CN102264683B

CN102264683B - 制备非基因毒性二乙酰大黄酸(双醋瑞因)的方法以及包含非基因毒性二乙酰大黄酸的制剂

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Publication number: CN102264683B
Application number: CN200980149276.3A
Authority: CN
Inventors: A·马佐拉; S·莫亚那
Original assignee: Evultis SA
Current assignee: EVULTIS公司; Evultis SA
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2009-11-03
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2029-11-03
Also published as: EP2364287A2; CN102264683A; MX2011006041A; US20110245341A1; EP2364287B1; BRPI0917627A2; US8598232B2; WO2010000879A2; WO2010000879A3

Abstract

本发明涉及一种制备非基因毒性二乙酰大黄酸(双醋瑞因)的方法，其包括：i)将粗双醋瑞因(或粗大黄酸)转化为水溶性盐；ii)将盐双醋瑞因(或大黄酸)溶液吸附至疏水性树脂；iii)使用合适的溶剂洗涤以去除杂质(特别是基因毒性杂质)；iv)洗脱以回收双醋瑞因或大黄酸；v)若所述方法应用于大黄酸，通过乙酰化将其转化为双醋瑞因；vi)纯化的双醋瑞因的酸化及其回收，以及干燥。本发明也涉及通过本发明的方法获得的非基因毒性双醋瑞因，其中基因毒性杂质的总含量为1ppm以下，所述非基因毒性双醋瑞因适于制备符合目前卫生局要求的用于人类和兽医用途的药物制剂，特别是胶囊。

Description

制备非基因毒性二乙酰大黄酸(双醋瑞因)的方法以及包含非基因毒性二乙酰大黄酸的制剂

技术领域

本发明涉及制备具有高纯度，特别是具有低基因毒性杂质含量的二乙酰大黄酸(双醋瑞因)的新方法。这些特性允许在用于人类和兽医应用的药物制剂中使用非基因毒性双醋瑞因。

背景技术

双醋瑞因(化学名称：1，8-二乙酰氧基-3-羧基蒽醌)为具有抗炎活性(特别是抗自由基活性)的分子，因此可用于预防和治疗各种病理状态，特别是涉及软骨退化的那些病例状态，例如关节炎和骨关节炎的某些形式。

化学地，双醋瑞因具有如下结构：

制备双醋瑞因的原料为衍生自含有糖(glycosilate)基蒽醌结构的不同植物种类的植物提取物；特别地，番泻叶(Senna)或芦荟(Aloe)提取物最合适。尽管方法可应用于衍生自含有可转化为双醋瑞因的产物的任何植物种类的所有植物提取物，在下文中所用的命名法将指来自芦荟提取物的产物。

通常，3-羧基-1，8-二乙酰化的蒽醌产物通过包含于第一提取产物中的糖的氧化降解获得，所述氧化降解利用不同的试剂，如铬酸酐(DEA-4.120.989和DE A-120.990)或FeCl₃(WO96/30034)。在该氧化步骤之后，分离相应的蒽醌三醇(芦荟大黄素(Aloemodine))；接下来的步骤是存在于芦荟大黄素中的酚基和醇基的乙酰化反应，从而制得所谓的三乙酸酯(芦荟大黄素三乙酸酯)。通过利用氧化将3位的亚甲基醇基(-CH₂OH)转化为相应的羧基而获得双醋瑞因。

总是从芦荟素获得粗双醋瑞因的一种可选择的方法是将芦荟素(Aloin)乙酰化，随后用铬酸酐氧化。

如上所述，这种步骤属于在不同的专利中所描述的现有技术。

已知粗双醋瑞因含有必须被去除的杂质。

许多纯化方法已由不同作者进行描述。一些专利描述有时在逆流中(EP 520 414)在增加产物溶解性的有机碱(如三乙胺)的存在下使用不是特别可混溶的有机溶剂的混合物进行提取(液/液提取)。其他作者进行在各种溶剂混合物中不同无机盐的依次沉淀(WO2004/050601)。

