MX2012004791A - Formas sólidas de n-(4-(7-azabiciclo[2.2.1]heptan-7-il)-2-(trifluo rometil)fenil)-4-oxo-5-(trifluorometil)-1,4-dihidroquinolina-3-ca rboxamida. - Google Patents

Formas sólidas de n-(4-(7-azabiciclo[2.2.1]heptan-7-il)-2-(trifluo rometil)fenil)-4-oxo-5-(trifluorometil)-1,4-dihidroquinolina-3-ca rboxamida.

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Abstract

La presente invención se relaciona con formas sustancialmente cristalinas y en estado sólido de formas sólidas de N-(4-(7-azabiciclo[2.2.1]heptan-7-il)-2-trifluorometil)fenil)-4-o xo-5-(trifluorometil)-1,4-dihidroquinolin-3-carboxamida (Forma A-HC1, Forma B B-HC1, o cualquier combinación de estas formas), las composiciones farmacéuticamente aceptables de la misma, y los métodos de tratamiento con la misma.

Description

FORMAS SÓLIDAS DE N- (4- (7-AZABICICLO [2.2.1] HEPTAN- 7-IL) -2- (TRIFLUOROMETIL) FENIL) -4-OXO-5- (TRIFLUOROMETIL) - 1 , 4-DIHIDROQUINOLINA -3-CARBOXAMIDA Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos No. de serie 61/254.614, presentada el 23 de octubre de 2009.
Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a formas en estado sólido, por ejemplo, formas cristalinas de N-(4-(7-azabiciclo[ 2.2.1] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida, que es un modulador del gen regulador de la conductancia de la transmembrana de la fibrosis quistica ("CFTR") . La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen formas cristalinas de N-(4-(7-azabiciclo[ 2.2.1] heptan-7-il ) -2- ( trif luorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) - 1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida y métodos relacionados con las mismas.
Antecedentes de la invención Los transportadores de cassette de ATP son una familia de proteínas transportadoras de membrana que regulan el transporte de una amplia variedad de agentes farmacológicos, fármacos potencialmente tóxicos y xenobióticos , así como aniones. Son proteínas de membrana homologas que se unen y usan adenosina trifosfato (ATP) para sus actividades específicas. Algunos de estos transportadores se descubrieron como proteínas de resistencia a múltiples fármacos (como la glicoproteína MDR1-P o la proteína de resistencia a múltiples fármacos, MRP1), defendiendo las células cancerosas malignas contra los agentes quimioterapéuticos . Hasta la fecha, se han identificado 48 de dichos transportadores agrupados en 7 familias en base a su identidad de secuencia y función.
Un miembro de la familia de transportadores de cassette de ATP comúnmente asociado con la enfermedad es el canal de anión mediado por cAMP/ATP-, CFTR. El GFTR se expresa en una variedad de tipos celulares, incluidas las células epiteliales de absorción y secretoras, donde regula el flujo aniónico a través de la membrana, así como la actividad de otros canales iónicos y proteínas . En las células epiteliales, el funcionamiento normal del CFTR es fundamental para el mantenimiento del transporte de electrolitos en todo el cuerpo, incluido el tejido respiratorio y digestivo. El CFTR está compuesto por aproximadamente 1480 aminoácidos que codifican una proteína compuesta por una repetición en serie de dominios transmembrana, cada uno de los cuales contiene seis hélices transmembrana y un dominio de unión a nucleótido. Los dos dominios transmembrana están unidos por un dominio (R) grande, polar y regulador con múltiples sitios de fosforilación que regulan la actividad del canal y el tráfico celular.
El gen que codifica CFTR se ha identificado y secuenciado (ver Gregory, R. J. et al. (1990) Nature 347:382-386; Rich, D. P. et al. (1990) Nature 347:358-362), Riordan, J. R. et al. (1989) Science 245:1066-1073). Una anomalía en este gen causa mutaciones en el CFTR, resultando en fibrosis quística ("FQ"), la enfermedad genética mortal más común en humanos. La fibrosis quística afecta aproximadamente uno de cada 2500 bebés en los Estados Unidos. En la población de todos los Estados Unidos, hasta 10 millones de personas son portadoras de una sola copia del gen anómalo sin efectos adversos aparentes. Por el contrario, las personas con dos copias del gen asociado a la FQ padecen los efectos debilitantes y mortales de la FQ, entre ellos, la enfermedad pulmonar crónica.
En pacientes con fibrosis quística, las mutaciones en el CFTR expresadas endógenamente en el epitelio respiratorio conducen a una secreción aniónica apical reducida, causando un desequilibrio en el transporte iónico y de fluidos. La disminución resultante en el transporte aniónico contribuye a aumentar la acumulación de mucosidad en el pulmón y las infecciones microbianas relacionadas que en última instancia causan el fallecimiento de pacientes con FQ. Además de la enfermedad pulmonar, los pacientes con FQ generalmente padecen trastornos gastrointestinales e insuficiencia pancreática que, de no tratarse, provocan la muerte. Asimismo, la mayoría de los hombres con fibrosis quística son infértiles y la fertilidad disminuye en las mujeres con fibrosis quística. Por el contrario con los efectos graves de las dos copias del gen asociado a la FQ, las personas con una sola copia del gen asociado a la FO muestran una resistencia elevada al cólera y a la deshidratación provocada por la diarrea, que quizás explique la frecuencia relativamente alta del gen de la FQ en la población.
El análisis de la secuencia del gen CFTR de los cromosomas de FQ ha revelado una variedad de mutaciones que provocan enfermedades (Cutting, G. R. et al. (1990) Nature 345:366-369; Dean, M. et al. (1990) Cell 51:863:870; y Kerem, B-S. et al. (1989) Science 245:1073-1080; Kerem, B-S et al. (1990) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 87:8447-8451). Hasta la fecha, se han identificado más de 1000 mutaciones que provocan mutaciones en el gen de la FQ ( http : //www. genet . sickkids . on . ca/cftr/app ) .
La mutación más prevalente es una eliminación de fenilalanina en la posición 508 de la secuencia de aminoácidos del CFTR y se conoce generalmente como ñF508-CFTR. Esta mutación ocurre en aproximadamente el 70% de los casos de fibrosis quistica y está asociada con una enfermedad grave.
La eliminación del residuo 508 en AF508-CFTR evita que la proteina naciente se pliegue correctamente. Esto provoca que la proteina mutante no pueda salir del retículo endoplasmático ni transportarse a la membrana plasmática. En consecuencia, el número de canales presentes en la membrana es mucho menor que el observado en células que expresan el CFTR de tipo silvestre. Además del tráfico defectuoso, la mutación resulta en la abertura defectuosa de canales. En conjunto, el número reducido de canales en la membrana y la abertura defectuosa conducen a un transporte aniónico reducido a través del epitelio, conduciendo al transporte iónico y de fluidos defectuoso. (Quinton, P. M. (1990), FASEB J. 4: 2709-2727). Sin embargo, los estudios han demostrado que las cantidades reducidas de AF508-CFTR en la membrana son funcionales, aunque menores que el CFTR de tipo silvestre. (Dolmans et al. (1991), Nature Lond. 354: 526-528; Denning et al, supra; Pasyk y Foskett (1995), J. Cell. Biochem. 270; 12347-50). Además de AF508-CFTR, Rl 17H-CFTR y G551D-CFTR, otras mutaciones que causan enfermedades en el CFTR que resultan en defectos en el tráfico, síntesis y/o abertura de canales podrían ser reguladas hacia arriba o hacia abajo para alterar la secreción aniónica y modificar el avance y/o gravedad de la enfermedad.
Si bien el CFTR transporta una variedad de moléculas además de los aniones, es evidente que este papel (el transporte de aniones, cloruro y bicarbonato) representa un elemento en un importante mecanismo de transporte de iones y agua a través del epitelio. Los otros elementos incluyen el canal de Na+ epitelial, ENaC, cotransportador Na+/2C1"/K+, bomba Na+-K+-ATPasa y los canales de K+ en la membrana basolateral, que son responsables de la captación de cloruro en la célula.
Estos elementos funcionan en conjunto para lograr el transporte direccional a través del epitelio a través de su expresión selectiva y localización dentro de la célula. La absorción de cloruro se produce por la actividad coordinada de ENaC y CFTR, que se encuentran presentes en la membrana apical y la bomba Na+-K+-ATPasa y los canales de Cl" expresados en la superficie basolateral de la célula. El transporte secundario activo de cloruro a partir del lado luminal conduce a la acumulación de cloruro intracelular , que luego puede salir pasivamente de la célula a través de los canales iónicos de Cl~, provocando un transporte vectorial. La disposición del cotransportador Na+/2C1"/K+, la bomba Na+-K+-ATPasa y los canales de K+ en la membrana basolateral en la superficie basolateral y el CFTR en el lado luminal coordinan la secreción del cloruro a través del CFTR en el lado luminal. Dado que probablemente el agua nunca se transporta activamente por si misma, su flujo a través del epitelio depende de pequeños gradientes osmóticos transepiteliales generados por el flujo en masa de sodio y cloruro.
Se cree que el transporte defectuoso de bicarbonato debido a mutaciones en el CFTR causa defectos en ciertas funciones secretoras. Ver, por ejemplo, "Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis " , Paul M. Quinton, Lancet 2008; 372:415-417.
Las mutaciones en el CFTR que se asocian con la disfunción moderada del CFTR también son evidentes en pacientes con afecciones que comparten ciertas manifestaciones de enfermedades con FQ pero no cumplen con los criterios diagnósticos para la FQ. Estas incluyen ausencia bilateral congénita de vasos deferentes, pancreatitis crónica idiopática, bronquitis crónica y rinosinusitis crónica. Otras enfermedades en las cuales se cree que el CFTR mutante es un factor de riesgo junto con genes modificadores o factores ambientales incluyen colangitis esclerosante primaria, aspergilosis broncopulmonar alérgica y asma.
También se ha demostrado que el humo de cigarrillo, la hipoxia y factores ambientales que inducen la señalización hipóxica deterioran la función del CTFR y pueden contribuir a ciertas formas de enfermedad respiratoria, tales como bronquitis crónica. Las enfermedades que pueden deberse a la función del CFTR defectuosa pero no cumplen con los criterios de diagnóstico para la FQ se caracterizan como enfermedades relacionadas con el CFTR.
Además de la fibrosis quística, la modulación de la actividad del CFTR puede ser beneficiosa para otras enfermedades que no están causadas directamente por mutaciones en el CFTR, tales como enfermedades secretoras y otras enfermedades de pliegue de proteínas mediadas por el CFTR. El CFTR regula el flujo de cloruro y bicarbonato a través del epitelio de muchas células para controlar el movimiento de fluidos, la solubilización de proteínas, la viscosidad de la mucosa y la actividad enzimática. Los defectos en el CFTR pueden causar el bloqueo de las vías respiratorias o conductos en muchos órganos, incluidos el hígado y el páncreas. Los potenciadores son compuestos que mejoran la actividad de abertura de CFTR presente en la membrana celular. Cualquier enfermedad que implique engrosamiento de la mucosa, regulación defectuosa de los fluidos, eliminación defectuosa de la mucosa o conductos bloqueados que conducen a la inflamación y a la destrucción de tejidos podría constituir un candidato para los potenciadores .
Estas incluyen, a modo no taxativo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, EPOC inducida por tabaquismo, bronquitis crónica, rinosinusitis , constipación, enfermedad del ojo seco y síndrome de Sjogren, enfermedad del reflujo gastroesofágico, litiasis biliar, prolapso rectal y enfermedad inflamatoria del intestino. La EPOC se caracteriza por la limitación del flujo de aire que es progresiva y no es completamente reversible. La limitación de flujo de aire se debe a la hipersecreción de mucosidad, enfisema y bronquiolitis . Los activadores del CFTR mutante o de tipo silvestre ofrecen un tratamiento posible de la hipersecreción de mucosa y eliminación mucociliar defectuosa que es común en la EPOC. Específicamente, el aumento de la secreción aniónica a través del CFTR puede facilitar el transporte de fluidos en la superficie de las vías respiratorias para hidratar la mucosa y optimizar la viscosidad de fluidos periciliares . Esto conduciría a una eliminación mejorada de la mucosidad y a una reducción en los síntomas asociados con la EPOC. Además, previniendo la infección y la inflamación en curso debido a la depuración mejorada de las vías respiratorias, los moduladores del CFTR pueden prevenir o retardar la destrucción parenquimal de las vías respiratorias que caracteriza al enfisema y reduce o revierte el aumento en el número de células de secreción de mucosa y el tamaño que sobrelisa la hipersecreción de mucosa en las enfermedades de las vías respiratorias. La enfermedad del ojo seco se caracteriza por una reducción en la producción acuosa de lágrimas y perfiles anormales de películas de lágrima de lípidos, proteínas y mucina. Existen varias causas del ojo seco, algunas de las cuales incluyen la edad, la cirugía ocular Lasik, artritis, medicaciones, quemaduras químicas/térmicas, alergias y enfermedades tales como fibrosis quística y síndrome de Sjogren. El aumento de la secreción aniónica a través del CFTR mejoraría el transporte de fluidos a partir de las células endoteliales corneales y glándulas secretoras que rodean al ojo para aumentar la hidratación de la córnea. Esto ayudaría a aliviar los síntomas asociados con la enfermedad del ojo seco. El síndrome de Sjogren es una enfermedad autoinmune en la cual el sistema inmune ataca las glándulas productoras de humedad en todo el cuerpo, incluyendo el ojo, boca, piel, tejido respiratorio, hígado, vagina e intestino. Los síntomas incluyen ojo, boca y vagina secos, así como enfermedad pulmonar. La enfermedad también se asocia con artritis reumatoide, lupus sistémico, esclerosis sistémica y polimiositis/dermatomiositis . Se cree que el tráfico defectuoso de proteínas causa la enfermedad, para la cual las opciones de tratamiento son limitadas. Los moduladores de la actividad del CFTR pueden hidratar varios órganos afectados por la enfermedad y pueden ayudar a aliviar los síntomas asociados. Las personas con fibrosis quística tienen episodios recurrentes de obstrucción intestinal e incidencias más altas de prolapso rectal, litiasis biliar, enfermedades de reflujo gastroesofágico , malignidades gastrointestinales y enfermedad inflamatoria del intestino, indicando que la función del CFTR puede jugar un papel importante para la prevención de dichas enfermedades.
Tal como se describe anteriormente, se cree que la eliminación del residuo 508 en AF508-CFTR evita que la proteína naciente se pliegue correctamente, resultando en la incapacidad de esta proteína mutante para salir del retículo endoplasmático y para transportarse a la membrana plasmática. Como resultado, hay cantidades insuficientes de la proteína madura en la membrana plasmática y el transporte de cloruro dentro de los tejidos epiteliales se reduce significativamente. De hecho, se ha demostrado que este fenómeno celular de procesamiento defectuoso del retículo endoplasmático (RE) del CFTR por parte de la maquinaria del RE es la base subyacente, no solamente para la enfermedad de la fibrosis quística, sino también de una amplia gama de otras enfermedades aisladas y hereditarias. Las dos formas en que la maquinaria del RE puede tener un mal funcionamiento es por pérdida de unión a la exportación del RE de las proteínas que conducen a la degradación o por la acumulación en el RE de estas proteínas defectuosas o plegadas incorrectamente [Aridor M, et al, Nature Med., 5(7), pp 745- 751 (1999); Shastry, B.S., et al, Neurochem. International, 43, pp 1-7 (2003); Rutishauser, J., et al, S iss Med Wkly, 132, páginas 211-222 ( 2002); Morello, JP et al, TIPS, 21, pp. 466- 469 (2000); Bross P. , et al, Human Mut. , 14, pp. 186-198 (1999)]. Las enfermedades asociadas con la primera clase del funcionamiento incorrecto del RE son fibrosis quística (debido a AF508-CFTR plegado incorrectamente como se describió anteriormente), enfisema hereditario (debido a al-antitripsina; variantes que no sean de Piz), hemocromatosis hereditaria, deficiencias de de coagulación - fibrinólisis , tales como deficiencia de proteína C, angioedema hereditario tipo 1, deficiencias de procesamiento de lípidos, tales como hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia tipo 1, abetalipoproteinemia , enfermedades de almacenamiento lisosomal, tales como enfermedad de célula de inclusión/pseudo-Hurler , mucopolisacaridosis (debido a enzimas de procesamiento lisosomal), enfermedad de Sandhof/Tay-Sachs (debido a fi -hexosaminidasa ) , síndrome de Crigler-Naj j ar tipo II (debido a la UDP glucuronosiltransferasa ) , poliendocrinopatía/hiperinsulemia , diabetes mellitus (debido al receptor de insulina), enanismo de Laron (debido al receptor de la hormona del crecimiento), deficiencia de mieloperoxidasa , hipoparatiroidismo primario (debido a la hormona preproparatiroide ) , melanoma (debido a la tirosinasa). Las enfermedades asociadas con la última clase del funcionamiento incorrecto del RE son síndrome de glicoproteínas deficientes en carbohidratos tipo 1, enfisema hereditario (debido a al-Antitripsina (variante PiZ), hipertiroidismo congénito, osteogénesis imperfecta (debido a procolágeno tipo I, II, IV), hipofibrinogenemia hereditaria (debido a fibrinógeno) , deficiencia de ACT (debido a al-antiquimiotripsina ) , diabetes insípida (DI), DI neurogénica (debido a la hormona vasopresina /receptor V2 ) , DI nefrogénica (debido a acuaporina II), síndrome de Charcot-Marie Tooth (debido a la proteína 22 mielina periférica), enfermedad de Perlizaeus-Merzbacher , enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer (debido a ß??? y presenilinas ) , enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, varios trastornos neurológicos de poliglutamina tales como enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelar tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia dentatorubro palidoluysiana y distrofia miotónica, asi como encefalopatías espongiformes, tales como enfermedad de Creutzfeldt-Jakob hereditaria (debido a un defecto en el procesamiento de la proteína prión), enfermedad de Fabry (debido a la a-galactosidasa A lisosomal), síndrome de Straussler-Scheinker (debido a un defecto en el procesamiento de Prp), infertilidad, pancreatitis, insuficiencia pancreática, osteoporosis , osteopenia, síndrome de Gorham, canalopatías de cloruro, miotonía congenita (formas Thomson y Becker), síndrome de Bartter ' s tipo III, enfermedad de Dent, hiperekplexia, epilepsia, hiperekplexia, enfermedades de almacenamiento lisosomal, síndrome de Angelman, discinesia ciliar primaria (PCD), PCD con situs inversus (también conocida como síndrome de Kartagener), PCD sin situs inversus y aplasia ciliar y enfermedad hepática.
Otras enfermedades que participan en una mutación en el CFT incluyen infertilidad masculina causada por ausencia bilateral congénita de vasos deferentes ( CBAVD ) , enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopática y aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) . Ver " CFTR-opathies: disease phenotypes associated with cystic fibrosis transmembrane regulator gene mutations", Peader G. Noone y Michael R. Knowles , Respir. Res. 2001,2: 328-332 (incorporado a la presente a modo de referencia).
Además de la regulación hacia arriba de la actividad del CFTR, la reducción de la secreción aniónica mediante moduladores del CFTR puede ser beneficiosa para el tratamiento de diarreas secretoras, en las cuales el transporte de agua epitelial aumenta bruscamente como resultado del transporte de cloruro activado de secretagogo. El mecanismo implica la elevación de AMPc y la estimulación del CFTR.
Si bien existen numerosas causas de diarrea, las mayores consecuencias de las enfermedades diarreicas que resultan del transporte excesivo de cloruro son comunes a todos, e incluyen deshidratación , acidosis, crecimiento defectuoso y muerte. Las diarreas agudas y crónicas representan un problema médico importante en muchas partes del mundo. La diarrea es un factor significativo en la malnutrición y la causa principal de muerte (5.000.000 muertes/año) en niños menores de cinco años de edad .
Las diarreas secretoras son también una afección peligrosa en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirido (SIDA) y enfermedad inflamatoria del intestino crónica (IBD). Dieciséis millones de personas que viajan a países en desarrollo desde naciones industrializadas desarrollan diarrea cada año, con una gravedad y número de casos de diarrea que varía dependiendo del país y área del viaje.
Por consiguiente, existe una necesidad de potenciadores del CFTR potentes y selectivos de las formas de tipo silvestre y mutantes del CFTR humano. Estas formas del CFTR mutantes incluyen a modo no taxativo AF508del, G551D, R117H, 2789+5G->A.
También existe una necesidad de tener moduladores de la actividad del CFTR, y composiciones de los mismos que pueden usarse para modular la actividad del CFTR en la membrana celular de un mamífero.
Existe una necesidad de métodos para tratar enfermedades causadas por la mutación en el CFTR usando dichos moduladores de la actividad del CFTR.
Existe una necesidad de métodos para modular la actividad del CFTR en una membrana celular ex vivo de un mamífero .
Además, existe una necesidad para tener formas sólidas estables de dicho compuesto que pueden usarse fácilmente en composiciones farmacéuticas para usar como agentes terapéuticos .
Compendio de la invención La presente invención se refiere a formas sólidas de de N- ( 4- ( 7-azabiciclo [ 2.2.1 ] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida (denominado en adelante "Compuesto I" ) que tiene la siguiente estructura: Compuesto I.
