管の血液漏れなどの異常により疾患が発生した場合、血管構造を保持させることにより、これら疾患の初期治療剤として使用可能である。
実施例5は、実施例2で述べているように、酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルを用いて、RGD配列を含むポリペプチドであるエキスタチン及びキストリンの効果を確認した。実施例2のように、正常酸素分圧で生育したマウスの場合、網膜全般にわたって均一な血管の分布を確認することができ(図5のB)、高圧酸素処理後、生理食塩水のみで処置したマウスの場合、血管新生の形はそのほとんどが異常であり、虚血が発生したことを観察した(図5のA)。エキスタチン及びキストリン1μg/kg/day(図9)では、異常な血管新生の形態的特徴は観察されず、正常発生する血管が正常に形成されていることが観察された。これは、実施例6のように、RGD配列を含むポリペプチドが正常血管の成長を助ける役割を果たすことを意味する。
実施例6は、実施例2で述べているように、酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルを用いて、RGD配列を含むポリペプチド(配列番号6、8)の効果を組織染色して確認した。実施例2のように、C57BL/6マウスを、酸素分圧を調節可能な装置にて、生後7日後、75%の酸素分圧を維持する高圧酸素環境で5日間放置した後、正常酸素分圧である20%の酸素圧で5日間更に放置する。このとき、5日間、1日に1回、RGD配列を含むポリペプチド(配列番号6、8)をマウスに腹腔内投与して網膜を摘出した後、6μmのパラフィン切断(paraffin cross section)を行いH&E組織染色し、顕微鏡で観察した。正常マウスの場合、網膜層の内側の神経節細胞層が肥厚せずに正常な厚さを維持していることを示し(図10のA)、陰性対照群として、酸素分圧の差により網膜層の内側の神経節細胞層が異常に肥厚していることを観察した(図10のB)。RGD配列を含むポリペプチド(配列番号6、8)を処理した場合は、正常マウスと同様に、陰性対照群と比較して、網膜層の内側の神経節細胞層が肥厚せずに正常な厚さを維持していることを示している(図10のC、D)。これは、実施例3、4のように、RGD配列を含むポリペプチドが正常血管の成長を助ける役割を果たすことを意味するだけでなく、網膜層の内側の神経節細胞層が肥厚せずに正常な厚さを形成して網膜が正常に維持されることを意味する。この結果も、RGD配列を有するポリペプチド(配列番号6、8)は、糖尿病性網膜症及び年齢関連黄斑変性症のような疾患の初期(初期には血管新生が発生しない)に血管の血液漏れなどの異常により疾患が発生した場合、血管構造を保持させることにより、これら疾患の初期治療剤として使用可能であるという更なる証拠を示している。
単核細胞群の準備
単核細胞群を分離するため、C57BL/6マウスの両側の大腿骨と脛骨とを分離して、50ユニットのヘパリンを含むDMEM培地に浸漬した。分離された大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を得るため、分離された骨の骨頭及び骨端部位を切断して骨髄腔を露出させた後、22G注射針を用いて、露出した骨髄腔内に10mlのDMEM培地を流入させて骨髄細胞を分離した。分離された骨髄細胞から脂肪及び筋肉組織を分離するため、骨髄細胞懸濁液を70μmのナイロンメッシュセルストレーナー(nylon mesh cell strainer)を用いてろ過した。骨髄細胞懸濁液の1.5倍の量でFicoll−Paque Plus(1.077mg/mlの濃度)を添加し、常温、3,000rpmで20分間遠心分離を行い、Ficoll−Paqueと培地との界面に存在する単核細胞群を分離した。分離された単核細胞群をDMEM培地で2回洗浄した後、2%のウシ胎仔血清(fetal bovine serum)と1mMのHEPESとを添加したDMEM培地1mlに懸濁した。分離された単核細胞群は、1.1〜3.2×106セル/マウスであり、細胞を観察するため、ヘキスト33342を用いて染色して観察した(図11のA)。
網膜内血管新生の生成を誘導する実験
実施例7は、実施例2で述べているように、酸素分圧の差による人為的な網膜内血管新生の生成を誘導するマウスモデルを用いて、単核細胞群及び/又はRGD配列を含むポリペプチド(配列番号5)を、下記表のように用いて、生後20日目(PN20)及び27日目(PN27)の効果を確認した。