取决于所用的方法，最终产物表现出通常不适于口服药学上的人类和兽医应用的纯度，从而需要进一步的提纯步骤，方法产率明显降低。特别地，这些方法不产生非基因毒性双醋瑞因，特别是不产生高纯度的非基因毒性双醋瑞因。

在下文中，术语“基因毒性杂质”指在任何暴露水平下具有损伤DNA的潜力的化合物，所述损伤导致/促成了肿瘤发展。

术语“非基因毒性杂质”指不具有损伤DNA的潜力但对人类仍然有毒的化合物。

取决于用作原料的植物提取物和应用的制造方法，不同的基因毒性杂质可存在于最终产物中。在这些杂质中，如下产物由于它们的基因毒性活性而是相关的：大黄素(Emodin)、单乙酰基大黄素、二乙酰基大黄素、三乙酰基大黄素、芦荟大黄素、单乙酰基芦荟大黄素、二乙酰基芦荟大黄素和三乙酰基芦荟大黄素。

当双醋瑞因来自芦荟时，基因毒性杂质为芦荟大黄素及其单-、二-和三乙酰化衍生物，其具有如下结构：

和大黄素及其单-、二-和三乙酰化衍生物，其具有如下结构：

对人类有毒的其他杂质为：1，8-丹蒽醌、大黄酸(Rhein)、单乙酰基大黄酸I、单乙酰基大黄酸II，其具有如下结构：

以及另外的N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、三乙胺、乙醇、醋酸、铬和其他重金属(包括铬)。

如今，对于所有新药，卫生局(Health Authorities)要求确定并定量基因毒性化合物；基因毒性杂质的最大可接受含量由极精确限度固定。

ICH指南(EMEA/CHMP/QWP/251344/2006)要求总基因毒性杂质含量(按照TTC：毒理学关注阈值)为15ppm以下。

该限度更低于2006年以前提交的专利中所描述的那些(例如EP520 414)。

由于卫生机构(Health Agencies)对基因毒性化合物的新要求，这些杂质的存在使得如今非高纯度的双醋瑞因作为用于人类和兽医用途的药物制剂中的活性成分的使用变得不恰当。由于此原因，需要开发能够获得高纯度的双醋瑞因(这意味着不含这些基因毒性杂质和非基因毒性杂质的双醋瑞因)的新的纯化方法。

令人惊讶地，现在发现合适的树脂可用于纯化双醋瑞因，也去除特定的基因毒性化合物(芦荟大黄素和单、二-和三乙酰基衍生物，特别是三乙酰基芦荟大黄素，以及大黄素和单、二-和三乙酰基衍生物)。该新纯化方法可用于双醋瑞因本身或其脱乙酰化形式(大黄酸)。该方法涉及使用合适的树脂选择性地分离双醋瑞因与杂质。该方法能够获得非基因毒性双醋瑞因：优选地，基因毒性杂质通过常规分析方法不可测得(这意味着1ppm以下)。所得非基因毒性双醋瑞因因此可用于人类和兽医应用的药物制剂。这些制剂特别适用于口服给药。

