具体实施方式
实施例13株菌种的抗逆性和生物学性能测定
3株菌种:嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094、酿酒酵母CGMCC No.2388为申请人从健康动物肠道或粪便中分离、选育得到,保藏于4℃冰箱中。
1)地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094培养物的制备:将冰箱保藏的斜面菌种接种到BPY种子培养基中活化,37℃、200rpm培养18h,得到芽孢率在95%以上的培养物;
2)嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093培养物的制备:将冰箱保藏的斜面菌种接种到MRS种子培养基中活化,35℃、100rpm培养16h,即得;
3)酿酒酵母CGMCC No.2388培养物的制备:将冰箱保藏的斜面菌种接种到98号种子培养基中活化,30℃、150rpm培养16h,即得;
4)耐酸性测定:将上述制备的培养物按5%接种量分别接种于pH值2.0、3.0、4.0的人工模拟胃液中,0h计数作对照,2h、6h取样用磷酸缓冲液按10倍系列稀释,进行平板活菌计数,计算存活率。
本发明选育的3株菌种在胃酸中存活率结果见表1。
人工模拟胃液的制备:量取9.5%~10.5%浓盐酸16.4毫升,加蒸馏水至1000毫升,做基础人工胃液,用盐酸或氢氧化钠调pH值2.0、3.0、4.0,各取10mL(9mL),分装于试管中,100℃下蒸汽灭菌15分钟,在无菌条件下,每10mL液体中加入0.100g胃蛋白酶。
表13株菌种在人工模拟胃液中的存活率
5)耐胆盐测定:将上述制备的3株菌种的培养物,按5%接种量分别接种于0.03%、0.1%、0.2%、0.3%不同浓度的猪胆盐溶液中,0h计数作对照,2h、6h取样用生理盐水按10倍系列稀释计数,进行平板活菌计数,计算存活率。
本发明所选育的3株菌种在胆盐中存活率结果见表2。
胆盐的制备:0.85%生理盐水中各9mL,分装于试管中,121℃下蒸汽灭菌30分钟,在无菌条件下,制成0.03%、0.1%、0.2%、0.3%不同浓度的猪胆盐溶液。
表23株菌种在不同浓度猪胆盐中处理6h的存活率
6)耐高温测定:将上述制备的3株菌种的培养物,分别于50℃、60℃、70℃、80℃水浴处理15min、30min,计算存活率。
表33株菌种在不同高温下处理不同时间的存活率(%)
7)耐药性测定:采用药敏纸片法。
表43株菌种的耐药性测定结果
8)产酶测定:采用中华人民共和国轻工业行业标准,工业用α-淀粉酶制剂(QB/T1805.1-1993),工业酶制剂通用试验方法(QB/T1803-1993)对地衣芽孢杆菌进行淀粉酶活力测定;采用行业标准:工业用蛋白酶制剂(QB/T1805.3-1993),对地衣芽孢杆菌进行蛋白酶活力测定。
地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094淀粉酶活力为:800u/ml;蛋白酶活力为1000u/ml。
9)产酸测定:采用离子色谱法对嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093发酵液进行了产酸测定。
产酸结果表明,嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093总有机酸量为8.2g/L,其中乳酸量为5.76g/L,乙酸量为2.03g/L,还有少量的异丁酸。
10)抑菌试验:采用牛津杯法对常见致病菌进行抑菌测定。
a、在装有10mL营养肉汁培养基的试管中活化三株致病菌:K99、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌,37℃恒温培养20h;
