CN102224141A

CN102224141A - N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1,4-二氢喹啉-3-甲酰胺的固体形式

Info

Publication number: CN102224141A
Application number: CN2009801469269A
Authority: CN
Inventors: B·张; M·科拉维克; M·布特费尔德; P·D·J·格鲁滕休斯; F·梵高尔
Original assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-10-23
Filing date: 2009-10-23
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2029-10-23
Also published as: US20140113933A9; DK2358680T3; PL2358680T3; US20130231368A1; CA2741178A1; WO2010048573A1; KR20110074916A; RU2011120327A; RU2518479C2; JP5645835B2; AU2009308241B2; MX2011004374A; JP2012506868A; US8436014B2; PT2358680E; NZ592504A; ZA201102732B; BRPI0920598A2; IL212308A0; CN102224141B

Abstract

本发明涉及N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺的固态形式(例如晶型)、包含其的药物组合物及使用其的方法。

Description

N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1,4-二氢喹啉-3-甲酰胺的固体形式

相关申请

本申请要求2008年10月23日提交的美国临时申请顺序号US61/107,813的优先权利益，该申请的标题为“N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺的固体形式”，将该文献的全部内容引入本文参考。

本发明的技术领域

本发明涉及N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺的固态形式、例如晶型，其为囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(“CFTR”)调节剂。本发明还涉及包括N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺的晶型的药物组合物及使用其的方法。

发明背景

ATP盒转运蛋白(cassette transporter)是一族膜转运蛋白，其调节范围广泛的药理学试剂、可能的毒性药物和外源性化学物质以及阴离子的转运。它们是同源膜蛋白，其结合和使用细胞的三磷酸腺苷(ATP)来实现它们的特异性活性。人们发现，这些转运蛋白中的一些是多药抗药性蛋白质类(例如MDR1-P糖蛋白，或多药抗药性蛋白MRP1)，保护恶性癌细胞免于化疗剂的影响。迄今为止，已经鉴定出了48种这类转运蛋白，基于它们的序列同一性和功能分为7族。

通常与疾病有关的ATP盒转运蛋白家族的一个成员是cAMP/ATP-介导的阴离子通道，CFTR。CFTR在多种细胞类型(包括吸收和分泌上皮细胞)中表达，其中它调节跨膜的阴离子流通，并调节其他离子通道和蛋白质的活性。在上皮细胞中，CFTR的正常功能对于维持包括呼吸和消化组织在内的整个身体的电解质转运是非常关键的。CFTR是由约1480个氨基酸构成的，这些氨基酸编码由跨膜结构域的串联重复构成的蛋白质，每个跨膜结构域包含6个跨膜螺旋和1个核苷酸结合结构域。2个跨膜结构域通过一个具有多个磷酸化位点的大的、极性的、调节性(R)-结构域相连，所述磷酸化位点调节通道活性和细胞运输。

已经鉴定出了编码CFTR的基因并测定了其序列(参见Gregory，R.J.等人(1990)Nature 347：382-386；Rich，D.P.等人(1990)Nature 347：358-362)，Riordan，J.R.等人(1989)Science 245：1066-1073)。这个基因的缺陷引起CFTR突变，导致囊性纤维化(“CF”)，是人体最常见致命的遗传性疾病。在美国，囊性纤维化影响约2,500分之一的婴儿。在一般的美国人口中，高达1千万的人携带有单个拷贝这样的缺陷基因，但没有明显的不良效果。与此不同的是，具有2拷贝与CF有关的基因的个体会发生CF的致虚弱和致命作用，包括慢性肺病。

在患囊性纤维化的患者中，在呼吸上皮中内源性表达的CFTR突变导致顶膜的阴离子分泌减少，使离子和液体转运失衡。所导致的阴离子转运的减少使得CF患者的肺粘液蓄积增加并伴随最终导致死亡的微生物感染。除了呼吸性疾病，CF患者典型地具有胃肠方面的问题和胰功能不全，如果不治疗的话，会导致死亡。此外，大部分患有囊性纤维化的男性都不能生育，而患囊性纤维化的女性则生育力降低。与2拷贝和CF有关的基因所带来的严重后果不同的是，携带有单个拷贝与CF有关的基因的个体显示出对霍乱和腹泻导致的脱水的抵抗力增强——可能解释了CF基因在这个人群中的相对高频率出现。

CF染色体的CFTR基因的序列分析显示了很多导致疾病的突变(Cutting，G.R.等人(1990)Nature 346：366-369；Dean，M.等人(1990)Cell 61：863：870；和Kerem，B-S.等人(1989)Science 245：1073-1080；Kerem，B-S等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8447-8451)。迄今为止，已经鉴定出了1000种以上的引起疾病的CF基因突变(http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/)。最常见的突变是在CFTR氨基酸序列的508位上苯丙氨酸的缺失，一般称作ΔF508-CFTR。这种突变在约70％的囊性纤维化病例中都会发生，与严重的疾病有关。

ΔF508-CFTR中残基508的缺失妨碍了初生蛋白正确折叠。这导致该突变蛋白不能退出ER，和抵达质膜。结果，膜中存在的通道数量远小于表达野生型CFTR的细胞中所观察到的数量。除了运输受损，该突变导致通道门控缺陷。这样加起来，膜中通道数量减少和门控缺陷导致通过上皮的阴离子转运减少，导致离子和液体转运出现缺陷(Quinton，P.M.(1990)，FASEB J.4：2709-2727)。但是，研究已经显示出，尽管比野生型CFTR少，膜中数量减少的ΔF508-CFTR是有功能的。(Dolmans等人(1991)，Nature Lond.354：526-528；Denning等人，出处同前；Pasyk和Foskett(1995)，J.Cell.Biochem.270：12347-50)。除了ΔF508-CFTR、R117H-CFTR和G551D-CFTR以外，导致运输、合成和/或通道门控缺陷的其他的引起疾病的CFTR突变可以被上调或下调，以改变阴离子分泌并改变疾病进程和/或严重性。

尽管除了阴离子外CFTR还转运多种分子，但是显然，这种作用(转运阴离子，氯离子(chloride)和碳酸氢盐(bicarbonate))代表了跨上皮细胞转运离子和水的重要机制中的一个要素。其他要素包括上皮Na+通道、ENaC、Na+/2Cl-/K+共转运蛋白、Na⁺-K⁺-ATP酶泵和基底外侧膜K⁺通道，它们负责将氯离子吸收到细胞中。

这些要素一起运作，以通过它们在细胞中的选择性表达和定位实现跨上皮细胞的定向转运。通过存在于顶膜上的ENaC和CFTR与在细胞的基底外侧表面上表达的Na⁺-K⁺-ATP酶泵和Cl通道之间的协调性活性，发生了氯离子的吸收。氯离子从腔侧的继发性主动转运导致细胞内的氯离子蓄积，接着可被动地通过Cl^-离子通道离开细胞，导致矢量转运。基底外侧表面上的Na⁺/2Cl^-/K⁺共转运蛋白、Na⁺-K⁺-ATP酶泵和基底外侧膜K⁺通道和腔侧上的CFTR的排列，通过腔侧上的CFTR来协调氯离子的分泌。由于水可能从不自己主动转运，因此它依靠钠和氯离子的总体流量产生的微小的跨上皮渗透梯度流过上皮。

推定因CFTR中的突变导致的碳酸氢盐转运缺陷导致一些分泌功能缺陷。例如，参见“Cystic fibrosis：impaired bicarbonate secretion andmucoviscidosis，”Paul M.Quinton，Lancet 2008；372：415-417。

与中度CFTR功能障碍相关的CFTR中的突变还在患有与CF共有一些疾病表现、但不满足CF诊断标准的疾病的患者中明显。它们包括先天性双侧输精管缺失、特发性慢性胰腺炎、慢性支气管炎和慢性鼻鼻窦炎(rhinosinusitis)。认为突变体CFTR与修饰基因或环境因素一起是危险因素的其他疾病包括原发性硬化性胆管炎、变应性支气管肺曲菌病和哮喘。

还显示吸烟、缺氧和诱导含氧量低信号的环境因素损害CFTR功能并且可以引起一些呼吸道疾病的形式，例如慢性支气管炎。可能因缺陷性CFTR功能、但不满足CF诊断标准的疾病被表征为CFTR-相关疾病。

除了囊性纤维化，调节CFTR活性还有益于并非是CFTR突变直接导致的其他疾病，例如CFTR介导的分泌性疾病和其他蛋白质折叠性疾病。CFTR调节氯离子和碳酸氢盐流通过许多细胞上皮，以控制流体运动、蛋白质增溶、粘液粘度和酶活性。CFTR中的缺陷可以导致气道或许多器官包括肝和胰腺中的导管阻塞。增强剂是增强细胞膜中存在的CFTR门控活性的化合物。涉及粘液浓稠、流体调节受损、粘液清除受损或导致炎症和组织破坏的阻塞导管的任何疾病可以是增强剂的候选者。