发明内容

因此，本发明的一个目的是一种制备非基因毒性双醋瑞因，特别是高纯度非基因毒性双醋瑞因的方法。

本发明的方法适用于双醋瑞因本身或大黄酸。其包括如下连续步骤：

a.将粗双醋瑞因或粗大黄酸转化为其水溶性盐；然后

b.将所述盐溶解于水中；

c.通过将在步骤b.中获得的水溶液流经填充所述疏水性树脂的柱子而将双醋瑞因或大黄酸吸附于疏水性树脂上；

d.在步骤c.之后，通过将合适的有机溶液流过所述柱子而解吸杂质，并回收含有基因毒性杂质和非基因毒性杂质的有机溶液；

e.在步骤d.之后，通过将水醇溶液流过所述柱子而洗脱双醋瑞因或大黄酸，回收含有高纯度的非基因毒性双醋瑞因或大黄酸盐的水醇溶液；

f.将在步骤e.之后回收的水醇溶液酸化；

g.回收并干燥非基因毒性双醋瑞因或大黄酸。

当起始物为大黄酸时，所述方法包括在步骤f.之后并在步骤g.之前，通过乙酰化转化双醋瑞因中的大黄酸的另外的步骤。

术语“非基因毒性双醋瑞因”意指其中总基因毒性杂质含量为1ppm以下的双醋瑞因。此外，其他杂质在极低水平，特别地

-对于大黄酸、单乙酰基大黄酸I、单乙酰基大黄酸II，1％w/w以下；

-对于1，8-丹蒽醌，1ppm以下，特别是0.1ppm以下；

-对于重金属(包括铬)，10ppm以下；

-对于溶剂，500ppm以下。

在步骤a中所用的粗双醋瑞因可具有不同的提取源。特别地，

本发明的方法应用于：

-依照如下所述的A类方法，获自芦荟的原料，其含有双醋瑞因和杂质(特别是基因毒性杂质，如芦荟大黄素、大黄素和它们的衍生物)；

-依照B类方法，通过如上所述的原料的全脱乙酰化获得的混合物。使用已知方法，如WO 96/30034中所述的那些，进行脱乙酰化以获得大黄酸。

方法可起始于含有显著量的杂质，特别是基因毒性杂质的粗双醋瑞因或大黄酸。

在本发明的一个特定实施方案中，当基因毒性杂质的含量过高(特别是大大超过500或600ppm)，在实施本发明的方法之前进行至少一次预结晶。结晶溶剂可例如为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。

令人惊讶地，本发明人发现亲脂性树脂可用于有效分离双醋瑞因或大黄酸与源自初始植物提取物的提取/改性的杂质(特别是基因毒性杂质)。不局限于任何理论，本发明人认为这可由它们的亲脂性/亲水性程度的差异进行解释，所述差异与结构差异(例如乙酰化酚基和伯醇基的存在与否，或酚基和乙酰化基团的存在与否，和可成盐羧基的存在)相关。

水溶性盐：

A类方法：方法的第一步骤(a.)为使粗双醋瑞因成盐以获得可溶于水中的双醋瑞因盐。双醋瑞因的水溶性盐优选为双醋瑞因的无机盐，更优选为双醋瑞因与碱金属的盐。在一个优选的实施方案中，双醋瑞因盐为双醋瑞因的钾盐或双醋瑞因的钠盐。双醋瑞因的钾盐的溶解度为在中性pH(pH＝7)下大约1克/50毫升水。

B类方法：方法的第一步骤(a.)为使粗大黄酸成盐以获得可溶于水中的大黄酸盐。大黄酸的水溶性盐优选为大黄酸的无机盐，更优选为大黄酸与碱金属的盐。在一个优选的实施方案中，大黄酸盐为大黄酸的钾盐或大黄酸的钠盐。

疏水性树脂：

本发明的方法中所用的树脂为疏水性树脂。

这种疏水性树脂优选为聚合物型，其中所述聚合物骨架不包含亲水性官能团(如OH、COOH、NH₂…)。聚合物骨架有利地为烃骨架(由C和H原子构成)，其可具有疏水性取代基。

疏水性化合物不与水分子形成氢键。疏水性化合物通常为非极性化合物，但一些疏水性化合物可为略微极性的化合物。

作为合适的聚合物的例子，可考虑苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物(PS-DVB)。所述共聚物可由卤素原子(特别是溴原子)在苯上取代。

根据一个优选的实施方案，所述树脂不仅为疏水性的，还是多孔的，甚至是更高度多孔的。

树脂的孔隙率可例如由其孔体积限定，该孔隙率优选为1毫升/克以上，更优选为1毫升/克至2.5毫升/克之间。

多孔疏水性树脂有利地具有重要的比表面积，其优选为550平方米/克以上。在一个特定的实施方案中，比表面积为550平方米/克至1300平方米/克之间，更优选为590平方米/克至1200平方米/克之间。