b、双层平板的制备:取直径90mm的平板,注入灭菌的营养琼脂15~20mL,水平放置使之凝固,作为底层,另取营养琼脂(冷至50℃左右)与37℃240h培养的指示菌液适量(50mL 培养基加8mL左右)混匀,吸取10mL浇在底层培养基上,水平放置使之凝固,作为菌层;
c、加样品:用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯,打开皿盖,放在培养基上。在牛津杯中加满相同量的发酵液上清液(约200uL),每个样品2个重复。将加完样的双碟小心放入37℃恒温箱内,培养16-18h后,取出测量抑菌圈大小。
表53株菌种对常见致病菌的抑菌结果
实施例2、复合微生态制剂的制备
1、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094菌粉的制备
1)平板培养复壮:将地衣芽孢杆菌菌种接种于BPY平板培养基上,于37℃培养24h,使地衣芽孢杆菌复壮,并形成单菌落,挑取单菌落于接种于斜面培养基上,于37℃培养36h;
2)一级种子的制备:将步骤1)培养的地衣芽孢杆菌菌种转接茄子瓶斜面培养基上,于37℃培养12h,使其处于对数中后期,得一级种子;
所述的斜面培养基为BPY固体培养基;
3)二级种子的制备:将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液,接种到装有1.6M3BPY种子培养基的2M3种子罐中,温度37℃,转速200rpm,罐压0.05Mpa,通风比:1∶0.6~0.8(14.4~19.2M3/h),培养10~14h,为二级种子液;
4)地衣芽孢杆菌发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子液按照10%的接种量接种到装有16M3发酵培养基的发酵罐中,温度37℃,转速220rpm,罐压0.05Mpa,通风比:1∶0.6~0.8,培养20h,至芽孢形成率90%以上,活菌数为1~2×1010cfu/ml,则中止发酵,得地衣芽孢杆菌发酵液;
所述的发酵培养基为:麸皮2%,豆粕1%,氯化钠0.8%,硫酸镁0.01%。
5)地衣芽孢杆菌菌粉的制备:在步骤4)制备的发酵液中加入25%的填充物米糠,混匀,进行喷雾干燥,进风温度120~130℃,排风温度40~50℃,雾化器转速15000~18000rpm,得到水分含量<5%,活菌数≥109cfu/g的地衣芽孢杆菌菌粉。
所述的填充物为:米糠、沸石粉、稻壳粉中的任一种。
2、嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌粉的制备
1)平板培养复壮:将嗜酸乳杆菌菌种接种于MRS平板培养基上,于37℃培养24h,使嗜酸乳杆菌复壮,并形成单菌落;挑取单菌落接种于斜面培养基上,于37℃培养24h;
2)一级种子的制备:将步骤1)培养的嗜酸乳杆菌斜面菌种转接到装有300ml MRS培养基的500mL三角瓶中,于37℃培养12h,转速100rpm,使其处于对数中后期,为一级种子;
3)二级种子的制备:将步骤2)培养的嗜酸乳杆菌一级种子转接到装有1.6L MRS培养基的2.0L三角瓶中,于37℃静止培养12h,为二级种子液;
4)发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子液按照3%的接种量接种到装有16M3发酵培养基的发酵罐中,温度37℃,转速120rpm,罐压0.05Mpa,培养16h,至活菌数为2×109cfu/ml,中止发酵;
所述的发酵培养基为:葡萄糖2%,大豆蛋白胨1%,硫酸铵0.5%,氯化钠0.2%,硫酸镁0.05%。
