CN109602748A - 维生素b2在制备预防和治疗纤维化疾病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及维生素B2在制备治疗和预防纤维化疾病药物中的用途。所述的维生素B2是维生素B2或其药用衍生物。所述的纤维化疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心纤维化、子宫内膜纤维化、眼纤维化、胰腺纤维化、脾纤维增生疾病、骨髓纤维化疾病或由纤维化诱发的疾病。所述的维生素B2可以和一种或多种药用载体组成药物组合物。维生素B2或其药物组合物可以单独使用或者和其他药物联合使用。且其在治疗纤维化疾病方面具有疗效显著、毒副作用少、使用安全的优点。

Description

维生素B2在制备预防和治疗纤维化疾病药物中的用途

技术领域

本发明属于已知药物的新用途领域，涉及维生素B2在制备预防和治疗不同纤维化疾病的药物中的用途。

背景技术

纤维化(Fibrosis)是多种病因诱导细胞因子过度表达引起固有功能细胞和间质细胞活化转型、过量细胞外基质积聚、组织结构破坏及功能丧失的病理过程。纤维化可发生于多种器官，包括肺、肝脏、肾脏和心脏等重要脏器。纤维化病理过程可分为①诱导期(炎症反应期):原发致病病因导致的细胞损伤可诱导促纤维化细胞因子如TGF-β1和PDGF等的释放，致使组织固有细胞表型转化并加速促纤维化细胞因子的释放。促纤维化细胞因子一方面促使受损功能细胞进行转型修复，另一方面也激活间质纤维细胞，促进间质细胞转型为肌成纤维细胞；②炎症基质合成期(纤维化形成期):此阶段纤维化效应细胞—肌成纤维细胞合成分泌纤黏连蛋白、胶原蛋白等ECM成分，ECM成分与固有细胞、浸润的炎性细胞、促炎因子等生物活性物质在组织内相互作用，诱导纤维化的形成；③炎症后基质合成期(疤痕形成期):进入该期，损伤的过度修复导致几乎全部固有细胞向肌成纤维细胞转型，同时由于ECM合成与降解作用失调，最终造成不易降解的ECM大量积聚并取代健康的组织细胞，组织内瘢痕持久形成。临床对纤维化疾病的治疗方案主要是联合使用抗炎、免疫抑制药物以延缓纤维化进程，该方案因其疗效的不确定性以及不良反应多而未能广泛应用。而器官移植虽然是纤维化末期唯一有效的治疗手段，但它同样面临器官供体缺乏，手术成活率低，术后难恢复等问题。由此可见，特异性强、疗效确切且无明显不良反应的抗纤维化药物的发现意义重大。转化生长因子β1(TGF-β1)信号对于肺纤维化病理过程中肌成纤维细胞的形成起着至关重要的作用，也是目前临床抗肺纤维化药物主要的作用靶点。基于TGF-β1信号在纤维化病理过程中的重要作用，目前的体外纤维化模型大多是以TGF-β1为诱导剂，体内纤维化模型中TGF-β1信号的活化也发挥举足轻重的重用，以上模型广泛用于纤维化病理机制的研究以及抗纤维化药物的活性评价。

维生素B2是一种水溶性B族维生素，在人体内主要以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)两种形式参与氧化还原反应，具有良好的抗氧化活性，是机体健康和正常生长所必需的。此外，维生素B2还具有多种生理调节功能，包括促进发育和细胞的再生、维护皮肤和细胞膜的完整性，以及与其他物质结合一起，从而影响生物氧化和能量代谢等。近年来，维生素B2更多的新功效被发现，包括利尿消肿、防治肿瘤以及抑制心脑血管病的发生等。临床数据显示，高血压患者口服维生素B2(75mg/d)后，与用药前相比血小板聚集性显著被抑制；冠心病、心肌缺血及心绞痛患者，每天口服225mg维生素B2，2～3个月后，心绞痛发作频率有所降低；偏头痛患者大剂量(200～400mg/d)补充维生素B2可使偏头痛发生频率降低、发作持续时间缩短；前列腺增生患者每天口服50mg维生素B2，半年后症状得到改善。值得注意的是，过量的维生素B2会从尿液中直接排出体外，因此无需担心服用过量等问题，即对人体没有任何副作用。到目前为止，未见维生素B2对纤维化疾病防治作用的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对的缺乏有效的预防和治疗纤维化疾病的药物的不足，提供一种维生素B2的新用途，即维生素B2在制备用于有效的预防或治疗纤维化疾病药物中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：

