JP5894176B2

JP5894176B2 - 血栓溶解用組成物及びこれを含む血管狭窄又は閉塞性疾患の治療用医薬組成物

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Publication number: JP5894176B2
Application number: JP2013537603A
Authority: JP
Inventors: フェホ・チ; クォン・イル; デキム・ヨン; ユホン・スン
Original assignee: インダストリー−アカデミックコーポレーションファウンデーション，ヨンセイユニバーシティ
Priority date: 2010-11-01
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2031-11-01
Also published as: EP2636412A4; KR101463181B1; WO2012060607A3; CN103327996B; JP2013542952A; ES2679400T3; US20130316951A1; EP2636412A2; CN103327996A; WO2012060607A2; EP2845601A1; EP2845601B1; KR20120061036A; US9982021B2

Description

本発明は、血栓溶解用組成物及びこれを含む血管狭窄又は閉塞性疾患の治療用医薬組成物に関する。

大部分の脳卒中は、大きな又はより小さい脳内動脈の血栓塞栓性閉塞（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｃｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）により引き起こされる（非特許文献１）。虚血性脳卒中の場合、速い血栓溶解だけが不可避な完全な梗塞の発病を抑制するための唯一に確立された治療方法である（１９９５；及び非特許文献２）。組み換え組織プラスミノゲン活性化因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｒｔ−ＰＡ）の静脈内投与による治療法は、虚血性脳卒中の発病（ｏｎｓｅｔ）後３時間内に施せる第一の及び現在唯一承認された虚血性脳卒中に対する治療法である（非特許文献３及び４）。しかし、半分以上の患者が血栓溶解治療後、成功裏な血流再開（ｒｅｃａｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）に失敗する（非特許文献５及び６）。例え、閉塞された動脈が血栓溶解治療法により成功裏に血流再開したとしても、このような回復（ｂｅｎｅｆｉｔｓ）は、再潅流障害（非特許文献７）、脳出血（非特許文献８）及び再閉塞（非特許文献９）の危険により再び弱化される。また、ｒｔ−ＰＡは、神経毒性を有すると報告された（非特許文献１０〜１４）。

血流再開戦略は、その効能が証明されたが、適用可能性の限界及び潜在的な副作用のため、ｒｔ−ＰＡより更に効能の良い新規な血栓溶解製剤を開発するための試みがなされた。このような試みは、ｔ−ＰＡの変異体、動物資源由来のプラスミノゲン活性化因子、及びマイクロプラスミンを含む。上述の薬物（ｄｒｕｇｓ）は、下記のような目的を有する：（ａ）フィブリン特異性の増強；（ｂ）血漿内半減期の延長；（ｃ）プラスミノゲン活性化因子インヒビター−１による抑制能減少；及び（ｄ）神経毒性の回避。数個の薬物が臨床実験を完了し、いくつかの薬物が現在効能を研究している状態である。このような薬物は、血栓内フィブリンをターゲットとする。しかし、血栓は、血小板−フィブリノゲン相互作用により形成される。また、トロンビン、白血球及び赤血球細胞も血栓の構成成分である。フィブリンをターゲットとする血栓溶解製剤に対する血栓の抵抗性は、脳卒中患者に見られる低い再開通率（ｒｅｃａｎａｌｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅｓ）の主な理由の一つであり、このような現象は、血小板に富む血栓による閉塞において、より一般的に起こり得る。このような側面で、血栓溶解効能の改善のために、血小板をターゲットとする治療法が、フィブリンをターゲットとする治療法に対する選択的な又は追加的な方法になり得る。

インテグリンファミリーのメンバーである血小板糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａは、高密度で血小板膜表面に存在する（非特許文献１５）。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体は、フィブリノゲンに特異的に結合することにより、血小板凝集経路において最終の共通工程を媒介する（非特許文献１６）。したがって、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体をターゲットとすることは、血小板に作用する薬物開発において重要である。いくつかの血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗剤が開発されたが、これらは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するヒト−マウスキメラ抗体のＦａｂ断片（アブシキシマブ、ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、ＲＧＤペプチドの非ペプチド類似体（チロフィバン及びラミフィバン）及びＫＧＤモチーフを含む環状ヘプタペプチドディスインテグリン（エプチフィバチド、ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）を含む（非特許文献１７〜１９）。上述のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗剤は、不安定性狭心症、急性心筋梗塞、そして経皮的冠状動脈形成術（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｔｒａｎｓｆｅｍｏｒａｌｃｏｒｏｎａｒｙａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ，ＰＴＣＡ）及びステント施術を受けた患者に効果的であった。脳卒中の場合、アブシキシマブは、症状発症から５時間〜６時間が過ぎてから処理された患者ではその効能が現れなかった（非特許文献２０）。しかし、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗剤は、再閉塞された脳卒中患者において血栓を溶解させて、選択された患者に効果的である（非特許文献９、１７、２１〜２２）。また、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抑制剤は、動物脳卒中において、微細血管開放の維持に有益であり、神経保護効能を有する（非特許文献２３〜２４）。

韓国蛇（Ｇｌｏｙｄｉｕｓｓａｘａｔｉｌｉｓ）の毒液から精製されてクローニングされた新規なディスインテグリンであるサキサチリン（Ｓａｘａｔｉｌｉｎ）は、トリペプチド配列であるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を有するが、この配列は、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対するディスインテグリンの認識部位である（非特許文献２５〜２６）。サキサチリンは、血小板凝集（非特許文献２５）及び血小板活性化（非特許文献２７）に対して強力な抑制効能を有し、血栓生成を妨害することが知られている。