5)嗜酸乳杆菌菌粉的制备:将步骤4)制备的发酵液,5000rpm离心,得到菌泥,加入与菌泥的重量/体积百分比为20%的冻干保护剂,混匀,于-45℃冷冻干燥,得到水分含量<5%,活菌数≥109cfu/g的嗜酸乳杆菌菌粉;
所述的冻干保护剂为:脱脂奶粉、甘油、蔗糖、麦芽糊精和谷氨酸钠的混合物,按照:脱脂奶粉∶甘油∶蔗糖∶麦芽糊精∶谷氨酸钠=2∶1.0∶1.0∶1.5∶1.0的比例混合而成。3、酿酒酵母CGMCC No.2388菌粉的制备
1)平板培养复壮:将冰箱保藏的酿酒酵母斜面菌种采用划线接种的方法在98号平板培养基上划线接种,于30℃培养46h,使酿酒酵母复壮,并形成单菌落;挑取单菌落于新鲜的98号斜面培养基上,于30℃培养36h,放置冰箱备用;
2)一级种子的制备:将步骤1)培养好的酿酒酵母新鲜斜面菌种转接到装有200ml 98号培养基的500mL三角瓶中,于30℃培养12~16h,转速150rpm,使其处于对数中后期,为一级种子;
3)二级种子的制备:将步骤2)培养好的酿酒酵母种子液转接到装有1.2L 98号培养基的2.0L三角瓶中,于30℃静止培养12h,为二级种子液;
4)发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子按照10%的接种量接种到装有15~16M3发酵培养基的发酵罐中,温度30℃,转速200rpm,罐压0.05Mpa,培养16h中止发酵,此时活菌数为1.5×109cfu/ml;
所述的发酵培养基为:红糖1%,大豆蛋白胨1%,酵母膏0.2%,氯化钠0.5%,硫酸镁0.01%,磷酸氢二钾0.2%。
5)酿酒酵母菌粉的制备:将步骤4)制备的发酵液,2000pm离心,得到菌泥,加入与菌泥的重量/体积百分比为10~15%的冻干保护剂,混匀后于-25℃冷冻干燥,得到水分含量<5%,活菌数≥109cfu/g的酿酒酵母菌粉;
所述的冻干保护剂为脱脂奶粉、甘油、麦芽糊精按照:2∶0.5∶1比例混合而成。4、复合微生态制剂的制备
将1、2、3制备的地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094菌粉、嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌粉、酿酒酵母CGMCC No.2388菌粉和新称取的玉米芯粉,上述各成分的重量配比为:1∶1∶2∶20混合,得复合微生态制剂。
实施例3复合预混料的制备
每千克复合预混料中含有硫酸亚铁30g、硫酸铜10g、硫酸锌12g、硫酸锰2g、1%碘化钾0.10g、氯化钴0.30g、1%亚硒酸钠0.10g、有机铁15g、有机铜5g、有机锌6g、有机锰3g、维生素A0.30g、维生素D34g、维生素E 3.2g、维生素K30.18g、维生素B10.30g、维生素B20.40维生素B60.15、维生素B120.002g、泛酸1.5g、烟酸0.10g、叶酸0.05g、生物素0.0102g、赖氨酸140g、复合微生态制剂100g、乙氧基喹啉3g、50%氯化胆碱80g、沸石粉200g,麸皮补足到1000g。
该原料的制备方法:先将维生素、微量元素类用混合机分别预混,然后再按“部分载体、预混过的微量元素、维生素、复合微生态制剂、剩余载体”的顺序投料进行均匀混合即可。实施例4复合预混料的制备
每千克复合预混料中含有硫酸亚铁35g、硫酸铜12g、硫酸锌20g、硫酸锰4g、1%碘化钾0.15g、氯化钴0.50g、1%亚硒酸钠0.15g、有机铁20g、有机铜8g、有机锌15g、有机锰6g、维生素A 0.35g、维生素D34.5g、维生素E 3.5g、维生素K30.20g、维生素B10.40g、维生素B20.65g、维生素B60.20g、维生素B120.0022g、泛酸2.0g、烟酸0.25g、叶酸0.08g、生物素0.015g、赖氨酸140g、复合微生态制剂200g、乙氧基喹啉3g、50%氯化胆碱90g、沸石粉200g,麸皮补足到1000g。