这些疾病包括但不限于慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、吸烟诱发的COPD、慢性支气管炎、鼻鼻窦炎、便秘、干眼病、斯耶格伦综合征、胃食管返流疾病、胆石、直肠脱垂和炎性肠病。COPD的特征在于渐进性和非完全可逆性的气流受限。气流受限是由于粘液分泌过多、肺气肿和细支气管炎。突变体或野生型CFTR的活化剂为COPD中常见的粘液分泌过多和粘膜纤毛清除受损提供了潜在的治疗。具体地，增加跨CFTR的阴离子的分泌会促进流体转运到气道表面液体中，以水化粘液且优化纤周流体粘度。这会导致增强粘膜纤毛清除并减轻与COPD有关的症状。此外，通过预防导致的进行性感染和炎症(因气道清除改善)，CFTR调节剂可以预防或减缓表征肺气肿的气道实质毁坏和减少或逆转粘液分泌细胞数量和大小增加，其是气道疾病中的粘液分泌过多的基础。干眼病的特征在于泪水产生减少以及泪液膜液体、蛋白质和粘蛋白性质异常。干眼有很多种原因，其中一些包括年龄、Lasik眼科手术、关节炎、药物、化学/热灼伤、变态反应和疾病，例如囊性纤维化和斯耶格伦综合征。通过CFTR的阴离子分泌增加可以增加由眼周围的角膜内皮细胞和分泌腺中的流体转运，以增强角膜水合。这有助于减轻与干眼病有关的症状。斯耶格伦综合征是一种自身免疫性疾病，其中免疫系统攻击全身的产生液体的腺体，包括眼、口、皮肤、呼吸组织、肝、阴道和消化道。症状包括眼、口和阴道干燥，以及肺病。该病也与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化病和多肌炎/皮肌炎有关。蛋白质运输缺陷据认为会导致该疾病，由此限制了治疗选择。CFTR活性的调节剂可以使受该疾病影响的各种器官水合并有助于缓解相关的症状。具有囊性纤维化的个体存在肠梗阻反复发作和直肠脱垂、胆石、胃食管返流疾病、GI恶性肿瘤和炎性肠病的高发病率，显示CFTR功能可能在预防这类疾病中起重要作用。

如上所述，据认为，ΔF508-CFTR中残基508的缺失会妨碍初生蛋白正确折叠，导致该突变蛋白不能退出ER，并被运输至质膜。结果，质膜中存在的成熟蛋白量不足，上皮组织内的氯离子转运显著减少。事实上，经由ER机制加工CFTR的ER缺陷的这种细胞现象已经显示出，其不仅是CF疾病的潜在基础，也是范围广泛的其他独立和遗传疾病的潜在基础。导致ER机制障碍的两种途径是，通过丧失与蛋白质的ER排出的偶联(coupling)而导致降解，或者是通过这些缺陷/错误折叠蛋白质的ER蓄积[Aridor M等人，Nature Med.，5(7)，pp745-751(1999)；Shastry，B.S.等人，Neurochem.International，43，pp 1-7(2003)；Rutishauser，J.等人，Swiss Med Wkly，132，pp 211-222(2002)；Morello，JP等人，TIPS，21，pp.466-469(2000)；Bross P.等人，HumanMut.，14，pp.186-198(1999)]。与第一类ER机能障碍有关的疾病是囊性纤维化(由如上所述的错误折叠的ΔF508-CFTR导致)、遗传性肺气肿(由a1-抗胰蛋白酶；非Piz变体导致)、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷(coagulation-fibrinolysis deficiencies)，例如蛋白质C缺乏症、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷、例如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β脂蛋白血症、溶酶体贮积病、例如I-细胞疾病/假性胡尔勒病(pseudo-Hurler)、粘多糖病(由溶酶体加工酶导致)，桑霍夫病/泰-萨病(Sandhof/Tay-Sachs)(由β-氨基己糖苷酶导致)，克-纳综合征(Crigler-Najjar)II型(由UDP-葡糖醛酸-唾液酸-转移酶导致)、多内分泌腺病/高胰岛素血症、糖尿病(由胰岛素受体导致)、拉伦侏儒症(Laron dwarfism)(由生长激素受体导致)、髓过氧化物酶缺乏症、原发性甲状旁腺功能减退(由前甲状旁腺激素原导致)，黑素瘤(由酪氨酸酶导致)。与后一类ER机能障碍有关的疾病是GlycanosisCDG 1型(缺糖基团糖蛋白综合征)、遗传性肺气肿(由α1-抗胰蛋白酶(PiZ变体)导致)、先天性甲状腺功能亢进症、成骨不全(由I、II、IV型前胶原导致)、遗传性低纤维蛋白原血症(由纤维蛋白原导致)、ACT不足(由α1-抗胰凝乳蛋白酶导致)、尿崩症(DI)、神经生长性(neurophyseal)DI(由加压素激素/V2-受体导致)、肾性DI(由水通道蛋白-II导致)、夏-马-图三氏综合征(Charcot-Marie Tooth syndrome)(由周围髓磷脂蛋白22导致)、佩-梅病、神经变性疾病、例如阿尔茨海默病(由βAPP和衰老蛋白导致)、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上麻痹、匹克病、若干聚谷氨酰胺(polyglutamine)神经性障碍，例如亨廷顿病、I型脊髓小脑性共济失调(spinocerebullar ataxia)、脊髓延髓肌肉萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩，和强直性肌营养不良，以及海绵样脑病，例如遗传性克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)(由朊病毒蛋白加工缺陷导致)、法布里病(由溶酶体α-半乳糖苷酶A导致)、Straussler-Scheinker综合征(由Prp加工缺陷导致)、不育、胰腺炎、胰腺功能不全、骨质疏松症、骨质减少、Gorham综合征、氯化物通道病变(chloride channelopathies)、先天性肌强直(Thomson和Becker型)、巴特综合征III型、Dent病、震惊综合征(hyperekplexia)、癫痫症、震惊综合征、溶酶体贮存病、Angelman综合征、原发性纤毛运动障碍(PCD)、具有左右转位的PCD(也称作卡塔格内(Kartagener)综合征)、没有左右转位和睫状发育不良(ciliary aplasia)的PCD和肝病。

与CFTR中突变有关的其他疾病包括因输精管先天性双侧缺失(CBAVD)导致的男性不育、轻度肺疾病、特发性胰腺炎和变应性支气管肺曲菌病(ABPA)。参见“CFTR-opathies：disease phenotypes associatedwith cystic fibrosis transmembrane regulator gene mutations，”PeaderG.Noone和Michael R.Knowles，Respir.Res.2001，2：328-332(引入本文参考)。

除了上调CFTR活性以外，CFTR调节剂导致的阴离子分泌减少对于治疗分泌性腹泻可能是有益的，其中由于促分泌性活化的氯离子转运，上皮细胞的水转运显著增加。该机制包括提高cAMP和刺激CFTR。

尽管腹泻有很多原因，但由氯离子转运过量引起的腹泻性疾病的主要后果是共同的，包括脱水、酸中毒、发育受损和死亡。急性和慢性腹泻代表了世界上很多地区的主要医学问题。腹泻是营养不良的重要因素，并且是导致5岁以下儿童死亡的主要原因(每年死亡5,000,000人)。

分泌性腹泻也是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和慢性炎性肠病(IBD)患者的一种危险的症状。每年有1600万从发达国家到发展中国家的旅行者发生腹泻，腹泻病例的严重性和数量随着所旅行的国家和地区而变化。

因此，对人CFTR野生型和突变型的有效和选择性CFTR增强剂存在需求。这些突变型CFTR包括、但不限于ΔF508del、G551D、R117H、2789+5G-＞A。

对CFTR活性调节剂及其组合物也存在需求，它们可以用于调节哺乳动物细胞膜中的CFTR活性。

对使用这种CFTR活性调节剂治疗因CFTR中突变导致的疾病的方法存在需求。

对调节哺乳动物离体细胞膜中CFTR活性的方法存在需求。

此外，对易于用于适合于用作治疗剂的药物组合物的所述化合物的稳定固体形式存在需求。

发明概述

本发明涉及N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺的固体形式(下文的“化合物1”)，其具有如下结构：

化合物1及其药学可接受的组合物适用于治疗多种疾病、障碍或病症或者减轻其严重性，包括但不限于囊性纤维化、胰腺炎、窦炎、遗传性肺气肿、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷、例如C蛋白缺陷、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷、例如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β-脂蛋白血症、溶酶体贮存病、例如I-细胞疾病/假性胡尔勒病、粘多糖病、桑霍夫病/泰-萨病、克-纳综合征II型、多内分泌腺病/高胰岛素血症、糖尿病、拉伦侏儒症、髓过氧化物酶缺陷、原发性甲状旁腺机能减退、黑素瘤、Glycanosis CDG 1型、遗传性肺气肿、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT缺陷、尿崩症(DI)、神经生长性DI、肾性DI、夏-马-图三氏综合征、佩-梅病、神经变性疾病、例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、皮克病、若干聚谷氨酰胺神经病学障碍、例如亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓与延髓肌肉萎缩、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩和肌强直性营养不良、以及海绵状脑病、例如遗传性克-雅病、法布里病、Straussler-Scheinker综合征、COPD、干眼病、胰腺功能不全、骨质疏松症、骨质减少、Gorham综合征、氯化物通道病变、先天性肌强直(Thomson和Becker型)、巴特综合征III型、Dent病、震惊综合征、癫痫症、震惊综合征、溶酶体贮存病、Angelman综合征、原发性纤毛运动障碍(PCD)、具有左右转位的PCD(也称作卡塔格内综合征)、没有左右转位的PCD和睫状发育不良和斯耶格伦病。

在一个方面中，化合物1是基本上晶体的净游离形式的晶型A(Form A)。

本文所述的方法可以用于制备包含晶型A的本发明组合物。用于该方法的成分的用量和特征如本文所述。

附图简述

图1是晶型A的X-射线粉末衍射图案。

图2是基于单X-射线晶体分析的晶型A的构象图。

图3提供了晶型A的FTIR光谱。

发明详述

定义

除非另作陈述，否则本文所用的下列定义应适用。

本文使用的术语“ABC-转运蛋白”是指ABC-转运蛋白或其包含至少一个结合结构域的片段，其中所述蛋白或其片段存在于体内或体外。本文使用的术语“结合结构域”是指可以与调节剂结合的ABC-转运蛋白上的一个结构域。参见，例如Hwang，T.C.等人，J.Gen.Physiol.(1998)：111(3)，477-90。

本文所用的术语“CFTR”意指囊性纤维化跨膜传导调节剂或具有其调节剂活性的突变体，包括但不限于ΔF508 CFTR、R117H CFTR和G551D CFTR(关于CFTR突变例如参见http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/)。

本文所用的术语“调节”意指以可测量的量增加或降低。

本文所用的术语“正常CFTR”或“正常CFTR功能”是指不具有任何因环境因素导致的损伤的类似于野生型的CFTR，所述的环境因素例如吸烟、污染或任何在肺中产生炎症的情况。