本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

Ｗａｒｄｌａｗ，Ｊ．Ｍ．，Ｖ．Ｍｕｒｒａｙ，ｅｔａｌ．（２００９）．ＣｏｃｈｒａｎｅＤａｔａｂａｓｅＳｙｓｔＲｅｖ（４）：ＣＤ０００２１３．Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｈ．，Ｂ．Ｔ．Ｂａｔｅｍａｎ，ｅｔａｌ．（２００６）．Ｓｔｒｏｋｅ３７（２）：４１９−４２４．Ｃａｐｌａｎ，Ｌ．Ｒ．，Ｊ．Ｐ．Ｍｏｈｒ，ｅｔａｌ．（１９９７）．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３３７（１８）：１３０９−１３１０；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ１３１３．Ｌｏｐｅｚ−Ｙｕｎｅｚ，Ａ．Ｍ．，Ａ．Ｂｒｕｎｏ，ｅｔａｌ．（２００１）．Ｓｔｒｏｋｅ３２（１）：１２−１６．Ｒｈａ，Ｊ．Ｈ．ａｎｄＪ．Ｌ．Ｓａｖｅｒ（２００７）．Ｓｔｒｏｋｅ３８（３）：９６７−９７３．Ｌｅｅｅｔａｌ．（２００７）．Ｓｔｒｏｋｅ３８：１９２−１９３．Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄＡ．Ｊ．Ｄｕｔｋａ（１９９０）．ＡｒｃｈＮｅｕｒｏｌ４７（１１）：１２４５−１２５４．Ａｄａｍｓ，Ｈ．，Ｒ．Ａｄａｍｓ，ｅｔａｌ．（２００５）．Ｓｔｒｏｋｅ３６（４）：９１６−９２３．Ｈｅｏ，Ｊ．Ｈ．，Ｋ．Ｙ．Ｌｅｅ，ｅｔａｌ．（２００３）．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ６０（１０）：１６８４−１６８７．Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｌ．ａｎｄＳ．Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ（１９９７）．Ｃｅｌｌ９１（７）：９１７−９２５．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｆ．，Ｓ．Ｅ．Ｔｓｉｒｋａ，ｅｔａｌ．（１９９８）．ＮａｔＭｅｄ４（２）：２２８−２３１．Ｎｉｃｏｌｅ，Ｏ．，Ｆ．Ｄｏｃａｇｎｅ，ｅｔａｌ．（２００１）．ＮａｔＭｅｄ７（１）：５９−６４．Ｙｅｐｅｓ，Ｍ．，Ｍ．Ｓａｎｄｋｖｉｓｔ，ｅｔａｌ．（２００２）．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１０９（１２）：１５７１−１５７８．Ｍａｔｙｓ，Ｔ．ａｎｄＳ．Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ（２００３）．ＮａｔＭｅｄ９（４）：３７１−３７３．Ｓｈａｔｔｉｌ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄＭ．Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ（１９９７）．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１００（１１Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ９１−９５．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｉ．Ｆ．Ｃｈａｒｏ，ｅｔａｌ．（１９８８）．Ｂｌｏｏｄ７１（４）：８３１−８４３．Ｓｅｉｔｚ，Ｒ．Ｊ．，Ｓ．Ｍｅｉｓｅｌ，ｅｔａｌ．（２００４）．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ６２（１１）：２１１０−２１１２．Ａｂｏｕ−Ｃｈｅｂｌ，Ａ．，Ｃ．Ｔ．Ｂａｊｚｅｒ，ｅｔａｌ．（２００５）．Ｓｔｒｏｋｅ３６（１０）：２２８６−２２８８．Ｅｃｋｅｒｔ，Ｂ．，Ｃ．Ｋｏｃｈ，ｅｔａｌ．（２００５）．Ｓｔｒｏｋｅ３６（６）：１１６０−１１６５．Ａｄａｍｓ，Ｈ．Ｐ．，Ｊｒ．，Ｍ．Ｂ．Ｅｆｆｒｏｎ，ｅｔａｌ．（２００８）．Ｓｔｒｏｋｅ３９（１）：８７−９９．Ｓｅｉｔｚ，Ｒ．Ｊ．，Ｍ．Ｈａｍｚａｖｉ，ｅｔａｌ．（２００３）．Ｓｔｒｏｋｅ３４（８）：１９３２−１９３５．Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｗ．Ｍｏ，ｅｔａｌ．（２００７）．ＢＭＣＭｏｌＢｉｏｌ８：８８．Ｃｈｏｕｄｈｒｉ，Ｔ．Ｆ．，Ｂ．Ｌ．Ｈｏｈ，ｅｔａｌ．（１９９８）．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１０２（７）：１３０１−１３１０．Ａｂｕｍｉｙａ，Ｔ．，Ｒ．Ｆｉｔｒｉｄｇｅ，ｅｔａｌ．（２０００）．Ｓｔｒｏｋｅ３１（６）：１４０２−１４１０．Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｙ．，Ｙ．Ｓ．Ｋｏｈ，ｅｔａｌ．（２００２）．ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ１０５（１）：７９−８６．Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｙ．，Ｙ．Ｄ．Ｓｏｈｎ，ｅｔａｌ．（２００２）．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ２９３（１）：５３０−５３６．Ｊａｎｇ，Ｙ．Ｊ．，Ｏ．Ｈ．Ｊｅｏｎ，ｅｔａｌ．（２００７）．ＪＶａｓｃＲｅｓ４４（２）：１２９−１３７．

本発明者らは、既に生成された血栓を溶解し、閉塞された或いは狭くなった血管による疾病を治療することができる血栓溶解剤を開発するために鋭意研究し、その結果、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドが、血管内に既に生成された血栓を効果的に溶解する活性を有することを確認することにより、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、血栓溶解用組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記血栓溶解用組成物を含む血管狭窄又は閉塞性疾患の治療用医薬組成物を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明及び請求の範囲及び図面により、更に明確にされる。

本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドの薬剤学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体とを含む血栓溶解用組成物を提供する。

トリペプチド配列であるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）は、ディスインテグリンの認識部位であり（Ｈｏｎｇ，Ｋｏｈｅｔａｌ．，２００２；及びＨｏｎｇ，Ｓｏｈｎｅｔａｌ．，２００２）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドを含む代表的な例がディスインテグリンである。ディスインテグリンが血小板の凝集を抑制して血栓の形成を妨害することは、既に知られていた。しかし、生体内で既に凝集して形成された血栓に溶解効果があることについては全く知られていなかった。本発明者は、ディスインテグリンのようなＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドが、血管内に既に形成された血栓を効果的に溶解する活性を有することを確認することにより、本発明を完成した。

本明細書において用語‘Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチド’は、血栓内に存在するインテグリンに結合して血栓を溶解することのできるアミノ酸ベースの分子を包括する概念であって、ペプチドの長さ、修飾の有無、電気的特性などを問わず、インテグリン認識部位であるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むものであれば制限なく使用できる。

本発明の血栓溶解用組成物の有効成分として使用される、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドは、血栓内に存在するインテグリン、好ましくは、血栓を形成する血小板表面のＧＰ（糖タンパク質）ＩＩｂ−ＩＩＩａに、競合結合の原理で結合し、血小板などをフィブリノゲンなどの構成成分から離す原理で血栓を効率的に分解する。

一実施形態において、本発明のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドは、配列番号１〜１１からなる群から選択されるいずれかの配列で表されるアミノ酸配列を含むペプチドである。

他の実施形態において、本発明のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドは、配列番号１〜１１からなる群から選択されるいずれかの配列で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。

また他の実施形態において、本発明のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドは、ディスインテグリンであり、例えば、サキサチリン、ロドストミン、アルボラブリン、アプラギン、バシリシン、バトロキソスタチン、ビチスタチン、バルボリン（ｂａｒｂｏｕｒｉｎ）、セレベリン、セラスチン、クロタトロキシン、ズリシン、エキスタチン、エレガンチン、エリスチコフィン、フラボリジン、フラボスタチン、ハリシン、ジャララシン、ジャラスタチン、ジャラリン、ラチェシン、ルトシン、モロシン、サルモシン、テルゲミニン、トリグラミン、トリメスタチン、トリムクリン、トリムターゼ、ウスリスタチン及びビリジンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明のまた他の実施形態において、前記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドは、サキサチリンであり、好ましくは、配列番号１２のアミノ酸配列からなるサキサチリンである。

その他にも血栓溶解活性を有する本発明のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドには、好ましくは、配列番号１で表されるオリゴペプチド（ＧＲＧＤＳＰ）及びその環形であるｃｙｃｌｉｃＧＲＧＤＳＰ、そしてジスルフィド結合が形成されている配列番号２から１１からなる群から選択されるいずれかの配列で表されるオリゴペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の血栓溶解有効成分であるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドは、プラスミノゲン活性化因子のような既知の血栓溶解剤と共に使用することもできるが、既知の他の血栓溶解剤無しに単独で使用して、既に形成された血栓を非常に効果的に溶解してもよく、再閉塞や出血などの副作用もほとんど発生させない。

