JP5894176B2 - 血栓溶解用組成物及びこれを含む血管狭窄又は閉塞性疾患の治療用医薬組成物 - Google Patents
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Description
(i)本発明は、Arg−Gly−Aspモチーフを含むペプチドを含む血栓溶解用組成物、これを含む血管狭窄又は閉塞性疾患の治療用医薬組成物、そしてこれを投与する工程を含む血栓溶解方法及び血管狭窄又は閉塞性疾患の治療方法に関する。
(ii)本発明の組成物及び方法は、血小板表面GPIIb−IIIaのような血栓内インテグリンをターゲットとする原理を採択し、既に生成された血栓を効果的に分解する利点があり、これは、既存のプラスミノゲン活性化の原理とは異なる。
(iii)また、本発明の組成物及び方法は、貫通後の再狭窄も起こさず、微細血管まで効果的に開放させるため、神経保護効能がある。
実験動物及びFeCl3による血栓生成モデル
8週齢の雄性ICR(Institute of Cancer Research)マウス((株)オリエントバイオ)を利用した。実験室動物の管理及び利用は、これに対するNIHの指針に従って、制度的に承認されたプロトコールに従って行った。手術方法をみると、動物は、70%N2O及び30%O2の混合物内5%イソフルランの吸入を通じて麻酔させた。麻酔は、2%イソフルランで維持させた。手術方法の間、動物の体温は、直腸用プローブで持続的にモニタリングして、恒温性被覆調節ユニット(Homeothermic blanket control unit)及びヒーティングパッド(Harvard Apparatus,Holliston,MA)を利用して、37.0±0.2℃に維持した。サキサチリンのインビボ血栓溶解活性をテストするために、FeCl3(Sigma Aldrich,USA)で誘導された頸動脈血栓モデルを利用した。頸部正中切開を施して、左側総頸動脈を手術顕微鏡下で注意して解剖した。超音波ドップラー流速プローブ(Transonic MA0.7PSB)を総頸動脈(CCA)の中央部位に配置した。頸動脈血流量は、超音波TS420血流量計(Transonic Instruments,Ithaca,NY)及びiWorx IX−304Tデータ獲得システム(iWorx Systems,Inc.,Dover,NH)を利用して測定した。対照群としてCCAのベースライン血流量を5分間測定した。対照群のベースライン血流量の決定後、プローブを除去した。露出したCCA中央地点の外膜表面に50% FeCl3で飽和されたろ過紙(700×500μm)を5分間接触させることにより、化学的ストレスによる酸化的血管損傷が誘導された。ろ過紙を除去した後、CCAを生理食塩水で洗浄し、これの血流量を測定した。血流量の減少により血栓形成及び動脈閉塞を決定し、完全閉塞(complete occlusion)は、血流が10分間ない場合と定義した。
血栓形成及び大きさにおいてモデルの一致性(consistency)を評価した。完全閉塞10分後、損傷されたCCA切片を摘出して、4%パラホルムアルデヒドに浸して固定し、組織学的分析のためにパラフィンに包埋した。パラフィンブロックを3μm厚で垂直方向に連続的に切断した。切断されたスライスをガラススライドにマウンティングしてヘマトキシリン(Dako,Denmark)及びエオシン(Sigma Aldrich,USA)で染色した。各動物において血栓の大きさ(垂直長さ及び領域)は、最も大きい血栓大きさを示すスライスでScionイメージ分析ソフトウェア(Scion Co.,Frederick,MA,USA)を利用することにより測定した。
本実施例において、血栓溶解製剤として使用したサキサチリンは、大韓民国公開特許第2002−0064787号に記載の方法に従って分離精製した組み換えサキサチリン(r−saxatilin)タンパク質を使用した。そのアミノ酸配列は、配列番号12に示した。
CCA閉塞10分後、PE−10チュービングと連結された注入ポンプ(KD Scinetific Inc.,USA)を利用して、左側大腿部静脈を通じてサキサチリンを静脈内投与した。注入開始時間から2時間連続的に頸動脈血流量をモニタリングした。