El compuesto I y composiciones farmacéuticamente aceptables del mismo son útiles para tratar o disminuir la gravedad de una variedad de enfermedades, trastornos o afecciones, que incluyen, a modo no taxativo, fibrosis quistica, asma, EPOC inducida por tabaquismo, bronquitis crónica, rinosinusitis , constipación, pancreatitis, insuficiencia pancreática, infertilidad masculina causada por la ausencia bilateral congénita de vasos deferentes (CBAVD), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) , enfermedad hepática, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de coagulación - fibrinólisis , tal como deficiencia de proteina C, angioedema hereditario tipo 1, deficiencias de procesamiento de l pidos, tales como hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia tipo 1, abetalipoproteinemia , enfermedades de almacenamiento lisosomal, tales como enfermedad de las células de inclusión/pseudo-Hurler , mucopolisacaridosis , enfermedad de Sandhof/Tay-Sachs , síndrome de Crigler-Naj jar tipo II, poliendocrinopatía/hiperinsulemia , diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiencia de mieloperoxidasa , hipoparatiroidismo primario, melanoma, síndrome de glicoproteínas deficientes en carbohidratos tipo 1, hipertiroidismo congénito, osteogénesis imperfecta, hipofibrinogenemia hereditaria, deficiencia de ACT, diabetes insípida (DI), DI neurogénica, DI nefrogénica, síndrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher , enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, varios trastornos neurológicos de poliglutamina tales como enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia dentatorubro palidoluysiana y distrofia miotónica, asi como encefalopatías espongiformes, tales como enfermedad de Creutzfeldt-Jakob hereditaria (debido a un defecto en el procesamiento de la proteína prión), enfermedad de Fabry, síndrome de Straussler-Scheinker , EPOC, enfermedad del ojo seco, enfermedad de Sjógren, osteoporosis , osteopenia, cicatrización ósea y crecimiento óseo (incluyendo reparación ósea, regeneración ósea, reduciendo la resorción ósea y aumentando la deposición ósea), síndrome de Gorham, canalopatías de cloruro tales como miotonía congénita (formas de Thomson y Becker), síndrome de Bartter tipo III, enfermedad de Dent, hiperekplexia , epilepsia, hiperekplexia, enfermedad de almacenamiento lisosomal, síndrome de Angelman, discinesia ciliar primaria (PCD), un término para trastornos heredados de la estructura y/o función de los cilios, incluyendo PCD con situs inversus (también denominada síndrome de Kartagener), PCD sin situs inversus y aplasia ciliar.
En un aspecto, el Compuesto I está en una forma sustancialmente cristalina denominada Forma B, Forma A-HC1 o Forma B-Hcl, como se describe y se caracteriza en la presente.
En otro aspecto, el Compuesto I está en una forma de sal clorhidrato denominada Forma A-HC1 o B-HC1 como se describe y se caracteriza en la presente.
En otro aspecto, el Compuesto I está en una forma de sal de clorhidrato denominada Forma B-HCl como se describe y se caracteriza en la presente.
Los procesos descritos en la presente pueden usarse para preparar las composiciones de la presente invención que comprenden Forma B, Forma A-HCl, Forma B-HCl o cualquier combinación de estas formas.
Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es un patrón de difracción de polvo de rayos X de un ejemplo de muestra de la Forma A-HCl.
La Figura 2 es la curva DSC para una muestra representativa de la Forma A-HCl.
La Figura 3 es una curva generada mediante análisis termogravimétrico de una muestra representativa de la Forma A-HCl que presenta un peso de muestra como una función de la temperatura.
La Figura 4 es un espectro FTIR de una muestra representativa de la Forma A-HCl.
La Figura 5 es un espectro 13C NMR de fase sólida de una muestra representativa de la Forma A-HCl.
La Figura 6 es un espectro 19F NMR de fase sólida de una muestra representativa de la Forma A-HCl.
La Figura 7A es un patrón de difracción de polvo de rayos X para una muestra representativa de la Forma B registrada con el Instrumento 1.
La Figura 7B es un patrón de difracción de polvo de rayos X para una muestra representativa de la Forma B registrada con el Instrumento 2.
La Figura 8 es la curva DSC para una muestra representativa de la Forma B.
La Figura 9 es una curva generada mediante análisis termogravimétrico de una muestra representativa de la Forma B que presenta un peso de muestra como una función de la temperatura.
La Figura 10 es un espectro FTIR de una muestra representativa de la Forma B.
La Figura 11 es un espectro 13C N R de fase sólida de una muestra representativa de la Forma B.
La Figura 12 es un espectro 19F NMR de fase sólida de una muestra representativa de la Forma B.
La figura 13 es un patrón de difracción de polvo de rayos X para una muestra representativa de la Forma B-HC1.
La Figura 14 es la curva DSC para una muestra representativa de la Forma B-HC1.
La Figura 15 es una curva generada mediante análisis termogravimétrico de una muestra representativa de la Forma B-HC1 que presenta un peso de muestra como una función de la temperatura.
La Figura 16 es un espectro FTIR de una muestra representativa de la Forma B-HCl.
La Figura 17 es un espectro 13C NMR de fase sólida de una muestra representativa de la Forma B-HCl.
La Figura 18 es un espectro 19F NMR de fase sólida de una muestra representativa de la Forma B-HCl.
La Figura 19 es una ilustración de la estructura conformacional de la Forma B con base en el análisis de rayos X simple.
La Figura 20 es una ilustración de la estructura conformacional de la Forma A-HCl con base en el análisis de rayos X simple.
La Figura 21 es un diagrama de empaque molecular de la Forma A-HCl con base en el análisis de rayos X simple.
La Figura 22 es una ilustración de la estructura conformacional de la Forma B-HCl con base en el análisis de rayos X simple.
La Figura 23 es un diagrama de empaque molecular de la Forma B-HCl con base en el análisis de rayos X simple.
Descripción detallada de la invención Definiciones Como se usa en la presente, se aplicarán las siguientes definiciones salvo que se indique lo contrario .
La expresión "transportador de ABC" como se usa en la presente significa una proteína transportadora de ABC o un fragmento de la misma que comprende al menos un dominio de unión, en donde dicha proteína o fragmento de la misma está presente in vivo o in vitro. El término "dominio de unión" como se usa en la presente significa un dominio en el transportador de ABC que se puede unir a un modulador. Ver, por ejemplo, Hwang, T. C. et al., J. Gen. Physiol. (1998): 212(3), 477-90.
El término "CFTR", tal como se utiliza en la presente, significa regulador de la conductancia de la transmembrana de la fibrosis quística o una mutación del mismo capaz de tener actividad de regulador, que incluye, a modo no taxativo, AF508 CFTR, R117H CFTR y G551D CFTR (ver, por ejemplo, http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app, para consultar mutaciones de CFTR).
El término "modulador", tal como se utiliza en la presente, significa aumentar o reducir en una cantidad mensurable .
La expresión "CFTR normal" o "función del CFTR normal" como se usa en la presente significa CFTR de tipo silvestre sin ningún deterioro debido a factores ambientales tales como tabaquismo, contaminación o cualquier elemento que produzca inflamación en los pulmones .
La expresión "CFTR reducido" o "función del CFTR reducida" como se usa en la presente significa menor que el CFTR normal o menor que la función del CFTR normal. El término "cristalino" se refiere a compuestos o composiciones donde las unidades estructurales están dispuestas en patrones o estructuras geométricas fijas, de forma tal que los sólidos cristalinos tienen un orden rígido de largo alcance. Las unidades estructurales que constituyen la estructura cristalina pueden ser átomos, moléculas o iones. Los sólidos cristalinos muestran puntos de fusión definidos.
La expresión "sustancialmente cristalino" se refiere a un material sólido que se dispone predominantemente en patrones o estructuras fijas que tienen orden rígido de largo alcance. Por ejemplo, los materiales sustancialmente cristalinos tienen más de aproximadamente 85% de cristalinidad (por ejemplo, más de aproximadamente 90% de cristalinidad, más de aproximadamente 95% de cristalinidad o más de aproximadamente 99% de cristalinidad). Cabe señalar también que la expresión "sustancialmente cristalino" incluye el término descriptivo "cristalino", que se define en el párrafo anterior.
A los efectos de la presente invención, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de Elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75ta Ed. Adicionalmente , los principios generales de la química orgánica se describen en "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, y "March's Advanced Organic Chemistry", 5ta Ed., Ed.: Smith, M.B. y March, J., John Wiley & Sons, Nueva York: 2001, cuyos contenidos completos se incorporan a la presente a modo de referencia .
Salvo que se indique de otro modo, todas las formas tautoméricas de los compuestos de la invención están dentro del alcance de la invención.
Adicionalmente, a menos que se especifique de otro modo, se pretende que las estructuras descritas en la presente incluyan compuestos que difieran únicamente en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen las estructuras presentes excepto por el reemplazo de hidrógeno por deuterio o tritio, o el reemplazo de un carbono por un carbono enriquecido 13C- o 14C- están dentro del alcance de la presente invención. Dichos compuestos son útiles, por ejemplo, como herramientas analíticas o sondas en ensayos biológicos. Dichos compuestos, particularmente compuestos que contienen átomos de deuterio, pueden exhibir propiedades metabólicas modificadas.
FORMA A-HC1 En un aspecto, la invención se refiere a una forma de N- ( 4-( 7-azabiciclo[ 2.2.1 ]heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) - 1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida caracterizada como Forma A-HC1.
En algunas realizaciones, la Forma A-HC1 se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en grados en un patrón de difracción de polvo de rayos X: un pico de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,3 grados (por ejemplo aproximadamente 7,1 grados); un pico de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 8,2 grados); un pico de aproximadamente 13,9 a aproximadamente 14,2 grados, (por ejemplo, aproximadamente 14,1 grados); y un pico de aproximadamente 21,0 a aproximadamente 21,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 21,2 grados); en una difracción de polvo de rayos X obtenida usando una radiación Cu K alfa.
En algunas realizaciones, la Forma A-HC1 se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en grados en un patrón de difracción de polvo de rayos X: un pico de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,3 grados (por ejemplo, aproximadamente 7,1 grados); un pico de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 8,2 grados); un pico de aproximadamente 11,9 a aproximadamente 12,3 grados, (por ejemplo, aproximadamente 12,1 grados); un pico de aproximadamente 13,5 a aproximadamente 13,9 grados, (por ejemplo, aproximadamente 13,7 grados); un pico de aproximadamente 16,2 a aproximadamente 16,6 grados, (por ejemplo, aproximadamente 16,4 grados); un pico de aproximadamente 18,5 a aproximadamente 18,9 grados, (por ejemplo, aproximadamente 18,7 grados); y un pico de aproximadamente 21,0 a aproximadamente 21,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 21,2 grados); en una difracción de polvo de rayos X obtenida usando una radiación Cu K alfa.
En algunas realizaciones, la Forma A-HC1 se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en grados en un patrón de difracción de polvo de rayos X: un pico de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,2 grados (por ejemplo, aproximadamente 7,1 grados); un pico de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 8,2 grados); un pico de aproximadamente 13,9 a aproximadamente 14,3 grados, (por ejemplo, aproximadamente 14,1 grados); un pico de aproximadamente 14,5 a aproximadamente 14,9 grados, (por ejemplo, aproximadamente 14,7 grados); un pico de aproximadamente 16,2 a aproximadamente 16,6 grados, (por ejemplo, aproximadamente 16,4 grados); un pico de aproximadamente 18,5 a aproximadamente 18,9 grados, (por ejemplo, aproximadamente 18,7 grados); tres picos de aproximadamente 21,0 a aproximadamente 22,2 grados, (por ejemplo, picos de aproximadamente 21,2 grados, aproximadamente 21,7 y aproximadamente 21,9); un pico de aproximadamente 22,6 a aproximadamente 23,0 grados, (por ejemplo, aproximadamente 22,8 grados); 2 picos de aproximadamente 24 a aproximadamente 25 grados, (por ejemplo, aproximadamente 24,6 grados y aproximadamente 25,0 grados); y 2 picos de aproximadamente 35,3 a aproximadamente 36,0 grados, (por ejemplo, aproximadamente 35,6 grados); en una difracción de polvo de rayos X obtenida usando una radiación Cu K alfa.
En algunas realizaciones, la Forma A-HC1 se caracteriza por el patrón de difracción de polvo de rayos X proporcionado en la Figura 1.
En algunas realizaciones, la Forma A-HC1 se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en partes por millón (ppm) en un espectro de l3C N R en estado sólido: un pico de aproximadamente 163,5 a aproximadamente 163,9 ppm (por ejemplo, aproximadamente 163,7 ppm), un pico de aproximadamente 137,0 a aproximadamente 137,4 ppm (por ejemplo, aproximadamente 137,2 ppm), y un pico de aproximadamente 121,3 a aproximadamente 121,7 ppm (por ejemplo, aproximadamente 121.5 ppm) .
En algunas realizaciones, la Forma A-HC1 se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en partes por millón (ppm) en un espectro de 13C NMR en estado sólido: un pico de aproximadamente 175,5 a aproximadamente 175,9 ppm (por ejemplo, aproximadamente 175,7 ppm), un pico de aproximadamente 163,5 a aproximadamente 163,9 ppm (por ejemplo, aproximadamente 163.7 ppm), un pico de aproximadamente 142,4 a aproximadamente 142,8 ppm (por ejemplo, aproximadamente 142.6 ppm), un pico de aproximadamente 140,6 a aproximadamente 141,0 ppm (por ejemplo, aproximadamente 140.8 ppm), un pico de aproximadamente 137,0 a aproximadamente 137,4 ppm (por ejemplo, aproximadamente 137,2 ppm), un pico de aproximadamente 131,3 a aproximadamente 131,7 ppm (por ejemplo, aproximadamente 131,5 ppm), y un pico de aproximadamente 121,3 a aproximadamente 121,7 ppm (por ejemplo, aproximadamente 121,5 ppm) .
En algunas realizaciones, la Forma A-HC1 se caracteriza por un espectro de 13C NMR en estado sólido que se muestra en la Figura 5.
En algunas realizaciones, la Forma A-HCl se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en partes por millón (ppm) en un espectro de 19F NMR en estado sólido: un pico de aproximadamente -56,8 a aproximadamente -57,2 ppm (por ejemplo, aproximadamente -57,0 ppm) y un pico de aproximadamente -60,3 a aproximadamente -60,7 ppm (por ejemplo, aproximadamente -60,5 ppm ) .
En algunas realizaciones, la Forma A-HC1 se caracteriza por un espectro de 19F NMR en estado sólido que se muestra en la Figura 6.
Aun en otras realizaciones, la Forma A-HC1 se caracteriza por el espectro FTIR que se proporciona en la Figura 4.
FORMA B En un aspecto, la invención se refiere a una forma de N-( 4-( 7-azabiciclo[2.2.1 ]heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) - 1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida caracterizada como Forma B.
En algunas realizaciones, la Forma B se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en grados en un patrón de difracción de polvo de rayos X: un pico de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 6,9 grados (por ejemplo, aproximadamente 6,7 grados); un pico de aproximadamente 9,8 a aproximadamente 10,2 grados, (por ejemplo, aproximadamente 10,0 grados); un pico de aproximadamente 11,0 a aproximadamente 11,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 11,2 grados); un pico de aproximadamente 13,2 a aproximadamente 13,6 grados, (por ejemplo, aproximadamente 13,4 grados); y un pico de aproximadamente 23,8 a aproximadamente 24,2 grados, (por ejemplo, aproximadamente 24,2 grados); en una difracción de polvo de rayos X obtenida usando una radiación Cu K alfa .
En algunas realizaciones, la Forma B se caracteriza por uno o más de picos: un pico de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 6,9 grados (por ejemplo, aproximadamente 6 , 7 grados ) ; un pico de aproximadamente 9,2 a aproximadamente 9,6 grados, (por ejemplo, aproximadamente 9,4); un pico de aproximadamente 11,0 a aproximadamente 11,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 11,2 grados); un pico de aproximadamente 13,2 a aproximadamente 13,6 grados, (por ejemplo, aproximadamente 13,4 grados); un pico de aproximadamente 15,0 a aproximadamente 15,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 15,2 grados); un pico de aproximadamente 17,0 a aproximadamente 17,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 17,2 grados); un pico de aproximadamente 17,6 a aproximadamente 18,0 grados, (por ejemplo, aproximadamente 17,8 grados); un pico de aproximadamente 17,9 a aproximadamente 18,3 grados, (por ejemplo, aproximadamente 18,1 grados); un pico de aproximadamente 19,0 a aproximadamente 19,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 19,2); un pico de aproximadamente 19,9 a aproximadamente 20,3 grados, (por ejemplo, aproximadamente 20,1 grados); un pico de aproximadamente 21,0 a aproximadamente 21,5 grados, (por ejemplo, aproximadamente 21,2 grados); un pico de aproximadamente 21,8 a aproximadamente 22,2 grados, (por ejemplo, aproximadamente 22,0 grados); un pico de aproximadamente 23,8 a aproximadamente 24,2 grados, (por ejemplo, aproximadamente 24,0 grados); un pico de aproximadamente 26,0 a aproximadamente 26,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 26,2 grados); un pico de aproximadamente 27,0 a aproximadamente 27,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 27,2); un pico de aproximadamente 27,5 a aproximadamente 27,9 grados, (por ejemplo, aproximadamente 27,7 grados); y un pico de aproximadamente 28,7 a aproximadamente 29,1 grados, (por ejemplo, aproximadamente 28,9); en una difracción de polvo de rayos X obtenida usando una radiación Cu K alfa.
En algunas realizaciones, la Forma B se caracteriza por el patrón de difracción de polvo de rayos X proporcionado en la Figura 7.
En algunas realizaciones, la Forma B se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en partes por millón (ppm) en un espectro de C NMR en estado sólido: un pico de aproximadamente 165,1 a aproximadamente 165,5 ppm (por ejemplo, aproximadamente 165,3 ppm) un pico de aproximadamente 145,7 a aproximadamente 146,1 ppm (aproximadamente 145,9 ppm), un pico de aproximadamente 132,7 a aproximadamente 133,1 ppm (por ejemplo, aproximadamente 132,9 ppm) y un pico de aproximadamente 113,2 a aproximadamente 113,6 ppm (por ejemplo, aproximadamente 113,4 ppm).
En algunas realizaciones, la Forma B se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos como partes por millón (ppm) en un espectro de 13C NMR en estado sólido: un pico de aproximadamente 175,1 a aproximadamente 175,5 ppm (por ejemplo, aproximadamente 175,3 ppm), un pico de aproximadamente 165,1 a aproximadamente 165,5 ppm (por ejemplo, aproximadamente 165.3 ppm), un pico de aproximadamente 141,2 a aproximadamente 141,6 ppm (por ejemplo, aproximadamente 141.4 ppm), un pico de aproximadamente 145,7 a aproximadamente 146,1 ppm (por ejemplo, aproximadamente 145,9 ppm), un pico de aproximadamente 132,7 a aproximadamente 133,1 ppm (por ejemplo, aproximadamente 132,9 ppm), un pico de aproximadamente 123,3 a aproximadamente 123,7 ppm (por ejemplo, aproximadamente 123.5 ppm), un pico de aproximadamente 126,6 a aproximadamente 127,0 ppm (por ejemplo, aproximadamente 126,8 ppm) , un pico de aproximadamente 113,2 a aproximadamente 113,6 ppm (por ejemplo, aproximadamente 113,4 ppm), un pico de aproximadamente 117,2 a aproximadamente 117,6 ppm (por ejemplo, aproximadamente 117,4 ppm), un pico de aproximadamente 58,1 a aproximadamente 58,5 ppm (por ejemplo, aproximadamente 58,3 ppm), un pico de aproximadamente 26,7 a aproximadamente 27,1 ppm (por ejemplo, aproximadamente 26,9 ppm) y un pico de aproximadamente 29,0 a aproximadamente 29,4 ppm (por ejemplo, aproximadamente 29,2 ppm) .
En algunas realizaciones, la Forma B se caracteriza por un espectro de 13C NMR en estado sólido que se muestra en la Figura 11.
En algunas realizaciones, la Forma B se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en partes por millón (ppm) en un espectro de 19F NMR en estado sólido: un pico de aproximadamente -55,9 a aproximadamente -56,3 ppm (por ejemplo, aproximadamente -56,1 ppm) y un pico de aproximadamente -61,9 a aproximadamente -62,3 ppm (por ejemplo, aproximadamente -62,1 ppm) .
En algunas realizaciones, la Forma B se caracteriza por un espectro de 19F NMR en estado sólido que se muestra en la Figura 12.
En otra realización, la presente invención se refiere a un cristal de N- ( 4- ( 7-azabiciclo [ 2.2.1 ] heptan-7-il ) -2- (trifluorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida en la Forma B que tiene un sistema de cristal monoclinico, un grupo espacial P2i/c y las siguientes dimensiones de celdas unitarias: a = 13,5429(4) Á, b= 13,4557(4) Á, c = 12,0592(4) Á, = 90°, ß = 101,193°, y ?= 90°.
En una realización, la presente invención proporciona un cristal de N-(4-(7-azabiciclo [2.2.1] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) - 1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida en la Forma B que tiene un sistema de cristal monoclinico, un grupo espacial P2i/c y las siguientes dimensiones de celdas unitarias: a = 13,5429(4) Á, b = 13,4557(4) Á, c = 12,0592(4) Á.
Aun en otras realizaciones, la Forma B se caracteriza por el espectro FTIR proporcionado en la Figura 10.
FORMA B-HC1 En un aspecto, la invención se refiere a una forma de N- ( 4- ( 7-azabiciclo [ 2.2.1 ] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida caracterizada como Forma B-HC1.
En algunas realizaciones, la Forma B-HC1 se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en grados en un patrón de difracción de polvo de rayos X: un pico de aproximadamente 8,1 a aproximadamente 8,5 grados (por ejemplo, aproximadamente 8,3 grados); un pico de aproximadamente 8,8 a aproximadamente 9,2 grados, (por ejemplo, aproximadamente 9,0 grados); un pico de aproximadamente 12,8 a aproximadamente 13,2 grados, (por ejemplo, aproximadamente 13,0 grados); un pico de aproximadamente 17,8 a aproximadamente 18,2 grados, (por ejemplo, aproximadamente 18,0 grados); y un pico de aproximadamente 22,8 a aproximadamente 23,2 grados, (por ejemplo, aproximadamente 23,0 grados); en una difracción de polvo de rayos X obtenida usando una radiación Cu K alfa .
En algunas realizaciones, la Forma B-HC1 se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en grados en un patrón de difracción de polvo de rayos X: un pico de aproximadamente 8,1 a aproximadamente 8,5 grados (por ejemplo, aproximadamente 8,3 grados); ün pico de aproximadamente 14,6 a aproximadamente 15,1 grados, (por ejemplo, aproximadamente 14,8 grados); un pico de aproximadamente 16,5 a aproximadamente 16,9 grados, (por ejemplo, aproximadamente 16,7 grados); 3 picos de aproximadamente 17,6 a aproximadamente 18,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 17,8 grados, aproximadamente 18,0 grados y aproximadamente 18,2 grados); 2 picos de aproximadamente 21,4 a aproximadamente 22,1 grados, (por ejemplo, aproximadamente 21,7 grados y aproximadamente 22,0 grados); dos picos de aproximadamente 22,8 a aproximadamente 23,8 grados, (por ejemplo, picos de aproximadamente 23,0 grados y aproximadamente 23,6); dos picos de aproximadamente 24,7 a aproximadamente 25,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 24,9 grados y aproximadamente 25,2 grados); un pico de aproximadamente 26,9 a aproximadamente 27,3 grados, (por ejemplo, aproximadamente 27,1 grados); un pico de aproximadamente 30,9 a aproximadamente 31,3 grados, (por ejemplo, aproximadamente 31,1 grados); y un pico de aproximadamente 38,2 a aproximadamente 38,7 grados, (por ejemplo, aproximadamente 38,5 grados); en una difracción de polvo de rayos X obtenida usando una radiación Cu K alfa.