树脂优选为粒子形式，粒子尺寸可为50微米至700微米。在一个特定的实施方案中，粒子尺寸范围为250微米至700微米之间，有利地为250微米至600微米之间。在另一特定的实施方案中，粒子尺寸为50微米至150微米之间。此外，树脂可具有膨胀趋势。在一个特定的实施方案中，使用保水量为40％至70％，有利地为45％至55％的树脂。

作为合适的市售树脂的非限制性的例子，可提及如下产品：DIAION(HP20、HP20SS、HP21、HP2MG)或SEPABEADS(SP70、SP700、SP825、SP850、SP20SS、SP207、SP207SS)或MCIGEL(CHP20A/Y/P、CHP55A/Y)或其他PS-DVB树脂。

由于纯化方法基于化合物(双醋瑞因或大黄酸和杂质)和树脂之间的相互作用，它们之间足够的接触时间是必要的。在制造商说明书和初步试验的基础上，本领域技术人员能够确定柱子尺寸(长度、直径)、待纯化的产物量和树脂量之间的比例，和进行纯化方法的其他参数(溶剂、流动、压力...)。本领域技术人员也将考虑包含于粗双醋瑞因或大黄酸中的杂质的量。

分离方法：

将粗双醋瑞因(或大黄酸)的水溶性盐溶解于水中(步骤b.)，然后将所得水溶液渗滤经过填充疏水性树脂的柱子(步骤c.)，所述柱子根据制造商描述的指示和初始实验结果而制得。

在下文中，填充疏水性树脂的柱子也称为“树脂床”。树脂也可通过使用术语“吸附剂”而指定。

在一个优选的实施方案中，纯化方法起始于使双醋瑞因(或大黄酸)钠盐水溶液以通过初始研究选择的合适速度渗滤经过树脂床。水溶液渗滤经过树脂床导致分子(双醋瑞因-或大黄酸-和杂质)和吸附剂之间的不同的相互作用；双醋瑞因(或大黄酸)和杂质与吸附剂的相互作用力不同。该第一步骤称为“吸附步骤”。

在吸附步骤过程中，双醋瑞因(或大黄酸)和杂质被吸附至树脂上。来自柱子的水溶液不再含有显著量的双醋瑞因(或大黄酸)和杂质。

在吸附步骤之后，用合适的有机溶剂，特别是极性有机溶剂(如丙酮或乙腈)洗涤树脂床。该第二步骤称为“洗涤步骤”(步骤d.)。该洗涤步骤能够解吸杂质，结果是来自柱子的有机溶液含有所有杂质，但不含显著量的双醋瑞因(或大黄酸)。在洗涤步骤之后，仍然吸附于树脂上的仅有的化合物为双醋瑞因或大黄酸。

接下来的步骤称为“洗脱步骤”(步骤e.)：使洗脱溶剂(也称为洗脱液)渗滤经过柱子一次或多次(至少两次)。该洗脱步骤能够从柱子回收双醋瑞因或大黄酸。

在一个优选的实施方案中，洗脱液为水和醇的混合物，所述醇优选为C₁-C₄醇，更优选为乙醇或甲醇。醇/水比优选为10％/90％至60％/40％(百分比以相比于水和醇的总重量的重量表示)。在本发明的一个优选的实施方案中，使用水/醇梯度，起始于较低的醇的百分比，用水醇溶液进行至少两次洗脱步骤。在本发明的一个更优选的实施方案中，第一次洗脱通过约20/80比例的乙醇或甲醇/水混合物进行，最后的洗脱通过约60/40比例的乙醇或甲醇/水混合物进行。

通过对所选树脂的初始实验，本领域技术人员易于确定取决于树脂性质和洗脱液性质的洗脱步骤的次数。

回收含有双醋瑞因或大黄酸盐的洗脱液的第一级分，若适当，也回收含有另外的双醋瑞因或大黄酸的接下来的级分。在洗脱级分中的双醋瑞因(或大黄酸)的检测和定量可通过使用参比标准和相关保留时间的HPLC进行确定。