一実施形態において、本発明の血栓溶解用組成物は、プラスミノゲン活性化因子（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ）を含まないことを特徴とする。

他の実施形態において、本発明の血栓溶解用組成物の血栓溶解有効成分は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドからなることを特徴とする。

本発明の血栓溶解用組成物は、前記有効成分として使用されるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドの他にも、薬剤学的に許容される担体を更に含むことができる。

本発明の血栓溶解用組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含んでもよいが、これらに限定されるものではない。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の他の様態によると、本発明は、前記血栓溶解用組成物を含む血管狭窄又は閉塞性疾患の治療用医薬組成物を提供する。

本発明の血管狭窄又は閉塞性疾患の治療用医薬組成物は、上記詳述した血栓溶解用組成物を利用して血栓を溶解し、治療可能な対象疾病を治療する医薬組成物であるため、前記血栓溶解用組成物との関係で共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるためにその記載を省く。

本発明の医薬組成物は、既に生成されて凝集した血栓を効果的に溶解し、前記多様な血管狭窄又は閉塞性疾患を治療することにその特徴がある。即ち、本発明の医薬組成物は、単に血栓生成を予防して血管狭窄又は閉塞性疾患を治療するものではなく、既に生成された血栓を溶かして血管を効果的に通す原理で血管狭窄又は閉塞性疾患を治療する。

本明細書の用語‘閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）’は、血管が完全に詰まったか、或いは部分的に詰まって血管が狭くなっている状態を包括する用語である。本発明で言及された閉塞の程度は、測定された血流量に基づいて判断できる。即ち、閉塞の程度は、部分的閉塞（ｐａｒｔｉａｌｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）又は完全閉塞（ｃｏｍｐｌｅｔｅｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）に分類され、部分的閉塞は、正常血流量（ｂａｓｅｌｉｎｅｂｌｏｏｄｆｌｏｗ）の５０％〜６０％水準に減少された場合を意味し、完全閉塞は、９０％〜１００％水準に減少された場合を意味する（参考：図２）。

本発明の医薬組成物は、有効成分として含有する前記血栓溶解用組成物の他にも、薬剤学的に許容される担体を更に含むことができ、この際使用できる担体は、上記詳細に説明した通りである。

本発明の医薬組成物は、静脈内注入、動脈内注入、局所注入、脳室内注入、脊髄腔注入、皮下注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができ、好ましくは、血管内への直接注入により投与できる。血管内への直接注入とは、動脈、静脈、毛細血管を含む血管、例えば、大動脈、頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜動脈、腎動脈、細動脈、毛細血管、小静脈を含む血管内に投与することを意味し、血栓が生じた血管部位によって適宜その投与方法を選択することができる。

本発明の医薬組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により様々であって、通常の熟練した医者は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の一実施形態によると、本発明の医薬組成物の１日投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇである。

本発明の医薬組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位用量形態に製造するか、又は多用量容器内に入れて製造できる。ここで剤形は、油性又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液形態であるか、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤形態であってもよく、分散剤又は安定化剤を更に含むことができる。

Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドを血栓溶解有効成分として含有する本発明の医薬組成物は、プラスミノゲン活性化因子のような既知の血栓溶解剤と共に使用することもできるが、既知の他の血栓溶解剤無しに単独で使用して既に形成された血栓を非常に効果的に溶解してもよく、再閉塞や出血などの副作用もほとんど発生させない。

一実施形態において、本発明の医薬組成物は、プラスミノゲン活性化因子（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ）を含まないことを特徴とする。

他の実施形態において、本発明の医薬組成物の血栓溶解有効成分は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドからなることを特徴とする。

本発明の医薬組成物により治療できる疾患は、多様な血管狭窄又は閉塞性疾患を含み、例えば、脳血管疾患（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ，ＣＶＤ）、心血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ）、動脈硬化性血管疾患（ａｒｔｅｒｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ）、冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｄｉｓｅａｓｅ，ＣＡＤ）、末梢血管疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌａｒｔｅｒｙｄｉｓｅａｓｅ，ＰＡＤ）などが挙げられ、好ましくは、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、裂孔性脳梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、大動脈狭窄症、心筋梗塞症、偏頭痛、脚ブロック、脳虚血、急性虚血性心血管疾患、血栓性静脈炎、静脈血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、末梢血管疾患、血管性頭痛、アテローム性動脈硬化症、血管痙攣、再狭窄症、バルーン血管形成術後の再狭窄症、及び血管炎による血管閉塞症であり、最も好ましくは、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、心筋梗塞症である。

本明細書の用語‘脳血管疾患（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ，ＣＶＤ）’は、酸素に富む血液を顔面及び脳に供給する血管で起こる動脈硬化性血管疾患である。一般に、ＣＡＤ及び／又はＰＡＤ（末梢血管疾患）と共に発生する合併性疾患（ｃｏｍｏｒｂｉｄｄｉｓｅａｓｅ）だけではなく、虚血性疾患又は血流量の不足を引き起こす疾患も含む。例えば、ＣＶＤは、虚血性脳血管疾患、急性脳梗塞、脳卒中、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、静脈瘤、軽症認知障害（ｍｉｌｄｃｏｇｎｉｔｉｖｅｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ，ＭＣＩ）又は一過性虚血発作（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｉｓｃｈｅｍｉｃａｔｔａｃｋｓ，ＴＩＡ）を含むが、これらに限定されるものではない。

本明細書の用語‘心血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ）’又は‘動脈硬化性血管疾患（ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ）’は、心臓、心臓弁膜、血液及び身体の血管構造（ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）に影響を及ぼす多くの状態を分類する場合に利用される一般的な用語であって、心臓又は血管に影響を及ぼす疾病を含む。好ましくは、代謝症候群、症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、血栓症、アテローム性血栓症、冠動脈疾患、安定及び不安定狭心症、脳卒中、大動脈狭窄症又は大動脈瘤のような大動脈疾患、脳血管疾患、末梢血管疾患又は急性虚血性動脈硬化性イベントを含むが、これらに限定されるものではない。一般に、本明細書の用語‘動脈硬化性血管疾患（ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ）’は、非虚血性疾患よりは虚血性疾患又は虚血誘発性（ｐｒｏｉｓｃｈｅｍｉｃ）疾患を意味する。

本明細書の用語‘冠動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｄｉｓｅａｓｅ，ＣＡＤ）’は、心筋に血液を供給する動脈（冠動脈）が粥状硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ）、カルシウム沈殿による硬化及び／又は狭窄により発生される動脈硬化性血管疾患を意味する。ＣＡＤは、心筋への血流量減少を招き、これによって心筋に十分な量の酸素を供給されず、究極的に壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を引き起こす。ＣＡＤは、急性冠動脈症候群、心筋梗塞（心臓麻痺）、狭心症（安定及び不安定）又は心臓に血液を供給する血管で発生するアテローム性動脈硬化症及びアテローム性血栓症を含むが、これらに限定されるものではない。