En algunas realizaciones, la Forma B-HC1 se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en grados en un patrón de difracción de polvo de rayos X: un pico de aproximadamente 8,1 a aproximadamente 8,5 grados (por ejemplo, aproximadamente 8,3 grados); un pico de aproximadamente 13,8 a aproximadamente 14,3 grados, (por ejemplo, aproximadamente 14,1 grados); 2 picos de aproximadamente 14,6 a aproximadamente 15,5 grados, (por ejemplo, aproximadamente 14,8 grados y aproximadamente 15,2 grados); un pico de aproximadamente 16,5 a aproximadamente 16,9 grados, (por ejemplo, aproximadamente 16,7 grados); 3 picos de aproximadamente 17,6 a aproximadamente 18,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 17,8 grados, aproximadamente 18, 0 grados y aproximadamente 18,2 grados); 2 picos de aproximadamente 19,1 a aproximadamente 19,7 grados, (por ejemplo, aproximadamente 19,3 grados y aproximadamente 19,5 grados); 2 picos de aproximadamente 21,4 a aproximadamente 22,1 grados, (por ejemplo, picos de aproximadamente 21,7 grados y aproximadamente 22,0 grados); 2 picos de aproximadamente 22,8 a aproximadamente 23,8 grados, (por ejemplo, picos de aproximadamente 23,0 grados y aproximadamente 23,6 grados); 4 picos de aproximadamente 24,5 a aproximadamente 25,9 grados, (por ejemplo, aproximadamente 24,7 grados, aproximadamente 24,9 grados, aproximadamente 25,2 grados y aproximadamente 25,7 grados); un pico de aproximadamente 26,9 a aproximadamente 27,3 grados, (Por ejemplo, aproximadamente 27,1 grados); 2 picos de aproximadamente 27,7 a aproximadamente 28,3 grados, (por ejemplo, aproximadamente 27,9 grados y aproximadamente 28,1 grados); 2 picos de aproximadamente 29,5 a aproximadamente 30,0 grados, (por ejemplo, aproximadamente 29,7 grados y aproximadamente 29,8 grados); 2 picos de aproximadamente 29,5 a aproximadamente 30,0 grados, (por ejemplo, aproximadamente 29,7 grados y aproximadamente 29,8 grados); un pico de aproximadamente 30,9 a aproximadamente 31,3 grados, (Por ejemplo, aproximadamente 31,1 grados); un pico de aproximadamente 32.1 a aproximadamente 32,5 grados, (por ejemplo, aproximadamente 32,3 grados); 3 picos de aproximadamente 33.2 a aproximadamente 34,1 grados, (por ejemplo, aproximadamente 33,4 grados, aproximadamente 33,8 grados y aproximadamente 33,9 grados); un pico de aproximadamente 35,0 a aproximadamente 35,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 35,2 grados); un pico de aproximadamente 36,0 a aproximadamente 36,4 grados, (por ejemplo, aproximadamente 36,2 grados); y 3 picos de aproximadamente 38,3 a aproximadamente 40,1 grados, (por ejemplo, aproximadamente 38,5 grados, aproximadamente 38,6 grados y aproximadamente 39,9 grados); en una difracción de polvo de rayos X obtenida usando una radiación Cu ? alfa.
En algunas realizaciones, la Forma B-HC1 se caracteriza por el patrón de difracción de polvo de rayos X proporcionado en la Figura 13.
En algunas realizaciones, la Forma B-HC1 se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en partes por millón (ppm) en un espectro de 13C NMR en estado sólido: un pico de aproximadamente 168,0 a aproximadamente 168,4 ppm (por ejemplo, aproximadamente 168.2 ppm), un pico de aproximadamente 148,5 a aproximadamente 148,9 ppm (por ejemplo, aproximadamente 148.7 ppm), un pico de aproximadamente 138,6 a aproximadamente 139,0 ppm (por ejemplo, aproximadamente 138,8 ppm), un pico de aproximadamente 119,6 a aproximadamente 120,0 ppm (por ejemplo aproximadamente 119.8 ppm) y un pico de aproximadamente 23,7 a aproximadamente 24,1 ppm (por ejemplo aproximadamente 23,9 ppm ) .
En algunas realizaciones, la Forma B-HC1 se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en partes por millón (ppm) en un espectro de 13C NMR en estado sólido: un pico de aproximadamente 176,1 a aproximadamente 176,5 ppm (por ejemplo, aproximadamente 176.3 ppm), un pico de aproximadamente 168,0 a aproximadamente 168,4 ppm (por ejemplo, aproximadamente 168,2 ppm), un pico de aproximadamente 148,5 a aproximadamente 148,9 ppm (por ejemplo, aproximadamente 148,7 ppm), un pico de aproximadamente 143,0 a aproximadamente 143,4 ppm (por ejemplo, aproximadamente 143.2 pm), un pico de aproximadamente 138,6 a aproximadamente 139,0 ppm (por ejemplo, aproximadamente 138,8 ppm), 7 picos de aproximadamente 119 a aproximadamente 134 ppm (por ejemplo, aproximadamente 131,6 ppm, aproximadamente 129,6 ppm, aproximadamente 129,1 ppm, aproximadamente 126,7 ppm, aproximadamente 125,8 ppm, aproximadamente 122,7 ppm y aproximadamente 119,8 ppm), un pico de aproximadamente 112,1 a aproximadamente 112,5 ppm (por ejemplo, aproximadamente 112.3 ppm), un pico de aproximadamente 68,8 a aproximadamente 69,2 ppm (por ejemplo, aproximadamente 69,0 ppm), un pico de aproximadamente 66,7 a aproximadamente 67,1 ppm (por ejemplo, aproximadamente 66,9 ppm), un pico de aproximadamente 28,1 a aproximadamente 28,5 ppm (por ejemplo, aproximadamente 28,3 ppm) y un pico de aproximadamente 23,7 a aproximadamente 24,1 ppm (por ejemplo, aproximadamente 23,9 ppm ) .
En algunas realizaciones, la Forma B-HC1 se caracteriza por un espectro de 13C NMR en estado sólido que se muestra en la Figura 17.
En algunas realizaciones, la Forma B-HCl se caracteriza por uno o más de los siguientes picos medidos en partes por millón (ppm) en un espectro de 19F NMR en estado sólido: un pico de aproximadamente -55,4 a aproximadamente -55,8 (por ejemplo, aproximadamente -55,6 ppm) y un pico de aproximadamente -61,8 a aproximadamente -62,2 ppm (por ejemplo, aproximadamente -62,0 ppm).
En algunas realizaciones, la Forma B-HCl se caracteriza por un espectro de 19F NMR en estado sólido que se muestra en la Figura 18.
En otras realizaciones adicionales, la Forma B-HCl se caracteriza por el espectro FTIR que se proporciona en la Figura 16.
En un aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la Forma A-HCl, la Forma B, la Forma B-HCl o cualquier combinación de las mismas y un adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable .
En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para tratar una enfermedad mediada por CFTR en un humano que comprende administrar al humano una cantidad efectiva de la Forma A-HCl, la Forma B, la Forma B-HCl o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, el método comprende administrar un agente terapéutico adicional.
En algunas realizaciones, la enfermedad se selecciona de fibrosis quistica, pancreatitis, sinusitis, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de coagulación - fibrinólisis , tal como deficiencia de proteina C, angioedema hereditario tipo 1, deficiencias de procesamiento de lipidos, tales como hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia tipo .1, abetalipoproteinemi , enfermedades de almacenamiento lisosomal, tales como enfermedad de las células de inclusión/pseudo-Hurler , mucopolisacaridosis , enfermedad de Sandhof/Tay-Sachs , síndrome de Crigler-Na jar tipo II, poliendocrinopatía/hiperinsulemia , diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiencia de mieloperoxidasa, hipoparatiroidismo primario, melanoma, síndrome de glicoproteínas deficientes en carbohidratos tipo 1, enfisema hereditario, hipertiroidismo conqénito, osteogénesis imperfecta, hipofibrinogenemia hereditaria, deficiencia de ACT, diabetes insípida (DI), DI neurogénica, DI nefrogénica, síndrome de Charcot-Marie Tooth , enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher , enfermedades neurodegenerativas tales co o enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkínson, esclerosis lateral amiotróf ica , parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, varios trastornos neurológicos de poliglutamina tales como enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia dentatorubro palidoluysiana y distrofia miotónica, así como encefalopatías espongiformes, tales como enfermedad de Creutzfeldt-Jakob hereditaria, enfermedad de Fabry, síndrome de Straussler-Scheinker , EPOC, enfermedad del ojo seco, insuficiencia pancreática, osteoporosis , osteopenia, síndrome de Gorham, canalopatías de cloruro, miotonía congénita (formas de Thomson y Becker), síndrome de Bartter tipo III, enfermedad de Dent, hiperekplexia , epilepsia, hiperekplexia, enfermedad de almacenamiento lisosomal, síndrome de Angelman, discinesia ciliar primaria (PCD), PCD con situs inversus (también denominada síndrome de Kartagener), PCD sin situs inversus y aplasia ciliar y enfermedad de Sjógren.
En una realización, la presente invención proporciona un método para tratar la fibrosis quística en un humano que comprende administrar a dicho humano una cantidad efectiva de la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HCl o cualquier combinación de las mismas.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un envase o kit farmacéutico que comprende la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HCl o cualquier combinación de estas formas, y un portador farmacéuticamente aceptable .
Otros aspectos de la invención Usos, formulación y administración Composiciones farmacéuticamente aceptables En un aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticamente aceptables, en donde dichas composiciones comprenden la Forma A-HC1, Forma B o Forma B-HC1 como se describe en la presente, y opcionalmente comprenden un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, estas composiciones opcionalmente comprenden también uno o más agentes terapéuticos adicionales .
Como se describió anteriormente, las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención comprenden adicionalmente un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable que, tal como se utiliza en la presente, incluye cualquier disolvente, diluyente u otro vehículo líquido, ayudas de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos , agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según sea adecuado para la dosificación particular deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences, Decimosexta Edición, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) divulga varios portadores usados en la formulación de composiciones farmacéuticamente aceptables y técnicas conocidas para la preparación de las mismas. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los componentes de la invención, tal como en caso de que produzca algún efecto biológico o que interactúe de otra forma en una manera perjudicial para cualquier otro componente de la composición farmacéuticamente aceptable, se contempla el uso del mismo dentro del alcance de la presente invención. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, a modo no taxativo, agentes de intercambio de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero, tal como albúmina de suero humano, sustancias tamponadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico o sorbato de potasio, mezclas de glicérido parciales de ácidos grasos vegetales, agua, sales o electrólitos, tales como sulfato de protamina, fosfato de hidrógeno disódico, fosfato de hidrógeno de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidina , poliacrilatos , ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno , lanolina, azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa , etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras en forma de supositorios; aceites tales como aceite de maíz, aceite de colza; aceite de girasol; aceite de sésamo; aceite de oliva y aceite de soja; glicoles; tales como propilenglicol o polietilenglicol ; esteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponadores tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico y soluciones amortiguadoras de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes, también pueden estar presentes en la composición, de acuerdo con el criterio del formulador.
Usos de compuestos y composiciones farmacéuticamente aceptables En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de una afección, enfermedad o trastorno implicado por la mutación del CFTR. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para tratar una afección, enfermedad o trastorno implicado por una deficiencia de la actividad del CFTR, comprendiendo el método administrar una composición que comprende: La Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HCl o cualquier combinación de estas formas como se describe en la presente, a un sujeto, preferiblemente a un mamífero, que lo necesita.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para tratar enfermedades asociadas con una función reducida del CFTR debido a mutaciones en el gen que codifica el CFTR o factores ambientales (por ejemplo, tabaquismo). Estas enfermedades incluyen fibrosis quistica, asma, EPOC inducida por tabaquismo, bronquitis crónica, rinosinusitis , constipación, pancreatitis, insuficiencia pancreática, infertilidad masculina causada por la ausencia bilateral congénita de vasos deferentes (CBAVD), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA), enfermedad hepática, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, trastornos de coagulación y fibrinólisis , tal como deficiencia de proteína C, angioedema hereditario tipo 1, trastornos de procesamiento de lípidos, tal como hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia tipo 1, abetalipoproteinemia , enfermedades de almacenamiento lisosomal, tal como enfermedad de las células de inclusión/pseudo-Hurler, mucopolisacaridosis , enfermedad de Sandhoff/Tay-Sachs , síndrome de Crigler-Naj jar tipo II, poliendocrinopatía/hiperinsulemia , diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiencia de mieloperoxidasa , hipoparatiroidismo primario, melanoma, síndrome de glicoproteinas deficientes en carbohidratos tipo 1, hipertiroidismo congénito, osteogénesis imperfecta, hipofibrinogenemia hereditaria, deficiencia de ACT, diabetes insípida (DI), DI neurogénica (central), DI nefrogénica, síndrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedades neurodegenerativas, tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, diversos trastornos neurológicos relacionados con la poliglutamina , tal como enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia dentatorubro palidoluysiana y distrofia miotónica, así como encefalopatías espongiformes, tal como enfermedad de Creutzfeldt-Jakob hereditaria (debido a un defecto en el procesamiento de la proteína prión), enfermedad de Fabry, síndrome de Straussler-Scheinker , EPOC, enfermedad del ojo seco o enfermedad de Sjogren, osteoporosis , osteopenia, cicatrización ósea y crecimiento óseo (incluida la reparación ósea, regeneración ósea, reducción de la absorción ósea y aumento de la deposición ósea), síndrome de Gorham, canalopatías de cloruro, tal como miotonía congénita (formas de Thomson y Becker), síndrome de Bartter tipo III, enfermedad de Dent, hiperekplexia, epilepsia, hiperekplexia , enfermedad de almacenamiento lisosomal, síndrome de Angelman, discinesia ciliar primaria (PCD), trastornos heredados de la estructura y/o función de los cilios, incluido PCD con situs inversus (también denominada síndrome de Kartagener) , PCD sin situs inversus y aplasia ciliar.
En algunas realizaciones, el método incluye tratar o reducir la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En ciertas realizaciones, el paciente posee formas mutantes del CFTR humano. En otras realizaciones, el paciente posee una o más de las siguientes mutaciones AF508, R117H y G551D del CFTR humano. En una realización, el método incluye tratar o reducir de la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación AF508 de CFTR humano que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En una realización, el método incluye tratar o reducir de la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación G551D de CFTR humano que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En una realización, el método incluye tratar o reducir de la gravedad de la fibrosis quistica en un paciente que posee la mutación AF508 de CFTR humano en al menos en un alelo que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En una realización, el método incluye tratar o reducir de la gravedad de la fibrosis quistica en un paciente que posee la mutación AF508 de CFTR humano en ambos alelos que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En una realización, el método incluye tratar o reducir de la gravedad de la fibrosis quistica en un paciente que posee la mutación G551D de CFTR humano al menos en un alelo que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En una realización, el método incluye tratar o reducir de la gravedad de la fibrosis quistica en un paciente que posee la mutación G551D de CFTR humano en ambos alelos que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente.
En algunas realizaciones, el método incluye reducir de la gravedad de la fibrosis quistica en un paciente, que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En ciertas realizaciones, el paciente posee formas mutantes de CFTR humano. En otras realizaciones, el paciente posee una o más de las siguientes mutaciones ñF508, R117H y G551D de CFTR humano. En una realización, el método incluye reducir de la gravedad de la fibrosis quistica en un paciente que posee la mutación AF508 de CFTR humano que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En una realización, el método incluye reducir de la gravedad de la fibrosis quistica en un paciente que posee la mutación G551D de CFTR humano que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En una realización, el método incluye reducir de la gravedad de la fibrosis quistica en un paciente que posee la mutación AF508 de CFTR humano al menos en un alelo que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En una realización, el método incluye reducir de la gravedad de la fibrosis quistica en un paciente que posee la mutación ñF508 de CFTR humano en ambos alelos que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En una realización, el método incluye reducir de la gravedad de la fibrosis quistica en un paciente que posee la mutación G551D de CFTR humano al menos en un alelo que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente. En una realización, el método incluye reducir de la gravedad de la fibrosis quística en un paciente que posee la mutación G551D de CFTR humano en ambos alelos que comprende administrar a dicho paciente una de las composiciones como se definen en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método de tratamiento o reducción de la gravedad de la osteoporosis en un paciente que comprende administrar a dicho paciente el Compuesto I como se describe en la presente .
En ciertas realizaciones, el método de tratamiento o reducción de la gravedad de la osteoporosis en un paciente comprende administrar a dicho paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método de tratamiento o reducción de la gravedad de la osteoporosis en un paciente que comprende administrar a dicho paciente el Compuesto I como se describe en la presente .
En ciertas realizaciones, el método de tratamiento o reducción de la gravedad de la osteopenia en un paciente comprende administrar a dicho paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método de cicatrización ósea y/o reparación ósea en un paciente que comprende administrar a dicho paciente el Compuesto I como se describe en la presente.
En ciertas realizaciones, el método de cicatrización ósea y/o reparación ósea en un paciente comprende administrar a dicho paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método de reducción de la resorción ósea en un paciente que comprende administrar a dicho paciente el Compuesto I como se describe en la presente.
En ciertas realizaciones, el método de reducción del a resorción ósea en un paciente comprende administrar a dicho paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método de aumento de deposición ósea en un paciente que comprende administrar a dicho paciente el Compuesto I como se describe en la presente.
En ciertas realizaciones, el método de aumento de la deposición ósea en un paciente comprende administrar a dicho paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método de tratamiento o reducción de la gravedad de EPOC en un paciente que comprende administrar a dicho paciente el Compuesto I como se describe en la presente.
En ciertas realizaciones, el método de tratamiento o reducción de la gravedad de EPOC en un paciente comprende administrar a dicho paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método de tratamiento o reducción de la gravedad de EPOC inducida por tabaquismo en un paciente que comprende administrar a dicho paciente el Compuesto I como se describe en la presente.
En ciertas realizaciones, el método de tratamiento o reducción de la gravedad de EPOC inducida por tabaquismo en un paciente comprende administrar a dicho paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método de tratamiento o reducción de la gravedad de bronquitis crónica en un paciente que comprende administrar a dicho paciente el Compuesto I como se describe en la presente.
En ciertas realizaciones, el método de tratamiento o reducción de la gravedad de la bronquitis crónica en un paciente comprende administrar a dicho paciente una composición farmacéutica como se describe en la presente.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para tratar enfermedades asociadas con la función normal del CFTR. Estas enfermedades incluyen enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), bronquitis crónica, bronquitis recurrente, bronquitis aguda, rinosinusitis , constipación, pancreatitis incluida pancreatitis crónica, pancreatitis recurrente y pancreatitis aguda, insuficiencia pancreática, infertilidad masculina causada por ausencia bilateral congénita de vasos deferentes (CBAVD), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopática, enfermedad hepática, enfisema hereditario, litiasis biliar, enfermedad de reflujo gastroesofágico , malignidades gastrointestinales, enfermedad intestinal inflamatoria, constipación, diabetes, artritis, osteoporosis y osteopenia .
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para tratar enfermedades asociadas con la función normal del CFTR incluida hemocromatosis hereditaria, deficiencias de coagulación-fibrinólisis , tal como deficiencia de la proteína C, angioedema hereditaria Tipo 1, deficiencias de procesamiento de lípidos, tal como hipercolesterolemia, quilomicronemia Tipo I, abetalipoproteinemia, enfermedades de almacenamiento lisosomal tal como enfermedad de células I /pseudo-Hurler , mucopolisacáridosis , Sandhof /Tay-Sachs , Crigler-Naj ar tipo II, poliendocrinopatia/hiperinsulemia , Diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiencia de mileoperoxidasa, hipoparatiroidismo primario, melanoma, síndrome de glicoproteínas deficientes en carbohidratos tipo 1, hipertiroidismo congénito, osteogénesis imperfecta, hipofibrinogenemia hereditaria, deficiencia de ACT, diabetes insípida (DI), DI neurogénica, DI neprogénica, síndrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedades neurodegenerativas, tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, diversos trastornos neurológicos relacionados con la poliglutamina, tal como enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, atrofia dentatorubro palidoluysiana y distrofia miotónica, así como encefalopatías espongiformes, tal como enfermedad de Creutzfeldt-Jakob hereditaria (debido a un defecto en el procesamiento de la proteína prión) , enfermedad de Fabry, síndrome de Straussler-Scheinker , Síndrome de Gorham, canalopatías de cloruro, miotonía congénita (formas de Thomson y Becker), síndrome de Bartter tipo III, enfermedad de Dent, hiperekplexia, epilepsia, hiperekplexia , enfermedad de almacenamiento lisosomal, síndrome de Angelman, discinesia ciliar primaria (PCD), PCD con situs inversus (también denominada síndrome de Kartagener), PCD sin situs inversus y aplasia ciliar o Síndrome de Sjógren, que comprende la etapa de administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HC1 o una combinación de estas formas, como se describe en la presente.
De acuerdo con una realización preferida alternativa, la presente invención proporciona un método de tratamiento de la fibrosis quística que comprende la etapa de administrar a dicho mamífero una composición que comprende la etapa de administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de una composición que comprende la Forma A-HC1, Forma B, Forma B-HC1, o cualquier combinación de estas formas, descrita en la presente.
De acuerdo con la invención una "cantidad efectiva" de la Forma A-HCl, Forma B, Forma B-HC1, cualquier combinación de estas formas o una composición farmacéuticamente aceptable es que la cantidad efectiva para tratar o disminuir la gravedad de una o más de las enfermedades, trastornos o afecciones como se describen anteriormente .