当来自芦荟的双醋瑞因或大黄酸通过该方法纯化时，HPLC法可具有例如如下主要特性：

柱子：Supelcosil LC-ABZ150x4.6毫米，5微米(Supelco)

流速：1.5毫升/分钟

检测器：254纳米

柱温：40℃

进样体积：20微升

运行时间：25分钟

LOD：对于双醋瑞因0.45ppm(w/w)

LOQ：对于双醋瑞因1.35ppm(w/w)

更精确的数据可由与质谱检测器联用的HPLC获得。

然后通过公知的方法将含有双醋瑞因(或大黄酸)盐的回收级分酸化以获得作为游离羧酸的双醋瑞因(或大黄酸)(步骤f.)。通过所述方法将大黄酸转化为双醋瑞因。之后，通过常规方法回收并干燥高纯度的非基因毒性双醋瑞因(步骤g.)。

游离羧酸形式的双醋瑞因可通过如下方式回收：用合适的有机或无机酸(优选稀释的强酸，如H₂SO₄ 1M)酸化，随后沉淀双醋瑞因，在真空下过滤，接着用水洗涤。在大黄酸的情况中，在用合适的有机或无机酸(优选稀释的强酸，如H₂SO₄ 1M)酸化之后，过滤沉淀，在完全干燥之后，将沉淀溶解于无水吡啶和醋酸酐中(如公知方法所描述)。一旦反应完成，将水和冰加入至混合物导致高纯度的非基因毒性双醋瑞因的沉淀和存在的盐的溶解。通过过滤，优选在真空下或离心，接着用水洗涤而回收最终产物。

最终产物的纯度通过依照例如如上所述的色谱条件的HPLC进行检测。

基因毒性杂质含量有利地在该方法的检测阈值以下，这意味着含量为1ppm以下。

非基因毒性杂质含量有利地为

-对于1，8-丹蒽醌，1ppm以下，特别是0.1ppm以下；

-对于重金属(包括铬)，10ppm以下；

-对于溶剂，500ppm以下。

特别地，本发明的高纯度的非基因毒性双醋瑞因的如下杂质的规格为：

对于游离羧酸形式的粗双醋瑞因或粗大黄酸(其含有甚至超过500-600ppm的基因毒性杂质)含量，方法A或B的总产率平均为大约75-90％。

本发明也涉及可通过本发明的方法获得的非基因毒性双醋瑞因。在所述非基因毒性双醋瑞因中，基因毒性杂质的总含量为1ppm以下。

本发明也涵盖包含作为活性成分的所述非基因毒性双醋瑞因以及药学可接受的赋形剂(特别是非基因毒性赋形剂)的药物制剂。所述制剂优选为适于口服给药的形式。

本发明特别涉及包含作为活性成分的本发明的非基因毒性双醋瑞因以及非基因毒性赋形剂的胶囊。所述赋形剂有利地为乳糖和硬脂酸镁。所述胶囊有利地通过用均质化的粉末混合物(其通过将粉末形式的非基因毒性双醋瑞因与乳糖和硬脂酸镁混合而形成)填充硬胶质胶囊而制得。人们可例如使用Press-Fit^TM技术(用两个柔性囊形片覆盖片剂)。

本发明的高纯度非基因毒性双醋瑞因可用作用于人类和动物的药物。所述药物可用于治疗涉及软骨退化的病理状态，例如用于治疗关节炎和骨关节炎。

具体实施方式

不以任何方式限制本发明的范围的如下实施例说明了方法的优选实施方案。

实施例1(SEPABEADS SP207和HP20树脂的使用)

粗双醋瑞因的钾盐的制备

将含有约500ppm基因毒性杂质的50g粗双醋瑞因悬浮于750毫升丙酮和50毫升水中，在磁力搅拌下，在3小时的时间内加入稀释于100毫升丙酮中的25毫升三乙胺，保持pH不超过7，直至完全溶解。在18℃下用在260毫升丙酮中的32克乙基己酸钾处理获得的最终溶液。在2小时的时间内加入成盐试剂。沉淀形成，在过滤之后，用500毫升丙酮洗涤沉淀，并在40℃的真空下干燥一个晚上。