维生素B2在制备预防和治疗纤维化疾病的药物中的用途。

进一步地，所述的纤维化疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心纤维化、子宫内膜纤维化、眼纤维化、胰腺纤维化、脾纤维增生疾病、骨髓纤维化和皮肤纤维化等纤维化疾病或由纤维化诱发的疾病。

所述的肺纤维化疾病是药物性肺纤维化，特发性肺纤维化(IPF)，结节病、尘肺、过敏性肺炎和放射线等诱发的肺纤维化，其他病因未明的肺纤维化，以及由肺纤维化诱发的疾病。

所述的肝纤维化是病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性疾病、脂肪肝、营养不良、慢性充血性心力衰竭和药物等不同原因引起的肝脏纤维化，其他病因未明的肝脏纤维化，以及由肝纤维化诱发的疾病。

所述的肾纤维化是高血压、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、肾移植排斥、肾盂肾炎、肾结石、高血脂、糖尿病、高尿酸尿症、高钙尿症等原因引起的肾脏纤维化，其他病因未明的肾脏纤维化，以及由肾纤维化诱发的疾病。

所述的心纤维化是缺血性心脏疾病、高血压、病毒性心肌炎、代谢性心肌病、克山病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病和心律失常等原因引起的心脏纤维化、心脏重构和心肌肥厚，其他病因未明的心纤维化，以及由心纤维化诱发的疾病。

所述的子宫内膜纤维化是不同原因引起的子宫内膜纤维化病变如子宫内膜异位症等，以及由子宫内膜纤维化诱发的疾病。

所述的眼纤维化是眼睛外伤、眼睛手术和糖尿病引起的眼视网膜纤维增生疾病，以及由眼纤维化诱发的疾病。

所述的胰脏纤维化是急性胰腺炎、胰管梗阻、慢性酒精中毒、Oddi括约肌功能失调、胰腺缺血，以及由胰脏纤维化诱发的疾病；

所述的骨髓纤维化是特发性和药物引起的骨髓纤维化、真性红细胞增多症、慢性髓细胞性白血病、何杰金氏病，以及由骨髓纤维化诱发的疾病。

本发明中，所述的维生素B2是维生素B2或其药用衍生物，所述的维生素B2药用衍生物是维生素B2的药用盐或酯。

所述的维生素B2可以单独使用或者和其他药物联合使用。

所述的维生素B2药物可以制备成药物组合物，该组合物至少包括一种活性成分维生素B2和一种药用载体。

进一步地，所述的药物组合物，包括1～99％(质量)维生素B2和1～99％(质量)药用载体，优选为10～90％(质量)维生素B2和10～90％(质量)药用载体

本发明所述的维生素B2或其药物组合物可以制备成片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂，用于口服给药，以及经静脉、肌肉、直肠、皮内或皮下等方式给药。

所述的药物组合物还可以是水溶液、非水溶液或混悬液。

本发明中，所述的维生素B2或其药物组合物中，维生素B2在治疗时的使用剂量根据患者的年龄和病情而定，常用的每日剂量为50～50000mg，优选500～30000mg，更优选1000～20000mg。给药次数一天一次或数次。

本发明通过构建体内、体外纤维化模型，考察受试物维生素B2在肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心纤维化等纤维化疾病预防和治疗中的用途。试验结果表明，维生素B2或其药物组合物能够明显抑制肺、肝、肾和心纤维化病理进程。

附图说明

图1为维生素B2体外可抑制TGF-β1刺激的肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心纤维化标志蛋白α-SMA表达的上调。

其中A、B、C和D依次为预先用300μM维生素B2或溶媒(Control)处理的肺上皮细胞A549细胞、肝星状细胞LX-2、肾小管上皮细胞CD3和原代心成纤维细胞经10ng/mL的TGF-β1刺激后纤维化标志蛋白α-SMA表达的变化。##P＜0.01，与control组比较；**P＜0.01，与TGF-β1组比较。