本文所用的术语“减少的CFTR”或“降低的CFTR功能”是指少于正常CFTR或低于正常CFTR功能。

本文所用的“晶体”意指化合物或组合物，其中结构单元以固定几何模式或晶格排列，使得晶体固体具有刚性大范围次序。构成晶体结构的结构单元可以是原子、分子或离子。晶体固体显示确定的熔点。

本文所用的术语“基本上晶体”意指以具有刚性大范围次序的固定几何模式或晶格排列的固体物质。例如基本上晶体物质具有大于约85％的结晶度(例如大于约90％的结晶度或大于约95％的结晶度)。还应注意术语“基本上晶体”包括在前述段落中定义的主题词“晶体”。

在一个方面中，本发明的特征在于N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺的形式，其特征为其是晶型A。

在一些实施方案中，晶型A的特征在于使用Cu Kα辐射得到的X-射线粉末衍射中的如下一个或多个峰：约7.7-约8.1度，例如约7.9度；约11.7-约12.1度，例如约11.9度；约14.2-约14.6度，例如约14.4度；和约15.6-约16.0度，例如约15.8度的峰。

在一些实施方案中，晶型A的特征在于使用Cu Kα辐射得到的X-射线粉末衍射中的如下一个或多个峰：约7.8-约8.0度，例如约7.9度；约11.8-约12.0度，例如约11.9度；约14.3-约14.5度，例如约14.4度；和约15.7-约15.9度，例如约15.8度。

在其他实施方案中，晶型A的特征在于使用Cu Kα辐射得到的X-射线粉末衍射中的如下一个或多个峰：约7.7-约8.1度，例如约7.9度；约21.6-约22.0度，例如约21.8度；和约23.6-约24.0度，例如约23.8度。

在其他实施方案中，晶型A的特征在于使用Cu Kα辐射得到的X-射线粉末衍射中的如下一个或多个峰：约7.8-约8.0度，例如约7.9度；约21.7-约21.9度，例如约21.8度；和约23.7-约23.9度，例如约23.8度。

在一些实施方案中，晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的一个或多个如下峰：约7.7-约8.1度(例如约7.9度)的峰；约9.1-约9.5度(例如约9.3度)的峰；约11.7-约12.1度(例如约11.9度)的峰；约14.2-约14.6度(例如约14.4度)的峰；约14.9-约15.3度(例如约15.1度)的峰；约15.6-约16.0度(例如约15.8度)的峰；约16.8-约17.2度(例如约17.0度)的峰；约17.5-约17.9度(例如约17.7度)的峰；约19.1-约19.5度(例如约19.3度)的峰；约19.9-约20.3度(例如约20.1度)的峰；约21.2-约21.6度(例如约21.4度)的峰；约21.6-约22.0度(例如约21.8度)的峰；约23.2-约23.6度(例如约23.4度)的峰；约23.6-约24.0度(例如约23.8度)的峰；约25.4-约25.8度(例如约25.6度)的峰；约26.6-约27.0度(例如约26.8度)的峰；约29.2-约29.6度(例如约29.4度)的峰；约29.5-约29.9度(例如约29.7度)的峰；约29.9-约30.3度(例如约30.1度)的峰；和约31.0-约31.4度(例如约31.2度)的峰。

在一些实施方案中，晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的一个或多个如下峰：约7.8-约8.0度(例如约7.9度)的峰；约9.2-约9.4度(例如约9.3度)的峰；约11.8-约12.0度(例如约11.9度)的峰；约14.3-约14.5度(例如约14.4度)的峰；约15.0-约15.2度(例如约15.1度)的峰；约15.7-约15.9度(例如约15.8度)的峰；约16.9-约17.1度(例如约17.0度)的峰；约17.6-约17.8度(例如约17.7度)的峰；约19.2-约19.4度(例如约19.3度)的峰；约20.0-约20.2度(例如约20.1度)的峰；约21.3-约21.5度(例如约21.4度)的峰；约21.7-约21.9度(例如约21.8度)的峰；约23.3-约23.5度(例如约23.4度)的峰；约23.7-约23.9度(例如约23.8度)的峰；约25.5-约25.7度(例如约25.6度)的峰；约26.7-约26.9度(例如约26.8度)的峰；约29.3-约29.5度(例如约29.4度)的峰；约29.6-约29.8度(例如约29.7度)的峰；约30.0-约30.2度(例如约30.1度)的峰；和约31.1-约31.3度(例如约31.2度)的峰。

在一些实施方案中，晶型A的特征在于如图1中提供的衍射图案。

在一个方面中，本发明的特征在于包含晶型A和药学可接受的佐剂或载体的药物组合物。

在一个方面中，本发明的特征在于治疗人CFTR介导的疾病的方法，包括对所述人给予有效量的晶型A。

在一些实施方案中，该方法包括给予另外的治疗剂。

在一些实施方案中，所述疾病选自囊性纤维化、胰腺炎、窦炎、遗传性肺气肿、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷、例如C蛋白缺陷、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷、例如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β-脂蛋白血症、溶酶体贮存疾病、例如I-细胞疾病/假性胡尔勒病、粘多糖病、桑霍夫病/泰-萨病、克-纳综合征II型、多内分泌腺病/高胰岛素血症、糖尿病、拉伦侏儒症、髓过氧化物酶缺陷、原发性甲状旁腺机能减退、黑素瘤、Glycanosis CDG 1型、遗传性肺气肿、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT缺陷、尿崩症(DI)、神经生长性DI、肾性DI、夏-马-图三氏综合征、佩-梅病、神经变性疾病、例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、皮克病、若干聚谷氨酰胺神经病学障碍、例如亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓与延髓肌肉萎缩、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩和肌强直性营养不良、以及海绵状脑病、例如遗传性克-雅病、法布里病、Straussler-Scheinker综合征、COPD、干眼病、胰腺功能不全、骨质疏松症、骨质减少、Gorham综合征、氯化物通道病变、先天性肌强直(Thomson和Becker型)、巴特综合征III型、Dent病、震惊综合征、癫痫症、震惊综合征、溶酶体贮存病、Angelman综合征、原发性纤毛运动障碍(PCD)、具有左右转位的PCD(也称作卡塔格内综合征)、没有左右转位的PCD和睫状发育不良和斯耶格伦病。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗人囊性纤维化的方法，包括对所述人给予有效量的晶型A。

在一个方面中，本发明的特征在于包含晶型A和药学可接受的载体的药包或试剂盒。

在一个方面中，本发明的特征在于N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺的晶型，其具有三方晶系(trigonal crystal system)、R-3空间群和如下晶胞尺寸：

α＝90°，β＝90°，和γ＝120°。

在一个实施方案中，本发明提供了N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺的晶型，其具有如下晶胞尺寸：

应用、制剂和给药

药学可接受的组合物

在本发明的一个方面中提供了药学可接受的组合物，其中这些组合物包含如本文所述的晶型A且任选包含药学可接受的载体、佐剂或赋形剂。在一些实施方案中，这些组合物任选还包含一种或多种另外的治疗剂。

如上所述，本发明的药学可接受的组合物还包含药学可接受的载体、佐剂或赋形剂，其在本文中使用时，包括任何和所有的溶剂、稀释剂或其他液体载体、助分散剂或助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，其适合所需的特定剂型。Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)描述了在配制药学可接受的组合物中使用的各种载体和已知的制备其的技术。除了例如由于产生任何不希望的生物学效应或以有害的方式干扰该药学可接受的组合物的任何其他组分而与本发明化合物不相容的任何常规的载体介质以外，任何常规的载体介质的使用也涵盖在本发明的范围内。可以用作药学可接受的载体的物质的一些例子包括但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质、例如人血清白蛋白、缓冲物质、例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质、例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、羊毛脂、糖、例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡；油，例如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和豆油；二醇类；例如丙二醇或聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格液；乙醇，和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒性的相容性润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，此外根据配制者的判断，该组合物中也可以存在着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

化合物和药学可接受的组合物的应用

在另一个方面，本发明提供一种治疗与CFTR突变有关的病症、疾病或障碍或减轻其严重性的方法。在一些实施方案中，本发明提供一种治疗与CFTR活性缺陷有关的病症、疾病或障碍的方法，该方法包括给有此需要的受试者，优选哺乳动物施用包含化合物1晶型A的组合物。

在一些实施方案中，本发明提供一种治疗与因编码CFTR的基因突变或环境因素(例如吸烟)导致的CFTR功能降低相关的疾病的方法。这些疾病包括囊性纤维化、慢性支气管炎、复发性支气管炎、急性支气管炎、先天性双侧输精管缺失(CBAVD)导致的男性不育、子宫和阴道先天性缺失(CAUV)导致的女性不育、特发性慢性胰腺炎(ICP)、特发性复发性胰腺炎、特发性急性胰腺炎、慢性鼻鼻窦炎、原发性硬化性胆管炎、变应性支气管肺曲菌病、糖尿病、干眼、便秘、变应性支气管肺曲菌病(ABPA)、骨疾病(例如骨质疏松症)和哮喘。

在一些实施方案中，本发明提供一种治疗与正常CFTR功能相关的疾病的方法。这些疾病包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性支气管炎、复发性支气管炎、急性支气管炎、鼻鼻窦炎、便秘、胰腺炎、包括慢性胰腺炎、复发性胰腺炎和急性胰腺炎、胰腺功能不全、先天性双侧输精管缺失(CBAVD)导致的男性不育、轻度肺疾病、特发性胰腺炎、肝病、遗传性肺气肿、胆石、胃食管返流病、胃肠道恶性肿瘤、炎性肠病、便秘、糖尿病、关节炎、骨质疏松症和骨质减少。