サキサチリンの用量反応を調べるために、動物を任意的に7つの群(各群は、5匹のマウスを含む)に分けた:生理食塩水(対照群)、1,1.75,2.5,3.75,5.0及び10.0mg/kgのサキサチリンが投与された群。投与量(dose)の10%程度は、ボーラスで静脈内投与し、残りは60分間連続的に注入された。
血栓溶解において、サキサチリンの効果は、投与方法によって評価された。本実験のために、各動物において5mg/kgのサキサチリンの総投与量を利用し、動物を任意的に4つの群(各群は、5匹のマウスを含む)に分けた:(a)総投与量(5mg/kg)のボーラス注入;(b)閉塞してから10分後にサキサチリン投与量の半分(2.5mg/kg)を注入し、最初のボーラス注入から60分後にサキサチリン投与量の半分を注入する二重ボーラス注入;(c)閉塞してから10分後にサキサチリン投与量の半分(2.5mg/kg)を注入し、残りの投与量を60分間連続的に注入;及び(d)閉塞してから10分後にサキサチリン投与量の10%(0.5mg/kg)を注入し、残り(4.5mg/kg)を60分間連続的に注入。
血流量を測定することにより、血流再開及びその程度を測定した。ベースライン血流量に対するデータ及びCCA閉塞後2時間持続的にモニタリングされた血流量に対するデータがiWorx Labscribe2データ獲得ソフトウェア(version 2.045000)を利用して得られた。血流量モニタリング後2時間目に全てのマウスからCCAを得て、4%パラホルムアルデヒド溶液で固定して、組織学的調査のためにパラフィンに包埋した。パラフィンブロックを3μm厚で横方向に連続的に切断して、ガラススライドにマウンティングし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
血流時間(flow−time)曲線下の面積により頸動脈血流量を分析した。動物間の生理学的条件の変異によって引き起こされる差異(differences)を避けるために、全ての測定された数値は、各動物の最少血流によって標準化した。血栓溶解効果を下記のように計算して、正常血流量の平均値に対する百分率で表示した:(サキサチリン投与後2時間の平均血流量/正常血流量の平均値)×100(%)。用量反応研究における各群の平均値を計算し、これを用量反応曲線で示した(平均値±標準偏差)。
各動物において、毎1分間の血流量の平均を計算して、サキサチリンの投与量及び投与方法に対してそれぞれ代表的な時間依存的パターンを示した。各群において、全ての動物の平均値を計算し、時間による変化を連続的な棒グラフで示した(平均値±標準偏差)。
効果的な血流再開のためのサキサチリンの投与時期を調べた。効果的な血流再開は、正常レベルの50%の血流量が回復して、少なくとも30分間以上持続される状態と定義した。
配列最適化されたサキサチリン誘導体のクローニング及びpPIC9ベクターの作製
サキサチリン誘導体の発現システムとしてPichia発現システムを利用して、このためのベクターを作製した。
発現ベクターの分離/精製及び保存のために、大腸菌(DH5α)に形質転換させて保存用菌株(Glycerol stock,−70℃保管)を作製した。Pichia pastoris形質転換のために、Pichia宿主細胞(GS115)の形質転換過程では、大腸菌(DH5α)形質転換に比べて多量の発現ベクターを利用した。前記サキサチリン遺伝子の染色体挿入過程として部位特異的組み換えを誘導するために、発現ベクターの特定遺伝子位置(HIS4遺伝子座)の切断によりプラスミドを線形化した(即ち、pPIC9ベクターの場合、SalI又はStuIを使用して切断)。GS115コンピテント細胞に10μg〜50μgの線形化された発現ベクタープラスミドと40μgの運搬(carrier)DNA(サケ精子DNA)を混合して形質転換させた。以後、成長が良好な単一コロニーを選別した。形質転換で細胞内導入されたサキサチリン遺伝子がPichia(GS115)染色体上のhis4遺伝子間に挿入されたかどうかを、ゲノムDNAを抽出してPCR方法で確認した。
遺伝子の挿入が確認されたPichia菌株の一部を選別して、組み換えタンパク質の発現を確認した。候補菌株をフラスコ規模で培養し、SDS−PAGE方法で分析した。
活性分析用サキサチリン誘導体試料の作製