图2为维生素B2体外可阻断TGF-β1刺激的肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心纤维化效应细胞表面硬度的改变。

其中A、B、C和D依次为预先用300μM维生素B2或溶媒(Control)处理的肺上皮细胞A549细胞、肝星状细胞LX-2、肾小管上皮细胞CD3和原代心成纤维细胞经10ng/mL的TGF-β1刺激后细胞表面硬度的变化。##P＜0.01，与control组比较；**P＜0.01，与TGF-β1组比较。

图3为维生素B2灌胃给药对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型的病理学检查结果

A为HE染色实验结果，B为Masson染色检测胶原表达的结果，C为免疫组织化学法检测α-SMA表达的结果。

具体实施方式

实施例1、基于纤维化标志蛋白α-SMA的维生素B2体外抗肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心纤维化作用研究。

肺上皮细胞A549细胞、肝星状细胞LX-2、肾小管上皮细胞CD3和原代心成纤维细胞预先用300μM维生素B2或溶媒处理，然后经10ng/mL的TGF-β1刺激上述四种细胞向肌成纤维细胞转型而构建体外肺、肝、肾和心纤维化模型，以纤维化标志蛋白α-SMA表征纤维化的程度。如图1所示，10ng/ml的TGF-β1刺激人肺上皮细胞A549、肝星状细胞LX-2、肾小管上皮细胞CD3和原代小鼠心成纤维细胞48h后，纤维化标志蛋白α-SMA的明显上调(P＜0.01＝证明经典的肺、肝、肾和心纤维化模型的成功构建)。300μM的维生素B2可明显阻断TGF-β1诱导的纤维化标志蛋白α-SMA的上调，表明了维生素B2对肺、肝、肾和心纤维化病理进程具有抑制作用。

实施例2、细胞硬度为纤维化标志物考察维生素B2体外抗肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心纤维化作用。

我们前期研究结果证明细胞硬度可作为表征纤维化程度的的生物标志物。肺上皮细胞A549细胞、肝星状细胞LX-2、肾小管上皮细胞CD3和原代心成纤维细胞预先用300μM维生素B2或溶媒处理，然后经10ng/mL的TGF-β1刺激上述四种细胞向肌成纤维细胞转型而构建体外肺、肝、肾和心纤维化模型，原子力显微镜检测上述四种细胞经TGF-β1刺激后细胞硬度的变化，以细胞硬度(杨氏模量)为标志物表征纤维化的程度。结果表明(图2)，在上述肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心纤维化模型中，维生素B2可明显阻断TGF-β1诱导的细胞硬度的增加，进一步证明了维生素B2体外可产生抗肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心纤维化作用。

实施例3、维生素B2体内抗纤维化作用研究。

1、模型制备及给药：

选用体重20-24g之间成年雄性C57小鼠，分别设定空白对照组(生理盐水)、模型组、受试药组(维生素B2，1.4g/kg，灌胃给药)，每组10只动物。博莱霉素按3mg/kg经气管灌注给药制备小鼠肺纤维化模型；博莱霉素造模后第7天给予不同受试药物，每日给药一次，连续给药21天。

2、病理组织取材：

于给药后第28日，小鼠腹腔注射0.1ml/10g水合氯醛麻醉，打开胸腔，剪开左心房，用预冷的生理盐水从右心室缓慢注入心脏，经肺循环灌注至肺脏发白为止，剪下左肺叶放入4％多聚甲醛固定24h，石蜡包埋后切片，其余肺组织贮藏在液氮中备用。样本用等渗生理盐水解冻，并制成匀浆并于-20℃贮藏。

3、小鼠肺脏组织病理切片制备及纤维化评价指标：

上述组织病理学样本采用4％多聚甲醛浸泡24h，乙醇脱水，石蜡包埋，曙红苏木紫染色，Masson三色染色，光镜下进行组织学评价。评价指标包括：肺泡腔体积、肺泡壁厚度、中性粒细胞和胶原含量等。