La Forma A-HCl, la Forma B, la Forma B-HC1 o cualquier combinación de estas formas o una composición farmacéuticamente aceptable de las mismas pueden administrarse usando cualquier cantidad y cualquier via de administración efectiva para tratar o disminuir la gravedad de una o más enfermedades, trastornos o afecciones como se indica anteriormente.
En ciertas realizaciones, la Forma A-HC1, Forma B, Forma B-HC1, cualquier combinación de estas formas o una composición farmacéuticamente aceptable de las mismas es útil para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quistica en pacientes que exhiben actividad residual del CFTR en la membrana apical de epitelios respiratorios y no respiratorios. La presencia de actividad residual del CFTR en la superficie epitelial se puede detectar fácilmente usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, técnicas estándar electrofisiológicas , bioquímicas o histoquímicas . Dichos métodos identifican la actividad del CFTR usando técnicas electrofisiológicas in vivo o ex vivo, medición de concentraciones de Cl" en el sudor o la salivación, o técnicas bioquímicas o histoquímicas ex vivo para monitorear la densidad de la superficie celular. Usando dichos métodos, la actividad residual del CFTR puede detectarse fácilmente en pacientes heterocigotos u homocigotos para una variedad de mutaciones diferentes, incluidos pacientes homocigotos o heterocigotos para la mutación más común, AF508.
En otra realización, la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HC1 o cualquier combinación de estas formas descritas en la presente o una composición farmacéuticamente aceptable de las mismas es útil para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quistica en pacientes que tienen actividad del CFTR residual inducida o aumentada usando métodos farmacológicos o terapia de genes. Dichos métodos aumentan la cantidad de CFTR presente en la superficie celular, induciendo asi una actividad del CFTR ausente hasta el momento en un paciente o aumentando el nivel existente de actividad residual del CFTR residual en un paciente.
En una realización, la Forma A-HC1, Forma B, Forma B-HC1 o cualquier combinación de estas formas, descrita en la presente, o una composición farmacéuticamente aceptable, es útil para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quistica en pacientes con determinados genotipos que exhiben actividad residual del CFTR, por ejemplo, mutaciones de clase III (regulación o abertura defectuosa), mutaciones de clase IV (conductancia alterada) o mutaciones de clase V (síntesis reducida) (Lee R. Choo-Kang, Pamela L., Zeitlin, Type I, II, III, IV, and V cystic fibrosis Tansmembrane Conductance Regulator Defects and Opportunities of Therapy; Current Opinión in Pulmonary Medicine 6:521 - 529,2000). Otros pacientes cuyos genotipos exhiben actividad residual del CFTR incluyen pacientes homocigotos con una de estas clases o heterocigotos con cualquier otra clase de mutaciones, incluidas las mutaciones de clase I, las mutaciones de clase II o una mutación que carezca de clasificación .
En una realización, la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HC1 o una combinación de estas formas descrita en la presente o una composición farmacéuticamente aceptable de la misma, es útil para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en pacientes con determinados fenotipos clínicos, por ejemplo, un fenotipo clínico moderado a leve que generalmente se correlaciona con la cantidad de actividad residual del CFTR en la membrana apical del epitelio. Dichos fenotipos incluyen pacientes que exhiben insuficiencia pancreática o pacientes a los que se les diagnosticó pancreatitis idiopática y ausencia bilateral congénita de los vasos deferentes o enfermedad pulmonar leve.
La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad y condición general del sujeto, la gravedad de la infección, el agente particular, su modo de administración y aspectos similares. Los compuestos de la invención se formulan preferiblemente en formas de dosificación unitarias para lograr una fácil administración y uniformidad de dosificación. La expresión "forma de dosificación unitaria", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una unidad físicamente específica de un agente adecuado para el paciente a ser tratado. No obstante, se entenderá que el médico tratante determinará el uso total diario de los compuestos y composiciones de la presente invención según un criterio médico razonable. El nivel de dosificación efectivo específico para un paciente u organismo particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del mismo; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o coincidencia con el compuesto específico empleado, y factores similares bien conocidos en la medicina. Tal como se utiliza en la presente, el término "paciente" se refiere a un animal, preferiblemente, un mamífero, y más preferiblemente, un ser humano.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden administrarse a humanos y otros animales por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal , intravaginal , intraperitoneal , tópica (como por medio de polvos, ungüentos, gotas o parche), bucal, tal como pulverización oral o nasal, o similares, dependiendo de la gravedad de la infección que se está tratando. En ciertas realizaciones, los compuestos de la invención pueden administrarse por vía oral o parenteral en niveles de dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg y preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado.
Las formas de dosificación líquida para administración oral incluyen, a modo no taxativo, emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones , soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquida pueden contener diluyentes comúnmente utilizados en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico , carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato bencílico, propilenglicol , 1 , 3-butilenglicol , dimetilformamaida , aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, maní, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico , polietilenglicoles y ésteres ácidos grasos de sorbitano y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes .
Preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones inyectables estériles acuosas u oleaginosas pueden formularse de acuerdo con la técnica conocida utilizando agentes dispersantes o agentes humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteral aceptable no tóxico, como por ejemplo, una solución en 1 , 3-butanodiol . Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución de cloruro de sodio isotónica. Adicionalmente, convencionalmente se utilizan aceite estériles, fijos como un disolvente o medio de suspensión. Con este propósito, puede utilizarse cualquier aceite fijo suave incluyendo mono o diglicéridos sintéticos.
Adicionalmente, los ácidos grasos tales como ácido oleico se usan en la preparación de inyectables.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención bacteriana o incorporando agentes de esterilización en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Con el fin de prolongar el efecto de un compuesto de la presente invención, a menudo es deseable ralentizar la absorción del compuesto de inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse por medio del uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. La tasa de absorción del compuesto depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retrasada de una forma de fármaco administrado por parenteralmente se logra disolviendo o suspendiendo el compuesto en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectable se realizan formando matrices microencapsulados del compuesto en polímeros biodegradables tal como poliláctido-poliglicólido . Dependiendo de la relación entre el compuesto y el polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, la tasa de liberación del compuesto puede controlarse. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli ( ortoésteres ) y poli ( anhídridos ) . Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan colocando el compuesto en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejidos corporales.
Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden prepararse mezclando los compuestos de la presente invención con excipientes o portadores no irritantes adecuados tal como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera en forma de supositorio que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a temperatura corporal y por lo tanto se funden en el recto o en la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.
Las formas de dosificación sólida para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, pildoras, polvos y gránulos. En dichas formas de dosificación sólida, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable inerte tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o a) rellenos o extensores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa , alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y acacia, c) humectantes tal como glicerol, d) agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o tapioca, ácido alginico, ciertos silicatos y carbonato de calcio, e) agentes retardadores de solución tal como parafina, f) aceleradores de absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita y i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y pildoras, la forma de dosificación también puede comprender agentes tamponadores .
Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden emplearse como rellenos en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes como lactosa o azúcar derivada de la leche así como polietilenglicoles de peso molecular alto y similares. Las formas de dosificación sólida de comprimidos, grageas, cápsulas, pildoras y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y revestimientos tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Éstas pueden contener opcionalmente agentes bloqueadores de luz y pueden ser también de una composición que libere sólo el ingrediente activo o, preferiblemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente , de manera retardada. Ejemplos de composiciones de fijado que pueden utilizarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. Las composiciones sólidas de tipo similar también pueden emplearse como rellenos en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes como lactosa o azúcar derivada de la leche asi como polietilenglicoles de peso molecular alto y similares.
Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada con uno o más excipientes como se indicó anteriormente. Las formas de dosificación sólida de comprimidos, grageas, cápsulas, pildoras y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y revestimientos tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos para control de liberación y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. En dichas formas de dosificación sólida el compuesto activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas de dosificación sólida también pueden comprender, como sucede en la práctica normal, sustancias adicionales que no sean diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes en comprimidos y otros auxiliares en comprimidos tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina . En el caso de cápsulas, comprimidos y pildoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponadores . Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes bloqueadores de luz y pueden ser también de una composición que libere sólo el ingrediente activo o, preferiblemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Ejemplos de composiciones de fijado que pueden utilizarse incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Las formas de dosificación para administración tópica o transdérmica de un compuesto de la presente invención incluyen ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, inhaladores o parches. El componente activo se mezcla en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o solución amortiguadora necesaria, según sea requerido. También se contempla que formulaciones oftálmicas, gotas para los oídos y gotas para los ojos se encuentran dentro del alcance de la invención. Además, la presente invención contempla el uso de parches transdérmicos , que agregaron la ventaja de proporcionar administración controlada de un compuesto al cuerpo. Dichas formas de dosificación se preparan disolviendo o dispensando el compuesto en el medio apropiado. También pueden utilizarse potenciadores de absorción para aumentar el flujo del compuesto en la piel. La tasa puede controlarse proporcionando una membrana de control de tasa o dispersando el compuesto en un matriz polimérico o gel .
También se apreciará que la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HC1 o cualquier combinación de las mismas descritas en la presente o una composición farmacéuticamente aceptable de las mismas pueden emplearse en terapias de combinación, es decir, la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HC1 o cualquier combinación de las mismas descritas en la presente o una composición farmacéuticamente aceptable de las mismas, se pueden administrar simultáneamente, anteriormente o posteriormente a uno o más de los procedimientos terapéuticos y médicos deseados. La combinación particular de terapias (tratamientos o procedimientos) a emplearse en un régimen de combinación tomará en cuenta la compatibilidad del tratamiento y/o procedimiento deseado y el efecto terapéutico que se desea lograr. Asimismo, se apreciará que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, se puede administrar un compuesto de la invención simultáneamente con otro agente usado para tratar el mismo trastorno) o pueden lograr efectos diferentes (por ejemplo, control de cualquier efecto adverso). Tal como se utiliza en la presente, los agentes terapéuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o prevenir una enfermedad en particular se conocen como "adecuados para la enfermedad o trastorno que se está tratando".
En una realización, el agente adicional se selecciona de un agente mucolitico, un broncodilatador , un antibiótico, un agente antiinfeccioso, un agente antiinflamatorio, un modulador del CFTR que no sea un compuesto de la presente invención o un agente nutricional .
En una realización, el agente adicional es un antibiótico. Los ejemplos de antibióticos útiles en la presente incluyen tobramicina, incluida tobramicina en polvo para inhalación (TIP), azitromicina, aztreonam, incluyendo la forma en aerosol de aztreonam, amikacina, incluidas formulaciones liposomales de la misma, ciprofloxacina , incluidas formulaciones de la misma adecuadas para administrar por inhalación, levofloxacina, incluidas formulaciones en aerosol de la misma, y combinaciones de dos antibióticos, por ejemplo, fosfomicina y tobramicina.
En otra realización, el agente adicional es un mucolitico. Los ejemplos de mucolíticos útiles en la presente incluyen Pulmozyme®.
En otra realización, el agente adicional es un broncodilatado . Los ejemplos de broncodilatadores incluyen albuterol, sulfato de metaproterenol , acetato de pirbuterol, salmeterol o sulfato de tetrabulina.
En otra realización, el agente adicional es efectivo para restablecer el líquido superficial de las vías respiratorias pulmonares. Dichos agentes mejoran el movimiento de la sal hacia afuera y hacia adentro de las células, permitiendo que la mucosidad en las vías respiratorias esté más hidratada y, por lo tanto, se pueda desobstruir más fácilmente. Los ejemplos de dichos agentes incluyen solución salina hipertónica, denufosol tetrasódico ([[(3S,5R)-5- ( 4-amino-2-oxopirimidin-l-il ) -3-hidroxioxolan-2-il Jmetoxi-hidroxifosforil ] [ [ [ ( 2R, 3S, 4R, 5R) -5- ( 2 , 4-dioxopirimidin-l-il ) -3 , 4 , 4-dihidroxioxolan-2-il ]metoxi-hidroxifosforil ] oxi-hidroxifosforil ] hidrógeno fosfato) o bronquitol (formulación para inhalar de manitol).
En otra realización, el agente adicional es un agente antiinflamatorio, es decir, un agente que puede reducir la inflamación en los pulmones. Los ejemplos de dichos agentes útiles en la presente incluyen ibuprofeno, ácido docosahexaenoico (DHA) , sildenafil, glutationa inhalada, pioglitazona , hidroxicloroquina o simavastatina .
En otra realización, el agente adicional reduce la actividad del bloqueador del canal de sodio epitelial (ENaC) directamente o bloqueando el canal o indirectamente por la modulación de proteasas que producen un aumento en la actividad del ENaC (por ejemplo, proteasas de seina, proteasas de activación de canal). Ejemplos de dichos agentes incluyen camostat (un inhibidor de proteasa similar a la tripsina), QAU145, 552-02, GS-9411, INO-4995, Aerolitico y amilorida. Agentes adicionales que reducen la actividad del bloqueador del canal de sodio epitelial (ENaC) se pueden encontrar, por ejemplo, en la Publicación PCT No. WO2009/074575 , cuyo contenido se incorpora a la presente en su totalidad.
Entre otras enfermedades descritas en la presente, combinaciones de moduladores de CFTR, tales como Forma B, Forma B-HC1 y Forma A-HC1 y agentes que reducen la actividad del ENaC se usan para tratar el síndrome de Liddle, una afección inflamatoria o alérgica que incluye fibrosis quística, discinesia ciliar primaria, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, carcinoma de pulmón, xerostomía y queratocon untivitis seca, infecciones del tracto respiratorio (agudas y crónicas; virales y bacterianas) y carcinoma de pulmón.
Combinaciones de moduladores de CFTR, tal como Forma B, Forma B-HC1 y Forma A-HC1 y agentes que reducen la actividad de EnaC, también son útiles para tratar enfermedades mediadas por el bloqueo del canal de sodio epitelial que también incluyen enfermedades que no sean enfermedades respiratorias que estén asociadas con la regulación de fluido anormal en el epitelio, que implican tal vez la fisiología de los líquidos superficiales protectores sobre su superficie, por ejemplo, xerostomía (boca seca) o queratoconjuntivitis seca (ojo seco). Asimismo, el bloqueo del canal de sodio epitelial en el riñon podría utilizarse para promover diuresis e inducir así un efecto hipotensivo.
Asma incluye asma intrínseco (no alérgico) y asma extrínseco (alérgico), asma leve, asma moderado, asma grave, asma bronquítico, asma inducido por ejercicio, asma ocupacional y asma inducido luego de infección bacteriana. El tratamiento del asma también se comprende que abarca el tratamiento de sujetos, por ejemplo, de menos de 4 o 5 años de edad, que exhiben síntomas de sibilancia y son diagnosticados o pueden ser diagnosticados como "lactantes sibilantes", una categoría de pacientes establecida de gran preocupación médica y que a menudo se identifican como asmáticos incipientes o de fase temprana. (Para conveniencia, se hace referencia a esta afección asmática particular como "síndrome de lactante sibilante".) La eficacia en el tratamiento del asma se evidenciará por medio de frecuencia reducida o gravedad del ataque sintomático, por ejemplo, de ataque asmático agudo o broncoconstrictor , mejora en la función pulmonar o hiperreactividad mejorada de las vías respiratorias. También puede evidenciarse por una menor necesidad de otra terapia sintomática, es decir, terapia para o dirigida a restringir o suspender el ataque sintomático cuando ocurre, por ejemplo, antiinflamatoria (por ejemplo, corticoesteroide ) o broncodilatadora . El beneficio profiláctico en el asma puede, en particular, ser aparente en sujetos propensos a "descenso matutino". El "descenso matutino" es un síndrome asmático reconocido común para un porcentaje importante de asmáticos y caracterizado por ataque de asma, por ejemplo, entre aproximadamente las 4-6 am, es decir, a una hora normalmente muy distante de cualquier terapia de asma sintomática administrada previamente.
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica incluye bronquitis crónica o disnea asociada con la misma, enfisema, así como la exacerbación de las hiperreactividad de las vías respiratorias derivada de otra terapia con fármacos, en particular, otra terapia con fármacos de inhalación. En algunas realizaciones, las combinaciones de los moduladores del CFTR, tal como Forma B, Forma B-HCl y Forma A-HCl, y agentes que reducen la actividad del ENaC, son útiles para el tratamiento de bronquitis de cualquier tipo o género incluida, por ejemplo, bronquitis aguda, araqu dica, catarral, croupus, crónica o ftinoide.
En otra realización, el agente adicional es un modulador del CFTR que no sea la Forma B, Forma B-HCl y Forma A-HCl, es decir, un agente que tenga el efecto de modular la actividad del CFTR. Los ejemplos de dichos agentes incluyen ataluren ("PTC124®"; ácido 3-[5-(2-f luorofenil ) -1 , 2 , 4-oxadiazol-3-il ] benzoico) , sinapultida , lancovutida, depelestat (un inhibidor recombinante de la elastasa neutrofílica humana), cobiprostona (ácido 7-{(2R, 4aR, 5R, 7aR)-2-[ (3S)-1, 1-difluoro-3-metilpentil ] -2-hidroxi-6-oxooctahidrociclopenta[ b ] piran- 5-il}heptanoico) o ácido ( 3- ( 6- ( 1- ( 2 , 2-difluorobenzo [d ] [1,3] dioxol-5-i1 ) ciclopropanocarboxamido ) -3-metilpiridin-2-il ) benzoico . En otra realización, el agente adicional es ácido ( 3 - ( 6 - ( 1 - ( 2 , 2-dif luorobenzo [ d ] [1,3] dioxol-5-il ) ciclopropanocarboxamido ) -3-metilpiridin-2-il ) benzoico .
En otra realización, el agente adicional es un agente nutricional. Los ejemplos de dichos agentes incluyen pancrelipasa (reemplazo de enzimas pancreáticas), incluidas Pancrease®, Pancreacarb® , Ultrase®, o Creon®, Liprotomase® (anteriormente Trizytek®), Aquadeks®, o inhalación de glutationa. En una realización, el agente nutricional adicional es un pancrelipasa .
En una realización, el agente adicional es un modulador del CFTR que no sea un compuesto de la presente invención .
La cantidad de agente terapéutico adicional presente en las composiciones de esta invención no será superior a la cantidad que normalmente se administraría en una composición que comprende el agente terapéutico como el único agente activo. Preferiblemente, la cantidad de agente terapéutico adicional en las composiciones descritas en la presente variará de aproximadamente 50% a 100% de la cantidad normalmente presente en una composición que comprenda dicho agente como el único agente terapéuticamente activo.
La Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HCl o cualquier combinación de las mismas descrita en la presente o una composición farmacéuticamente aceptable de las mismas también pueden incorporarse en composiciones para recubrir un dispositivo médico implantable, tal como prótesis, válvulas artificiales, injertos vasculares, stents y catéteres. Por consiguiente, la presente invención en otro aspecto incluye una composición para recubrir un dispositivo implantable que comprende un compuesto de la presente invención como se describe en general anteriormente, y en las clases y subclases en la presente y un portador adecuado para recubrir dicho dispositivo implantable. En otro aspecto adicional, la presente invención incluye un dispositivo implantable recubierto con una composición que comprende un compuesto de la presente invención como se describe en general anteriormente, y en las clases y subclases en la presente y un portador adecuado para recubrir dicho dispositivo implantable. Recubrimientos adecuados y la preparación general de dispositivos implantables recubiertos se describen en las Patentes de los Estados Unidos 6.099.562; 5.886.026; y 5.304.121. Los recubrimientos son típicamente materiales poliméricos biocompatibles tales como polímero de hidrogel, polimetildisiloxano , policaprolactona , polietilenglicol , ácido poliláctico, acetato de etileno-vinilo y mezclas de los mismos. Los recubrimientos pueden cubrirse además opcionalmente por un recubrimiento superior adecuado de fluorosilicona , polisacáridos , polietilenglicol, fosfolípidos o combinaciones de los mismos para impartir características de liberación controlada en la composición.
Otro aspecto de la invención se refiere a modular la actividad del CFTR en una muestra biológica o un paciente (por ejemplo, in vitro o in vivo), cuyo método comprende administrar a un paciente o poner en contacto dicha muestra biológica con la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HC1 o cualquier combinación de las mismas descritas en la presente o una composición farmacéuticamente aceptable de las mismas. La frase "muestra biológica", tal como se utiliza en la presente, incluye, a modo no taxativo, cultivos celulares o extractos de los mismos; material de biopsia obtenido de un mamífero o extractos del mismo; y sangre, saliva, orina, heces, semen, lágrimas u otros fluidos corporales o extractos de los mismos.
La modulación del CFTR en una muestra biológica es útil para una variedad de fines que son conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de dichos fines incluyen, a modo no taxativo, el estudio de CFTR en fenómenos biológicos y patológicos; y la evaluación comparativa de nuevos moduladores del CFTR.
En otra realización adicional, se proporciona un método para modular la actividad de un canal de aniones in vitro o in vivo, que comprende la etapa de poner en contacto dicho canal con la Forma A-HC1, la Forma B , la Forma B-HC1 o cualquier combinación de las mismas descrita en la presente o una composición farmacéuticamente aceptable de las mismas. En realizaciones preferidas, el canal de aniones es un canal de cloruro o un canal de bicarbonato. En otras realizaciones preferidas, el canal de aniones es un canal de cloruro.
De acuerdo con una realización alternativa, la presente invención proporciona un método para aumentar el número de CFTR funcional en una membrana de una célula, que comprende la etapa de poner en contacto dicha célula con la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HC1 o cualquier combinación de las mismas descrita en la presente o una composición farmacéuticamente aceptable de las mismas .
De acuerdo con otra realización preferida, la actividad del CFTR se mide midiendo el potencial del voltaje de transmembrana. Los medios para la medición del potencial de voltaje en una membrana en la muestra biológica pueden emplear cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, tal como un ensayo del potencial de membrana u otros métodos electrofisiológicos .
El ensayo óptico de potencial de membrana utiliza sensores FRET sensibles al voltaje descritos por González y Tsien (ver González, J. E. and R. Y. Tsien (1995) "Voltage sensing by fluorescencé resonance energy transfer in single cells" Biophys J 69(4): 1272-80, y González, J. E. y R. Y. Tsien (1997) "Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescence resonance energy transfer" Chem Biol 4(4): 269-77) en combinación con instrumentos para medir los cambios de fluorescencia como, por ejemplo, una sonda lectora de voltaje e iones (VIPR) (ver, González, J. E., K. Oades, et al. (1999) "Cell-based assays and instrumentation for screening ion-channel targets" Drug Discov Today 4(9): 431-439) .