获得50克双醋瑞因的钾盐。

洗脱：

将15克该产物溶解于750毫升水中。在真空下过滤之后，使该溶液渗滤经过装有1.1升SEPABEADSSP207或DIAION HP20的4.5厘米-直径，120厘米-高的柱子(流速20毫升/分钟)。

SEPABEADSSP207和DIAION HP20的典型特性在如下表1中给出：

表1.SEPABEADSSP207和DIAION HP20的特性

之后，用一个床体积的丙酮洗涤柱子(流速18-20毫升/分钟)。

进行使用乙醇/水混合物的四个洗脱步骤以回收双醋瑞因钾盐：第一洗脱通过使用乙醇/水混合物20％/80％(100毫升/400毫升)进行，最后三次洗脱通过使用乙醇/水混合物60％/40％(300毫升/200毫升)进行(每个洗脱步骤流速为约15-20毫升/分钟)。

然后使用10％硫酸(H₂SO₄)将含有产物的经收集的级分调至pH2.5-3。将悬浮体冷却至20°-25℃并搅拌30分钟的时间；通过在真空下过滤回收沉淀，用150毫升热水(45-50℃)和150毫升丙酮洗涤，然后在真空下干燥。

使用两个所述树脂获得大约11.5克双醋瑞因，通过HPLC检测其显示1ppm以下的基因毒性杂质含量。

实施例2(DIAION HP2MG树脂的使用)

粗双醋瑞因的钾盐的制备

将含有约500ppm基因毒性杂质的50g双醋瑞因悬浮于750毫升丙酮和50毫升水中，在磁力搅拌下，在3小时的时间内加入稀释于100毫升丙酮中的25毫升三乙胺，保持pH不超过7，直至完全溶解。在2小时的时间内用在260毫升丙酮中的32克乙基己酸钾处理所得溶液。过滤所得沉淀，用500毫升丙酮洗涤并在40℃的真空下干燥一个晚上。

获得50克双醋瑞因钾盐。

洗脱：

将25克双醋瑞因钾盐溶解于1250毫升水中。在真空下过滤之后，使该溶液渗滤经过装有5.1升DIAION HP2MG的10.0厘米-直径，110厘米-高的柱子(流速20毫升/分钟)。

DIAION HP2MG的典型特性在如下表2中给出：

表2.DIAION HP2MG的特性

用一个床体积的丙酮洗涤柱子(流速18-20毫升/分钟)，接着4个洗脱步骤：使用乙醇/水混合物20％/80％(100毫升/400毫升)的第一洗脱步骤，使用乙醇/水60％/40％(300毫升/200毫升)的最后三个洗脱步骤(每个洗脱步骤流量为约15-20毫升/分钟)。

然后使用硫酸将含有产物的经收集的级分调至pH 2.5-3.0。悬浮体冷却至20°-25℃，搅拌30分钟的时间。在真空下过滤沉淀，用300毫升热水(45°-50℃)和150毫升丙酮洗涤，然后在真空下干燥。

获得19.25克双醋瑞因，其显示1ppm以下的基因毒性杂质含量。

实施例3

将含有约300ppm基因毒性杂质衍生物的5克粗双醋瑞因溶解于40毫升甲醇中，在磁力搅拌下加入40毫升水和5克KOH。在冷凝器的存在下进行加热至60-65℃ 30分钟；在此阶段之后，加入35毫升6N HCL；进行用约35毫升水的稀释，溶液煮沸约30分钟。在冷却之后，在真空下过滤悬浮体，残余物用水洗涤并在真空下干燥至恒重。

由此获得4.5克大黄酸。

按照实施例1中对于双醋瑞因所描述将由此获得的2克大黄酸转化为相应的钾盐。

将2克大黄酸的钾盐溶解于200毫升水中(溶液的最终pH为6.2)。在真空下过滤之后，使该溶液渗滤经过装有180克SEPABEADSSP207的7.5厘米-直径，10厘米-高的柱子(流速20毫升/分钟)。