サキサチリン誘導体タンパク質試料の製造のために、前記選別された菌株を大量にフラスコ培養した。培養条件は、メタノール投入量と代謝に使用される酸素供給を増加させる点を除いては、前記菌株培養条件と同一であった。簡略に、前記菌株を利用した発酵は、発酵器Fed−batch(KF7;KBT Co.Ltd.)を利用して30℃で行った。前記発酵器システムは、7リットル(実際には5リットルで実施)であり、制御システムは、温度/rpm/Air/O2/pH/DOであり、運転モードは、Batch&Fed−batch,半連続(Semi−continuous)モードであった。まず、前記菌株をYNB培地(1リットル当たりYeast Nitrogen Base 1.7g、硫酸アンモニウム5.0g、リン酸2水素カリウム11.5g、リン酸水素二カリウム2.85g、グリセロール10g)で一日間培養して、得られた前記培養液をバッチ培養(pH5.0;Start−up Medium,2リットル当たりリン酸54mL、硫酸カルシウム(無水)1.8g、硫酸カリウム、36g、硫酸マグネシウム(7H2O)30g、水酸化カリウム8.26g、グリセロール80g、TMS(Trace metal solution)8.8mL)で一日間培養した。前記TMS溶液(室温保管)は、適量の蒸留水にCuSO4−5H2O 6.0g、MnSO4−5H2O 4.28g、ZnCl2 20.0g、FeSO4−7H2O 65.0g、H2SO4 5mL、NaI 0.08g、Na2MoO4−2H2O 0.2g、ホウ酸0.02g、CoCl2−6H2O 0.92g、ビオチン0.2gを順に添加してよく溶かした後、1リットルに容量を合わせて、0.2μmフィルターで滅菌して作製した。前記batch培養液を8〜10時間、グリセロール流加培養(GFBM,pH5.0;0.5リットルのグリセロールを0.5リットルの蒸留水と混合してスチーム滅菌させて、室温に冷却させた後、GFBM 1リットル当たり12mLのTMSを添加して作製した)を行った。前記培養液にメタノール(MeOH)を3時間処理してタンパク質誘導をした後、3日間MeOH流加培養(MFBM,pH5.0;99.9%工業用メタノール1リットル当たりTMS 12mLを混合して作製し、別途の滅菌処理無しにすぐ使用して、容器及び配管は、スチーム滅菌して使用した)を行った。前記培養は、必要に応じてMeOH半連続培養で行った。この際、MeOHフィード率は、DO−STAT(DO set pt.,min.6ppm)を利用して、1日目は、6〜15mL/liter/hrであり、2〜3日目には、15〜20mL/liter/hrであった。一方、酸素は、GFBM培養から供給し、純粋酸素の供給量は、0.2〜0.4vvmであった。
サキサチリン誘導体(SX1,SX2,SX3,XL1,XL2,XL3,LS1,LS2及びLS3)の分離精製は、以下のように行った。
動物モデルの一致性
FeCl3を5分間処理した後、CCAの血流量は、調べられた全ての動物においてほぼゼロまで迅速に持続的に減少した(図1a)。CCAの血栓性閉塞を組織学的分析で確認した(図1b)。血栓の大きさは、動物間で類似していた(長さ:1.139±0.09mm;面積:0.799±0.139mm2)。サキサチリン処理群の血管を組織学的に分析した結果、血流量が完全に回復したマウスの頸動脈内部では血栓がほとんど消失したことが観察されたが、部分的に回復したマウスでは、血栓が一部残っており、血流量が全く回復しなかった場合は、血管が血栓により依然として閉塞していることを確認した(図2)。
r−サキサチリンの投与量依存的な効果は、血流時間曲線下の面積に対するデータを利用して評価した(図3)。生理食塩水処理群(2.47±1.07%)と比較し、サキサチリン処理群は、1mg/kg(2.36±0.78%)又は1.75mg/kg(4.97±3.94%)の投与量において目立つような変化は引き起こさなかった。血流量の回復は、2.5mg/kg(32.50±33.70%)の投与量から観察され、投与量依存的に増加した。血流は、5mg/kgのサキサチリンの投与でほぼ正常水準(94.50±20.47%)まで回復した。5mg/kgと10mg/kgのサキサチリン投与群間に明らかな差がなかった。