Estos ensayos sensibles al voltaje están basados en el cambio en la transferencia de energia por resonancia fluorescente (FRET) entre el tinte sensible al voltaje y soluble en membrana, DiSBAC2(3) y un fosfolipido fluorescente, CC2-DMPE que está adjunto en el prospecto externo de la membrana plasmática y actúa como donante de FRET. Los cambios en el potencial de la membrana (Vm) hacen que el DiSBAC2(3) con carga negativa se redistribuya por la membrana plasmática, haciendo que también cambie la cantidad de transferencia de energia de CC2-DMPE. Los cambios en la emisión de fluorescencia pueden monitorearse usando un VIPR™ II, que es un aparato integrado para manipular líquidos y detector de fluorescencia, diseñado para llevar a cabo detecciones sistemáticas en base a células en placas de microtitulación de 96 o 384 pocilios.
En otro aspecto de la presente invención se proporciona un kit para usar en la medición de la actividad del CFTR o un fragmento del mismo en una muestra biológica in vitro o in vivo que comprende (i) una composición que comprende la Forma A-HCl, la Forma B, la Forma B-HCl o cualquier combinación de las mismas o cualquiera de las realizaciones anteriores; e (ii) instrucciones para a) poner en contacto la composición con la muestra biológica y b) medir la actividad de dicho CFTR o un fragmento del mismo. En una realización, el kit comprende además instrucciones para a) poner en contacto un compuesto adicional con la muestra biológica; b) medir la actividad de dicho CFTR o un fragmento del mismo en presencia de dicho compuesto adicional, y c) comparar la actividad del CFTR en presencia del compuesto adicional con la actividad del CFTR en presencia de la Forma A-HCl, la Forma B, la Forma B-HCl o cualquier combinación de las mismas descrita en la presente. En una realización, la etapa de comparación de la actividad de dicho CFTR o un fragmento del mismo proporciona una medida de la densidad de dicho CFTR o un fragmento del mismo. En realizaciones preferidas, el kit se usa para medir la densidad del CFTR.
En un aspecto, la invención incluye un proceso para preparar un compuesto de la fórmula 9a. o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, que comprende poner en contacto trans-4-aminociclohexanol con anhídrido de Boc para producir un compuesto de fórmula A poner en contacto un compuesto de fórmula A con ácido metanosulfónico para producir un compuesto de fórmula B NHBOC Ó OMs B poner en contacto un compuesto de fórmula B con ácido trifluoroacético para producir un compuesto de fórmula C poner en contacto un compuesto de fórmula C con hidróxido para producir un compuesto de fórmula 9a.
En otra realización, el proceso también comprende poner en contacto un compuesto de fórmula 9a con ácido clorhídrico para producir un compuesto de fórmula 9.
De modo que la invención descrita en la presente se entienda mejor, se establecen los siguientes ejemplos. Debería entenderse que estos ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como restrictivos de esta invención de ningún modo.
Ejemplos Métodos y materiales XRPD (Difracción de rayos X de polvo) Instrumento 1 Los datos de la difracción de rayos X de polvo (XRPD) se registran a temperatura ambiente usando un Difractómetro de Rayos X de Polvo de mesa Rigaku/MSC MiniFlex (Rigaku, The Woodlands, TX) . El Rayo X se genera usando un tubo de Cu operado a 30 kv y 15 mA con filtro de supresión de ?ß. La rendija de divergencia es variable con las rendijas de dispersión y recepción fijadas a 4,2 grados y la rendija a 0,3 rttm, respectivamente. El modo de escaneo es de tiempo fijo (TF) con un ancho de etapa de 0,02 grados y tiempo de recuento de 2,0 segundos. El Difractómetro de rayos X de polvo se calibra usando un estándar de referencia: 75% de Sodalita (Na3Al4SiiOi2Cl ) y 25% de Silicio (Rigaku, Cat No. 2100/ALS). Esta fase de seis muestras se usa con portamuestras de fondo cero (SH-LBSI511-RNDB ) . La muestra de polvo se coloca en el área pretendida y se aplana con un portaobjetos de vidrio.
Instrumento 2 Alternativamente, las mediciones de difracción de rayos X de polvo se realizaron usando un difractómetro X-pert Pro de PANalaytical a temperatura ambiente con radiación de cobre (1.54060 A). La óptica del haz incidente comprendía una rendija de divergencia variable para asegurar un largo iluminado constante sobre la muestra y sobre el lado del haz difractado. Se usó un detector de estado sólido lineal rápido con un largo activo de 2,12 grados 2 theta medido en un modo de escaneo. La muestra en polvo se cargó en el área endentada de un soporte de sílice de fondo cero y se hizo girar para obtener mejores estadísticas. Se midió un escaneo simétrico de 4-40 grados 2 theta con un tamaño de paso de 0,017 grados y un tiempo de paso de escaneo de 15,5 s.
Instrumento 3 Alternativamente, se recopilaron datos de alta resolución a temperatura ambiente en la línea de haz ID31 (European Synchrotron Radiation Facility en Grenoble, Francia). Los rayos X son producidos por tres onduladores ex-vació con una brecha de 11 mm. El haz es monocromado por un monocromador de doble cristal criogénicamente enfriado (cristales Si(l 11)). Las rendijas enfriadas con agua definen el tamaño del haz incidente en el monocromador, y del haz monocromático transmitido a la muestra en el rango de 0,5 a 2,5 mm (horizontal) por 0,1 a 1,5 mm (vertical). La longitud de onda usada para el experimento fue 1,29984 (3) Á. El difractómetro consiste en un banco de nueve detectores que se escanea verticalmente para medir la intensidad difractada como una función de 2T. Cada detector es precedido por un cristal analizador Si(lll) y los canales detectores están a una distancia de aproximadamente 2o. El difractómetro es capaz de producir patrones de difracción de alta resolución precisos con anchos pico de 0,003°, y la precisión de las posiciones pico está en el orden de 0,0001°. Los datos de difracción de polvo se procesaron y se indexaron usando Materials Studio (módulo de reflejo). La estructura se resolvió usando un módulo PowderSolve de Materiales Studio. Se evaluó la viabilidad estructural de la solución resultante y se refino posteriormente usando un procedimiento de refinamiento Rietveld.
Los espectros de XPRD descritos en los ejemplos para la Forma B se registraron usando el Instrumento 1 (Fig. 7A) o el Instrumento 2 (Fig. 7B) con los ajustes descritos anteriormente. Los espectros de XPRD descritos en los ejemplos para la Forma B-HC1 y la Forma A-HC1 se registraron usando el Instrumento 2 con los ajustes descritos anteriormente. El sistema de cristal, el grupo espacial y las dimensiones de la celda unitaria para la Forma A-HC1 y Forma B-HC1 se determinaron usando el instrumento 3.
Calorimetría de barrido diferencial (DSC) La calorimetría de barrido diferencial (DSC) se realizó usando un calorímetro de barrido diferencial TA DSC Q2000 (TA Instruments, New Castle, DE). El instrumento se calibró con indio. Se pesaron muestras de aproximadamente 2-3 mg en recipientes herméticos que se plegaron usando tapas con un orificio. Las muestras DSC se escanearon de 25 °C a 315 °C a una tasa de calentamiento de 10°C/min. Los datos se recopilaron con el software Thermal Advantage Q Series™ y se analizaron con el software Universal Analysis (TA Instruments, New Castle , DE ) .
Análisis termogravimétrico (TGA) Los datos del Análisis termogravimétrico (TGA) se recopilaron en un analizador termogravimétrico TA 0500 (TA Instruments, New Castle, DE). Se escaneó una muestra con un peso de aproximadamente 3-5 mg de 25°C a 350°C a una tasa de calentamiento de 10°C/min. Los datos se recopilaron con el software Thermal Advantage Q Series™ y se analizaron con el software Universal Analysis (TA Instruments, New Castle, DE). Espectroscopia FTIR Los espectros FTIR se recopilaron de un espectrómetro termocientífico Nicolet 67 0 0 FT-IR, con un compartimiento para muestras Smart Orbit (accesorio de reflexión total atenuada de múltiples reflexiones), ventana de diamante a 4 5 grados. El Software usó para recopilar y analizar los datos: Omnic, 7 . 4 . Los ajustes de recopilación fueron los siguientes: Detector: DTGS KBr; Divisor de haz: Ge sobre KBr; Fuente: EverGlo IR; Rango de escaneo: 4 0 0 0 - 40 0 cm -1; Aumento : 8 , 0 ; Velocidad óptica: 0 , 632 9 cm/seg; Abertura: 1 0 0 ; No. de escaneos : 32 ; y Resolución: 4 cm"1 La muestra de polvo se colocó directamente sobre el cristal de diamante y se agregó presión para adaptar la superficie de la muestra a la superficie del cristal de diamante. Se recolectó el espectro de fondo y luego se recolectó la muestra.
Espectroscopia magnética nuclear en estado sólido Los espectros de la espectroscopia magnética nuclear en estado sólido (SSNMR) se adquirieron con un espectrómetro de calibre ancho de frecuencia de protones Bruker 400 MHz. Los tiempos de relajación longitudinal de relajación de protones ( 1U Ti) se obtuvieron ajustando los datos de recuperación de saturación de protones detectados a una función exponencial. Estos valores se usaron para fijar un retraso del reciclo óptimo del experimento de giro de ángulo mágico de retro-polarización ( 13C CPMAS ) , que, típicamente, se fijó entre 1,2 x 1E ?? y 1,5 x 1H Ti. Los espectros de carbono se adquirieron con un tiempo de contacto de 2 ms usando una rampa de amplitud lineal sobre canal de protones (de 50% a 100%) y desacople de 100 kHz TPPM. La velocidad típica del giro de ángulo mágico (MAS) fue 15,0 kHz. Los espectros de flúor se obtuvieron usando un experimento MAS de polarización con desacoplado de protones. Se usó un desacoplado de 100 kHz TPPM. El retraso del reciclo se fijó en >5 x 19F tt. El tiempo de relajación longitudinal de flúor (19F i) se obtuvo a ustando los datos de recuperación de saturación con desacople de protones y flúor detectado a una función exponencial. Se hace referencia externamente a los espectros de carbono y de flúor usando la resonancia campo arriba del adamantano de fase sólida que se fijó a 29,5 ppm. Usando este procedimiento, los espectros de carbono fueron dirigidos indirectamente a tretametilsilano a 0 ppm y los espectros de flúor fueron dirigidos indirectamente a nitrometano a 0 ppm.
Ejemplo Preparativo: 7-azabiciclo [ 2.2.1 ] heptano clorhidrato ( 9 ) .
Material de partida: Trans -am¡nociclohexanol NaOH acuoso TFA M * HCI luego HCI (gas) c 9 Preparación de trans-4- ( terc-butoxicarbonilamino) ciclohexanol (A) , método 1. Se agregó carbonato de sodio (920,2 g, 8,682 mol, 2 eq) a un recipiente de reacción con posterior adición de agua (3, 000 L, 6 vol) y se agitó. Se agregó diclorometano (DCM, 4,000 L, 4 vol) y luego trans-4-aminociclohexanol (500,0 g, 4,341 mol) para generar una mezcla de reacción bifásica que se agitó vigorosamente a temperatura ambiente. Luego se agregó por goteo una solución de Boc20 (947,4 g, 997 ,3 mL, 4,341 mol, 1 eq) en DCM (2 vol) rápidamente al recipiente y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción luego se filtró y la torta de filtración se lavó con agua (2x8 vol). El producto se secó por succión hasta que se convirtió en una torta compacta. La torta luego se secó en un horno de vacío a 35°C durante 24 h proporcionando 830 g de trans-4-(terc- butoxicarbonilamino ) ciclohexanol (A) como un sólido cristalino.
Preparación de trans-4- ( tere-butoxicarbonilamino) ciclohexanol (A) , método 2. Dos matraces de fondo redondo de 3 cuellos de 50 L se equiparon cada uno con un agitador mecánico y un termopar. Los matraces se colocaron en una pileta de enfriamiento y luego cada matraz se cargó con agua (8,87 L) y trans-4-aminociclohexanol (1479 g). Después de aproximadamente 10 a 30 minutos, el trans-4-aminociclohexanol se había disuelto y se agregó carbonato de potasio (1774,6 g) a cada matraz. Después de aproximadamente 10 a 20 minutos, el carbonato de potasio se había disuelto y se cargó DCM (2,96 L) en cada matraz. Luego se agregó anhídrido de Boc (3082,6 g) en DCM (1479 mL) a cada matraz a una tasa tal que mantuviera la temperatura de 20 a 30°C. Se utilizó un baño de hielo/agua para controlar la exotermia y acelerar la adición, que tardó aproximadamente 1 a 2 horas. Durante la adición se formó una suspensión y las mezclas de reacción se dejaron entibiar hasta alcanzar temperatura ambiente y se agitaron durante toda la noche hasta que se evaluó que la reacción se había completado en base a la desaparición del anhídrido de Boc . Luego se cargó heptano (6 L) a cada matraz y las mezclas se enfriaron hasta alcanzar aproximadamente 0 a 5°C. Los sólidos se recogieron de cada matraz mediante filtración utilizando el mismo filtro. Los sólidos combinados se lavaron con heptano (6 L) y luego agua (8 L). Los sólidos se cargaron en una vasija de tamaño apropiado equipada con un agitador mecánico. Se agregaron agua (12 L) y heptano (6 L) y la suspensión resultante se agitó de forma mecánica durante 30 a 60 minutos. Los sólidos se recogieron mediante filtración y luego se lavaron en un filtro con agua (8 L) y heptano (8 L), se secaron con aire en un filtro durante tres días y luego se secaron al vacío de 30 a 35°C hasta alcanzar un peso constante para proporcionar el producto como un sólido blanco.
Preparación de trans-4-{terc- butoxicarbonilamino) clclohexilmetanosulfonato (B) , método 1. Un matraz de 12 L se equipó con un flujo de nitrógeno y un agitador mecánico. Se agregó trans-4- (terc-butoxicarbonilamino ) ciclohexanol (750 g, 3,484 mol) y luego tetrahidrofurano (THF, 6,000 L, 8 vol) y la mezcla se agitó. Se agregó trietilamina (370,2 g, 509,9 mL, 3, 658 mol, 1,05 eq) y la mezcla se enfrió hasta alcanzar 0°C. Se agregó cuidadosamente por goteo cloruro de metanosulfonilo (419,0 g, 283,1 mL, 3,658 mol, 1,05 eq) manteniendo la temperatura de la mezcla por debajo de 5°C. Después de la adición, la mezcla se agitó a 0°C durante 3 h y luego se entibió gradualmente hasta alcanzar temperatura ambiente (17°C) y se agitó durante toda la noche (aproximadamente 15 h) . La mezcla se aplacó con agua (6 vol) y se agitó durante 15 min. Se agregó acetato de etilo (EtOAc, 9 , 000 L, 12 vol) y se continuó agitando durante 15 min. Se detuvo la agitación y la mezcla se dejó reposar 10 min y la fase acuosa se eliminó. Se agregó HC1 1 N (6 vol, 4,5 L) y se continuó agitando durante 15 min. Se detuvo la agitación y la fase acuosa se eliminó. Se agregó 10% p/v NaHC03 (4,5 L, 6 vol) y la mezcla se agitó durante 10 min. Se detuvo la agitación y la fase acuosa se eliminó. Se agregó agua (6 vol, 4,5 L) y la mezcla se agitó durante 10 min. La capa acuosa se eliminó y la capa orgánica se pasó por un filtro pulidor y se concentró hasta obtener 4 vol. Se agregó heptano (5,5 vol, 4 L) y la mezcla se concentró nuevamente hasta secarse lo que resultó en 988 g de tians-4- (terc-butoxicarbonilamino ) ciclohexilmetañosulfonato .
Preparación de trans-4-texc- butoxicarbonilamino) ciclohexilmetanosulfonato (B) , método 2. Un matraz de fondo redondo de 3 cuellos equipado con un agitador mecánico, embudo de adición, entrada de nitrógeno, termopar y tubo de secado se colocó en una pileta de enfriamiento. Se agregaron trans-A- { erc-butoxicarbonilamino ) ciclohexanol (2599 g, 12,07 mol, 1,0 eq), tetrahidrofurano (THF) (20,8 L) y trietilamina (1466 g, 14,49 mol, 1,2 eq) al matraz. La mezcla se enfrió con un baño de agua helada y se agitó. Se agregó por goteo cloruro de metanosulfonilo (1466 g, 12,80 mol, 1,06 eq) mediante embudo de adición durante 1 hora. Una vez que la adición se completó, el baño de enfriamiento se eliminó y la mezcla de reacción se agitó hasta que la TLC indicó que el material de partida se había consumido (aproximadamente 30 minutos). La mezcla de reacción luego se aplacó con una solución de ácido clorhídrico acuoso (223 mL de HC1 en 6,7 L de agua) y EtOAc (10,4 L). La mezcla se agitó durante aproximadamente 10 a 20 minutos a temperatura ambiente y luego se transfirió a un embudo de separación. Las capas se separaron y la capa acuosa se descartó. La capa orgánica se lavó con agua (2 x 4,5 L), solución acuosa de bicarbonato de sodio saturado (1 x 4,5 L) y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro con agitación durante 5 a 10 minutos. La mezcla se filtró y la torta de filtración se lavó con EtOAc (2 x 600 mL) . Los lavados combinados y el filtrado se concentraron a presión reducida a 40°C, proporcionando un sólido blanco. El sólido se recogió y colocó en heptano (3 L) y se enfrió en una pileta de enfriamiento de hielo/metanol . Se agregó más heptano (5 L) y la mezcla se agitó de 0 a 5°C durante no menos de 1 hora. Los sólidos luego se recolectaron mediante filtración, se lavaron con heptano frío (0 a 5°C, 2 x 1,3 L) y se secaron al vacio a 40°C hasta alcanzar un peso constante para proporcionar el compuesto del titulo.
Nota: Puede utilizarse un reactor con camisa en lugar de un matraz de fondo redondo con una pileta de enfriamiento y baño de hielo.
Preparación de fcrans-4-aminociclohexilmetanosulfonato (C) , método 1. Se agregó trans-4- ( terc-butoxicarbonilamino ) ciclohexilmetanosulfonato (985 g, 3,357 mol) en un matraz de 3 cuellos de 12 L equipado con un agitador bajo atmósfera de nitrógeno y orificio de ventilación abierto. Se agregó a temperatura ambiente DCM (1,970 L, 2 vol ) y comenzó a agitarse. Lentamente se agregó ácido trif luoroacético (TFA) (2,844 kg, 1,922 L, 24,94 mol, 2 vol) a la mezcla en dos lotes de 1 L cada uno. Después de la primera adición, la mezcla se agitó durante 30 min y luego se llevó a cabo una segunda adición. La mezcla se agitó durante toda la noche (15 h) a temperatura ambiente dando como resultado una solución clara. Luego se agregó 2-metiltetrahidrofurano (4 vol ) a la mezcla de reacción, que se agitó durante 1 h. La mezcla luego se filtró cuidadosamente en una campana de extracción y se secó por succión para generar 1100 g de sal TFA de trans-A-aminociclohexilmetanosulfonato con exceso de TFA.
Preparación de trans-4-aminociclohexilmetanosulfonato (C) , método 2. Un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 50 L se equipó con un agitador mecánico, embudo de adición y termopar y se colocó en una pileta de enfriamiento. Al matraz se agregó trans- - ( terc-butoxicarbonilamino ) ciclohexilmetanosulfonato (3474 g, 1,0 eq) y DCM (5,9 L) al matraz. La suspensión resultante se agitó durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente y luego se agregó ácido trif luoroacético (TFA, 5,9 L) mediante un embudo de adición lentamente durante 2 , 5 horas para controlar la exotermia resultante y la tasa de desprendimiento de gas. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche y luego se enfrió hasta alcanzar 15°C a 20°C utilizando un baño de agua helada. Luego se agregó 2-metil tetrahidrofurano (2-MeTHF, 11,8 L) mediante embudo de adición a una tasa tal que mantuviera la temperatura interna por debajo de 25°C (aproximadamente 1,5 horas). La adición de los primeros 4-5 L de 2-MeTHF fue exotérmica. La suspensión resultante se agitó durante 1 hora. Los sólidos se recogieron mediante filtración y luego se lavaron con 2-MeTHF (2 x 2,2 L) y luego se secó al vacio a temperatura ambiente hasta alcanzar un peso constante para proporcionar el compuesto del titulo como un sólido blanco.
Preparación de 7-azabiciclo [2.2.1] heptano clorhidrato (9), método 1. La sal TFA de trans-4-aminociclohexilmetanosulfonato (200 g, 650,9 mmol) se introdujo en un matraz de 3 cuellos de 3 L con posterior adición de agua (2,200 L, 11 vol). Lentamente se agregó NaOH (78,11 g, 1,953 mol, 3 eq) manteniendo la temperatura de la mezcla de reacción por debajo de 25°C y la mezcla se agitó durante toda la noche. Luego se agregó DCM (1,4 L, 7 vol) y la mezcla se agitó y la capa orgánica se separó. La capa acuosa luego se extrajo una segunda vez con DCM (1,4 L, 7 vol) y las capas de DCM se combinaron. Luego se agregó HC1 (108,5 mL, 12M, 1,3020 mol, 2 eq), la mezcla se agitó durante 30 min y luego se concentró en un evaporador giratorio hasta secarse. Se agregó acetonitrilo (10 vol) y la mezcla se concentró. Esto se repitió 3 veces hasta que se eliminó azeotrópicamente toda traza de agua, para proporcionar 7-azabiciclo [ 2.2.1 ]heptano clorhidrato (9). El producto bruto se recristalizó de acetonitrilo (10 vol ) para proporcionar 7-azabiciclo [ 2.2.1 ] heptano clorhidrato (9) como un sólido cristalino incoloro. H NMR (DMSO-d6) ppm 8 , 02-8,04 (d); 7,23-7,31 (m); 4,59 { s ) ; 3,31 ( s ) ; 2,51-3,3 (m); 1 , 63-1,75 (m); 1, 45-1,62 (m) .
Cabe destacar que, en lugar de agregar DCM para la extracción, el producto bruto también puede destilarse de aproximadamente 95°C a 97°C y recristalizarse adicionalmente .