用相当于柱体积的体积的丙酮洗涤(流速18-20毫升/分钟)，然后进行使用水/乙醇混合物的洗脱直至完全洗脱大黄酸。进行4个洗脱步骤：通过使用乙醇/水混合物20％/80％进行两次第一洗脱，通过使用乙醇/水混合物60％/40％进行最后两次洗脱(每个洗脱步骤流速为约15-20毫升/分钟)。

然后使用10％硫酸(H₂SO₄)将含有大黄酸的级分调至pH 4.5-5。悬浮体冷却至5-10℃，通过在真空下过滤回收沉淀，用冷水洗涤并在真空下干燥。

在干燥之后，使用1∶1比例的吡啶和乙酸酐将沉淀乙酰化(或者可使用其他常规乙酰化试剂)。

在干燥之后，获得1.8克双醋瑞因，其显示1ppm以下的基因毒性杂质含量。

分析测定

双醋瑞因、单乙酰基大黄酸I、单乙酰基大黄酸II和大黄酸的HPLC分析。

柱子：Supercosil LC-ABZ150x4.6毫米，5微米(Supelco)

流速：1.5毫升/分钟

检测器：254纳米

柱温：40℃

进样体积：20微升

时间：25分钟

已验证方法的线性、特异性、精确性、样品稳定性、定量和检测限和准确性。

本发明的高纯度的非基因毒性双醋瑞因的如下杂质的规格为：

大黄酸不超过0.20％(我们的结果为0.0％至0.05％)

单乙酰基大黄酸I 不超过0.50％(我们的结果为0.07％至0.22％)

单乙酰基大黄酸II 不超过0.50％(我们的结果为0.11％至0.21％)

每一个任何未知物不超过0.10％(我们的结果：无)

相应的保留时间(RT)为：

双醋瑞因 4.4分钟

单乙酰基大黄酸II 5.8分钟

单乙酰基大黄酸I 7.0分钟

大黄酸 10.5分钟

芦荟大黄素(水解之后的芦荟大黄素和单-、二-和三乙酰基芦荟大黄素之和)的HPLC分析。

柱子：Supercosil LC-ABZ150x4.6毫米，5微米(Supelco)

流速：1.5毫升/分钟

检测器：254纳米

柱温：40℃

进样体积：20微升

运行时间：20分钟

芦荟大黄素不超过1ppm(我们的结果为0至1ppm)

(芦荟大黄素和单-、二-和三乙酰基芦荟大黄素之和)

芦荟大黄素的相应的保留时间(RT)为：

芦荟大黄素 12.3分钟

双醋瑞因、单乙酰基大黄酸I、单乙酰基大黄酸II、芦荟大黄素、三乙酰基芦荟大黄素、大黄酸、三乙酰基大黄素、大黄素、1，8-单蒽醌的HPLC/C-MS分析。

柱子：J.Sphere H80 ODS 4微米，250x4.6毫米(YMC)(或等同物)

流速：0.8毫升/分钟

检测器：254纳米

进样体积：20微升

运行时间：60分钟

相应的保留时间(RT)为：

^*这些杂质的含量低于HPLC-UV法的检测限。它们通过更灵敏的方法进行分析：使用荧光检测的HPLC和LC-MS。

重金属和铬

通过目前的USP或EP确定重金属。

通过原子吸收确定铬。

本发明的高纯度的非基因毒性双醋瑞因的规格为如下：

重金属：不超过10ppm(我们的结果为5至8ppm)

铬含量：不超过5ppm(我们的结果为2至4ppm)

残余溶剂色谱：

柱子：DB-62460m，0.32毫米ID，1.8微米

检测器：FID(火焰电离)