本明細書の用語‘末梢血管疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌａｒｔｅｒｙｄｉｓｅａｓｅ，ＰＡＤ）’は、心臓及び脳以外の個所で発生するアテローム性動脈硬化症及びアテローム性血栓症のような疾患であって、一般にＣＡＤと共に発生する合併性疾患を含む。

本発明の医薬組成物は、単に血栓生成を予防する原理で前記疾病を予防又は治療するものではなく、既に生成された血栓を溶かし、血管を効果的に開通する原理で前記血管狭窄又は閉塞性疾患を治療することにその特徴がある。

例えば、脳梗塞の場合、血栓生成を予防する医薬組成物（例えば、アスピリン）は、既によく知られている。しかし、一度血栓が生成されて脳血管を閉塞し、脳梗塞が発病した以上、これを効果的に治療できる医薬組成物はほとんとない実情であった。

組み換えプラスミノゲン活性化因子（ｒｔ−ＰＡ）の静脈内投与による治療法は、脳梗塞の発病後３時間内に施せる現在唯一承認された脳梗塞治療法である。しかし、プラスミノゲン活性化因子を利用した治療法の場合、上記のような時間的制限があるだけではなく、半分以上の患者が、血栓溶解治療後成功裏な血流再開に失敗する。そのような現状において、既に生成された血栓を効果的に溶解できる本発明の医薬組成物は、一度発病した血管狭窄又は閉塞性疾患の治療において非常に現実的で画期的なアプローチであると言える。それだけではなく、本発明の血管狭窄又は閉塞性疾患の治療用医薬組成物は、微細血管の閉塞も効果的に治療し、また再狭窄も起こさない点でその価値が大きいと言える。

本発明の他の様態によると、本発明は、配列番号３〜１１からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列からなる、血栓溶解活性を有するペプチドを提供する。

本発明のまた他の様態によると、本発明は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドを血管に投与する工程を含む血栓溶解方法を提供する。

本発明のまた他の様態によると、本発明は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドを血管に投与する工程を含む血管の狭窄又は閉塞性疾患の治療方法を提供する。

本発明の血栓溶解方法及び血管狭窄又は閉塞性疾患の治療方法は、上記詳述したペプチドを利用して血栓を溶解する方法であるため、前記共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるためにその記載を省く。

本発明のペプチドは、サキサチリンのアミノ酸配列（配列番号１２）に基づいたサキサチリン誘導体（即ち、欠失変異体）であり、サキサチリンの活性、即ち、形成された血栓に対する溶解能をより効率的に奏する配列を予測することにより最適化されたアミノ酸配列を用いて製造される。

本発明で提供されるサキサチリン誘導体は、全長のサキサチリンより薬剤学的に優れた特性を有する。

まず、本発明で提供されるサキサチリン誘導体は、全長の野性型サキサチリンに比べて短いが、血栓溶解能が類似している（参照：図７及び図８）。

第二に、本発明で提供されるサキサチリン誘導体は、免疫原性が減少されて、全長の野性型サキサチリンに比べ免疫反応を誘導しないため、全長の野性型サキサチリンに比べ、安全性に優れている。

第三に、本発明で提供されるサキサチリン誘導体は、全長の野性型サキサチリンに比べ、血栓溶解治療で血流再開後の再閉塞頻度及び血流量増減の程度が著しく減少し、安定的に正常血流量を維持する傾向を示す（参照：図７及び図８）。このようなサキサチリン誘導体の血栓溶解パターンは、野生型サキサチリンと比較し、治療学的に効能の増大及び副作用の減少をもたらす。

本明細書において、用語‘ペプチド’は、ペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合して形成された線形の分子を意味する。

本発明のペプチドは、当業界に公知された化学的合成方法、特に固相合成技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔａｌ．，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））によって製造できる。

本発明のペプチドは、それ自体が天然のサキサチリンより非常に優れた安定性を示すが、追加的なアミノ酸の修飾によって安定性が更に向上され得る。本発明の好ましい実施形態によると、本発明のペプチドのＣ−末端は、ヒドロキシ基（−ＯＨ）又はアミノ基（−ＮＨ_２）へ修飾でき、前記ペプチドのＮ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択される保護基と結合させることができる。

上述のアミノ酸の修飾は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用をする。本明細書において用語‘安定性’は、インビボ安定性だけではなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。上述の保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。

本発明の好ましい実施形態によると、本発明のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドは、ＳＸ１（配列番号３），ＳＸ２（配列番号４），ＳＸ３（配列番号５），ＸＬ１（配列番号６），ＸＬ２（配列番号７），ＸＬ３（配列番号１１），ＬＳ１（配列番号８），ＬＳ２（配列番号９）及びＬＳ３（配列番号１０）を含み、より好ましくは、ＳＸ１，ＳＸ２，ＳＸ３及びＸＬ２を含み、更に好ましくは、ＳＸ１及びＳＸ３を含み、最も好ましくは、ＳＸ１を含む。

本発明によると、本発明の方法は、形成された血栓による血管の治療に非常に効果的に適用できる。即ち、本発明のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドは、血栓形成を抑制できるだけではなく、既に形成された血栓を効果的に溶解することができる。したがって、本発明の方法は、血管閉塞（部分又は完全閉塞）が発生した患者（例えば、脳梗塞患者）に適用され、既に形成された血栓を溶解させることにより、非常に効率的に治療に適用できる。

本発明の好ましい実施形態によると、本発明のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドの処理濃度は、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、５ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇであって、最も好ましくは、１０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇである。

本発明の好ましい実施形態によると、本発明の方法が適用できる動物は、特に制限されず、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、猿、豚、馬、牛、羊、カモシカ、犬又は猫を含み、更に好ましくは、ヒト又はマウスを含む。

本発明の好ましい実施形態によると、前記動物血管は、動脈、静脈、毛細血管を含み、より好ましくは、大動脈、頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜動脈、腎動脈、腸骨動脈、細動脈、毛細血管、小静脈を含み、最も好ましくは、大動脈又は頸動脈を含む。

本発明の特徴及び利点を要約すると以下の通りである：
（ｉ）本発明は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含むペプチドを含む血栓溶解用組成物、これを含む血管狭窄又は閉塞性疾患の治療用医薬組成物、そしてこれを投与する工程を含む血栓溶解方法及び血管狭窄又は閉塞性疾患の治療方法に関する。
（ｉｉ）本発明の組成物及び方法は、血小板表面ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａのような血栓内インテグリンをターゲットとする原理を採択し、既に生成された血栓を効果的に分解する利点があり、これは、既存のプラスミノゲン活性化の原理とは異なる。
（ｉｉｉ）また、本発明の組成物及び方法は、貫通後の再狭窄も起こさず、微細血管まで効果的に開放させるため、神経保護効能がある。