同时，对上述组织病理学样本使用免疫组化技术检测小鼠肺组织中肺纤维化标志蛋白α-SMA表达量的变化

4、维生素B2的体内抗肺纤维化作用评价结果：

实验结果见图3。HE染色实验结果显示，空白对照组动物肺组织内结构清晰，未见纤维化表现。博来霉素模型组小鼠肺组织切片严重纤维化，表现为肺泡结构破坏或消失，纤维结缔组织填充，并伴有炎症细胞浸润；肺泡间质明显水肿增宽，大量成纤维细胞和胶原组织沉积。维生素B2给药组小鼠肺组织结构较模型组相对完整，肺泡内未见明显的炎症细胞，存在少量的纤维灶，纤维化程度明显减轻。Masson染色结果显示，空白对照组动物肺组织内有少量胶原分布。博来霉素模型组支气管壁周围和肺泡隔区域，可见蓝色胶原纤维明显增多。维生素B2给药组小鼠与模型组相比，胶原纤维沉积明显减少。免疫组织化学检测结果显示，空白对照组动物肺组织肺泡间隔细胞偶见α-SMA阳性表达。博来霉素模型组肺组织增厚的肺泡间隔和塌缩的肺泡结构内均可见α-SMA表达量显著升高，大量阳性表达细胞形成典型的成纤维细胞灶。维生素B2给药组肺泡间隔中仍可见散落的成纤维细胞灶存在，但α-SMA阳性表达细胞较博来霉素组明显减少。以上病理组织切片结果显示，维生素B2体内产生明显的抗纤维化作用。

Claims (10)

1.维生素B2在制备预防和治疗纤维化疾病药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的纤维化疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心纤维化、子宫内膜纤维化、眼纤维化、胰腺纤维化、脾纤维增生疾病、骨髓纤维化疾病或由纤维化诱发的疾病。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的肺纤维化疾病是与药物治疗相关的肺纤维化，特发性肺纤维化，感染性肺纤维化，继发性肺纤维化，结节病、尘肺、过敏性肺炎或放射线诱发的肺纤维化，其他病因未明的肺纤维化，以及由肺纤维化诱发的疾病；所述的肝纤维化是病毒性肝硬化、酒精性肝硬化、心源性肝硬化、自身免疫性疾病、脂肪肝、营养不良或药物引起的肝脏纤维化，其他病因未明的肝脏纤维化，以及由肝纤维化诱发的疾病；所述的肾纤维化是高血压、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、肾移植排斥、肾盂肾炎、肾结石、高血脂、糖尿病、高尿酸尿症、高钙尿症引起的肾脏纤维化，其他病因未明的肾脏纤维化，以及由肾纤维化诱发的疾病；所述的心纤维化是缺血性心脏疾病、高血压、病毒性心肌炎、代谢性心肌病、克山病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病或心律失常引起的心脏纤维化、心脏重构和心肌肥厚，其他病因未明的心纤维化，以及由心纤维化诱发的疾病；所述的子宫内膜纤维化是不同原因引起的子宫内膜纤维化病变如子宫内膜异位症等，以及由子宫内膜纤维化诱发的疾病；所述的眼纤维化是眼睛外伤、眼睛手术或糖尿病引起的眼视网膜纤维增生疾病，以及由眼纤维化诱发的疾病；所述的胰脏纤维化是急性胰腺炎、胰管梗阻、慢性酒精中毒、Oddi括约肌功能失调、胰腺缺血，以及由胰脏纤维化诱发的疾病；所述的骨髓纤维化是特发性和药物引起的骨髓纤维化、真性红细胞增多症、慢性髓细胞性白血病、何杰金氏病，以及由骨髓纤维化诱发的疾病。

4.根据权利要求1-3任何一项所述的用途，其特征在于，所述的维生素B2单独使用或者和其他药物联合使用。

5.如权利要求1-4任何一项所述的用途，其特征在于，所述的维生素B2是维生素B2或其药用衍生物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的维生素B2药用衍生物是维生素B2的药用盐或酯。

7.如权利要求1-6任何一项所述的用途，其特征在于，所述的维生素B2和药用载体组成药物组合物。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括质量为1～99％的维生素B2和1～99％药用载体。

9.如权利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物为水溶液、非水溶液或混悬液，或制备成片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂，用于口服、静脉、肌肉、直肠、皮内或皮下给药。

10.如权利要求1-9中任何一项所述的用途，其特征在于，所述的维生素B2每日剂量为50～50000mg，优选500～30000mg，更优选1000～20000mg。