在一些实施方案中，本发明提供一种治疗与正常CFTR功能相关的疾病的方法，包括遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷、例如蛋白质C缺乏症、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷、例如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β脂蛋白血症、溶酶体贮积病、例如I-细胞疾病/假性胡尔勒病、粘多糖病，桑霍夫病/泰-萨病，克-纳综合征II型、多内分泌腺病/高胰岛素血症、糖尿病、拉伦侏儒症、髓过氧化物酶缺乏症、原发性甲状旁腺功能减退、黑素瘤、Glycanosis CDG 1型、先天性甲状腺功能亢进症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT不足、尿崩症(DI)、神经生长性DI、肾性DI、夏-马-图三氏综合征、佩-梅病、神经变性疾病、例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上麻痹、匹克病、若干聚谷氨酰胺神经性障碍、例如亨廷顿病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓延髓肌肉萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩，和强直性肌营养不良，以及海绵样脑病，例如遗传性克雅病(由朊病毒蛋白加工缺陷导致)、法布里病、Straussler-Scheinker综合征、Gorham综合征、氯化物通道病变、先天性肌强直(Thomson和Becker型)、巴特综合征III型、Dent病、震惊综合征、癫痫症、震惊综合征、溶酶体贮存病、Angelman综合征、原发性纤毛运动障碍(PCD)、具有左右转位的PCD(也称作卡塔格内综合征)、没有左右转位的PCD和睫状发育不良、或斯耶格仑病，该方法包括对所述哺乳动物施用有效量的包含本文所述的晶型A的组合物的步骤。

根据一个可替代的优选实施方案，本发明提供一种治疗囊性纤维化的方法，包括给所述哺乳动物施用组合物的步骤，包括对所述哺乳动物施用有效量的包含本文所述的晶型A的组合物的步骤。

根据本发明，晶型A或药学可接受的组合物的“有效量”是有效治疗如上所述一种或多种疾病、障碍或病症或减轻其严重性的用量。

可以使用有效治疗一种或多种如上所述疾病、障碍或病症或减轻其严重性的任意量和任意给药途径给予晶型A或其药学可接受的组合物。

在一些实施方案中，晶型A或其药学可接受的组合物适用于治疗患者的囊性纤维化或减轻患者的囊性纤维化的严重性，该患者的呼吸上皮或非呼吸上皮的顶膜中显示残留的CFTR活性。使用本领域已知的方法，例如标准的电生理学、生化或组织化学技术可以容易地检测上皮细胞表面残留的CFTR活性的存在。这些方法使用体内或离体的电生理技术、汗液或唾液的Cl^-浓度测定或者离体生化或组织化学技术来监测细胞表面密度，以鉴定CFTR活性。使用这些方法，可以容易地在各种不同突变体的杂合或纯合的患者，包括最常见的突变体ΔF508的杂合或纯合的患者中检测残留的CFTR活性。

在另一个实施方案中，本文所述的晶型A或其药学可接受的组合物适用于治疗患者的囊性纤维化或减轻患者的囊性纤维化的严重性，该患者具有用药理学方法或基因疗法诱导或增强的残留CFTR活性。这些方法增加细胞表面上存在的CFTR的量，因此在患者中诱导迄今不存在的CFTR活性或在患者中提高残留CFTR活性的现存水平。

在另一个实施方案中，本文所述的晶型A或其药学可接受的组合物适用于患者的囊性纤维化或减轻患者的囊性纤维化的严重性，该患者具有某些显示残留CFTR活性的基因型，例如，III类突变(调节或门控受损)、IV类突变(传导改变)或V类突变(合成减少)(Lee R.Choo-Kang，Pamela L.，Zeitlin，Type I，II，III，IV，and V cystic fibrosisTansmembrane Conductance Regulator Defects and Opportunities ofTherapy；Current Opinion in Pulmonary Medicine 6：521-529，2000)。显示残留CFTR活性的其他患者基因型包括这些类型之一的纯合或与任何其他类型突变的杂合的患者，所述其他类型的突变包括I类突变、II类突变或无分类的突变。

在一个实施方案中，本文所述的晶型A或其药学可接受的组合物适用于治疗患者的囊性纤维化或减轻患者的囊性纤维化的严重性，该患者具有某些临床表型，例如，典型地与上皮细胞顶膜中的残留CFTR活性的量相关的轻度至中度临床表型。这些表型包括显示胰腺功能不全的患者或者诊断为特发性胰腺炎和输精管的先天性双侧缺失或者轻度肺病的患者。

所需的确切的量对于不同的受试者而言是不同的，这取决于受治疗者的种类、年龄和总体状况、感染的严重度、具体的药物、其给药方式等。本发明的化合物优选配制成易于给药和剂量均匀的剂量单位形式。本文使用的表述“剂量单位形式”是指适于所要治疗的患者的药物的物理上分离的单位。但是，应当理解，本发明的化合物和组合物的每日总使用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何具体的患者或生物体的具体有效剂量水平将取决于多种因素，包括所要治疗的疾病和该疾病的严重性；所使用的具体化合物的活性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和所使用的具体化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所使用的具体化合物联合或同时使用的药物等，以及医学领域公知的其他因素。本文使用的术语“患者”是指动物，优选哺乳动物，最优选人。

本发明的药学可接受的组合物可以通过口服、直肠、胃肠外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉剂、软膏、滴剂或贴剂)、经颊以及作为口腔或鼻喷雾剂等方式施用于人和其他动物，这取决于所要治疗的感染的严重性。在一些实施方案中，本发明的化合物可以以每日约0.01mg/kg-约50mg/kg，优选约0.5mg/kg-约25mg/kg受试者体重的剂量水平经口服或胃肠外施用，每日一次或多次，以获得期望的治疗效果。

用于口服给药的液体剂型包括但不限于，药学可接受的乳剂、微乳、溶液、混悬剂、糖浆和酏剂。除了活性化合物以外，该液体剂型可以包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是，棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯，以及它们的混合物。除了惰性稀释剂，该口服组合物也可以包含佐剂，例如湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。

可以根据已知的技术，使用适当的分散剂或湿润剂和助悬剂配制可注射制剂，例如无菌注射用水或油性混悬液。无菌注射制剂也可以是在无毒性的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、混悬剂或乳剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的赋形剂或溶剂是水、林格液，U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油一般也用作溶剂或助悬介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(例如油酸)可以用于注射制剂中。

注射制剂可以通过例如细菌截留性过滤器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，其中所述无菌固体组合物可以在临用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。

为了延长本发明化合物的效果，经常需要减缓吸收皮下或肌内注射的化合物。这可以通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混悬液来实现。那么，化合物的吸收速率将取决于其溶出速度，溶出速度又可能取决于晶体大小和晶型。可替代地，延迟胃肠外给药的化合物形式的吸收可以通过将该化合物溶解或混悬于油性载体中来实现。通过在生物可降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙醇酸交酯)中形成化合物的微囊基质，制备可注射的储库型剂型(depot form)。根据化合物与聚合物的比例和所使用的具体聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其它生物可降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库型注射剂也可以通过将化合物包埋在与机体组织相容的脂质体或微乳中来制备。

直肠或阴道施用的组合物优选是栓剂，其可以通过将本发明的化合物与适当的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂用蜡混合来制备，其中所述赋形剂或载体在环境温度下是固体，但在体温下是液体，因此在直肠或阴道腔中融化并释放出活性化合物。

口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性的、药学可接受的赋形剂或载体混合，所述赋形剂或载体例如为柠檬酸钠或磷酸二钙、和/或a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂，例如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶解阻滞剂，例如石蜡，f)吸收促进剂，例如季铵类化合物，g)湿润剂，例如十六醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，例如高岭土和膨润土，和i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，及它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，该剂型也可以包含缓冲剂。

相似类型的固体组合物也可以在软和硬的填充性明胶胶囊中用作填充剂，胶囊使用例如乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂。可以用包衣和壳、例如肠溶衣和药物配制领域公知的其它包衣来制备片剂、糖衣片(dragees)、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型。它们任选可以包含遮光剂，也可以是这样一种组合物：它们只在或优选在肠道的某一部分(任选地以延迟方式)释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。相似类型的固体组合物也可以在软和硬的填充性明胶胶囊中用作填充剂，胶囊使用赋形剂、例如乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇等。

活性化合物也可以存在于具有一种或多种上述赋形剂的微囊形式中。可以用包衣和壳例如肠溶衣、控释包衣、和药物配制领域公知的其它包衣来制备片剂、糖衣片、胶囊、丸剂和颗粒剂等固体剂型。在这些固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂，例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。这些剂型也可以例如如一般实践，包含惰性稀释剂以外的其它物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况中，该剂型也可以包含缓冲剂。它们任选可以包含遮光剂，也可以是这样一种组合物：它们只在或优选在肠道的某一部分任选地以延迟方式释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物和蜡。

本发明化合物的局部或经皮给药的剂型包括软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。活性组分在无菌条件下与药学可接受的载体和任何需要的防腐剂或可能需要的缓冲剂混合。眼用制剂、滴耳剂和滴眼剂也涵盖在本发明的范围内。此外，本发明涵盖透皮贴剂的使用，它的附加优点在于向机体可控地递送化合物。这类剂型可以通过将化合物溶解或分散于适当的介质中来制备。也可以使用吸收增强剂来增加化合物通过皮肤的流量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。

也应当认识到，本文所述晶型A或其药学可接受的组合物可以用在联合治疗中，也就是说，本文所述晶型A或其药学可接受的组合物可以在一种或多种另外的所需治疗或医学操作的同时、之前或之后施用。在联合治疗方案中使用的治疗(治疗或操作)的具体组合将考虑所要实现的所需治疗效果与所需的治疗和/或操作的相容性。也应当认识到，所使用的治疗可以对相同的疾病达到期望的效果(例如，本发明的化合物可以与另一种用于治疗相同疾病的药物同时施用)，或者它们可以实现不同的效果(例如，控制任何不良反应)。本文所用的通过正常给药来治疗或预防特定疾病或病症的另外的治疗剂被称作“适合所要治疗的疾病或病症”。

