CN102210653A - 牛蒡苷元的微乳制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，涉及一种微乳制剂。具体而言，本发明涉及包含牛蒡苷元和微乳载体的微乳制剂，其中所述微乳载体包含油相和乳化剂，所述微乳的平均粒径为10～90nm。本发明的牛蒡苷元的微乳制剂可明显提高牛蒡苷元的口服生物利用度和对肿瘤的抑制作用。

Description

牛蒡苷元的微乳制剂
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种微乳制剂。具体而言，本发明涉及牛蒡苷元的微乳制剂。
背景技术
牛蒡子为菊科植物牛蒡的干燥成熟果实，是常用中药，具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的功能，用于风热感冒、咳嗽痰多、麻疹、风疹、咽喉肿痛、痒腮丹毒、痈肿疮毒。该中药含有木脂素类化合物，主要是牛蒡苷(arctiin)和牛蒡苷元(arctigenin)等。虽然牛蒡苷元(也称牛蒡子苷元)在牛蒡子中的含量很低，但是其前体牛蒡苷在中药牛蒡和毛头牛蒡果实中含量较高，所以通过牛蒡苷转化可以获得大量的牛蒡苷元。据文献报道，牛蒡苷在体内被分解为牛蒡苷元而产生众多药理作用，并且牛蒡苷元比牛蒡苷具有更强的生物活性，比如显著的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗PAF受体及钙拈抗活性。
牛蒡苷元为白色粉末或无色块状结晶，在氯仿、甲醇、乙醇等有机溶剂中易溶，在石油醚中难溶，熔点为111-112℃。不易挥发，空气中不易被氧化，物理及化学性质均较为稳定。但牛蒡苷元难溶于水，生物利用度低，在一定程度上限制了其作为新药的应用。牛蒡苷元的分子结构如下：
Figure BDA0000053491440000011
关于牛蒡苷元在小鼠、家兔体内的药物动力学特征已有报道。对牛蒡苷元小鼠胃肠道吸收、家兔静脉注射、灌胃牛蒡苷元的药物动力学特征以及牛蒡苷元在大鼠体内分布研究结果表明：(1)牛蒡苷元在胃肠道内较为稳定，转化、破坏较少。(2)家兔静脉注射不同剂量牛蒡苷元时，各剂量的半衰期T1/2等主要动力学参数十分接近，且药-时曲线下面积(AUC)随剂量增加而成比例增加，说明牛蒡苷元的消除为线性动力学；(3)家兔灌胃牛蒡苷元的绝对生物利用度为9.5％；(4)牛蒡苷元在大鼠体内分布广泛，在肝、肺中分布浓度较高，其次为心、脾、肾等。血浆蛋白结合率实验表明，牛蒡苷元与大鼠血浆蛋白平均结合率为78.3％。
家兔灌胃给药的生物利用度仅仅为9.5％，分析主要的原因在于牛蒡苷元属于脂溶性化合物，水溶性较差，才导致口服生物利用度很低。发明专利申请公布说明书CN 101036644A公开了一种含牛蒡子苷元的药物组合物，该发明将牛蒡苷元包合在环糊精衍生物中，以解决牛蒡子苷元水溶性差及其生物利用度低的问题。发明专利申请公布说明书CN101036643A也公开了一种含牛蒡子苷元的药物组合物，该药物组合物包含牛蒡苷元、油、乳化剂和水，具体的提供的是一种口服或静脉乳剂，该乳剂的平均粒径均大于100nm，每100ml乳剂中含牛蒡苷元0.05-2.0g、油5-20g、乳化剂0.5-5.0g、油酸0.02-0.2g，余量为水。
微乳给药系统是由药物、油相(即油相组分)、水、乳化剂以及助乳化剂以适当比例混合形成的一种混合物，平均粒径为10-100nm，体外可形成热力学稳定体系，由乳化剂以及助乳化剂共同起稳定作用；对水溶性、脂溶性及难溶性药物均有较好的溶解力，物理稳定性较高；因表面张力较低，故易透过胃肠壁的水化层，药物可直接和胃肠上皮细胞接触，促进药物吸收，提高生物利用度；口服后可经淋巴管吸收，克服了首过效应及大分子通过胃肠道上皮细胞膜时的障碍。
但是，微乳的制备也存在很多的困难。由于微乳中需要大量的乳化剂，随着乳化剂含量的增高及其在体内的蓄积势必产生一定的毒性，并且助乳化剂、油相及它们之间的配比关系都会对微乳的粒径及其稳定性产生重大的影响。
发明内容
为提高牛蒡苷元的水溶性及其在体内的口服生物利用度，本发明提供了牛蒡苷元的一种新型微乳制剂。本发明所述的微乳粒径大小均匀，一般为10-100nm。本发明通过利用微乳作为牛蒡苷元的药物载体，将其制备成为牛蒡苷元微乳浓缩物，也可以加入赋形剂将其制备成含有牛蒡苷元的各种微乳制剂，包括固体微乳制剂和液体微乳制剂。
本发明的牛蒡苷元的微乳制剂，含有牛蒡苷元和微乳载体，所述微乳载体包含油相和乳化剂，所述微乳制剂的平均粒径为10-90nm。牛蒡苷元与微乳载体组成牛蒡苷元的微乳浓缩物。根据本发明的牛蒡苷元的微乳制剂，其中所述微乳载体可以进一步含有赋形剂。本发明所述的牛蒡苷元微乳浓缩物在室温下可以为液体、固体或半固体。本发明的微乳制剂包含牛蒡苷元和微乳载体，所述微乳载体包括油相和乳化剂，还可以进一步包括助乳化剂，优选地，在本发明的微乳制剂中牛蒡苷元、油相、乳化剂和助乳化剂重量比为：牛蒡苷元1-10份、油相5-85份、乳化剂20-60份、助乳化剂5-60份。本发明还分别对油相、乳化剂和助乳化剂分别进行优选。