図１ａは、ＦｅＣｌ_３処理による閉塞パターンを示すグラフである。ＦｅＣｌ_３処理後、血流量がゼロ近くまで減少し、最終的に、血管が完全に閉塞されて維持された。図１ｂは、実際血管に生成された血栓を検出するためのＨ＆Ｅ染色結果を示す写真である。５匹のマウスで生成された血栓の大きさを測定した結果、均一な大きさの血栓が生成されて、血栓溶解剤による効果を検証するに適したモデルと判断された。図２は、正常血管及び閉塞された程度が相異なる血管で測定した血流量、及びこれらの血管に形成された血栓を検出した結果を示すグラフ及び写真である。図３は、実施例で使用した組み換えサキサチリンの投与量による血流量の変化を測定したグラフである。サキサチリンの投与量が増加するにつれて、血流量（血流時間曲線下の面積）がほぼベースラインに回復した（５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇのサキサチリン投与群）。図４は、実施例で使用したサキサチリンの投与方法による血栓溶解効能を比較した結果を示すグラフである。パネルＡの青色矢印は、再閉塞が起こる時点を意味する。パネルＡにおいて、Ｂはボーラス注入（ｂｏｌｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を意味し、Ｉは連続的な静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）注入を意味する。図５は、実施例で使用したサキサチリンの投与量による血栓溶解効能を測定した結果を示すグラフである。ＦｅＣｌ_３誘導された動物に、指示濃度のサキサチリンを投与し、２時間血流量を連続的にモニタリングした。図６は、サキサチリンとサキサチリン誘導体（ＳＸ１及びＳＸ３）の血小板凝集抑制程度を測定した結果を示すグラフである。図７は、４０ｍｇ／ｋｇのサキサチリンとサキサチリン誘導体（ＳＸ１及びＳＸ３）の処理による血流量の変化を測定した結果を示すグラフである。図８は、２０ｍｇ／ｋｇのサキサチリンとサキサチリン誘導体（ＳＸ１及びＳＸ３）の処理による血流量の変化を測定した結果を示すグラフである。

以下、実施例を通じて本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。

実験方法
実験動物及びＦｅＣｌ_３による血栓生成モデル
８週齢の雄性ＩＣＲ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）マウス（（株）オリエントバイオ）を利用した。実験室動物の管理及び利用は、これに対するＮＩＨの指針に従って、制度的に承認されたプロトコールに従って行った。手術方法をみると、動物は、７０％Ｎ_２Ｏ及び３０％Ｏ_２の混合物内５％イソフルランの吸入を通じて麻酔させた。麻酔は、２％イソフルランで維持させた。手術方法の間、動物の体温は、直腸用プローブで持続的にモニタリングして、恒温性被覆調節ユニット（Ｈｏｍｅｏｔｈｅｒｍｉｃｂｌａｎｋｅｔｃｏｎｔｒｏｌｕｎｉｔ）及びヒーティングパッド（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を利用して、３７．０±０．２℃に維持した。サキサチリンのインビボ血栓溶解活性をテストするために、ＦｅＣｌ_３（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）で誘導された頸動脈血栓モデルを利用した。頸部正中切開を施して、左側総頸動脈を手術顕微鏡下で注意して解剖した。超音波ドップラー流速プローブ（ＴｒａｎｓｏｎｉｃＭＡ０．７ＰＳＢ）を総頸動脈（ＣＣＡ）の中央部位に配置した。頸動脈血流量は、超音波ＴＳ４２０血流量計（ＴｒａｎｓｏｎｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）及びｉＷｏｒｘＩＸ−３０４Ｔデータ獲得システム（ｉＷｏｒｘＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｏｖｅｒ，ＮＨ）を利用して測定した。対照群としてＣＣＡのベースライン血流量を５分間測定した。対照群のベースライン血流量の決定後、プローブを除去した。露出したＣＣＡ中央地点の外膜表面に５０％ＦｅＣｌ_３で飽和されたろ過紙（７００×５００μｍ）を５分間接触させることにより、化学的ストレスによる酸化的血管損傷が誘導された。ろ過紙を除去した後、ＣＣＡを生理食塩水で洗浄し、これの血流量を測定した。血流量の減少により血栓形成及び動脈閉塞を決定し、完全閉塞（ｃｏｍｐｌｅｔｅｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）は、血流が１０分間ない場合と定義した。

血栓の組織学的分析及び大きさ測定
血栓形成及び大きさにおいてモデルの一致性（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を評価した。完全閉塞１０分後、損傷されたＣＣＡ切片を摘出して、４％パラホルムアルデヒドに浸して固定し、組織学的分析のためにパラフィンに包埋した。パラフィンブロックを３μｍ厚で垂直方向に連続的に切断した。切断されたスライスをガラススライドにマウンティングしてヘマトキシリン（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）及びエオシン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）で染色した。各動物において血栓の大きさ（垂直長さ及び領域）は、最も大きい血栓大きさを示すスライスでＳｃｉｏｎイメージ分析ソフトウェア（ＳｃｉｏｎＣｏ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）を利用することにより測定した。

血栓溶解製剤として使用した組み換えサキサチリン
本実施例において、血栓溶解製剤として使用したサキサチリンは、大韓民国公開特許第２００２−００６４７８７号に記載の方法に従って分離精製した組み換えサキサチリン（ｒ−ｓａｘａｔｉｌｉｎ）タンパク質を使用した。そのアミノ酸配列は、配列番号１２に示した。

組み換えサキサチリンによる静脈内血栓溶解
ＣＣＡ閉塞１０分後、ＰＥ−１０チュービングと連結された注入ポンプ（ＫＤＳｃｉｎｅｔｉｆｉｃＩｎｃ．，ＵＳＡ）を利用して、左側大腿部静脈を通じてサキサチリンを静脈内投与した。注入開始時間から２時間連続的に頸動脈血流量をモニタリングした。

サキサチリンの用量反応
サキサチリンの用量反応を調べるために、動物を任意的に７つの群（各群は、５匹のマウスを含む）に分けた：生理食塩水（対照群）、１，１．７５，２．５，３．７５，５．０及び１０．０ｍｇ／ｋｇのサキサチリンが投与された群。投与量（ｄｏｓｅ）の１０％程度は、ボーラスで静脈内投与し、残りは６０分間連続的に注入された。

サキサチリンの投与方法
血栓溶解において、サキサチリンの効果は、投与方法によって評価された。本実験のために、各動物において５ｍｇ／ｋｇのサキサチリンの総投与量を利用し、動物を任意的に４つの群（各群は、５匹のマウスを含む）に分けた：（ａ）総投与量（５ｍｇ／ｋｇ）のボーラス注入；（ｂ）閉塞してから１０分後にサキサチリン投与量の半分（２．５ｍｇ／ｋｇ）を注入し、最初のボーラス注入から６０分後にサキサチリン投与量の半分を注入する二重ボーラス注入；（ｃ）閉塞してから１０分後にサキサチリン投与量の半分（２．５ｍｇ／ｋｇ）を注入し、残りの投与量を６０分間連続的に注入；及び（ｄ）閉塞してから１０分後にサキサチリン投与量の１０％（０．５ｍｇ／ｋｇ）を注入し、残り（４．５ｍｇ／ｋｇ）を６０分間連続的に注入。

血流再開の確認
血流量を測定することにより、血流再開及びその程度を測定した。ベースライン血流量に対するデータ及びＣＣＡ閉塞後２時間持続的にモニタリングされた血流量に対するデータがｉＷｏｒｘＬａｂｓｃｒｉｂｅ２データ獲得ソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０４５０００）を利用して得られた。血流量モニタリング後２時間目に全てのマウスからＣＣＡを得て、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定して、組織学的調査のためにパラフィンに包埋した。パラフィンブロックを３μｍ厚で横方向に連続的に切断して、ガラススライドにマウンティングし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。