在一个实施方案中，另外的活性剂选自黏液溶解药(mucolyticagent)、支气管扩张剂、抗生素、抗感染剂、抗炎剂、本发明化合物以外的CFTR调节剂或营养剂。

在一个实施方案中，另外的活性剂是抗生素。本文所用的典型抗生素包括妥布霉素、包括妥布霉素吸入粉末(TIP)、阿奇霉素、氨曲南、包括氨曲南的气雾剂形式、阿米卡星、包括其脂质体制剂、环丙沙星、包括其适合于通过吸入给药的制剂、左氧氟沙星、包括其气雾剂制剂和两种抗生素的组合，例如磷霉素和妥布霉素。

在另一个实施方案中，另外的活性剂是黏液溶解药(mucolyte)。本文所用的典型黏液溶解药包括

在另一个实施方案中，另外的活性剂是支气管扩张剂。典型支气管扩张剂包括沙丁胺醇、硫酸奥西那林(metaprotenerol sulfate)、醋酸吡布特罗、沙美特罗或硫酸tetrabuline。

在另一个实施方案中，另外的活性剂有效恢复肺气道表面液体。这种活性剂改善盐在细胞内和外的运动，使得肺气道中的粘液更易于水化且由此更易于被清除。典型的这种活性剂包括高张生理盐水、地纽福索钠([[(3S，5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-3-羟基氧杂环戊烷-2-基]甲氧基-羟基磷酰基][[[(2R，3S，4R，5R)-5-(2，4-二氧代嘧啶-1-基)-3，4-二羟基氧杂环戊烷-2-基]甲氧基-羟基磷酰基]氧基-羟基磷酰基]磷酸氢盐)或bronchitol(甘露糖醇的吸入制剂)。

在另一个实施方案中，另外的活性剂是抗炎药，即可以减轻肺中的炎症的活性剂。本文所用的典型的这种活性剂包括布洛芬、二十二碳六烯酸(DHA)、西地那非、吸入谷胱甘肽、吡格列酮、羟氯喹或辛伐他汀(simavastatin)。

在另一个实施方案中，另外的活性剂降低上皮钠通道阻滞剂(ENaC)的活性(通过阻断通道直接降低活性或通过调节导致ENaC活性增加的蛋白酶(例如丝氨酸蛋白酶、通道活化蛋白酶)间接降低活性)。典型的这种活性剂包括卡莫司他(胰蛋白酶样蛋白酶抑制剂)、QAU145、552-02、GS-9411、INO-4995、Aerolytic和阿米洛利。降低上皮钠通道阻滞剂(ENaC)活性的另外的活性剂可以在例如PCT公开号WO2009/074575中找到，将该文献的全部内容完整地引入本文参考。

在本文所述的其他疾病中，CFTR调节剂、例如晶型A与降低ENaC活性的活性剂的组合用于治疗Liddle综合征、炎性或变应性病症，包括囊性纤维化、原发性纤毛运动障碍、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、呼吸道感染、肺癌、口干燥症和干燥性角结膜炎(keratoconjunctivitis sire)、呼吸道感染(急性和慢性；病毒和细菌性)和肺癌。

CFTR调节剂、例如晶型A与降低ENaC活性的活性剂的组合还用于治疗阻断上皮钠通道介导的疾病，包括并非呼吸性疾病的疾病，它们与通过上皮的流体调节异常相关，可能涉及其表面上的保护性表面液体的生理学异常，例如口腔干燥症(口干燥)或干燥性角结膜炎(干眼)。此外，阻断肾中的上皮钠通道可以用于促进利尿且由此诱导降血压效应。

哮喘包括内源性(非变应性)哮喘和外源性(变应性)哮喘、轻度哮喘、中度哮喘、重度哮喘、支气管哮喘、运动诱发哮喘、职业性哮喘和细菌感染后诱发的哮喘。对哮喘的治疗还应理解为包括治疗例如显示哮鸣症状的低于4或5岁和诊断或可诊断为″喘鸣婴儿″的受试者，主要医学关注的确立的患者类别和目前通常鉴定为初始或早期哮患者(为便利起见，这种特定哮喘病症称作″喘鸣婴儿综合征″)。治疗喘哮的预防性功效通过例如急性哮喘或支气管收缩发作的症状发作频率或严重性减少、肺功能改善或气道高反应性改善得到证实。可以进一步通过对其他治标疗法的需求减少得到证实，所述治标疗法即用于或预期在发作时限制或中断症状发作的疗法，例如抗炎(例如皮质类固醇)或支气管扩张。特别地，哮喘中的预防有益性对易于″晨降″的受试者而言显而易见。″晨降″是公认的哮喘综合征，常见于较大百分比的哮喘患者且特征在于哮喘发作，例如在约4-6am之间的几小时，即在通常基本上远离任何预先给予的治标性哮喘疗法的时间。

慢性阻塞性肺疾病包括慢性支气管炎或与之相关的呼吸困难、肺气肿以及其他药物疗法特别是其他吸入药物疗法之后的气道高反应性加剧。在一些实施方案中，CFTR调节剂、例如晶型A与降低ENaC活性的活性剂的组合用于治疗无论何种类型或起源的支气管炎，包括，例如急性支气管炎、花生仁吸入性支气管炎、卡他性支气管炎、格鲁布性支气管炎、慢性支气管炎或结核性支气管炎。

在另一个实施方案中，另外的活性剂是非化合物1晶型A的CFTR调节剂，即具有调节CFTR活性的效应的活性剂。典型的这种活性剂包括阿他卢仑(

3-[5-(2-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基]苯甲酸)、西那普肽、兰可夫肽、地来司他(人重组中性白细胞弹性蛋白酶抑制剂)、考前列酮(7-{(2R，4aR，5R，7aR)-2-[(3S)-1，1-二氟-3-甲基戊基]-2-羟基-6-氧代八氢环戊[b]吡喃-5-基}庚酸)或(3-(6-(1-(2，2-二氟苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷甲酰氨基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸。在另一个实施方案中，另外的活性剂是(3-(6-(1-(2，2-二氟苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷甲酰氨基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸。

在另一个实施方案中，另外的活性剂是营养剂。典型的这种活性剂包括胰脂肪酶(胰腺酶替代物)，包括

或

(在先的

)、

或谷胱甘肽吸入。在一个实施方案中，另一种营养剂是胰脂肪酶。

在一个实施方案中，另外的活性剂是非本发明化合物的CFTR调节剂。

其他治疗剂在本发明组合物中的含量将不超过在包含该治疗剂作为唯一活性成分的组合物中的通常给药量。优选地，其他治疗剂在目前所公开的组合物中的量将是通常的包含该治疗剂作为唯一治疗活性剂的组合物中的含量的约50％-100％。

本文所述的晶型A或其药学可接受的组合物也可以引入到涂覆可植入医药装置的组合物中，如假肢、人工瓣膜、血管移植物、移植片固定模和导管。因此，本发明在另一方面包括涂覆可植入装置的组合物，其包含如上一般性描述和在本文的大类与亚类中所述的本发明化合物，和适合于涂覆所述可植入装置的载体。在另一方面，本发明包括涂有组合物的可植入装置，所述组合物包含如上一般性描述和在本文大类与亚类中所述的本发明化合物，和适合于涂覆所述可植入装置的载体。适合的涂料和涂覆可植入装置的一般制备描述在美国专利US 6,099,562、5,886,026和5,304,121中。涂料通常是生物可相容的聚合材料，如水凝胶聚合物、聚甲基二硅氧烷、聚己内酯、聚乙二醇、聚乳酸、乙烯乙酸乙烯酯和它们的混合物。涂料可以可选地进一步被适合的氟硅氧烷、多糖、聚乙二醇、磷脂或其组合的表层所覆盖，以赋予组合物的控释特征。

本发明的另一方面涉及在生物样品或患者中调节CFTR活性(例如体外或体内)，该方法包括对患者给予本文所述的晶型A或其药学可接受的组合物或者使所述生物样品与本文所述的晶型A或其药学可接受的组合物接触。本文所用的术语“生物样品”非限制性地包括细胞培养物及其提取物；从哺乳动物获得的活组织检查材料或其提取物；和血液、唾液、尿、粪便、精液、泪液或其他体液或者其提取物。

在生物样品中调节CFTR可用于本领域技术人员已知的多种目的。这类目的的实例包括但不限于CFTR在生物学与病理学现象中的研究；和新型CFTR调节剂的对比评价。

在另一个实施方案中，提供了体外或体内调节阴离子通道活性的方法，所述方法包括使所述通道与本文所述的晶型A或其药学可接受的组合物接触的步骤。在优选的实施方案中，该阴离子通道是氯离子通道或碳酸氢根通道。在其他优选的实施方案中，该阴离子通道是氯离子通道。

按照可替代选择的实施方案，本发明提供增加细胞膜中功能性CFTR数量的方法，所述方法包括使所述细胞与本文所述的晶型A或其药学可接受的组合物接触的步骤。

根据另一种优选的实施方案，通过测定跨膜电压电位来测定CFTR的活性。测定生物样品中跨膜电压电位的手段可以采用本领域的任意已知方法，如光学膜电位测定法或其他电生理学方法。

光学膜电位测定法采用如Gonzalez和Tsien所述的电压-敏感性FRET传感器(参见Gonzalez，J.E.和R.Y.Tsien(1995)“Voltagesensing by fluorescence resonance energy transfer in single cells.”Biophys J 69(4)：1272-80和Gonzalez，J.E.and R.Y.Tsien(1997)；“Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescenceresonance energy transfer”Chem Biol 4(4)：269-77)与测定荧光变化的仪器的组合，如电压/离子探针读数器(VIPR)(参见Gonzalez，J.E.，K.Oades等人(1999)“Cell-based assays and instrumentation forscreening ion-channel targets”Drug Discov Today 4(9)：431-439)。