Preparación de 7-azabiciclo [2.2.1] heptano clorhidrato (9), método 2. Un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 50 L equipado con un agitador mecánico, embudo de adición y termopar y se colocó en un manto de calentamiento. Se agregaron al matraz trans-4-aminociclohexilmetanosulfonato trifluoroacetato en (3000 g, 1 eq) y agua (30 L) . La mezcla se agitó a medida que se agregaba 50% NaOH (2343 g, 29 ,29 mol, 3 eq) mediante un embudo de adición a una tasa tal que mantuviera la temperatura por debajo de 25°C dado que la adición fue levemente exotérmica. Tras completarse la adición de NaOH, la mezcla de reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. El producto se recuperó mediante destilación fraccional a temperatura de reflujo, (aproximadamente 100°C) con una temperatura de cabeza de 95 a 98°C. El pH de cada fracción se ajustó hasta alcanzar 2 mediante la adición de HC1 y se concentró a presión reducida a 55°C para proporcionar una pasta espesa. Se agregó acetonitrilo (ACN 1,5 L) y la suspensión resultante se agitó durante 30 minutos y luego se enfrió hasta alcanzar 0 a 5°C durante 1 hora. Los sólidos se recogieron mediante filtración, se lavaron con ACN frío (0 a 5°C) (2 x 600 mL) y se secó al vacio a 50°C hasta alcanzar un peso constante.
Un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 22 L se equipó con un agitador mecánico, termopar y condensador y se colocó en un manto de calentamiento. El sólido recogido (2382 g), metanol (4,7 L) y 2-MeTHF (4,7 L) se agregaron al matraz. La suspensión resultante se agitó y se calentó hasta alcanzar reflujo (aproximadamente 65°C). El matraz de la reacción se transfirió a una pileta de enfriamiento y la mezcla se agitó. Luego se agregó 2-MeTHF (4,7 L) mediante embudo de adición durante 30 minutos. La suspensión resultante se enfrió hasta alcanzar 0 a 5°C y se agitó a esta temperatura durante 30 minutos. Los sólidos se recogieron mediante filtración, se lavó con 2-MeTHF frío (0 a 5°C) (2 x 600 mL) y luego se secó al vacio a 55°C hasta alcanzar un peso constante.
Un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 12 L equipado con un agitador mecánico, termopar, entrada de nitrógeno y condensador se colocó en un manto de calentamiento. El producto bruto (2079 g) y ACN (6,2 L) se agregaron al matraz. La suspensión resultante se agitó y se calentó hasta alcanzar reflujo (aproximadamente 82°C) durante 30 minutos. El matraz se transfirió a una pileta de enfriamiento y la suspensión lentamente se enfrió hasta alcanzar 0 a 5°C y se mantuvo a esta temperatura durante 1 hora. Los sólidos se recogieron mediante filtración, se lavó con (0 a 5°C) ACN frío (3 x 600 mL) y se secó al vacio a 55°C hasta alcanzar un peso constante proporcionando para proporcionar el producto titulado .
Ejemplo 1A: Preparación de ácido 4-oxo-5-( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxilico ( 7 ) .
Preparación de dietil 2- ( (2-Cloro-5- ( rifluorometil) fenilamino)metileno) malonato (4). Se combinaron 2-cloro-5- ( trifluorometil ) anilina (2) (200 g, 1.023 mol), dietil 2- ( etoximetileno )malonato (3) (276 g, 1,3 mol) y tolueno (100 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 1 L equipado con un condensador Dean-Stark. La solución se calentó con agitación hasta alcanzar 140°C y la temperatura se mantuvo durante 4 horas (h). La mezcla de reacción se enfrió hasta alcanzar 70°C y se agregó lentamente hexano (600 mL). La suspensión resultante se agitó y se dejó entibiar hasta alcanzar temperatura ambiente. El sólido se recogió mediante filtración, se lavó con 10% acetato de etilo en hexano (2 x 400 mL) y luego se secó al vacio para proporcionar el producto, dietil 2- ( ( 2-cloro-5-(trifluorometil ) fenilamino )metileno ) malonato (4), como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,28 (d, J = 13,0 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 13,0 Hz, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,80 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,50 (dd, J = 1,5, 8,4 Hz, 1H), 4.24 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 4,17 (q, J = 7,1 Hz,2 H) , 1 , 27 (m, 6H) .
Preparación de etilo 8-cloro-4-oxo-5- (trifluorometil) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxilato (5A) Método 1. Un matraz de 3 cuellos de 1L se cargó con Dowtherm® (200 mL, 8 mL/g) y se desgasificó a 200°C durante 1 h. El disolvente se calentó hasta alcanzar 260°C y se cargó en porciones durante 10 minutos (min) con dietil 2- ( ( 2-cloro-5- ( trif luorometil ) fenilamino ) metileno)malonato (4) (25 g, 0,07 mol). La mezcla resultante se agitó a 260°C durante 6,5 h y el producto derivado resultante de etanol se eliminó por destilación. La mezcla se dejó enfriar lentamente hasta alcanzar 80°C. Se agregó lentamente hexano (150 mL) durante 30 min y luego se agregaron 200 mL adicionales de hexano en una porción. La suspensión se agitó hasta alcanzar temperatura ambiente. El sólido se filtró, se lavó con hexano (3 x 150 mL) y luego se secó al vacio para proporcionar etil 8-cloro-4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxilato (5A) como un sólido tostado. XH N R (400 MHz, DMSO-d6) d 11,91 (s, 1H) , 8,39 (s, 1H), 8,06 (d, / = 8,3 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,24 (q, / = 7,1 Hz, 2H), 1,29 (t, J = 7,1 Hz, 3H).
Preparación de etil 8-cloro-4-oxo-5- (trifluorometil) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxilato (5A) Método 2. El compuesto 4 (2000 g, 5,468 mol) se introdujo en el reactor. Se cargó Dowtherm (4,000 L) en el reactor y se desgasificó a temperatura ambiente durante toda la noche con purga de nitrógeno. Luego se agitó y entibió hasta alcanzar 260°C. El EtOH producido se eliminó por destilación. La reacción se monitoreó y se completó después de 5,5 h, la reacción estaba sustancialmente completa. Se eliminó la fuente de calor y la mezcla de reacción se enfrió hasta alcanzar 80°C y se cargó heptano (2 ,000 L) . La mezcla se agitó durante 30 min. Se cargó heptano (6,000 L) en la mezcla agitada y se continuó agitando durante toda la noche. Lo sólidos se eliminaron por filtración y se lavaron con heptano (4,000 L) y se secaron en un horno de vacio a 50°C para proporcionar el Compuesto 6A.
Preparación de etil 4-oxo-5- ( trifluorometil) -1H-quinolina-3-carboxilato (6) . Un matraz de 3 cuellos de 5 L se cargó con etil 8-cloro- 4-oxo-5- ( trifluorometil ) - 1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxilato (5A) (100 g, 0,3 mol), etanol ( 1250 mL, 12,5 mL/g) y trietilamina (220 mL, 1,6 mol). El recipiente luego se cargó 10 g de 10% Pd/C (50% húmedo) a 5°C. La reacción se agitó vigorosamente bajo atmósfera de hidrógeno durante 20 h a 5°C, tiempo luego del cual la mezcla de reacción se concentró hasta proporcionar a volumen de aproximadamente 150 mL. El producto, etil 4-oxo-5- ( trifluorometil ) -lH-quinolina-3-carboxilato (6), se tomó directamente en la siguiente etapa como una suspensión con Pd/C.
Preparación de ácido 4-oxo-5- (trifluorometil) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxilico (7) . Se suspendió etil 4-oxo-5- ( trifluorometil ) -lH-quinolina-3-carboxilato (6) (58 g, 0,2 mol, suspensión de la reacción bruta conteniendo Pd/C) en NaOH (814 mL de 5 M, 4,1 mol) en un matraz de 1 L con un condensador de reflujo y se calentó a 80°C durante 18 h, con posterior calentamiento adicional a 100°C durante 5 h. La reacción se filtró tibia a través de Celite empaquetado para eliminar Pd/C y el Celite se enjuagó con NaOH 1 N. El filtrado se acidificó a aproximadamente pH 1 para obtener un precipitado blanco espeso. El precipitado se filtró, luego se enjuagó con agua y acetonitrilo frío. El sólido luego se secó al vacio para proporcionar ácido 4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxílico (7) como un sólido blanco. H N R (400,0 MHz , DMSO-d6) d 15,26 (s, 1H), 13,66 (s, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,13 (dd, J = 1,6, 7,8 Hz, 1H) , 8,06 - 7,99 (m, 2H) .
Ejemplo IB: Preparación Alternativa de ácido 4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxilico 5A 5B Preparación de ácido 8-cloro-4-oxo-5- (trifluorometil) -1 , -dihidroquinolina-3-carboxilico (5B) .
Se cargó etil 8-cloro-4-oxo-5- (trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxilato (5A) (1200 g, 3,754 mol) en un recipiente de reacción con posterior adición de 2-propanol (1,200 L) y agua (7,200 L) y se agitó. Se mezclaron hidróxido de sodio (600,6 g, 7,508 mol) y agua (1,200 L) y se dejó enfriar hasta alcanzar temperatura ambiente. La mezcla resultante se cargó en el recipiente de reacción y luego se calentó hasta alcanzar 80°C con agitación durante 3,5 h para generar una mezcla oscura, homogénea. Después de una hora más, se agregó mediante embudo de goteo ácido acético (9,599 L de 20% p/v, 31,97 mol) durante 45 min. La mezcla de reacción se enfrió con agitación hasta alcanzar 22°C a una tasa de 6°C/h. El sólido resultante se filtró y se lavó con agua (3 L) para generar una torta húmeda (1436 g). El filtrado se secó en un horno de vacio con una purga de nitrógeno sobre Drierite® para generar ácido 8-cloro-4-oxo-5-( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxílico ( 5B ) como un sólido marrón (1069 g). El ácido 8-cloro-4-oxo-5-( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxilico ( 5B) se purificó mediante suspensión en 1,5 L metanol y agitación durante 6 h. Luego se filtró y se secó para proporcionar 968,8 g de ácido 8-cloro-4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxílico purificado ( 5B) .
Preparación de ácido 4-oxo-5- (trifluorometil) - 1,4-dihidroquinolina-3-carboxílico (7) . Se cargó ácido 8-cloro-4-oxo-5- ( trifluorometil ) - 1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxilico (5B) (18,5 g, 1,00 eq, reactivo limitante) en un recipiente de reacción y se agregó MeOH (118 mL, 6,4 vol) bajo una atmósfera inerte con agitación. Se agregó en porciones metóxido de sodio (3,53 g, 1,00 eq.) durante 10 min al reactor. La mezcla se agitó hasta que todos los sólidos quedaron en solución (5-10 minutos). Luego se agregó paladio sobre carbono (2,7 g, 0,03 eq) a la mezcla de reacción. Se agregó formiato de potasio (10,78 g, 2 eq.) disuelto en MeOH (67 mL, 3,6 vol) a la mezcla de reacción durante 30 min y se agitó durante aproximadamente 4,5 h a temperatura ambiente. La reacción se estimó que estaba completa cuando no quedó más que el 1,0 % de ácido 8-cloro-4-oxo-5- ( trif luorometil )- 1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxí lico con respecto a ácido 4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxí lico (7). Cuando la reacción se completó, la mezcla se filtró a través de una almohadilla de Celite (masa de Celite utilizada aproximadamente 2 x masa de ácido 8-cloro-4-oxo-5- ( trifluorometil ) - 1 , 4 -dihidroquinolina-3-carboxilico (5B) cargada en el recipiente al comienzo) para eliminar los sólidos. La torta de Celite se lavó con MeOH (37 mL, 2 vol). El filtrado se cargó en un recipiente de reacción limpio y se agitó. Se cargó ácido acético (7,22 mL, 2 eq.) de forma continua a la solución agitada durante al menos 45 minutos y la suspensión resultante se agitó durante entre 5-16 h. El sólido se filtró y la torta se lavó con MeOH (56 mL, 3 vol ) , se secó por succión y luego se secó al vacio para proporcionar el producto como un sólido blanco/blancuzco.
De forma alternativa, el reactivo formiato de potasio puede reemplazarse por gas hidrógeno.
Ejemplo 2A: Preparación de 4- ( 7-azabiciclo[ 2.2.1] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) anilina (HA).
Preparación de 7- [4-nitro-3- (trifluorometil) fenil] - 7-azabiciclo [2.2.1] heptano (10A) , método 1. A un matraz conteniendo 7-azabiciclo [ 2.2.1 ] heptano clorhidrato (9) (4,6 g, 34,43 mol, se agregó una solución de 4-fluoro-l- nitro-2-(trifluorometil)benceno (8) (6,0 g, 28,69 mmol) y trietilamina (8,7 g, 12,00 mL, 86,07 mmol) en acetonitrilo (50 mL), bajo una atmósfera de nitrógeno. El matraz de la reacción se calentó a 80°C bajo una atmósfera de nitrógeno durante 16 h. La mezcla de reacción luego se dejó enfriar y se dividió entre agua y diclorometano . La capa orgánica se lavó con HC1 1 M, se secaron sobre Na2S04, se filtró y se concentró hasta secarse. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (0-10% acetato de etilo en hexanos) proporcionó 7-[ 4 -nitro-3- ( trif luorometil ) fenil ] -7-azabiciclo[ 2.2.1 ] heptano como un sólido amarillo. 1H NMR (400,0 MHz, DMSO-do) d 8,03 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,31 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,25 (dd, J = 2,6,9,1 Hz, 1H), 4,59 (s, 2H), 1,69 - 1,67 (m, 4H), 1,50 (d, J = 7,0 Hz, 4H).
Preparación, de 7- [4-nitro-3- (trifluorometil) fenil] -7-azabiciclo [2.2.1] heptano (10A) , método 2. Se introdujo 4-fluoro-l-nitro-2- ( trifluorometil ) benceno (8) (901 g, 4,309 mol) en un recipiente con camisa de 30 L, junto con carbonato de sodio (959,1 g, 9,049 mol) y DMSO (5 L, 5,5 vol) bajo una atmósfera de nitrógeno, con agitación. Luego se agregó 7-azabicic lo [ 2.2.1 ] heptano clorhidrato (9) (633,4 g, 4,740 mol) al recipiente en porciones y la temperatura gradualmente aumentó hasta alcanzar 55°C. La reacción se monitoreó mediante HPLC y cuando el sustrato fue < 1% AUC, la reacción se consideró completa. La mezcla luego se diluyó con 10 vol de EtOAc y se lavó con agua (5,5 vol) tres veces. La capa orgánica luego se concentró hasta obtener 4 vol y se agregó ciclohexano y se concentró hasta obtener 4 vol. El proceso de adición de ciclohexano y concentración de la solución resultante hasta obtener 4 vol se repitió hasta que se eliminó todo el EtOAc y el volumen total en el matraz fue aproximadamente 4 vol que contenían ciclohexano. La mezcla de reacción se calentó hasta alcanzar 60°C en un evaporador giratorio durante 30 min. La solución luego se enfrió hasta alcanzar temperatura ambiente con agitación o rotación durante 3 h. Todo el sólido luego se cristalizó y se concentró hasta secarse para proporcionar 7-[4-nitro-3-( trifluorornetil )fenil]-7-azabiciclo [ 2.2.1 ] heptano (10A).
Preparación de 7- [4-nitro-3- ( trifl o ornetil) fenil] -7-azabiciclo [2.2. l]heptano (10A) , método 3. A 4-fluoro-l-nitro-2- ( trifluorometil )benceno (8) disuelto en 3 vol de DCM, se agregaron tetrabutilamoniobromuro (0,05 eq ) y 50 p% KOH (3,6 eq). Luego se agregó 7-azabiciclo [ 2.2.1 ] heptano clorhidrato (9) a 0-5°C. La reacción se entibió hasta alcanzar temperatura ambiente. La reacción se monitoreó mediante HPLC y cuando el sustrato fue < 1% AUC, la reacción se consideró completa y las capas se separaron. La capa orgánica se lavó con HC1 1M y la capa acuosa se descartó. La capa orgánica luego se lavó una vez con agua, una vez con salmuera y se evaporó. El material resultante se recristalizó de ciclohexano a reflujo. El sólido se filtró, se lavó con ciclohexano y se secó en un horno de vacío a 45°C bajo una atmósfera de nitrógeno para proporcionar 7-[4-nitro-3- ( trifluorometil )fenil]-7-azabiciclo[2.2.1] heptano .
Preparación de 4- (7-azabicicIo [2.2.1] heptan-7-il) - 2- (trifluorometil) anilina (11A) . Un matraz cargado con 7- [ 4-nitro-3- ( trifluorometil ) fenil ] -7- azabiciclo[ 2.2.1 ]heptano (10A) (7,07 g, 24,70 mmol ) y 10% Pd/C (0,71 g, 6,64 mmol) se vació y luego enjuagó con nitrógeno. Se agregó etanol (22 mL) y el matraz de la reacción se ajustó con un balón de hidrógeno. Después de agitar vigorosamente durante 12 h, la mezcla de reacción se purgó con nitrógeno y el Pd/C se eliminó mediante filtración. El filtrado se concentró hasta proporcionar un aceite oscuro a presión reducida que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (0-15% acetato de etilo en hexanos ) para proporcionar 4- (7- azabiciclo [2.2.1] heptan-7-il ) -2- ( tri flúorometil ) anilina (IIA) como un sólido púrpura. H NMR (400,0 MHz, DMSO-dg) d 6,95 (dd, / = 2,3, 8,8 Hz, 1H) , 6,79 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,89 (s, 2H), 4,09 (s, 2H), 1,61-1,59 (m, 4H) y 1,35 (d, J = 6,8 Hz, 4H).
Ejemplo 2B : Preparación de 4- ( 7- azabiciclo [2.2.1] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) anilina (IIB) clorhidrato.
Preparación de 4- (7-azabiciclo [2.2.1] heptan-7-il) -2- (trifluorometil) anilina clorhidrato (11B) , método 1. Se cargó paladio sobre carbono (150 g, 5 % p/p) en un hidrogenador Büchi (capacidad de 20 L) bajo una atmósfera de nitrógeno, con posterior adición de 7- [ 4-nitro-3-( trifluorometil ) fenil ] -7-azabiciclo [2.2.1] heptano ( 10A, 1500 g), como se preparó en el Ejemplo 2A (método 2) anterior y 2-metiltetrahidrofurano (10,5 L, 7 vol). El hidrogenador luego se purgó con gas hidrógeno y luego se cargó en forma continua a la mezcla a una presión de 0,5 bar sobre la presión atmosférica. La mezcla luego se agitó a una temperatura entre 18°C y 23°C enfriando la camisa del recipiente. Cuando no se consumió más gas hidrógeno ni hubo más exotermia se aplicó vacio al recipiente. Luego se cargó gas nitrógeno en el recipiente a 0,5 bar y se volvió a aplicar vacio y posteriormente una segunda carga de 0,5 bar de gas nitrógeno. Cuando la HPLC de una alícuota filtrada mostró que no quedaba más 7- [ 4 -nitro-3- ( trif luorometil )fenil]-7-azabiciclo[ 2.2.1 ] heptano (10A) (por ejemplo, < 0,5%), la mezcla de reacción se transfirió a un matraz receptor bajo una atmósfera de nitrógeno mediante un embudo de filtración utilizando un filtro de Celite. La torta del filtro de Celite se lavó con 2-metiltetrahidrofurano (3 L, 2 vol ) . Los lavados y el filtrado se cargaron en un recipiente equipado con agitación, control de temperatura y una atmósfera de nitrógeno. Se agregó en forma continua HC1 4M en 1,4-dioxano (1 vol) durante 1 h en el recipiente a 20°C. La mezcla se agitó durante al menos unas 10 h adicionales, se filtró y se lavó con 2-metiltetrahidrofurano (2 vol) y se secó para generar 1519 g de la sal clorhidrato de 4- ( 7-azabiciclo [ 2.2.1 ] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) anilina (11B) como un sólido cristalino blanco.
En este ejemplo también pueden sustituirse disolventes alternativos. Por ejemplo, puede utilizarse MeOH y/o EtOH en lugar de 2-MeTHF.
Preparación de 4- ( 7-azabiciclo [2.2.1] heptan-7-il) -2- (trifluorometil) nilina clorhidrato (11B) , método 2. En un hidrogenador Büchi (capacidad de 20 L) se introdujo paladio sobre carbono (5% p/p, 150 g) bajo nitrógeno con posterior adición de 7- [ 4-nitro-3- ( trifluorometil ) fenil ] -7-azabiciclo[2.2.1 ]heptano (1500 g) y 2-metiltetrahidrofurano (10,5 L, 7 vol). El hidrogenador luego se purgó con gas hidrógeno y luego se cargó en forma continua a la mezcla de agitación a una presión de 0,5 bar sobre la presión atmosférica. La temperatura de la mezcla de reacción se mantuvo de 18°C a 23°C enfriando la camisa del recipiente. Cuando no se consumió más gas hidrógeno ni hubo más exotermia se aplicó vacio al recipiente. Luego se cargó gas nitrógeno en el recipiente y se volvió a aplicar vacio y luego una carga de gas nitrógeno a 0,5 bar. Se estimó que la reacción se había completado cuando una HPLC de una alícuota filtrada mostró que no se detectaba 7- [ 4-nitro-3-( trifluorometil ) fenil ] -7-azabiciclo [2.2.1 ]heptano ( < 0,5%). La mezcla de reacción luego se filtró a través de Celite. La suspensión remanente se transfirió a un matraz receptor bajo gas nitrógeno mediante un embudo de filtración conteniendo un filtro de Celite. La torta de Celite se lavó con 2-metiltetrahidrofurano (3 L, 2 vol ) . El filtrado y los lavados se transfirieron a un recipiente equipado con un mecanismo de agitación, control de temperatura y una atmósfera de nitrógeno. Se agregó en forma continua HC1 4M en 1,4-dioxano (1 vol) durante 1 h al recipiente a 20°C. La mezcla resultante se agitó durante unas 10 h más, se filtró y se lavó con 2-metiltetrahidrofurano (2 vol) y se secó para generar 1519 g de 7- [ 4-amino-3- ( trif luorometil ) fenil ] -7-azabiciclo [ 2.2.1 ] heptano clorhidrato (11B) como un sólido cristalino blanco.
En este ejemplo también pueden sustituirse disolventes alternativos. Por ejemplo, puede utilizarse MeOH y/o EtOH en lugar de 2-MeTHF.