最適化されたサキサチリンの静脈内投与方法は、用量反応研究において十分な効果を示した5mg/kgの総投与量を利用して決定した。正常血流量と比較し、投与群における血流量の平均百分率は、下記の通りである:(a)総投与量(5mg/kg)のボーラス注入群、77.01±46.11%;(b)投与量の半分をそれぞれ利用した二重ボーラス注入群、85.23±29.95%;(c)投与量の半分を注入し、残りの投与量を連続的に注入する群、80.72±30.13%;及び(d)総投与量の10%を注入し、残りの投与量を連続的に注入する群、94.50±20.47%。
生理食塩水が投与されたマウス及び1mg/kg又は1.75mg/kgのサキサチリンが投与されたマウスでは、効果的な血流再開が観察されなかった。2.5mg/kgのサキサチリンが投与された5匹のマウスのうち2匹、及び3.75mg/kgのr−サキサチリンが投与された5匹のマウスのうち3匹でのみ効果的な血流再開が起こった。
総51匹の動物をサキサチリンの血栓溶解効果の検証に利用した。そのうち、5mg/kgのサキサチリンのボーラス注入後から約90分後に、頸部切開部位における出血により1匹の動物が死亡し、他の1匹は、死亡しなかったものの、同一な部位における出血を示した。
インビトロ血小板凝集アッセイ
マウスPRP(血小板に富む血漿、platelet rich plasma)にサキサチリン誘導体及びADPを投与して、凝集測定器(Aggregometer;CHRONO−LOG,USA)を利用して凝集程度を測定し、本発明のサキサチリン誘導体の活性を評価した(表1)。
サキサチリンとサキサチリン誘導体(SX1,SX3)の血栓溶解効果は、前記実験と同一に血流時間曲線下の面積に対するデータを利用して評価した(図7及び図8)。サキサチリン及びサキサチリン誘導体の投与用量は、同一に処理した。20mg/kgを処理した場合、サキサチリン投与群は、60.92±39.52%の血流量を回復して、SX1投与群は、78.56±16.24%、SX3投与群は、69.15±14.89%の血流量を回復した。40mg/kgの用量を投与した時は、サキサチリンとサキサチリン誘導体(SX1,SX3)投与群の両方とも正常血流量まで回復して、再閉塞無しに維持された。再閉塞はなかったものの、20mg/kgの用量を投与した時と同様に、サキサチリン誘導体(SX1,SX3)を投与した時、野生型のサキサチリンに比べて血流量増減の程度が少なく、血流量が安定的に維持されることを確認した(図7)。
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Claims (7)
- (a)配列番号3、5、及び12からなる群から選択されるいずれかの配列で表されるアミノ酸配列を含むペプチドの薬剤学的有効量と、
(b)薬剤学的に許容される担体と、
を含むことを特徴とする血栓溶解用組成物。 - 前記ペプチドは、ディスインテグリン活性を有する請求項1に記載の血栓溶解用組成物。
- 前記ペプチドは、血栓内に存在するインテグリンに結合して血栓を分解する請求項1に記載の血栓溶解用組成物。
- 前記ペプチドは、血栓を形成する血小板表面のGP(糖タンパク質)IIb−IIIaに結合して血栓を分解する請求項1に記載の血栓溶解用組成物。
- 請求項1から4のいずれかに記載の血栓溶解用組成物を含むことを特徴とする血管の狭窄又は閉塞性疾患の治療用医薬組成物であって、
前記血管の狭窄又は閉塞性疾患は、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、裂孔性脳梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、心筋梗塞症、脳虚血、急性虚血性心血管疾患、静脈血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、末梢血管疾患、及び血管炎による血管閉塞症からなる群から選択され、
前記治療用医薬組成物は、血栓により血管が閉塞された患者に投与される治療用医薬組成物。 - 前記治療用医薬組成物は、血管内への直接注入により投与される請求項5に記載の治療用医薬組成物。
- 配列番号3及び5のいずれかのアミノ酸配列からなる、血栓溶解活性を有することを特徴とするペプチド。
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