这些电压敏感性测定法基于膜溶性、电压敏感性染料DiSBAC2(3)与荧光磷脂CC2-DMPE之间荧光共振能量转移(FRET)的变化，所述荧光磷脂连接于质膜的外部小叶，充当FRET供体。膜电位(V_m)的变化导致带负电的DiSBAC₂(3)跨越质膜重新分布，从CC2-DMPE转移的能量的量相应地改变。荧光发射的变化可以利用VIPR^TM II监测，它是一种整合的液体处理器和荧光检测器，被设计用来在96-或384-孔微量滴定板中进行基于细胞的筛选。

在另一方面中，本发明提供试剂盒，用于体外或体内测定生物样品中CFTR或其片段的活性，所述试剂盒包含：(i)包含晶型A或任意上述实施方案的组合物；和(ii)关于下列内容的说明书：a)使该组合物与该生物样品接触；和b)测定所述CFTR或其片段的活性。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含关于下列内容的说明书：a)使另外的组合物与该生物样品接触；b)测定在所述另外的化合物的存在下所述CFTR或其片段的活性；和c)比较在另外的化合物的存在下CFTR活性与在本文所述的晶型A的存在下CFTR的密度。在优选的实施方案中，所述试剂盒用于测定CFTR的密度。

为了可以更加充分地理解本文所述发明，提供下列实施例。应当理解，这些实施例仅供说明，不以任何方式被解释为限制本发明。

实施例

方法和材料

XRPD(X-射线粉末衍射)

在室温使用Rigaku/MSC MiniFlex Desktop粉末X-射线衍射仪(Rigaku，The Woodlands，TX)记录X-射线粉末衍射(XRPD)数据。使用在30kV和15mA下操作的Cu管与Kβ抑制滤波器生成X-射线。发散狭缝因散射可变，接收狭缝分别设定在4.2度和狭缝0.3mm。扫描模式是采用0.02度步长的固定时间(FT)和2.0秒计数时间。使用参比标准品校准粉末X-射线衍射仪：75％方钠石(Na₃Al₄Si₄O₁₂Cl)和25％硅(Rigaku，Cat#2100/ALS)。使用具有零背景样品试样架的6份样品台(SH-LBSI511-RNDB)。将粉末样品置于凹入的区域上并且用载玻片压平坦。

FTIR(傅里叶变换红外)光谱法

FTIR光谱采集自具有智能轨道采样隔室、金刚石窗、应用软件Omnic，7.4的Thermo Scientific，Nicolet 6700FT-IR光谱仪。将粉末样品直接置于金刚石晶体上并且加压以使样品表面密接于金刚石晶体表面。采集背景光谱，然后采集样品光谱。采集设置如下：

检测器：DTGS KBr；

分光镜：KBr；

源：IR；

扫描范围：4000-400cm^-1；

增益：8.0；

光学速度：0.6329cm/sec；

孔径：100；

扫描编号：32；和

分辨率：4cm^-1。

实施例1：4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酸(7)的制备。

在氮气气氛中在安装Dean-Stark冷凝器的三颈1-L圆底烧瓶中合并2-氯-5-(三氟甲基)苯胺2(200g，1.023mol)、2-(乙氧基亚甲基)丙二酸二乙酯3(276g，1.3mol)和甲苯(100mL)。在搅拌下将该溶液加热至140℃，维持该温度4h。将该反应混合物冷却至70℃，缓慢加入己烷(600mL)。搅拌得到的淤浆，将其温至室温。通过过滤收集固体，用10％乙酸乙酯的己烷溶液(2x400mL)洗涤，然后真空干燥，得到白色固体(350g，94％收率)，为期望的缩合产物2-((2-氯-5-(三氟甲基)苯基氨基)亚甲基)丙二酸二乙酯4。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.28(d，J＝13.0Hz，1H)，8.63(d，J＝13.0Hz，1H)，8.10(s，1H)，7.80(d，J＝8.3Hz，1H)，7.50(dd，J＝1.5，8.4Hz，1H)，4.24(q，J＝7.1Hz，2H)，4.17(q，J＝7.1Hz，2H)，1.27(m，6H)。

8-氯-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酸乙酯(5)的制备。向3-颈1-L烧瓶中加入

(200mL，8mL/g)，在200℃脱气1h。将溶剂加热至260℃，在10min内分部分加入2-((2-氯-5-(三氟甲基)苯基氨基)亚甲基)丙二酸二乙酯4(25g，0.07mol)。将得到的混合物在260℃搅拌6.5小时，通过蒸馏除去得到的乙醇副产物。将该混合物缓慢冷却至80℃。在30分钟(min)内缓慢加入己烷(150mL)，然后再加入一批200mL己烷。将淤浆搅拌至它达到室温。过滤固体，用己烷(3×150mL)洗涤，然后真空干燥，得到8-氯-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酸乙酯5，为黄褐色固体(13.9g，65％收率)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.91(s，1H)，8.39(s，1H)，8.06(d，J＝8.3Hz，1H)，7.81(d，J＝8.4Hz，1H)，4.24(q，J＝7.1Hz，2H)，1.29(t，J＝7.1Hz，3H)。

4-氧代-5-(三氟甲基)-1H-喹啉-3-甲酸乙酯(6)的制备。给3-颈5-L烧瓶中加入8-氯-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酸乙酯5(100g，0.3mol)、乙醇(1250mL，12.5mL/g)和三乙胺(220mL，1.6mol)。然后在5℃给烧瓶中加入10g 10％Pd/C(50％湿)。将该反应体系在5℃在氮气气氛中剧烈搅拌20h，此后将该反应混合物浓缩至约150mL体积。取产物4-氧代-5-(三氟甲基)-1H-喹啉-3-甲酸乙酯6与Pd/C成为的淤浆直接用于下一步。

4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酸(7)的制备。在具有回流冷凝器的1-L烧瓶中，将4-氧代-5-(三氟甲基)-1H-喹啉-3-甲酸乙酯6(58g，0.2mol，包含Pd/C的粗反应淤浆)混悬于NaOH(814mL 5M，4.1mol)，在80℃加热18h，然后在100℃再加热5h。通过填充的Celite温热过滤该反应体系以除去Pd/C，用1N NaOH冲洗Celite。酸化滤液至约pH 1，得到浓稠白色沉淀。过滤沉淀，然后用水和冷乙腈冲洗。然后真空干燥固体，得到4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酸7，为白色固体(48g，92％收率)。¹H NMR(400.0MHz，DMSO-d₆)δ15.26(s，1H)，13.66(s，1H)，8.98(s，1H)，8.13(dd，J＝1.6，7.8Hz，1H)，8.06-7.99(m，2H)。

实施例2：4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯胺的制备

7-[4-硝基-3-(三氟甲基)苯基]-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷(20)的制备。向包含7-氮杂双环[2.2.1]庚烷盐酸盐9(4.6g，34.43mmol，获自氮气气氛中)的烧瓶中加入4-氟-1-硝基-2-(三氟甲基)苯8(6.0g，28.69mmol)和三乙胺(8.7g，12.00mL，86.07mmol)在乙腈(50mL)中的溶液。将反应烧瓶在80℃、在氮气气氛中加热16h。将该反应混合物冷却，然后分配在水与二氯甲烷之间。用1M HCl洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化(0-10％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到7-[4-硝基-3-(三氟甲基)苯基]-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷10(7.2g，88％收率)，为黄色固体。¹H NMR(400.0MHz，DMSO-d₆)δ8.03(d，J＝9.1Hz，1H)，7.31(d，J＝2.4Hz，1H)，7.25(dd，J＝2.6，9.1Hz，1H)，4.59(s，2H)，1.69-1.67(m，4H)，1.50(d，J＝7.0Hz，4H)。

4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯胺(11)的制备。将加入7-[4-硝基-3-(三氟甲基)苯基]-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷10(7.07g，24.70mmol)和10％Pd/C(0.71g，6.64mmol)的烧瓶抽真空，然后充氮气。加入乙醇(22mL)，给反应烧瓶安装氢气囊。剧烈搅拌12h后，用氮气净化反应混合物，通过过滤除去Pd/C。减压浓缩滤液至得到深色油状物，通过硅胶色谱法纯化残余物(0-15％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯胺11，为紫色固体(5.76g，91％收率)。¹H NMR(400.0MHz，DMSO-d₆)δ6.95(dd，J＝2.3，8.8Hz，1H)，6.79(d，J＝2.6Hz，1H)，6.72(d，J＝8.8Hz，1H)，4.89(s，2H)，4.09(s，2H)，1.61-1.59(m，4H)和1.35(d，J＝6.8Hz，4H)。

实施例3：N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺(化合物1)的制备。

在室温向4-氧代-5-(三氟甲基)-1H-喹啉-3-甲酸7(9.1g，35.39mmol)和4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯胺11(9.2g，35.74mmol)在2-甲基四氢呋喃(91.00mL)中的溶液中加入丙基膦酸环酐(50％的乙酸乙酯溶液，52.68mL，88.48mmol)和吡啶(5.6g，5.73mL，70.78mmol)。将反应烧瓶在65℃、在氮气气氛中加热10h。冷却至室温后，用乙酸乙酯稀释反应体系，用饱和Na₂CO₃溶液(50mL)使反应停止。分离各层，用乙酸乙酯将水层萃取两次。用水洗涤合并的有机层，用Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩至得到黄褐色固体。将粗固体产物在乙酸乙酯/乙醚(2∶1)中搅拌成淤浆，通过真空过滤收集，用乙酸乙酯/乙醚(2∶1)洗涤两次，得到产物，为淡黄色晶体粉末。将粉末溶于温热乙酸乙酯，使其吸附在Celite上。通过硅胶色谱法纯化(0-50％乙酸乙酯的二氯甲烷溶液)，得到N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺(化合物1)，为白色晶体固体(晶型A)(13.5g，76％收率)。LC/MS m/z 496.0[M+H]⁺，保留时间1.48min(RP-C₁₈，10-99％CH₃CN/0.05％TFA，3min内)。¹H NMR(400.0MHz，DMSO-d₆)δ13.08(s，1H)，12.16(s，1H)，8.88(s，1H)，8.04(dd，J＝2.1，7.4Hz，1H)，7.95-7.88(m，3H)，7.22(dd，2.5，8.9Hz，1H)，7.16(d，J＝2.5Hz，1H)，4.33(s，2H)，1.67(d，J＝6.9Hz，4H)，1.44(d，J＝6.9Hz，4H)。