サキサチリンの用量反応
血流時間（ｆｌｏｗ−ｔｉｍｅ）曲線下の面積により頸動脈血流量を分析した。動物間の生理学的条件の変異によって引き起こされる差異（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）を避けるために、全ての測定された数値は、各動物の最少血流によって標準化した。血栓溶解効果を下記のように計算して、正常血流量の平均値に対する百分率で表示した：（サキサチリン投与後２時間の平均血流量／正常血流量の平均値）×１００（％）。用量反応研究における各群の平均値を計算し、これを用量反応曲線で示した（平均値±標準偏差）。

血栓溶解効果の時間パターン
各動物において、毎１分間の血流量の平均を計算して、サキサチリンの投与量及び投与方法に対してそれぞれ代表的な時間依存的パターンを示した。各群において、全ての動物の平均値を計算し、時間による変化を連続的な棒グラフで示した（平均値±標準偏差）。

血流再開時間
効果的な血流再開のためのサキサチリンの投与時期を調べた。効果的な血流再開は、正常レベルの５０％の血流量が回復して、少なくとも３０分間以上持続される状態と定義した。

蛇毒由来のサキサチリン誘導体の発現システムの確立
配列最適化されたサキサチリン誘導体のクローニング及びｐＰＩＣ９ベクターの作製
サキサチリン誘導体の発現システムとしてＰｉｃｈｉａ発現システムを利用して、このためのベクターを作製した。

まず、ペプチド配列最適化タンパク質を作製するために、サキサチリン遺伝子がＰｉｃｈｉａ宿主細胞内で発現される際に、Ｐｉｃｈｉａコドン選好度（ｃｏｄｏｎｕｓａｇｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）に適合するように、コドン最適化を行って、最適化された遺伝子ヌクレオチド配列に変換した（配列番号１３から配列番号２１）。前記最適化された遺伝子ヌクレオチド配列は、Ｐｉｃｈｉａ宿主細胞（ＧＳ１１５，Ｈｉｓ⁻；（株）アイジン）で発現させるに適したｐＰＩＣ９ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングするように設計した。より詳細には、サキサチリン誘導体遺伝子の５’−部位にＸｈｏＩ制限酵素部位を配置し、３’−部位にはＥｃｏＲＩ制限酵素部位を配置した。Ｐｉｃｈｉａ宿主細胞（ＧＳ１１５）発現用ベクターであるｐＰＩＣ９ベクターのＭＣＳ（マルチクローニング部位）に位置したＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩの制限酵素部位の間に遺伝子を挿入した。前記ｐＰＩＣ９ベクターにクローニングされたサキサチリン遺伝子は、Ｎ−末端部位に酵母αファクターと結合された融合タンパク質形態で発現されるように作製した。この際、前記酵母αファクターは、タンパク質を細胞外部に分泌するためのシグナル配列として機能しながら、細胞外部に分泌される時切断されて除去された。前記合成されたサキサチリンは、培養液に分泌されるため、回収した培養液を精製して有効活性分析用サキサチリン試料として利用した。

サキサチリン誘導体発現ベクター保存用菌株の作製
発現ベクターの分離／精製及び保存のために、大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換させて保存用菌株（Ｇｌｙｃｅｒｏｌｓｔｏｃｋ，−７０℃保管）を作製した。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換のために、Ｐｉｃｈｉａ宿主細胞（ＧＳ１１５）の形質転換過程では、大腸菌（ＤＨ５α）形質転換に比べて多量の発現ベクターを利用した。前記サキサチリン遺伝子の染色体挿入過程として部位特異的組み換えを誘導するために、発現ベクターの特定遺伝子位置（ＨＩＳ４遺伝子座）の切断によりプラスミドを線形化した（即ち、ｐＰＩＣ９ベクターの場合、ＳａｌＩ又はＳｔｕＩを使用して切断）。ＧＳ１１５コンピテント細胞に１０μｇ〜５０μｇの線形化された発現ベクタープラスミドと４０μｇの運搬（ｃａｒｒｉｅｒ）ＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡ）を混合して形質転換させた。以後、成長が良好な単一コロニーを選別した。形質転換で細胞内導入されたサキサチリン遺伝子がＰｉｃｈｉａ（ＧＳ１１５）染色体上のｈｉｓ４遺伝子間に挿入されたかどうかを、ゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲ方法で確認した。

サキサチリン誘導体の発現検証
遺伝子の挿入が確認されたＰｉｃｈｉａ菌株の一部を選別して、組み換えタンパク質の発現を確認した。候補菌株をフラスコ規模で培養し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法で分析した。

サキサチリン誘導体の発現及び精製
活性分析用サキサチリン誘導体試料の作製
サキサチリン誘導体タンパク質試料の製造のために、前記選別された菌株を大量にフラスコ培養した。培養条件は、メタノール投入量と代謝に使用される酸素供給を増加させる点を除いては、前記菌株培養条件と同一であった。簡略に、前記菌株を利用した発酵は、発酵器Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ（ＫＦ７；ＫＢＴＣｏ．Ｌｔｄ．）を利用して３０℃で行った。前記発酵器システムは、７リットル（実際には５リットルで実施）であり、制御システムは、温度／ｒｐｍ／Ａｉｒ／Ｏ２／ｐＨ／ＤＯであり、運転モードは、Ｂａｔｃｈ＆Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ，半連続（Ｓｅｍｉ−ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）モードであった。まず、前記菌株をＹＮＢ培地（１リットル当たりＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅ１．７ｇ、硫酸アンモニウム５．０ｇ、リン酸２水素カリウム１１．５ｇ、リン酸水素二カリウム２．８５ｇ、グリセロール１０ｇ）で一日間培養して、得られた前記培養液をバッチ培養（ｐＨ５．０；Ｓｔａｒｔ−ｕｐＭｅｄｉｕｍ，２リットル当たりリン酸５４ｍＬ、硫酸カルシウム（無水）１．８ｇ、硫酸カリウム、３６ｇ、硫酸マグネシウム（７Ｈ_２Ｏ）３０ｇ、水酸化カリウム８．２６ｇ、グリセロール８０ｇ、ＴＭＳ（Ｔｒａｃｅｍｅｔａｌｓｏｌｕｔｉｏｎ）８．８ｍＬ）で一日間培養した。前記ＴＭＳ溶液（室温保管）は、適量の蒸留水にＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ６．０ｇ、ＭｎＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ４．２８ｇ、ＺｎＣｌ_２２０．０ｇ、ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ６５．０ｇ、Ｈ_２ＳＯ_４５ｍＬ、ＮａＩ０．０８ｇ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４−２Ｈ_２Ｏ０．２ｇ、ホウ酸０．０２ｇ、ＣｏＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ０．９２ｇ、ビオチン０．２ｇを順に添加してよく溶かした後、１リットルに容量を合わせて、０．２μｍフィルターで滅菌して作製した。前記ｂａｔｃｈ培養液を８〜１０時間、グリセロール流加培養（ＧＦＢＭ，ｐＨ５．０；０．５リットルのグリセロールを０．５リットルの蒸留水と混合してスチーム滅菌させて、室温に冷却させた後、ＧＦＢＭ１リットル当たり１２ｍＬのＴＭＳを添加して作製した）を行った。前記培養液にメタノール（ＭｅＯＨ）を３時間処理してタンパク質誘導をした後、３日間ＭｅＯＨ流加培養（ＭＦＢＭ，ｐＨ５．０；９９．９％工業用メタノール１リットル当たりＴＭＳ１２ｍＬを混合して作製し、別途の滅菌処理無しにすぐ使用して、容器及び配管は、スチーム滅菌して使用した）を行った。前記培養は、必要に応じてＭｅＯＨ半連続培養で行った。この際、ＭｅＯＨフィード率は、ＤＯ−ＳＴＡＴ（ＤＯｓｅｔｐｔ．，ｍｉｎ．６ｐｐｍ）を利用して、１日目は、６〜１５ｍＬ／ｌｉｔｅｒ／ｈｒであり、２〜３日目には、１５〜２０ｍＬ／ｌｉｔｅｒ／ｈｒであった。一方、酸素は、ＧＦＢＭ培養から供給し、純粋酸素の供給量は、０．２〜０．４ｖｖｍであった。