该原料的制备方法:先将维生素、微量元素类用混合机分别预混,然后再按“部分载体、预混过的微量元素、维生素、复合微生态制剂、剩余载体”的顺序投料进行均匀混合即可。
实施例5复合预混料的制备
每千克复合预混料中含有硫酸亚铁40g、硫酸铜15g、硫酸锌22g、硫酸锰6g、1%碘化 钾0.23g、氯化钴0.6g、1%亚硒酸钠0.18g、有机铁25g、有机铜10g、有机锌25g、有机锰10g、维生素A0.40g、维生素D35g、维生素E 4g、维生素K30.25g、维生素B10.50g、维生素B20.70g、维生素B60.25g、维生素B120.003g、泛酸3.0g、烟酸0.40g、叶酸0.10g、生物素0.018g、赖氨酸140g、复合微生态制剂150g、乙氧基喹啉3g、50%氯化胆碱100g、沸石粉200g,麸皮补足到1000g。
该原料的制备方法:先将维生素、微量元素类用混合机分别预混,然后再按“部分载体、预混过的微量元素、维生素、复合微生态制剂、剩余载体”的顺序投料进行均匀混合即可。实施例6复合预混料的饲喂效果试验
1材料和方法
1.1本发明实施例3、4、5制备的复合预混料
1.2试验地点:唐山大北农猪育种科技有限责任公司
1.3试验设计
选取平均体重接近30kg的健康猪12栏,分为4个处理组,每组3个重复,即3栏,以栏为单位做为一个重复,每栏6头猪。称取初重后用SPSS软件进行分析,确认各处理间初始重无差异性。饲喂不同饲料的栏交叉排列,消除环境差异。试验期为40天。
1.4试验日粮
日粮配合参照NRC(1998)20~50kg瘦肉型猪饲养标准,各试验日粮的基础配方相同,基础日粮配方见表6。试验日粮分组:A:普通猪用预混料日粮;B-D:实施例3~5复合预混料日粮。
表6日粮养分组成及营养水平
1.5饲养管理
按照常规程序和方法进行编号、驱虫和免疫等管理,各组饲养密度相同,商品肉猪自由采食和自由饮水,各组间除日粮不同外,其它条件完全一致。
1.6检测指标
1.6.1生产性能测定
于饲养试验第一天和饲养结束称量每头猪的空腹体重,记录初始体重和末体重,计算每头猪日均增重;记录饲养初期及饲养结束的料重,计算每头猪耗料量。
料肉比(F/G)=消耗饲料总量/(期末体重-初始体重)
日均增重=(期末体重-初始体重)/饲喂天数
1.6.2猪肠道中分泌型IgA(sIgA)抗体测定
于饲养试验结束时(第40天),每个处理宰杀6头猪,解剖取猪小肠肠道内容物,用缓冲液均浆稀释后,采用Elisa法检测其sIgA抗体水平。
1.7统计分析
试验数据运用SPSS10.0软件中的One-way ANOVA进行统计分析,差异显著时进行Ducan多重比较。以P<0.05为差异显著水平。
2.试验结果
表7试验育成猪生长性能
注:同一行数据肩标中无相同字母代表差异显著(P<0.05)。
试验结果表明本发明的复合预混料饲喂效果非常理想,其中D组中试验猪平均日增重达898克,与对照组相比差异显著(P<0.05),日均增重比对照组提高了9.1%,而B、C组的体增重与对照组A组相比同样也有提高育成猪体增重的趋势;C、D两种含有微生态制剂的猪用预混料组在料肉比上均显著低于对照组(P<0.05),其中D组的料肉比数值最低,与对照组料肉比相比降低了4.1%,这说明D组日粮显著提高了育成猪的饲料转化效率,有助于经济效 益的提高(表7)。
通过对猪肠道重要防御蛋白sIgA抗体水平的测定可知,含有复合微生态制剂日粮处理组显著提高了中猪肠道内IgA抗体水平(P<0.05),而高剂量复合微生态制剂的添加更有助于刺激肠道抗体分泌含量(P<0.01)。
实验结果表明,本发明的含有复合微生态制剂的猪用复合预混料增强了猪肠道局部免疫力,提高了猪机体体液免疫水平,增强抵抗力,有助于减少猪病的发生,维护动物健康,从而更大程度地发挥猪的生长潜力,提高养殖户经济效益(表7)。