晶型A的粉末衍射图如图1所示。

下表1提供了晶型A的有代表性的XRPD峰。

表1.晶型A XRPD峰

2θ(度)	强度(％)
		2θ(度)	强度(％)

7.90	100.0
		9.28	10.8
11.90	12.8
		14.38	35.2
15.08	12.6
		15.80	34.1
16.96	25.2
		17.66	13.8
19.28	39.4
		20.06	20.2
21.36	14.5
		21.80	94.2
23.40	30.0
		23.80	92.0
25.64	8.9
		26.82	6.4
29.36	8.1
		29.72	18.1
30.14	14.2
		31.20	9.9

基于单晶X-射线分析的晶型A的构象图如图2中所示。使用安装密封管CuK-α源和Apex II CCD检测器的Bruker Apex II衍射仪获取衍射数据。使用SHELX程序(Sheldrick，G.M.，Acta Cryst.A64，pp.112-122(2008))分析和精确定义结构。基于强度、统计学和对称性，分析和精确定义三方晶系(trigonal crystal system)和R-3空间群中的结构。晶型A具有如下晶胞尺寸：

α＝90°，β＝90°和γ＝120°。

将晶型A的FTIR光谱提供在图3中。

下表2提供了晶型A的有代表性的FTIR峰。

表2.晶型A FTIR峰

位置(cm^-1)	强度
		407.4	46.07
436.7	72.55
		471.5	61.17
497.8	63.61
		505.7	60.34
532.9	61.14
		567.8	54.31
590.7	55.23
		614.4	64.01
649.7	50.74
		661.0	49.82
686.8	51.43
		726.1	53.80
751.4	35.60
		798.1	48.21
808.8	48.47
		824.8	42.25
875.5	52.89
		898.6	71.77
918.7	68.93

977.7	42.31
		1008.1	64.09
1047.3	35.70
		1072.5	53.76
位置(cm^-1)	强度
		1091.2	43.79
1113.4	28.46
		1131.4	30.00
1153.0	34.61
		1168.3	40.13
1199.3	74.26
		1221.8	48.07
1253.1	47.84
		1277.6	36.67
1291.7	48.07
		1310.8	55.99
1329.1	63.21
		1352.8	42.30
1433.2	42.45
		1463.0	63.68
1526.0	35.86
		1574.0	60.60
1607.5	60.30
		1662.6	55.12

1740.9	86.74
		2870.0	81.63
2947.7	75.12
		2963.8	75.30
3092.7	84.58

用于检测和测量化合物的ΔF508-CFTR增强特性的分析

用于测定化合物的ΔF508-CFTR调节性质的跨膜电位光学方法

该分析使用荧光电压传感染料以使用荧光板读出器(例如FLIPRIII，Molecular Devices，Inc.)测定跨膜电位改变作为NIH 3T3细胞中功能性ΔF508-CFTR增加的读出值。对该响应的驱动力在于在预先用化合物处理细胞、然后加载电压传感染料后，通过单一液体添加步骤生成与通道活化相关的氯离子梯度。

增强剂化合物的鉴定

为了鉴定ΔF508-CFTR增强剂，研发了双重添加HTS分析形式。该HTS分析使用荧光电压传感染料以测定FLIPR III上跨膜电位改变作为温度校准的ΔF508CFTR NIH 3T3细胞中ΔF508CFTR门控增加的测量值(电导)。对该响应的驱动力在于在预先用增强剂化合物(或DMSO媒介物对照品)处理细胞、然后加载再分布染料后，与在使用荧光板读出器例如FLIPR III的单一液体添加步骤中用福司柯林进行通道活化相关的Cl-离子梯度。

溶液

浴溶液#1：(以mM计)NaCl 160，KCl 4.5，CaCl₂2，MgCl₂1，HEPES 10，pH 7.4，含有NaOH。

不含氯离子的浴溶液：用葡糖酸盐取代浴溶液#1中的盐酸盐

细胞培养

将稳定表达ΔF508-CFTR的NIH3T3小鼠成纤维细胞用于跨膜电位的光学测量。将细胞维持在37℃、5％CO₂和90％湿度中的在175cm²培养瓶中的Dulbecco改进的Eagle培养基内，该培养基补充了2mM谷氨酰胺、10％胎牛血清、1X NEAA、β-ME、1X pen/strep和25mMHEPES。就全部光学分析而言，将细胞以～20,000/孔接种在384-孔基质胶-包被的培养板上，在37℃培养2hrs，然后在27℃培养24hrs，以进行增强剂分析。为了进行校准分析，在27℃或37℃与和不与化合物一起培养细胞16-24小时。电生理分析用于分析化合物的ΔF508-CFTR调节特性。

Ussing室分析

对表达ΔF508-CFTR的极化气道上皮细胞进行Ussing室实验，以进一步表征在光学测定法中鉴别的ΔF508-CFTR调节剂。从支气管组织中分离非-CF和CF气道上皮，如上所述培养(Galietta，L.J.V.，Lantero，S.，Gazzolo，A.，Sacco，O.，Romano，L.，Rossi，G.A.，&Zegarra-Moran，O.(1998)In Vitro Cell.Dev.Biol.34，478-481)，在用NIH3T3-条件培养基预包被的

Snapwell^TM滤器上铺平。4天后，除去顶部培养基，使细胞在空气液体界面上生长＞14天，然后使用。这产生单层完全分化的柱状细胞，它们具纤毛、特征在于气道上皮特征。从没有任何已知肺病的不吸烟者中分离非-CF HBE。从对ΔF508-CFTR而言纯合的患者中分离CF-HBE。

将生长在

SnapwellTM细胞培养插入物上的HBE固定在Ussing室(Physiologic Instruments，Inc.，San Diego，CA)上，使用电压钳系统(Department of Bioengineering，University of Iowa，IA)测定在基底外侧到顶端Cl^-梯度(I_SC)的存在下的经上皮电阻和短路电流。简言之，在电压钳记录条件下(V_保持＝0mV)、在37℃检验HBE。基底外侧溶液包含(以mM计)145 NaCl、0.83 K₂HPO₄、3.3 KH₂PO₄、1.2 MgClX、1.2CaCl₂、10葡萄糖、10HEPES(用NaOH将pH调整至7.35)，顶端溶液包含(以mM计)145葡糖酸钠、1.2MgCl₂、1.2CaCl₂、10葡萄糖、10HEPES(用NaOH将pH调整至7.35)。

增强剂化合物的鉴定

典型的方案使用基底外侧至顶端膜的Cl^-浓度梯度。为了产生该梯度，对基底外侧膜使用正常的林格液(ringer)。另外，通过用等摩尔的葡糖酸钠(用NaOH滴定至pH 7.4)代替顶膜的NaCl，以得到跨上皮的大幅的Cl^-浓度梯度。将福斯柯林(10μM)和所有受试化合物加入到细胞培养插入物的顶面。比较推测的ΔF508-CFTR增强剂与已知增强剂染料木黄酮的效果。

膜片钳记录

如之前所述使用穿孔的膜片记录配置监测ΔF508-NIH3T3细胞中的总Cl^-电流(Rae，J.，Cooper，K.，Gates，P.，& Watsky，M.(1991)J.Neurosci.Methods 37，15-26)。使用Axopatch 200B膜片钳放大器(AxonInstruments Inc.，Foster City，CA)在22℃进行电压钳记录。移取管溶液包含(以mM计)150N-甲基-D-葡萄糖胺(NMDG)-Cl、2MgCl₂、2CaCl₂、10EGTA、10HEPES和240μg/ml两性霉素-B(用HCl将pH调整至7.35)。胞外培养基包含(以mM计)150NMDG-Cl、2MgCl₂、2CaCl₂、10HEPES(用HCl将pH调整至7.35)。使用安装了Digidata 1320A/D界面与Clampex 8(Axon Instruments Inc.)的PC进行脉冲发生、数据采集和分析。为了活化ΔF508-CFTR，向浴中加入10μM福司柯林和20μM染料木黄酮，每30秒监测一次电流-电压相关性。

增强剂化合物的鉴定

还用穿孔膜片记录技术研究了ΔF508-CFTR增强剂增加稳定表达ΔF508-CFTR的NIH3T3细胞中宏观ΔF508-CFTR Cl-电流(I_ΔF508)的能力。从光学测定法中鉴别的增强剂引起具有在光学测定法中观察到的类似效力和功效的I_ΔF508的剂量依赖性增加。在所有检验的细胞中，施加增强剂前和过程中的逆转电位约为-30mV，它是计算的E_cl(-28mV)。

细胞培养

将稳定表达ΔF508-CFTR的NIH3T3小鼠成纤维细胞用于全细胞记录。将细胞维持在37℃、在5％CO₂和90％湿度中的在175cm²培养瓶中的Dulbecco改进的Eagle培养基中，该培养基补充了2mM谷氨酰胺、10％胎牛血清、1X NEAA、β-ME、1X pen/strep和25mMHEPES。为了进行全细胞记录，将2,500-5,000个细胞接种在聚-L-赖氨酸-包被的玻璃盖玻片上并且在27℃培养24-48hrs后用于测试增强剂的活性；且与或不与纠正化合物一起在37℃温育，以便测定纠正剂的活性。