RGD配列を含むポリペプチドの創傷治癒効果を調べるため、マウスの体部から約0.5〜1.0cm離れた地点の尾の背面に10×3mm大の全層創傷(full thickness wound)を作成した(図14)。傷の作成時において、出血は、圧迫法によって止血し、スプレーコーティングにより創傷面を感染から保護した。一方、ポリペプチドの効能を確認するため、4週間、毎日1回、ポリペプチドを1μg/kgの濃度で、2つの経路により投与した。一つの経路は、傷に直接点滴する方法であり、もう一つの経路は、腹腔注射する方法である。結果判定のため、マウスの尾に設けられた傷の大きさを毎週測定し、2週に1回、尾組織を採取してパラフィンブロックを作成した後、HE染色を行い、組織学的変化を観察した。その結果、3週後からは、投与経路にかかわらず、ポリペプチドを投与したマウスの傷の大きさが、対照群の傷の大きさより有意に減少したことを、写真から確認し(図14)、これを数値化してグラフで図式化した(図15)。また、HE染色による組織学的変化の観察においても、投与2週後から傷(scar)の下方組織において小さな毛細血管が少数見受けられた対照群とは異なり、ポリペプチドを投与したマウスの組織においては太い血管が多数見受けられた(図16)。これは、傷や火傷の治癒、褥瘡及び慢性潰瘍のような疾患の治療及び予防に使用できるだけでなく、毛包を正常に形成するための血管形成を安定化させることにより、脱毛症又は白毛症の治療、肥満による動脈硬化、心筋梗塞のような疾患の治療及び予防にも効果があると予想される。
線維肉腫細胞の培養
線維肉腫細胞(ヒト)を、10%のFBSを含むMEMで、5%のCO2、37℃の培養器にて培養した。シャーレで90%以上成長した細胞を用いた。
アンジオポイエチン−1の分泌の測定
6ウェルプレートに、細胞が2×105となるように培養された線維肉腫細胞に、RGD配列を含むポリペプチドを0〜100μg/mlで処理した。処理後12時間、アンジオポイエチン−1の分泌を誘導した。このとき、生成されたアンジオポイエチン−1の量をウェスタンブロット(western blotting)法にて測定した(図17)。
RGD配列を含むポリペプチドによるマウス血清内におけるアンジオポイエチン−1の分泌を測定するため、出生初期に高酸素環境(75%)にさらしたマウスを、再び正常酸素分圧(20%)に復帰させると、異常な血管新生を自発的に生成する原理を用いて実験を行った(Higgins RD. et al., Curr. Eye Res. 18:20-27 (1999); Bhart N. et al., Pediatric Res. 46:184-188 (1999); Gebarowska D. et al., Am. J. Pathol. 160:307-313 (2002))。このため、マウスを、酸素分圧を調節可能な装置にて、生後7日後、75%の酸素分圧を維持する高圧酸素環境で5日間放置した後、正常酸素分圧である20%の酸素圧で更に放置する。このとき、RGD配列を含むポリペプチド1μg/kgを腹腔投与してアンジオポイエチン−1の分泌を誘導した。その後、時間別に血清を分離してアンジオポイエチン−1の量をウェスタンブロット法にて測定した(図18)。
線維肉腫細胞の培養
線維肉腫細胞(ヒト)を、10%のFBSを含むMEMで、5%のCO2、37℃の培養器にて培養した。シャーレで90%以上成長した細胞を用いた。
アンジオポイエチン−1の分泌の測定
6ウェルプレートに、細胞が2×105となるように培養された線維肉腫細胞に、KGD配列を含むポリペプチドを0〜100μg/mlで処理した。処理後12時間、アンジオポイエチン−1の分泌を誘導した。このとき、生成されたアンジオポイエチン−1の量をウェスタンブロット法にて測定した(図19)。
血小板の準備
健康な供血者から、抗凝固剤として、3.8%のクエン酸ナトリウムを含む真空採血管で全血を採血した後、1,200rpmで遠心分離を行い、血小板濃縮プラズマ(Plasma Rich Plasma;PRP)を分離した。血小板は、1mMのプロスタグランジンE1の存在下、1,200rpmで遠心分離を行い、ペレットとして得た。血小板ペレットは、変形したTyrode’s−HEPESバッファ(140mMの塩化ナトリウム、2.9mMの塩化カリウム、1mMの塩化マグネシウム、5mMのグルコース、10mMのHEPES、pH7.4)に再懸濁した。
コラーゲンによる血小板の活性