サキサチリン誘導体の分離精製プロトコール
サキサチリン誘導体（ＳＸ１，ＳＸ２，ＳＸ３，ＸＬ１，ＸＬ２，ＸＬ３，ＬＳ１，ＬＳ２及びＬＳ３）の分離精製は、以下のように行った。

まず、サキサチリン誘導体が形質転換された酵母菌株は、高密度細胞培養された後、発酵上清を回収した。レジン吸着のために前記上清に硫酸アンモニウム（Ａ／Ｓ）を２Ｍの濃度まで前処理して、キャプチャークロマトグラフィーを行った。フェニルセファロース６ＦＦレジンを７５ｍＬのＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにパッキングした後、前記上清をローディングした。より規模の大きい（ｓｃａｌｅ−ｕｐ）改善プロトコールにしたがって、発酵上清を吸着させて、５倍のカラム容量（５ＣＶ）の平衡化緩衝液（２．０ＭＡ／ＳｉｎＰＢＳ）及び４倍のカラム容量（４ＣＶ）の洗浄緩衝液（１．５ＭＡ／Ｓｉｎ ×０．５ＰＢＳ）で洗浄した後、１．０Ｍ，０．８Ｍ，０．７Ｍ，０．５ＭＡ／Ｓ濃度で活性プール（ａｃｔｉｖｅｐｏｏｌ）を溶出した結果、‘×０．５ＰＢＳ緩衝液＋０．８ＭＡ／Ｓ’の溶出緩衝液を利用して溶出した結果が、品質と収率面で最も優れていた。カラムの再活性化は、３倍のカラム容量（３ＣＶ）の１ＮＮａＯＨ及び５倍のカラム容量（５ＣＶ）の蒸留水で実施した。

二番目に、前記得られた溶出緩衝液を利用して練磨性クロマトグラフィーを行った。上記と同一な条件の前処理後、レジンを２１５ｍＬのＳＯＵＲＣＥ３０ＲＰＣ／ＦＩＮＥＬＩＮＥＰｉｌｏｔ３５（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにパッキングした後、前記溶出緩衝液をローディングして吸着した。５倍のカラム容量（５ＣＶ）の平衡化緩衝液（０．１％ＴＦＡｉｎＤＤＷ）及び５倍のカラム容量（５ＣＶ）の洗浄緩衝液（０．１％ＴＦＡｉｎ１０％Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（ＡＣＮ））で洗浄した後、活性プールを３倍のカラム容量（３ＣＶ）の溶出緩衝液（０．１％ＴＦＡｉｎ３０％ＡＣＮ）で溶出した。以後、カラムの再活性化は、３倍のカラム容量（３ＣＶ）の０．１ＮＮａＯＨ（ｉｎ４０％ＡＣＮ）で行った。

三番目に、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０クロマトグラフィー（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を行った。まず、ＲＰＣから得られた活性プールは、精製品に適用するために、最終保管用緩衝液に交換した。このために、ＭＷＣＯ５ＫＤａＵＦを使用したが、サキサチリン分子量が７．７ｋＤａであって、多少収率減少が予想され、最終結果でも１０％以上の減少を示した。特に、ＲＰＣ活性プールには、有機溶媒であるアセトニトリルが約３０％程度含まれているため、有機溶媒が使用できるＵＦ膜を使用した。一方、ＵＦ法代案としてゲルろ過（ＧｅｌＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を使用することができるが、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０は、有機溶媒を使用できるレジンであって、サキサチリン脱塩に非常に適しており、これを行って最終サキサチリン誘導体を得た。

得られたサキサチリン誘導体を０．２μｍのフィルターを利用して滅菌した後、純度を測定した。以後、高純度のサキサチリン誘導体を凍結乾燥して滅菌パッキングし、投与前まで−８０℃に保管した。

以後、サキサチリン誘導体による静脈内血栓溶解及び用量反応は、上述の組み換えサキサチリンの方法と同様に行った（図７及び図８）。

実験結果
動物モデルの一致性
ＦｅＣｌ_３を５分間処理した後、ＣＣＡの血流量は、調べられた全ての動物においてほぼゼロまで迅速に持続的に減少した（図１ａ）。ＣＣＡの血栓性閉塞を組織学的分析で確認した（図１ｂ）。血栓の大きさは、動物間で類似していた（長さ：１．１３９±０．０９ｍｍ；面積：０．７９９±０．１３９ｍｍ^２）。サキサチリン処理群の血管を組織学的に分析した結果、血流量が完全に回復したマウスの頸動脈内部では血栓がほとんど消失したことが観察されたが、部分的に回復したマウスでは、血栓が一部残っており、血流量が全く回復しなかった場合は、血管が血栓により依然として閉塞していることを確認した（図２）。

サキサチリンの投与量依存的な血栓溶解効果
ｒ−サキサチリンの投与量依存的な効果は、血流時間曲線下の面積に対するデータを利用して評価した（図３）。生理食塩水処理群（２．４７±１．０７％）と比較し、サキサチリン処理群は、１ｍｇ／ｋｇ（２．３６±０．７８％）又は１．７５ｍｇ／ｋｇ（４．９７±３．９４％）の投与量において目立つような変化は引き起こさなかった。血流量の回復は、２．５ｍｇ／ｋｇ（３２．５０±３３．７０％）の投与量から観察され、投与量依存的に増加した。血流は、５ｍｇ／ｋｇのサキサチリンの投与でほぼ正常水準（９４．５０±２０．４７％）まで回復した。５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇのサキサチリン投与群間に明らかな差がなかった。

投与方法によるサキサチリンの効果
最適化されたサキサチリンの静脈内投与方法は、用量反応研究において十分な効果を示した５ｍｇ／ｋｇの総投与量を利用して決定した。正常血流量と比較し、投与群における血流量の平均百分率は、下記の通りである：（ａ）総投与量（５ｍｇ／ｋｇ）のボーラス注入群、７７．０１±４６．１１％；（ｂ）投与量の半分をそれぞれ利用した二重ボーラス注入群、８５．２３±２９．９５％；（ｃ）投与量の半分を注入し、残りの投与量を連続的に注入する群、８０．７２±３０．１３％；及び（ｄ）総投与量の１０％を注入し、残りの投与量を連続的に注入する群、９４．５０±２０．４７％。