Ejemplo 3A: Preparación de N- ( 4- ( 7-azabiciclo[ 2.2.1 ]heptan-7-ilo) -2- ( trifluorometil ) fenil ) -4-QXQ-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida (Forma A).
A una solución de ácido 4-oxo-5-(trifluorometil)-l H-quinolina-3-carboxílico (7) (9,1 g, 35,39 mmol) y 4-(7-azabiciclo [2.2.1] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) anilina (11A) (9,2 g, 35,74 mmol) en 2-metiltetrahidrofurano (91,00 mL) se agregó anhídrido cíclico de ácido propil fosfónico (T3P (50 % solución en acetato de etilo), 52,68 mL, 88,48 mmol) y piridina (5,6 g, 5,73 mL, 70,78 mmol) a temperatura ambiente. El matraz de la reacción se calentó a 65°C durante 10 h bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de enfriar hasta alcanzar temperatura ambiente, la mezcla de reacción luego se diluyó con acetato de etilo y se aplacó con solución saturada de a2C03 ( 50 mL ) . Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo dos veces más con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron hasta obtener un sólido tostado. El sólido crudo se suspendió en una mezcla 2:1 de acetato de etilo y éter dietilico, se recogió mediante filtración al vacio y se lavó dos veces más con mezcla de acetato de etilo/éter dietilico para proporcionar el producto bruto como un polvo amarillo claro cristalino. El polvo se disolvió en acetato de etilo tibio y se absorbió en Celite. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (0-50 % acetato de etilo en diclorometano ) proporcionó N-(4-(7-azabiciclo [2.2.1] heptan-7-il ) -2- ( trifluoromemil )fenil)-4-oxo-5- ( rif luorometil ) - 1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida (Compuesto I) como un sólido cristalino blanco en la forma A sólida. LC/MS m/z 496,0 [M+H]+, tiempo de retención 1,48 min (RP-Ci8, 10-99 % CH3CN/0,05 % TFA durante 3 min). 1E NMR (400,0 MHz , DMSO-d6) d 13,08 (s, 1H), 12,16 (s, 1H), 8,88 (s, 1H), 8,04 (dd, J = 2,1, 7,4 Hz, 1H), 7,95 - 7,88 (m, 3H), 7,22 (dd, 2,5, 8,9 Hz, 1H), 7,16 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 4,33 (s, 2H), 1,67 (d, J = 6,9 Hz, 4H), 1,44 (d, J = 6,9 Hz, 4H).
Ejemplo 3B : Preparación de N- ( 4 - ( 7-azabiciclof 2.2.1 ]heptan-7-il )-2- ( trifluorometil )fenil)-4-oxo-5- ( trif luorometil ) - 1 , 4 -dihidroquinolina-3-carboxamida (Forma A-HC1) 11B 7 I (FORMA A-HC1) Se cargó 2-metiltetrahidrofurano (0,57 L, 1,0 vol) en un recipiente de reacción con camisa de 30 L, con posterior adición de sal clorhidrato de 4- (7-azabiciclo [ 2.2.1 ] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) anilina (11B) (791 g, 2,67 mol) y ácido 4-oxo-5- ( trif luorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxílico (7) (573 g, 2,23 mol) y 5,2 L adicionales (9,0 vol) de 2-metiltetrahidrofurano . Comenzó la agitación y se agregó T3P en 2-metiltetrahidrofurano (2,84 kg, 4,46 mol) a la mezcla de reacción durante 15 min. Luego se agregó piridina (534,0 g, 546,0 mL, 6,68 mol) mediante un embudo de adición por goteo durante 30 min. La mezcla se entibió hasta alcanzar 45°C durante aproximadamente 30 min y se agitó durante 12-15 h. La mezcla luego se enfrió hasta alcanzar temperatura ambiente y se agregó 2-metiltetrahidrofurano (4 vol, 2,29 L) y luego agua (6,9 vol, 4 L), mientras la temperatura se mantuvo por debajo de 30°C. La capa de agua se eliminó y la capa orgánica se lavó cuidadosamente dos veces con solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica luego se lavó con 10% p/p ácido cítrico (5 vol) y finalmente con agua (7 vol). La mezcla se pasó por un filtro pulidor y se transfirió a otro recipiente seco. Se agregaron cristales simientes de N-(4-(7-azabiciclo[ 2.2.1 ]heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida clorhidrato (Forma A-HCl) (3,281 g, 5,570 mmol). Se burbujeó HC1 (g) (10 eq) durante 2 h y la mezcla se agitó durante toda la noche. La suspensión resultante se filtró, se lavó con 2-metiltetrahidrofurano (4 vol), se secó por succión y con horno a 60°C lo que proporcionó el Compuesto I como la Forma A-HCl.
El difractograma de polvo de la Forma A-HCl se muestra en la Figura 1.
La Tabla 1 a continuación proporciona los picos del XRPD representativos de la Forma A-HCl.
Tabla 1. Picos de XRPD de la Forma A-HCl Se determinó que un cristal simple de la Forma A-HC1 del Compuesto 1 tenía un sistema de cristal monoclínico, un grupo espacial P2x/c y las siguientes dimensiones de celdas unitarias: a = 13,6175(4) A, b = 21,614(3) Á, c = 8,3941(4) Á, a = 90°, a = 112,303° y ? = 90°.
También se evaluó una muestra representativa de la Forma A-HCl utilizando microscopio.
En la Figura 2 se proporciona una curva de DSC para una muestra representativa de la Forma A-HCl.
En la Figura 3 se proporciona una curva de TGA para una muestra representativa de la Forma A.
Una muestra representativa de la Forma A-HCl proporcionó el espectro FTTH proporcionado en la Figura 4.
La Tabla 2 proporciona las absorciones FTIR características de la Forma A-HCl.
Tabla 2. Absorciones FTIR de la Forma ? HC1 También se analizó una muestra representativa de la Forma A-HC1 utilizando (S) 13C y 19F NMR en estado sólido. Los respectivos espectros de la NMR se proporcionan en las Figuras 5 y 6. En las Tablas 3 y 4 que siguen a continuación se describen varios picos encontrados en los espectros de 13C SSNMR y 19F SSNMR.
Tabla 3. Picos de 13C SSNMR de la Forma A-HCl Tabla 4: Picos de 19F SSNMR de la Forma A-HCl Ejemplo de N-(4-(7-azabiciclo[2.2.1 ] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) fenil)-4-oxo-5- ( trifluorometil ) - 1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida (Forma B) . 11B 7 I(FORMA B) Se cargó 2-metiltetrahidrofurano (1 vol) en un recipiente de reacción con camisa de 30 L con posterior adición de la sal clorhidrato de 4- (7-azabiciclo[2.2.1 ] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) anilina (11B) (1,2 eq) y ácido 4-oxo-5- ( trifluorometil )- 1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxílico (7) (573 g, 2,228 mol). Se cargó más 2-metiltetrahidrofurano (9 vol) en el recipiente y comenzó a agitarse. Se agregó T3P en 2-metiltetrahidrofurano (2 eq) a la mezcla de reacción durante un periodo de 15 min. Se agregó rápidamente piridina (3 eq) por goteo utilizando un embudo de adición. Bajo agitación, la mezcla luego se calentó hasta alcanzar 45°C durante un período de aproximadamente 30 min y esta temperatura se mantuvo durante aproximadamente 5 h. La mezcla se enfrió hasta alcan2ar temperatura ambiente. Se agregó 2-Metiltetrahidrofurano (4 vol), con posterior adición lenta de agua (6,9 vol) y la temperatura de la reacción se mantuvo por debajo de 30°C. La capa de agua se eliminó y la capa orgánica se lavó dos veces con solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica luego se lavó cuidadosamente con 10% p/p ácido cítrico (5 vol) y agua (7 vol), se pasó por un filtro pulidor y luego se transfirió a otro recipiente seco. Se agregó 2-metiltetrahidrofurano (10 vol) y comenzó a agitarse. Se agregó por goteo heptano (10 vol) rápidamente con agitación. La mezcla se agitó durante un período de aproximadamente 12 h y luego se filtró al vacío. La torta de filtración sólida se introdujo en otro recipiente. Se cargó agua (15 vol) en el recipiente y la suspensión se agitó vigorosamente durante 48 h y luego se filtró. La torta sólida se lavó con agua (5 vol) y se secó a 45°C hasta obtener un peso constante para proporcionar el Compuesto I, Forma B.
El difractograma de polvo del Compuesto I, Forma B se muestra en las Figuras 7A y 7B.
Tabla 5: Picos de XRPD representativos de la Forma Tabla 5. Picos de XRPD de la Forma B En la Figura 8 se proporciona una curva de DSC para una muestra representativa de la Forma B.
En la Figura 9 se proporciona una curva de TGA para una muestra representativa de la Forma B.
Una muestra representativa de la Forma B proporcionó el espectro de FTIR que se muestra en la Figura 10.
La Tabla 6 proporciona las Absorciones FTIR características de la Forma B.
Tabla 6. Absorciones FTIR de la Forma B .
También se analizó una muestra representativa de la Forma B utilizando (S) 13C y 19F NMR en estado sólido. Los respectivos espectros de la NMR se proporcionan en las Figuras 11 y 12. En las Tablas 7 y 8 que siguen a continuación se describen varios picos encontrados en los espectros de 13C SSNMR y 19F SSNMR.
Tabla 7. Picos de 13C SSNMR de la Forma B.
Tabla 8. Picos de 19F SS MR de la Forma B.
Un cristal simple de la Forma B del Compuesto 1 se montó en un bucle Micro ount y se centró en un difractómetro Broker Apex II que se equipó con un tubo de rayos X de cobre sellado y detector CCD Apex II. Inicialmente , se recogieron 3 juegos de 40 cuadros para determinar una celda unitaria preliminar. A continuación se adquirió un juego de datos completo que consistió en 15 escaneos y se adquirieron 6084 cuadros. La recolección de datos se llevó a cabo a temperatura ambiente. Los datos se integraron y se graduaron utilizando el software Apex II de Bruker AXS . La integración y graduación resultó en 6176 reflexiones, 2250 de las cuales fueron únicas. La estructura se disolvió mediante métodos directos en el grupo espacial P2i/c utilizando el software SHELXTL. El refinamiento se llevó a cabo con el método de mínimos cuadrados de matriz completa en F2 , también utilizando el software SHELXTL. Se usaron 392 parámetros en total en el refinamiento, resultando en la reflexión a la relación del parámetro de 5,74. El índice final de refinamiento fue wR2 = 0,0962 y Rl = 0,0682 (wR2 = 0 , 0850 y Rl= 0,0412 para las reflexiones con I > 2 sigma ( I ) .
Se determinó que un cristal simple de N-(4-(7-azabiciclo [2,2.1] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida en Forma B tenía un sistema de cristal monoclínico, un grupo espacial V2\/c y las siguientes dimensiones de celdas unitarias: a = 13 , 5429(4) Á, b = 13, 4557(4) Á, c = 12,0592(4) Á, a = 90°, ß = 101,193° y ? = 90°.
E emplo 4B : Preparación de N- ( 4- ( 7-azabiciclo[ 2.2.1] heptan-7-il ) -2- ( trifluorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) - 1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida (Forma B-HC1) I (FORMA A-HC1) I (FORMA B-HCl) Se cargaron 100 mL de 2-metiltetrahidrofurano en un matraz de 3 cuellos que tiene una atmósfera de nitrógeno equipado con un agitador. El Compuesto I, Forma A-HC1 (55 g, 0,103 mol) se agregó al matraz y luego 349 mL de 2-metiltetrahidrofurano y comenzó a agitarse. Se agregaron 28 mL de agua al matraz y el matraz se entibió hasta alcanzar una temperatura interna de 60°C y se agitó durante 48 h. El matraz se enfrió hasta alcanzar temperatura ambiente y se agitó durante 1 h. La mezcla de reacción se filtró al vacio hasta que la torta de filtración estaba seca. La torta de filtración sólida se lavó con 2-metiltetrahidrofurano (4 vol ) dos veces. La torta de filtración sólida se sometió a succión por vacio durante un periodo de aproximadamente 30 minutos y se transfirió a una bandeja de secado. La torta de filtración se secó al vacio a 60°C, para proporcionar la Forma B-HC1 como un sólido cristalino blanco.
El difractograma de polvo de la Forma B-HC1 se muestra en la Figura 13.
La Tabla 9, a continuación, proporciona los picos del XRPD representativos de la Forma B-HCl.
Tabla 9. Picos de XRPD de la Forma B-HCl.
Se determinó que un cristal simple de la Forma B- HC1 tenia un sistema de cristal monoclínico, un grupo espacial P2i/a y las siguientes dimensiones de celdas unitarias: a = 12,57334(5) Á, b = 19,68634(5) Á, c = 8,39399(5) Á, a = 90°, a = 90,0554° y ? = 90°.
También se evaluó una muestra representativa de la Forma B-HCl utilizando microscopio.
En la Figura 14 se proporciona una curva de DSC para una muestra representativa de la Forma B-HCl.
En la Figura 15 se proporciona una curva de TGA para una muestra representativa de la Forma B-HCl.
Una muestra representativa de la Forma B-HCl proporcionó el espectro FTIR proporcionado en la Figura 16.
La Tabla 10 proporciona las absorciones FTIR características de la Forma B-HCl.
Tabla 10. Absorciones FTIR de la Forma B-HCl También se analizó una muestra representativa de la Forma B-HC1 utilizando (S) 13C y 19F NMR en estado sólido. Los respectivos espectros de la NMR se proporcionan en las Figuras 17 y 18. En las Tablas 11 y 12 que siguen a continuación se describen varios picos encontrados en los espectros de 13C SSNMR y 19F SSNMR.
Tabla 11. Picos de 13C SSNMR de la Forma B-HC1.
Tabla 12. Picos de iSF SSNMR de la Forma B-HC1 Ejemplo 4C: Preparación Alternativa de N-(4(7-azabiciclof 2.2.1 ] heptan-7-il ) -2-trifluorometil )fenil)-4-oxo-5- ( trif luorometil ) -1 , 4-dihidroquinolina-3-carboxamida ( Forma B-HC1 ) .
Se cargó la Forma A-HC1 (14,638 g, 27,52 mmol) en un matraz de fondo redondo de 100 mL. Se agregaron EtOH (248,9 mL) y agua ( 27,82 mL) . La suspensión blanca se calentó hasta alcanzar reflujo. Se obtuvo una solución clara a 77°C. La reacción se enfrió hasta alcanzar 45°C y se dejó agitar durante 30 min y luego se enfrió hasta alcanzar 20°C. La mezcla se dejó agitar durante 3 h más a 20°C. El producto se filtró y la torta se lavó con EtOH. El sólido se secó en un horno de vacio a 45°C con una purga de nitrógeno para proporcionar la Forma B-HC1 del Compuesto I, como un sólido blanco. El análisis mediante XRPD confirmó la identidad del sólido como la Forma B-HC1.
Cabe destacar que pueden usarse otras combinaciones de disolventes, tales como MeOH/H20 e IPA/H20 o similar en lugar de EtOH/H20 como se describe en este ejemplo. En la Tabla 13 se proporcionan ejemplos de combinaciones de disolventes alternativas.
Tabla 13. Otros disolventes que pueden usarse para hacer la fórmula B-HC1.
Disolvente Volumen de T[°C] disolvente MeOH 10 60 MeOH : H20 10:0,2 60 MeOH: H20 10:0,5 60 MeOH : H20 10:1 60 MeOH : H20 10:1,5 60 IPA: H20 10:1 75 IPA: H20 10:1,5 75 MeOH: H20 10:1 65 EtOH 10 70 EtOH: H20 10:0,2 70 EtOH: H20 10:0,5 70 EtOH: H20 10: 1 70 EtOH: H20 10:1,5 70 Cabe destacar también que en los Ejemplos 3A, 3B y 4A-4C puede utilizarse EtOAC en vez de 2-MeTHF como disolvente .
Ensayos para detectar y medir las propiedades de potenciación de AF508-CFTR de los compuestos Métodos ópticos del potencial de membrana para someter a ensayo las propiedades de modulación de AF508-CFTR de los compuestos El ensayo utiliza tintes de detección de voltaje fluorescente para medir los cambios en el potencial de membrana usando una lectora de placas fluorescente (por ejemplo, FLIPR III, Molecular Devices, Inc.) como una lectura para aumentar el AF508-CFTR funcional en las células NIH 3T3. La fuerza conductora para la respuesta es la creación de un gradiente iónico de cloruro junto con una activación de canal por una única etapa de adición de liquido después de que las células hayan sido previamente tratadas con compuestos y cargadas posteriormente con un tinte de detección de voltaje.
Identificación de compuestos potenciadores Para identificar a los potenciadores de AF508-CFTR, se desarrolló un formato de ensayo HTS de adición doble. Este ensayo HTS utiliza tintes de detección de voltaje para medir los cambios en el potencial de membrana por el FLIPR III como una medición para aumentar en abertura (conductancia) de AF508 CFTR en células NIH 3T3 de AF508 CFTR con corrección térmica. La fuerza conductora para la respuesta es un gradiente iónico CI" junto con una activación de canal con forskolina en una única etapa de adición de liquido usando una lectora de placas fluorescente tal como FLIPR III después de que las células hayan sido previamente tratadas con compuestos potenciadores (o testigo vehículo de DMSO) y posteriormente cargadas con un tinte de redistribución.
Soluciones Solución del baño No. 1: (en mM) NaCl 160, KC1 4,5, CaCl2 2, MgCl2 1, HEPES 10, pH 7,4 con NaOH .
Una alternativa de la Solución del Baño No. 1 incluye una solución del baño donde las sales de cloruro son sustituidas por sales de gluconato.
Cultivo celular Se usaron fibroblastos NIH3T3 de ratón que expresaban de manera estable la mutación AF508-CFTR para las mediciones ópticas del potencial de membrana. Las células se mantienen a 37°C en 5% de C02 y 90% de humedad en medio de Eagle modificado de Dulbecco complementado con glutamina 2 mM, 10% de suero bovino, NEAA lx, ß-??, pen/estrep lx y HEPES 25 mM en matraces de cultivo de 175 cm2. Para todos los ensayos ópticos, se sembraron 20.000 células por pocilio en placas recubiertas con matrigel de 384 pocilios y se cultivaron durante 2 horas a 37°C antes de cultivarlas a 27°C durante 24 horas para el ensayo de los potenciadores . Para los ensayos de corrección, las células se cultivan a 27 °C o 37 °C con y sin compuestos durante 16 - 24 h.
Ensayos electrofisiológicos para someter a ensayo las propiedades de modulación de AF508-CFTR de los compuestos . 1. Ensayo de cámara de Ussing Se llevaron a cabo experimentos con cámara de Ussing en células epiteliales polarizadas de las vias respiratorias que expresaban AF508-CFTR para realizar una caracterización adicional de los moduladores de AF508-CFTR identificados en los ensayos ópticos. Se aislaron epitelios de FQ y que no eran de FQ de tejido bronquial, se cultivaron como se describió anteriormente (Galietta, L.J.V., Lantero, S., Gazzolo, A., Sacco, 0., Romano, L . , Rossi, G.A., & Zegarra- oran, 0. (1998) In Vitro Cell. Dev. Biol. 34,478-481), y se colocaron en placas sobre filtros Costar® Snapwell™ que se pre-recubrieron con medios acondicionados con NJH3T3. Después de cuatro días, se eliminaron los medios apicales y las células se cultivaron en una interfaz de aire-liquido durante >14 días antes de sus uso. Esto resultó en una monocapa de células cilindricas completamente diferenciadas que fueron aciliadas, rasgos que son característicos de los epitelios de las vías respiratorias. Se aislaron aquellos que no eran de CF-HBE de no fumadores que no tenían ninguna enfermedad pulmonar conocida. Se aislaron CF-HBE de pacientes homocigotas para AF508-CFTR .
El HBE cultivado sobre insertos de cultivo celular Costar® Snapwell™ se montó en una cámara Ussing (Physiologic Instruments, Inc., San Diego, CA) , y la resistencia transepitelial y la corriente de corto circuito en presencia de un gradiente CI" basolateral a apical (Isc) se midieron usando un sistema de fijación de voltaje (Departamento de Bioingeniería, Universidad de Iowa, IA) . Brevemente, se examinó HBE en condiciones de registro de fijación de voltaje (Vhoid = 0 mV) a 37°C. La solución basolateral contenía (en mM) 145 de NaCl, 0,83 de K2HP04, 3,3 de KH2P04, 1,2 de MgCl2, 1,2 de CaCl2/ 10 de glucosa, 10 de HEPES (pH ajustado a 7,35 con NaOH) y la solución apical contenía (en mM) 145 de NaGluconato, 1,2 de MgCl2, 1,2 de CaCl2, 10 de glucosa, 10 de HEPES (pH ajustado a 7,35 con NaOH).
Identificación de los compuestos potenciadores Para el protocolo típico se utilizó un gradiente de concentración de Cl" en la membrana basolateral a apical. Para preparar este gradiente, se usaron soluciones normales de Ringers en la membrana basolateral, mientras que el NaCl apical se reemplazó con gluconato de sodio equimolar (titulado a pH 7,4 con NaOH) para obtener un gradiente con gran concentración de Cl" en todo el epitelio. Se añadieron forskolina (10 µ ) y todos los compuestos de prueba en el lado apical de los insertos de cultivo celular. La eficacia de los posibles potenciadores de &F508-CFTR se comparó con la del potenciador conocido, la genisteína. 2. Registros de fijación de parche La corriente Cl" total en células ñF508-NIH3T3 se monitoreó usando la configuración de los registros de parche perforado como se describió anteriormente (Rae, J., Cooper, K., Gates, P., & Watsky, M. (1991) J. Neurosci. Methods 37, 15-26). Los registros de fijación de voltaje se realizaron a 22 °C usando un amplificador de fijación de parche Axopatch 200B (Axon Instruments Inc., Foster City, CA) . La solución de pipeta contenia (en mM) 150 N-metil-D-glucamina (NMDG)-Cl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES y 240 ug/mL de anfotericina-B (pH ajustado a 7,35 con HC1). El medio extracelular contenia (en mM) 150 NMDG-C1,2 MgCl2,2 CaCl2,10 HEPES ( pH ajustado a 7,35 con HC1). La generación de pulsos, adquisición de datos y análisis se realizaron usando una PC equipada con una interfaz Digidata 1320 A/D junto con Clampex 8 (Axon Instruments Inc.) . Para activar AF508-CFTR, se agregaron 10 juM de forskolina y 20 µ? de genisteina al baño y se midió la relación entre la corriente y el voltaje cada 30 seg .