1回水洗した血小板浮遊液(2×108/ml)を、RGD配列を含むポリペプチド(配列番号5)があるかないかの状態で、10分間、室温にて前処理した後、コラーゲン(2μg/ml)を処理して活性化させた。室温にて2時間血小板を活性化させた後、1,500rpmで、5分間、4℃にて遠心分離を行った。上澄液を採取した後、血小板由来成長因子(PDGF)の分泌をEIA法にて定量した。その結果、ポリペプチドの処理により有意に減少していることを確認した(図20)。
Claims (16)
- Xaa−Gly−Asp配列を含むペプチドを有効成分とすることを特徴とする、血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記ペプチドのXaaアミノ酸が、Arg又はLysであることを特徴とする、請求項1に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号1又は配列番号2に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号4に記載のペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号6〜配列番号10に記載のものからなる群から選択される1つのペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記血管関連疾患が、血管壁の血液漏れ又は血管損傷又は異常な血管新生による浮腫及び/又は虚血症を特徴とする、請求項1又は2に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記虚血性血管関連疾患が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、年齢関連黄斑変性症及び緑内障からなる群から選択される眼科疾患の1つであることを特徴とする、請求項6に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記虚血性血管関連疾患が、糖尿病による足の壊疽、肺高血圧、虚血性心筋症、心不全、急性後肢虚血、人工皮膚及び移植用血管治療剤、並びに虚血症からなる群から選択される疾患であることを特徴とする、請求項6に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記血管関連疾患が、傷、火傷、褥瘡、慢性潰瘍及び正常な毛細血管の形成による脱毛症又は白毛症、並びに肥満による心血管疾患からなる群から選択される疾患であることを特徴とする、請求項6に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記ペプチドが、アンジオポイエチン−1の分泌を誘導することを特徴とする、請求項1又は2に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記組成物が、幹細胞を更に含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記幹細胞が、少なくとも血管内皮細胞に分化し得る能力を有する幹細胞であることを特徴とする、請求項11に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記血管関連疾患が、血管壁の血液漏れ又は血管損傷又は異常な血管新生による浮腫及び/又は虚血症であることを特徴とする、請求項11又は12に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記虚血性血管関連疾患が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、年齢関連黄斑変性症及び緑内障からなる群から選択される眼科疾患の1つであることを特徴とする、請求項11又は12に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記虚血性血管関連疾患が、糖尿病による足の壊疽、肺高血圧、虚血性心筋症、心不全、急性後肢虚血、人工皮膚及び移植用血管治療剤、並びに虚血症からなる群から選択される疾患であることを特徴とする、請求項11又は12に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
- 前記血管関連疾患が、傷、火傷、褥瘡、慢性潰瘍及び正常な毛細血管の形成による脱毛症又は白毛症、並びに肥満による心血管疾患からなる群から選択される疾患であることを特徴とする、請求項11又は12に記載の血管関連疾患の治療用組成物。
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