血栓溶解効果の減少は、投与方法によって異なる時点で観察された。急な再閉塞は、下記のような時点に観察された：（ａ）二重ボーラス注入されたマウスにおいて、最初の注入から約５０分後；（ｂ）総投与量のボーラス注入から約１００分後；及び（ｃ）投与量の半分がボーラス注入されて残りが連続的に注入された後から約１１０分後（図４）。総投与量の１０％を注入して、残りの投与量を連続的に注入するマウスでは、何の再閉塞も観察されなかった。

サキサチリンによる血流再開時間
生理食塩水が投与されたマウス及び１ｍｇ／ｋｇ又は１．７５ｍｇ／ｋｇのサキサチリンが投与されたマウスでは、効果的な血流再開が観察されなかった。２．５ｍｇ／ｋｇのサキサチリンが投与された５匹のマウスのうち２匹、及び３．７５ｍｇ／ｋｇのｒ−サキサチリンが投与された５匹のマウスのうち３匹でのみ効果的な血流再開が起こった。

効果的な血流再開は、正常血流量の５０％以上が回復し、少なくとも３０分間以上持続することと定義した（図５）。５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのｒ−サキサチリンが投与された全てのマウスにおいて効果的な血流再開が観察された（図５）。効果的な血流再開時間は、投与量によって下記の通りである：（ａ）２．５ｍｇ／ｋｇのｒ−サキサチリンが投与されたマウス、３２．９２±２３．５２分間；（ｂ）３．７５ｍｇ／ｋｇのサキサチリンが投与されたマウス、２１．７５±２１．６２分間；（ｃ）５ｍｇ／ｋｇのサキサチリンが投与されたマウス、１３．９２±６．０２分間；及び（ｄ）１０ｍｇ／ｋｇのサキサチリンが投与されたマウス、１９．４６±１９．７５分間。また、効果的な血流再開は、サキサチリンの投与方法によって評価した。総投与量のボーラス注入で処理された２匹のマウスを除いた５ｍｇ／ｋｇのサキサチリンが処理された全てのマウスは、効果的な血流再開を示した。効果的な血流再開時間は、下記の通りである：（ａ）総投与量のボーラス注入群、２．８６±０．２２分間；（ｂ）二重ボーラス注入群、１３．４４±２６．３１分間；（ｃ）投与量の半分を注入して、残りの投与量を連続的に注入する群、１９．４８±２５．９４分間；及び（ｄ）総投与量の１０％を注入して、残りの投与量を連続的に注入する群、１３．９２±６．０２分間。効果的な血流再開時間は、総投与量の１０％を注入して残りの投与量を連続的に注入する群より、総投与量のボーラス注入群で更に短かった（ｐ＝０．００４）。

サキサチリン処理後死亡率及び出血
総５１匹の動物をサキサチリンの血栓溶解効果の検証に利用した。そのうち、５ｍｇ／ｋｇのサキサチリンのボーラス注入後から約９０分後に、頸部切開部位における出血により１匹の動物が死亡し、他の１匹は、死亡しなかったものの、同一な部位における出血を示した。

サキサチリン誘導体の活性測定
インビトロ血小板凝集アッセイ
マウスＰＲＰ（血小板に富む血漿、ｐｌａｔｅｌｅｔｒｉｃｈｐｌａｓｍａ）にサキサチリン誘導体及びＡＤＰを投与して、凝集測定器（Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ；ＣＨＲＯＮＯ−ＬＯＧ，ＵＳＡ）を利用して凝集程度を測定し、本発明のサキサチリン誘導体の活性を評価した（表１）。

組み換えサキサチリン及びサキサチリン誘導体のインビトロ活性

表１及び図６から確認できるように、本発明のサキサチリン誘導体であるＳＸ１（３４９）及びＳＸ３（９１８）の活性が最も高く、サキサチリンと類似した血小板抑制パターンを確認することができた。

以上より、前記あらゆるサキサチリン及びサキサチリン誘導体の効果間に若干の差が存在するとしても、処理濃度の範囲による凝集抑制の程度を比較した場合、本発明のサキサチリン誘導体の処理（例えば、ＳＸ１，１μＭ；ＳＸ３，４μＭ）が前記サキサチリン（約０．７μＭ）の効果と類似していることが分かった（図６）。

サキサチリン誘導体の血栓溶解効果
サキサチリンとサキサチリン誘導体（ＳＸ１，ＳＸ３）の血栓溶解効果は、前記実験と同一に血流時間曲線下の面積に対するデータを利用して評価した（図７及び図８）。サキサチリン及びサキサチリン誘導体の投与用量は、同一に処理した。２０ｍｇ／ｋｇを処理した場合、サキサチリン投与群は、６０．９２±３９．５２％の血流量を回復して、ＳＸ１投与群は、７８．５６±１６．２４％、ＳＸ３投与群は、６９．１５±１４．８９％の血流量を回復した。４０ｍｇ／ｋｇの用量を投与した時は、サキサチリンとサキサチリン誘導体（ＳＸ１，ＳＸ３）投与群の両方とも正常血流量まで回復して、再閉塞無しに維持された。再閉塞はなかったものの、２０ｍｇ／ｋｇの用量を投与した時と同様に、サキサチリン誘導体（ＳＸ１，ＳＸ３）を投与した時、野生型のサキサチリンに比べて血流量増減の程度が少なく、血流量が安定的に維持されることを確認した（図７）。

２０ｍｇ／ｋｇの投与用量では、血流量の回復された程度に大きい差はなかったが、野生型のサキサチリンに比べ、サキサチリン誘導体（ＳＸ１）による血栓溶解治療において、血流再開以後の再閉塞頻度及び血流量増減の程度が顕著に減って、安定的に正常血流量を維持する傾向を確認した（図８）。

以上、本発明の望ましい実施形態を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい実施形態に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

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Claims

（ａ）配列番号３、５、及び１２からなる群から選択されるいずれかの配列で表されるアミノ酸配列を含むペプチドの薬剤学的有効量と、
（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、
を含むことを特徴とする血栓溶解用組成物。
前記ペプチドは、ディスインテグリン活性を有する請求項１に記載の血栓溶解用組成物。
前記ペプチドは、血栓内に存在するインテグリンに結合して血栓を分解する請求項１に記載の血栓溶解用組成物。
前記ペプチドは、血栓を形成する血小板表面のＧＰ（糖タンパク質）ＩＩｂ−ＩＩＩａに結合して血栓を分解する請求項１に記載の血栓溶解用組成物。
請求項１から４のいずれかに記載の血栓溶解用組成物を含むことを特徴とする血管の狭窄又は閉塞性疾患の治療用医薬組成物であって、
前記血管の狭窄又は閉塞性疾患は、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、裂孔性脳梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、心筋梗塞症、脳虚血、急性虚血性心血管疾患、静脈血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、末梢血管疾患、及び血管炎による血管閉塞症からなる群から選択され、
前記治療用医薬組成物は、血栓により血管が閉塞された患者に投与される治療用医薬組成物。
前記治療用医薬組成物は、血管内への直接注入により投与される請求項５に記載の治療用医薬組成物。
配列番号３及び５のいずれかのアミノ酸配列からなる、血栓溶解活性を有することを特徴とするペプチド。