载气：氦气色谱级

柱流速：2.5毫升/分钟

检测器温度：250°

进样器温度：140°

柱温：

速率℃/分钟	温度℃	时间分钟
			0	40	10
20	250	5

进样体积：1000微升

分流比：5

运行时间：26分钟

顶部空间条件

输送管路：120℃

输送管路：115℃

孵化时间：30分钟

本发明的高纯度的非基因毒性双醋瑞因的规格为如下：

Claims

1.一种由粗双醋瑞因制备非基因毒性双醋瑞因的方法，所述非基因毒性双醋瑞因是指总基因毒性杂质含量为1ppm以下的双醋瑞因，其中所述基因毒性杂质为在任何暴露水平下具有损伤DNA的潜力的化合物，所述损伤导致/促成了肿瘤发展，该方法包括如下连续步骤：

a.将粗双醋瑞因转化为其水溶性盐；然后

b.将所述盐溶解于水中；

c.通过将在步骤b.之后获得的水溶液渗滤经过填充疏水性树脂的柱子而将双醋瑞因吸附至疏水性树脂上；

d.在步骤c.之后，使用有机溶液解吸杂质，回收含有杂质的有机级分；

e.在步骤d.之后，使用水醇溶液解吸双醋瑞因，回收含有双醋瑞因的水醇级分；

f.将在步骤e.之后回收的经收集的水醇级分酸化；

g.回收并干燥非基因毒性双醋瑞因。

2.一种由粗大黄酸制备非基因毒性双醋瑞因的方法，所述非基因毒性双醋瑞因是指总基因毒性杂质含量为1ppm以下的双醋瑞因，其中所述基因毒性杂质为在任何暴露水平下具有损伤DNA的潜力的化合物，所述损伤导致/促成了肿瘤发展，该方法包括如下连续步骤：

a.将粗大黄酸转化为其水溶性盐；然后

b.将所述盐溶解于水中；

c.通过将在步骤b.之后获得的水溶液渗滤经过填充疏水性树脂的柱子而将大黄酸吸附至疏水性树脂上；

e.在步骤d.之后，使用水醇溶液解吸大黄酸，回收含有大黄酸的水醇级分；

f.将在步骤e.之后回收的经收集的水醇级分酸化；

g.通过乙酰化将大黄酸转化为双醋瑞因；

h.回收并干燥非基因毒性双醋瑞因。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a.中，所述水溶性盐为无机盐。

4.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤a.中，所述水溶性盐为碱金属盐。

5.根据权利要求4所述的方法，其中在步骤a.中，所述水溶性盐为钾盐或钠盐。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂为苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，该共聚物可由卤素原子在苯上取代。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂为多孔的。

8.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂是多孔的，孔体积为1毫升/克以上。

9.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂是多孔的，孔体积为1毫升/克至2.5毫升/克之间。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂具有550平方米/克以上的比表面积。

11.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂具有550平方米/克至1300平方米/克之间的比表面积。

12.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂具有590平方米/克至1200平方米/克之间的比表面积。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂为粒子形式，且粒子尺寸范围为50微米至700微米。

14.根据权利要求13所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂为粒子形式，且粒子尺寸范围为250微米至700微米之间。

15.根据权利要求13所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂为粒子形式，且粒子尺寸范围为250微米至600微米之间。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂具有40%至70%的保水量。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤c.中，所述疏水性树脂具有45%至55%的保水量。

18.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤e.重复至少两次，并收集每个水醇级分。

19.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用水/乙醇或水/甲醇混合物作为洗脱溶剂而进行步骤e.。

20.根据权利要求19所述的方法，其中在步骤e.中，醇/水质量比为10%/90%至60%/40%（w/w）。

21.可通过如权利要求1至20任意一项所述的方法获得的非基因毒性双醋瑞因，其中基因毒性杂质的总含量为1ppm以下，所述基因毒性杂质指在任何暴露水平下具有损伤DNA的潜力的化合物，所述损伤导致/促成了肿瘤发展。

22.包含作为活性成分地如权利要求21所述的非基因毒性双醋瑞因以及非基因毒性赋形剂的胶囊。

23.用作用于人类和动物的药物的包含如权利要求21所述的非基因毒性双醋瑞因和药学可接受赋形剂的药物制剂。

24.用作用于人类和动物的药物的包含如权利要求22所述的胶囊的药物制剂。