Identificación de los compuestos potenciadores Se investigó además la capacidad de los potenciadores de AF508-CFTR de aumentar la corriente Cl~ macroscópica de AF508-CFTR (IAFSOS) en células NIH3T3 que expresaban de manera estable la mutación AF508-CFTR, mediante las técnicas de registro de parche perforado. Los potenciadores identificados en los ensayos ópticos evocaron un aumento dependiente de la dosis en I¿F508 con una potencia y eficacia similar a la observada en los ensayos ópticos. En todas las células examinadas, el potencial de reversión antes y durante la aplicación del potenciador fue aproximadamente de -30 mV, que es el valor de ECi calculado (-28 mV) .
Cultivo celular Se usaron fibroblastos de NIH3T3 de ratón que expresaban de manera estable la mutación AF508-CFTR para los registros de células enteras. Las células se mantuvieron a 37°C en 5% de C02 y 90% de humedad en medio de Eagle modificado por Dulbecco y complementado con glutamina 2 mM, 10% de suero bovino, NEAA lx, ß-??, pen/estrep lx y HEPES 25 mM en matraces de cultivo de 175 cm2. Para los registros de células enteras, se sembraron 2500-5000 células en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina y se cultivaron durante 24-48 horas a 27°C antes de usarse para analizar la actividad de los potenciadores . Se incubaron con y sin el compuesto de corrección a 37°C para medir la actividad de los correctores . 3. Registros de canal único La actividad de abertura de t-CFTR y AF508-CFTR con corrección térmica expresada en células NIH3T3 se observó usando registros de parche de membrana de adentro hacia afuera como se describió anteriormente (Dalemans, ., Barbry, P., Champigny, G., Jallat, S., Dott , K . , Dreyer, D. , Crystal, R.G., Pavirani, A., Lecocq, J-P . , Lazdunski, M. (1991) Nature 354,526 - 528) usando un amplificador de fijación de parche Axopatch 200B. La pipeta contenia (en mM) : 150 de NMDG, 150 de ácido aspártico, 5 CaCI2, 2 MgCl2 y 10 HEPES (pH ajustado a 7,35 con base Tris). El baño contenia (en mM) : 150 de NMDG-CI, 2 de MgCl2, 5 de EGTA, 10 de TES y 14 de base Tris (pH ajustado hasta 7,35 con HC1). Después de la escisión, tanto wt como AF508-CFTR se activaron agregando 1 mM de Mg-ATP, 75 nM de la subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA; Promega Corp. Madison, WI) y 10 mM de NaF para inhibir las fosfatasas de proteína, que evitaron la interrupción de la corriente. El potencial de la pipeta se mantuvo a 80 mV. La actividad de los canales se analizó a partir de parches de membrana que contenían < 2 canales activos. La cantidad máxima de aberturas simultáneas determinó la cantidad de canales activos durante el transcurso de un experimento. A fin de determinar la amplitud de la corriente de canal único, los datos registrados de 120 segundos de actividad de AF508-CFTR se filtraron fuera de línea a 100 Hz y luego se usaron para construir histogramas de amplitud de todos los datos que se ajustaron con funciones multigaussianas usando el software Bio-Patch Analysis (Bio-Logic Comp. Francia). La corriente microscópica total y la probabilidad abierta (P0) se determinaron a partir de 120 segundos de actividad de los canales. La PQ se determina usando el software Bio-Patch o a partir de la relación PD = l/i(N), donde I = significa corriente, i = amplitud de corriente de canal único, y N = cantidad de canales activos en el parche .
Cultivo celular Se usaron fibroblastos NIH3T3 de ratón que expresaban de manera estable la mutación AF508-CFTR para los registros de fijación de parche escindido de membrana. Las células se mantienen a 37°C en 5% de C02 y 90% de humedad en medio de Eagle modificado por Dulbecco y complementado con glutamina 2 mM, 10% de suero bovino fetal, NEAA lx, ß-??, pen/estrep lx y HEPES 25 mM en matraces de cultivo de 175 cm2. Para los registros de canal único, se sembraron 2500-5000 células en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina y se cultivaron durante 24-48 horas a 27°C antes de usarse.
La Forma A del Compuesto I es útil como modulador de los transportadores del cassette de unión a ATP. Se midió que el valor de CE50 (µp?) del Compuesto I, Fórmula A fue de menos de 2,0 µ?. Se calculó que la eficacia del Compuesto I, Forma A fue de 100% a 25%. Cabe destacar que el 100% de eficacia es la respuesta máxima obtenida con el 4-metil-2- ( 5-fenil-lH-pirazol-3-il) fenol.

Claims (37)

REIVINDICACIONES
1. N-(4-(7-azabiciclo[2.2.1]heptan-7-il)-2-( trifluorometil ) fenil ) -4-oxo-5- ( trifluorometil ) -1 , 4-di h idroqu ino 1 i n- 3 -c arboxamida caracterizada como la Forma A-HC1.
2. La Forma A-HC1 según la reivindicación 1, en donde la Forma A-HC1 se caracteriza por uno o más picos en un patrón de difracción de polvo de rayos X seleccionados del grupo que consiste de un pico a aproximadamente 7.1 grados, un pico a aproximadamente 21. 2 gr ados , un pico entre aproximadamente 6.9 y 7.3 grados , un pico entre aproximadamente 8.0 y 8.4 grados , un pico entre aproximadamente 13.9 y 14. 3 grados, un pico entre aproximadamente 21.0 y 21. 4 grados , u n pico entre aproximadamente 14.5 y 14. 9 grados , un pico entre aproximadamente 16.2 y 16. 6 grados, un pico entre aproximadamente 18.5 y 18.9 grados , y un pico entre aproximadamente 22.6 y 23.0 grados .
3. La Forma A-¦HC1 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la Forma A-HC1 se caracteriza por un pico entre aproximadamente 6.9 y 7.3 grados, un pico entre aproximadamente 8.0 y 8.4 grados, un pico entre aproximadamente 13.9 y 14.3 grados, y un pico entre aproximadamente 21.0 y 21.4 grados en un patrón de difracción de polvo de rayos X .
4. La Forma A-HC1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la Forma A-HC1 se caracteriza por uno o más picos en un espectro 13C NMR seleccionados del grupo que consiste de un pico a aproximadamente 163.7 ppm, un pico a aproximadamente 137.2 ppm, y un pico a aproximadamente 121.5 ppm.
5. La Forma A-HC1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 , en donde la Forma A-HC1 se caracteriza por un pico a aproximadamente 163.7 ppm, un pico a aproximadamente 137.2 ppm, y un pico a aproximadamente 121.5 ppm en un espectro 13C NMR.
6. La Forma A-HC1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 , en donde la Forma A-HC1 se caracteriza por uno o más picos en un espectro 19F NMR seleccionados del grupo que consiste de un pico a aproximadamente -57.0 ppm y un pico a aproximadamente -60.5 ppm .
7. La Forma A-HC1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , en donde la Forma A-HC1 se caracteriza por un monocristal que se determina para poseer un sistema de cristales monoc 1 i nicos ; un grupo espacial P2i/c; y las siguientes dimensiones de la célula unitaria: a = 13.6175(4) Á; b = 21.614(3) Á; c = 8.3941(4) Á; a = 900 ; ß = 112.303°; y ? = 90°.
8. Una composición farmacéutica que comprende la Forma A-HC1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.
9. N-(4-(7-azabiciclo[2.2.1]heptan-7-il)-2-( tr i f luorome ti 1 )fenil)-4-oxo-5-( tr i f luorome t l ) - 1 , 4-dihidroquinolin-3-carboxamida caracterizada como la Forma B.
10. La Forma B según la reivindicación 9, en donde la Forma B se caracteriza por uno o más picos patrón de difracción de polvo de rayos seleccionados del grupo que consiste de un pico entre aproximadamente 6. 5 y 6.9 grados , un pico entre aproximadamente 9. 2 y 9.6 grados , un pico entre aproximadamente 11 .0 y 11. 4 grados , un pico entre aproximadamente 13 .2 y 13. 6 grados , un pico entre aproximadamente 15 .0 y 15. 4 grados , un pico entre aproximadamente 17 .0 y 17. 4 grados , un pico entre aproximadamente 17 .6 y 18. 0 grados , un pico entre aproximadamente 17 .9 y 18. 3 grados , un pico entre aproximadamente 19 .1 y 19. 5 grados , un pico entre aproximadamente 19 .9 y 20. 3 grados , un pico entre aproximadamente 21 .0 y 21. 5 grados , un pico entre aproximadamente 21 .8 a 22. 2 grados , un pico entre aproximadamente 23 .8 y 24. 2 grados , un pico entre aproximadamente 26 .0 y 26. 4 grados , un pico entre aproximadamente 27 .1 y 27. 5 grados , un pico entre a roximadamente 27 .5 y 27.9 grados , y un pico entre aproximadamente 28. 7 y 29.1 grados .
11. La Forma B según la reivindicación 9, en donde la Forma B se caracteriza por un pico entre aproximadamente 6.5 y 6.9 grados; un pico entre aproximadamente 9.8 y 10.2 grados; un pico entre aproximadamente 11.0 y 11.4 grados; un pico entre aproximadamente 13.2 y 13.6 grados; y un pico entre aproximadamente 23.8 y 24.2 grados en difracción de polvo de rayos X.
12. La Forma B según la reivindicación 9 o la reivindicación 11, en donde la Forma B se caracteriza por un pico a aproximadamente 6.7 grados; un pico a aproximadamente 10.0 grados; un pico a aproximadamente 11.2 grados; un pico a aproximadamente 13.4 grados; y un pico a aproximadamente 24.2 grados en una difracción de polvo de rayos X.
13. La Forma B según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde la Forma B se caracteriza por uno o más picos en un espectro 13C NMR seleccionados del grupo que consiste de un pico a aproximadamente 165.3 ppm, un pico a aproximadamente 145.9 ppm, un pico a aproximadamente 132.9 ppm, y un pico entre aproximadamente 113.4 ppm.
14. La Forma B según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en donde la Forma B se caracteriza por un pico a aproximadamente 165.3 ppm, un pico a aproximadamente 145.9 ppm, un pico a aproximadamente 132.9 ppm, y un pico a aproximadamente 113.4 ppm en un espectro 13C NMR .
15. La Forma B según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en donde la Forma B se caracteriza por uno o más picos en un espectro 19F NMR seleccionados del grupo que consiste de un pico a aproximadamente -56.1 ppm y un pico a aproximadamente -62.1 ppm en un espectro 19F NMR.
16. La Forma B según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en donde la Forma B se caracteriza por un monocristal determinado para poseer un sistema de cristales monoc 1 inicos , un grupo espacial P21/c, y las siguientes dimensiones de la célula unitaria: a = 13.5429(4) Á; b = 13.4557(4) Á; c - 12.0592(4) Á; a = 90 ° ; ß = 101.193°; y ? = 90°.
17. Una composición farmacéutica que comprende la Forma B según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, y un adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.
18. N-(4-(7-azabiciclo[2.2.1 ]heptan-7-il)-2-( trif luorometil )f enil ) -4-oxo-5-( tr i f luororne t i 1 ) - 1 , 4 -dihidroquinolin-3-carboxamida caracterizada como la Forma B-HC1.
19. La Forma B-HC1 según la reivindicación 18, en donde la Forma B-HC1 se caracteriza por uno o más de los siguientes: un pico entre aproximadamente 8.1 y 8.5 grados, un pico entre aproximadamente 14.6 y 15. , 1 grados, un pico entre aproximadamente 16. 5 y 16 .9 g ados , un pico en re aproximadamente 17. 6 y 18 .4 grados , 2 picos entre aproximadamente 21. 4 y 22 .1 grados , 2 picos entre aproximadamente 22. 8 y 23 .8 grados , 2 picos ent e aproximadamente 24. 7 y 25 .4 grados , un pico entre aproximadamente 26. 1 y 27 .3 grados , un pico entre aproximadamente 30. 9 y 31 .3 grados , y 1un pico entre aproximadamente 38 , , 2 y 38 .7 grados en un patrón de difracción de polvo de rayos X.
20. La Forma B-HC1 según la reivindicación 18 o la reivindicación 19, en donde la Forma B-HC1 se caracteriza por un pico entre aproximadamente 8.1 y 8.5 grados , un pico entre aproximadamente 14 .6 y 15 .1 grados , un pico entre aproximadamente 16. 5 y 16 .9 grados , 3 picos entre aproximadamente 17. 6 y 18 .4 grados , 2 picos entre aproximadamente 21. 4 y 22 .1 grados , 2 picos entre aproximadamente 22. 8 y 23 .8 grados , 2 picos entre aproximadamente 24. 7 y 25 .4 grados , un pico entre aproximadamente 26. 1 y 27 .3 grados , un pico entre aproximadamente 30. 9 y 31 .3 grados , y 'un pico entre aproximadamente 38 .2 y 38 .7 grados en un patrón de difracción de polvo de rayos X .
21. La Forma B-HC1 según la reivindicación 18, en donde la Forma B-HCl se caracteriza por un pico entre aproximadamente 8.1 y 8.5 grados; un pico entre aproximadamente 8.8 y 9.2 grados; un pico entre aproximadamente 12.8 y aproximadamente 13.2 grados; un pico entre aproximadamente 17.8 y 18.2 grados; y un pico entre aproximadamente 22.8 y 23.2 grados en una difracción de polvo de rayos X.
22. La Forma B-HCl según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde la Forma B-HCl se caracteriza por uno o más picos en un espectro 13C NMR seleccionados del grupo que consiste de un pico a aproximadamente 168.2 ppm, un pico a aproximadamente 148.7 ppm, un pico a aproximadamente 138.8 ppm, un pico a aproximadamente 119.8 ppm, y un pico a aproximadamente 23.9 ppm.
23. La Forma B-HC1 según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en donde la Forma B-HC1 se caracteriza por un pico a aproximadamente 168.2 ppm, un pico a aproximadamente 148.7 ppm, pico a aproximadamente 138.8 ppm, un pico a aproximadamente 119.8 ppm, y un pico a aproximadamente 23.9 ppm en un espectro 13C NMR.
24. La Forma B-HC1 según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, en donde la Forma B-HC1 se caracteriza por uno o más picos en un espectro 19F NMR seleccionados del grupo que consiste de un pico a aproximadamente -55.6 ppm y un pico a aproximadamente -62.0 ppm en un espectro 19F NMR.
25. La Forma B-HCl según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en donde la Forma B-HCl se caracteriza por un monocristal determinado para poseer un sistema de cristales monoc línicos , un grupo espacial P2i/a, y las siguientes dimensiones de la célula unitaria: a = 12.57334(5) Á; b = 19.68634(5) Á; c = 8.39399(5) Á; a = 90°; ß = 90.0554°; y ? = 90°.
26. Una composición farmacéutica que comprende la Forma B-HCl según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, y un adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.
27. Un método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente, en donde la enfermedad se selecciona de fibrosis quistica, asma, COPD inducida por fumar, bronquitis crónica, rinosinusit is , estreñimiento, pancreatitis, insuficiencia pancreática, esterilidad masculina provocada por ausencia bilateral congénita del vaso deferente (CBAD), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA), enfermedad hepática, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de fibrinólisis por coagulación, tales como deficiencia por la proteina C, angioederaa hereditario Tipo 1, deficiencias en el procesamiento de lipidos, tales como hipercoles terolemia Familiar, quilomicronemia Tipo 1, abet a 1 ipoprotei nemi a , enfermedades por almacenamiento lisosómico, tales como enfermedad por células I / seudo-Hur ler , mucopolisacaridosis, Sandhof /Tay-Sachs , Crigler- Najjar tipo II, poliendocrinopatia/hiperinsulinemia , Diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiencia de mieloperoxidasa , hipoparat iroidismo primario, melanoma, glucanosis CDG tipo 1, hipertiroidismo congénito, osteogénesis imperfecta, hipof ibr inogenemia hereditaria, deficiencia ACT, Diabetes insípida (DI), DI neurohipo f i s ar i a , DI nefrogénica, síndrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Pelizeus-Merzbacher , enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, diversos trastornos neurológicos por poliglutamina tales como Hunt ingt on ' s , ataxia espinocerebelosa tipo 1, atrofia muscular medular y bulbar, atrofia pa 1 ido lu i s i ana dent atorúbr ica y distrofia miotónica, así como encefalopatías espongiformes, tales como la enfermedad de Creut zf eldt- Jakob hereditaria (debida a un defecto en el procesamiento de la proteina prión), enfermedad de Fabry, síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker , COPD, enfermedad de queratocon j unt ivit is seca, o enfermedad de Sjogren, Os teoporos is , Osteopenia, curación ósea y crecimiento óseo (incluyendo reparación ósea, regeneración ósea, reducir la resorción ósea y aumentar la deposición ósea), Síndrome de Gorham's, canalopatías de cloruro tales como miotonía congénita (formas Thomson y Becker), síndrome de Bartter tipo III, enfermedad de Dent, epilepsia, hiperekplexia , enfermedad por almacenamiento lisosómico, Síndrome de Angelman, y Discinesia Ciliar Primaria (PCD), un término para trastornos hereditarios de la estructura y/o función de los cilios, incluyendo PCD con situs inversus (también conocido como síndrome de Kartagener), PCD sin situs inversus y aplasia ciliar, el método comprende el paso de administrar al paciente una cantidad eficaz de la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HC1 según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 9-16, o 18-25, o cualquier combinación de estas formas .
28. El método según la reivindicación 27, en donde la enfermedad es fibrosis quistica.
29. Un método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente, en donde la enfermedad se asocia con la función reducida del CFTR debida a mutaciones en el gen que codifica para el CFTR o factores ambientales, y en donde la enfermedad es fibrosis quistica, bronquitis crónica, bronquitis recurrente, bronquitis aguda, esterilidad masculina provocada por ausencia bilateral congénita del vaso deferente (CBAVD), esterilidad femenina provocada por ausencia congénita del útero y vagina (CAUV), pancreatitis crónica idiopática (ICP), pancreatitis recurrente idiopática, pancreatitis aguda idiopática, rinosinusitis crónica, colangitis esclerosante primaria, aspergilosis broncopulmonar alérgica, diabetes, queratocon j unt ivit is seca, estreñimiento, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA), enfermedades óseas, y asma, el método comprende el paso de administrar al paciente una cantidad eficaz de la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HC1 según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 9-16, o 18-25, o cualquier combinación de estas formas .
30. Un método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad en un paciente, en donde la enfermedad se asocia con la función normal del CFTR, el método comprende el paso de administrar al paciente una cantidad eficaz de la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HCl según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 9-16, o 18-25, o cualquier combinación de estas formas.
31. El método según la reivindicación 30, en donde la enfermedad es enfermedad pulmonar crónica obstructiva (COPD) , bronquitis crónica, bronquitis recurrente, bronquitis aguda, rinosinusitis , estreñimiento, pancreatitis crónica, pancreatitis recurrente, y pancreatitis aguda, insuficiencia pancreática, esterilidad masculina provocada por ausencia bilateral congénita del vaso deferente (CBAVD) , enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopática, enfermedad hepática, enfisema hereditario, cálculos biliares, enfermedad de reflujo gas troesof ágico , malignidades gastrointestinales, enfermedad inflamatoria del intestino, estreñimiento, diabetes, arthritis, os t eoporos i s , y osteopenia.
32. El método según la reivindicación 30, en donde la enfermedad es hemocromatos i s hereditaria, deficiencias de fibrinólisis por coagulación, tales como deficiencia por la proteina C, angioedema hereditario Tipo 1, deficiencias en el procesamiento de lípidos, tales como hipercoles terolemia familiar, qui lomicronemia Tipo 1, abetalipoproteinemia , enfermedades por almacenamiento lisosómico, tales como la enfermedad por células I / seudo-Hur ler , mucopolisacaridosis, Sandhof /Tay-Sachs , Crigler- Najjar tipo II, poliendocrinopatí a/hiperinsulinemia , Diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiencia de mieloperoxidasa , hipoparatiroidismo primario, melanoma, glucanosis CDG tipo 1, hipertiroidismo congénito, osteogénesis imperfecta, hipof ibr inogenemia hereditaria, deficiencia ACT, Diabetes insípida (DI), DI neurohipof isaria , DI nefrogénica, síndrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Pelizeus-Merzbacher , enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, diversos trastornos neurológicos por poliglutamina tales como Hunt ingt on ' s , ataxia espinocerebelosa tipo 1, atrofia muscular medular y bulbar, atrofia palidoluisiana dentatorúbrica y distrofia miotónica, así como encefalopatías espongiformes, tales como la enfermedad de Creutzf eldt-Jakob hereditaria (debida a un defecto en el procesamiento de la proteína prión), enfermedad de Fabry, síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker , Síndrome de Gorham's, canalopatías de cloruro, miotonía congénita (formas Thomson y Becker), síndrome de Bartter tipo III, enfermedad de Dent, hiperekplexia , epilepsia, enfermedad por almacenamiento lisosómico, Síndrome de Angelman, Discinesia Ciliar Primaria (PCD), PCD con situs inversus (también conocido como síndrome de artagener), PCD sin situs inversus y aplasia ciliar, o enfermedad de Sjogren.
33. Un método para modular la actividad del CFTR en una muestra biológica que comprende el paso de poner en contacto el CFTR con la Forma A-HC1, la Forma B, la Forma B-HC1 según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 9-16, o 18-25, o cualquier combinación de estas formas.
34. El método según la reivindicación 27 a 32, en donde el paciente posee un receptor transmembrana de fibrosis quística (CFTR) con una mutación del homocigoto AF508.
35. El método según la reivindicación 27 a 32, en donde el paciente posee un receptor transmembrana de fibrosis quística (CFTR) con una mutación del homocigoto G551D.
36. El método según la reivindicación 27 a 32, en donde el paciente posee un receptor transmembrana de fibrosis quística (CFTR) con una mutación del heterocigoto ñF508.
37. El método según la reivindicación 27 a 32, en donde el paciente posee un receptor transmembrana de fibrosis quística (CFTR) con una mutación del heterocigoto G551D.
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