单通道记录

如上所述使用切下的膜内翻外膜片(Dalemans，W.，Barbry，P.，Champigny，G.，Jallat，S.，Dott，K.，Dreyer，D.，Crystal，R.G.，Pavirani，A.，Lecocq，J-P.，Lazdunski，M.(1991)Nature 354，526-528)、应用Axopatch 200B膜片钳放大器(Axon Instruments Inc.)观察表达在NIH3T3细胞中的温度校准的ΔF508-CFTR和wt-CFTR的门控活性。移取管包含(以mM计)：150NMDG、150天冬氨酸、5CaCl₂、2MgCl₂和10HEPES(用Tris碱将pH调整至7.35)。浴包含(以mM计)：150NMDG-Cl、2MgCl₂、5EGTA、10TES和14Tris碱(用HCl将pH调整至7.35)。切下后，通过添加1mM Mg-ATP、75nM cAMP-依赖性蛋白激酶催化亚单位(PKA；Promega Corp.Madison，WI)和10mM NaF以抑制蛋白磷酸酶从而活化wt-和ΔF508-CFTR，这防止了电流下降。将移取管电位维持在80mV。从包含≤2活性通道的膜片中分析通道活性。同时开放的最大数量确定了实验过程中活性通道的数量。为了测定单通道电流振幅，以100Hz“离线”过滤从120秒ΔF508-CFTR活性记录的数据，然后用于构建所有点的振幅直方图，使用Bio-Patch分析软件(Bio-Logic Comp.France)采用多高斯函数拟合。从120秒的通道活性确定总微观电流和开放概率(P_o)。使用Bio-Patch软件或根据关系式P_o＝I/i(N)确定P_o，其中I＝平均电流，i＝单通道电流振幅，N＝膜片中活性通道的数量。

细胞培养

将稳定表达ΔF508-CFTR的NIH3T3小鼠成纤维细胞用于切下膜的膜片钳记录。将细胞维持在37℃、在5％CO₂和90％湿度中的在175cm²培养瓶中的Dulbecco改进的Eagle培养基中，该培养基补充了2mM谷氨酰胺、10％胎牛血清、1X NEAA、β-ME、1X pen/strep和25mMHEPES。为了进行单通道记录，将2,500-5,000个细胞接种在聚-L-赖氨酸-包被的玻璃盖玻片上并且在27℃培养24-48hrs后使用。

化合物1晶型A用作ATP结合盒转运蛋白的调节剂。经测定化合物1晶型A的EC₅₀(μm)低于2.0μM。将化合物1晶型A的效率计算为100％-25％。应注意100％效率是使用4-甲基-2-(5-苯基-1H-吡唑-3-基)苯酚得到的最大响应。

Claims

1.N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺，其特征为其是晶型A。

2.权利要求1的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约7.9度的峰。

3.权利要求1或2的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约9.3度的峰。

4.权利要求1-3任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约11.9度的峰。

5.权利要求1-4任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约14.4度的峰。

6.权利要求1-5任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约15.1度的峰。

7.权利要求1-6任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约15.8度的峰。

8.权利要求1-7任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约17.0度的峰。

9.权利要求1-8任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约17.7度的峰。

10.权利要求1-9任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约19.3度的峰。

11.权利要求1-10任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约20.1度的峰。

12.权利要求1-11任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约21.4度的峰。

13.权利要求1-12任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约21.8度的峰。

14.权利要求1-13任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约23.4度的峰。

15.权利要求1-14任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约23.8度的峰。

16.权利要求1-15任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约25.6度的峰。

17.权利要求1-16任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约26.8度的峰。

18.权利要求1-17任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约29.4度的峰。

19.权利要求1-18任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约29.7度的峰。

20.权利要求1-19任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约30.1度的峰。

21.权利要求1-20任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的约31.2度的峰。

22.权利要求1的晶型A，其中晶型A的特征在于在X-射线粉末衍射图案中的在约7.9度的峰、在约11.9度的峰、在约14.4度的峰和在约15.8度的峰。

23.权利要求1-22任一项的晶型A，其中晶型A的特征在于图1中所示的衍射图案。

24.药物组合物，包含权利要求1-23任一项的晶型A和药学可接受的佐剂或载体。

25.权利要求24的药物组合物，还包含另外的活性剂，其选自黏液溶解药、支气管扩张剂、抗生素、抗感染剂、抗炎剂、晶型A以外的CFTR调节剂或营养剂。

26.权利要求25的药物组合物，其中另外的活性剂是晶型A以外的CFTR调节剂。

27.治疗患者疾病或减轻其严重性的方法，其中所述疾病选自囊性纤维化、哮喘、吸烟诱发的COPD、慢性支气管炎、鼻鼻窦炎、便秘、胰腺炎、胰腺功能不全、因输精管先天性双侧缺失(CBAVD)导致的男性不育、轻度肺疾病、特发性胰腺炎、变应性支气管肺曲菌病(ABPA)、肝病、遗传性肺气肿、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷、例如蛋白质C缺乏症、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷、例如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β脂蛋白血症、溶酶体贮积病、例如I-细胞疾病/假性胡尔勒病、粘多糖病，桑霍夫病/泰-萨病，克-纳综合征II型、多内分泌腺病/高胰岛素血症、糖尿病、拉伦侏儒症、髓过氧化物酶缺乏症、原发性甲状旁腺功能减退，黑素瘤、Glycanosis CDG 1型、先天性甲状腺功能亢进症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT不足、尿崩症(DI)、神经生长性DI、肾性DI、夏-马-图三氏综合征、佩-梅病、神经变性疾病、例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上麻痹、匹克病、若干聚谷氨酰胺神经性障碍、例如亨廷顿病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓延髓肌肉萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩，和强直性肌营养不良，以及海绵样脑病，例如遗传性克雅病(由朊病毒蛋白加工缺陷导致)、法布里病、Straussler-Scheinker综合征(由Prp加工缺陷导致)、不育、胰腺炎、胰腺功能不全、骨质疏松症、骨质减少、Gorham综合征、氯化物通道病变、先天性肌强直(Thomson和Becker型)、巴特综合征III型、Dent病、震惊综合征、癫痫症、震惊综合征、溶酶体贮存病、Angelman综合征、原发性纤毛运动障碍(PCD)、具有左右转位的PCD(也称作卡塔格内综合征)、没有左右转位的PCD和睫状发育不良和肝病，该方法包括对所述患者给予有效量的权利要求1-23任一项的晶型A的步骤。

28.权利要求27的方法，其中所述疾病是囊性纤维化。

29.治疗患者疾病或减轻其严重性的方法，其中所述疾病与因编码CFTR的基因突变或环境因素导致的CFTR功能降低相关，该方法包括对所述患者给予有效量的权利要求1-23任一项的晶型A的步骤。

30.权利要求29的方法，其中疾病是囊性纤维化、慢性支气管炎、复发性支气管炎、急性支气管炎、因输精管先天性双侧缺失(CBAVD)导致的男性不育、子宫和阴道先天性缺失(CAUV)导致的女性不育、特发性慢性胰腺炎(ICP)、特发性复发性胰腺炎、特发性急性胰腺炎、慢性鼻鼻窦炎、原发性硬化性胆管炎、变应性支气管肺曲菌病、糖尿病、干眼、便秘、变应性支气管肺曲菌病(ABPA)、骨疾病和哮喘。

31.治疗患者疾病或减轻其严重性的方法，其中所述疾病与正常CFTR功能相关，该方法包括对所述患者给予有效量的权利要求1-23任一项的晶型A的步骤。

32.权利要求31的方法，其中所述疾病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性支气管炎、复发性支气管炎、急性支气管炎、鼻鼻窦炎、便秘、慢性胰腺炎、复发性胰腺炎和急性胰腺炎、胰腺功能不全、先天性双侧输精管缺失(CBAVD)导致的男性不育、轻度肺疾病、特发性胰腺炎、肝病、遗传性肺气肿、胆石、胃食管返流病、胃肠道恶性肿瘤、炎性肠病、便秘、糖尿病、关节炎、骨质疏松症和骨质减少。

33.权利要求31的方法，其中所述疾病是遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷、例如蛋白质C缺乏症、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷、例如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β脂蛋白血症、溶酶体贮积病、例如I-细胞疾病/假性胡尔勒病、粘多糖病，桑霍夫病/泰-萨病，克-纳综合征II型、多内分泌腺病/高胰岛素血症、糖尿病、拉伦侏儒症、髓过氧化物酶缺乏症、原发性甲状旁腺功能减退、黑素瘤、Glycanosis CDG 1型、先天性甲状腺功能亢进症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT不足、尿崩症(DI)、神经生长性DI、肾性DI、夏-马-图三氏综合征、佩-梅病、神经变性疾病、例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上麻痹、匹克病、若干聚谷氨酰胺神经性障碍、例如亨廷顿病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓延髓肌肉萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩，和强直性肌营养不良，以及海绵样脑病，例如遗传性克雅病(由朊病毒蛋白加工缺陷导致)、法布里病、Straussler-Scheinker综合征、Gorham综合征、氯化物通道病变、先天性肌强直(Thomson和Becker型)、巴特综合征III型、Dent病、震惊综合征、癫痫症、震惊综合征、溶酶体贮存病、Angelman综合征、原发性纤毛运动障碍(PCD)、具有左右转位的PCD(也称作卡塔格内综合征)、没有左右转位的PCD和睫状发育不良或斯耶格仑病。

34.试剂盒，用于体外或体内测定生物样品中CFTR或其片段的活性，所述试剂盒包含：

(i)包含权利要求1-23任一项的晶型A的组合物；和

(ii)关于下列内容的说明书：

a)使该组合物与该生物样品接触；和

b)测定所述CFTR或其片段的活性。

35.权利要求34的试剂盒，还包含关于如下的说明书：

a)使另外的组合物与该生物样品接触；

b)测定在所述的另外的化合物的存在下所述CFTR或其片段的活性；和

c)比较在另外的化合物的存在下CFTR的活性与在晶型A的存在下CFTR的密度。

36.调节生物样品中CFTR活性的方法，包括使所述CFTR接触权利要求1-23任一项的晶型A的步骤。

37.权利要求1-23任一项的晶型A，具有如下晶胞尺寸：

38.N-(4-(7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基)-2-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-5-(三氟甲基)-1，4-二氢喹啉-3-甲酰胺的晶型，具有三方晶系、R-3空间群和如下晶胞尺寸：

α＝90°；β＝90°；和γ＝120°。