油相对于牛蒡苷元微乳制剂是必不可少的组分之一。油相可促进药物在体内的转运，增强人体的吸收，提高药物的生物利用度。一定范围内，油相分子体积越大，对药物的溶解力越强，但油相分子体积过大不能形成微乳。为了增加药物溶解度，增大微乳形成区域，应选择与药物相适应的油相。
优选地，上述微乳制剂的油相为固体或半固体油相组分，其选自脂肪酸甘油酯、醇酯、脂肪醇和多糖基化的饱和甘油酯中的一种或几种。进一步优选地，脂肪酸甘油酯选自氢化椰油甘油酯、氢化棕榈油PEG-6酯和氢化棕榈橄榄油PEG-6酯中的一种或多种，醇酯选自丙二醇硬脂酸酯、PEG-2-硬脂酸酯和鲸蜡醇十六酸酯中的一种或多种，脂肪醇为肉豆蔻醇，多糖基化的饱和甘油酯为月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯。
优选地，上述微乳制剂的油相为液体油相组分，其选自甘油酯类、天然植物油及其级分、精油、挥发油和合成油中的一种或多种。甘油酯类为单甘油酯和二甘油酯的混合物、辛酸甘油酯、中链脂肪酸甘油酯、单亚油酸甘油酯或辛癸酸甘油酯，所述的天然植物油及其级分为红花油、芝麻油、玉米油、蓖麻油、椰子油、棉籽油、大豆油、柠檬油、薄荷油、薄荷醇、香芹芬、麝香草酚或它们的任意混合物，挥发油为留兰香油、丁香油、柠檬油、薄荷油或它们的任意混合物，合成油为三醋精、丁酸乙酯、辛酸油酸乙酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、辛酸乙酯或它们的任意混合物。
对上述油相的优选主要是为了增加牛蒡苷元在油相中的溶解度，增大微乳形成区域。上述所有的“优选”均表示在保证牛蒡苷元有较大溶解度的前提下，尽可能的选择具有更大微乳形成区域的油相。优选的组分具有更强的溶解牛蒡苷元的能力和形成较大微乳区域的能力。
乳化剂为牛蒡苷元微乳制剂必不可少的组分之一。乳化剂一般为具有表面活性的物质及它们的混合物，可以是离子的、非离子的或两性离子的表面活性剂，其具有降低界面张力形成界面膜，促使微乳形成。并不是所有的表面活性剂都适合作为本发明微乳的组分。
本发明经过药剂学研究试验发现，本发明所用到的乳化剂优选为壬基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、脱水山梨醇衍生物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯烷基醚、聚甘油脂肪酸酯和亚烷基多元醇酯中的一种或多种。聚氧乙烯脂肪酸酯为聚氧乙烯硬脂酸酯、PEG-40-硬脂酸酯或它们的混合物，脱水山梨醇衍生物为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80或它们的混合物，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为泊洛沙姆，聚氧乙烯烷基醚为聚氧乙烯-2-鲸蜡基醚、聚氧乙烯-10-鲸蜡基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚、聚氧乙烯-23-月桂基醚、聚氧乙烯-20-油基醚、聚氧乙烯-2-硬脂基醚、聚氧乙烯-10-硬脂基醚、聚氧乙烯-20-硬脂基醚或它们的混合物，聚甘油脂肪酸酯为十甘油单硬脂酸酯、六甘油单硬脂酸酯、四甘油单硬脂酸酯或它们的混合物，亚烷基多元醇酯为硬脂酰基、月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯或它们的混合物。
优选地，上述聚氧乙烯烷基醚为聚氧乙烯-23-月桂基醚或聚氧乙烯-20-油基醚。
自乳化药物传递系统(SEDDS)要在胃肠道内自乳化并维持乳剂状态，处方中需要有大量的乳化剂，但乳化剂量大可能会刺激胃肠道，所以应充分考虑乳剂的安全性。因此对于乳化剂的优选是结合药剂学和药物药理毒理研究，选择毒性、刺激性和溶血反应小的乳化剂，并且其具有更强的降低界面张力的能力。上述乳化剂的“优选”均表示对乳化剂安全性和乳化能力的筛选。优选的组分具有更强的安全性和乳化能力。
在优选的实施方式中，本发明的牛蒡苷元微乳制剂还包含助乳化剂。助乳化剂一般为具有表面活性的物质。助乳化剂既可增加膜的柔顺性，有利微乳乳滴界面膜的形成，又可增大乳化剂的溶解度，进一步降低界面张力，有利于微乳的稳定。在本发明中使用的助乳化剂为中等链长的醇类或HLB值适宜的非离子型表面活性剂极性有机物。
本发明的助乳化剂为以下组分之一或它们的任意混合物：短链醇、有机氨、烷基素酸、单双烷基酸甘油酯和聚氧乙烯脂肪酸酯。优选地，助乳化剂为短链醇，它选自聚乙二醇、正丁醇、正己醇、乙醇、乙二醇、丙二醇和甘油中的一种或几种。进一步优选地，助乳化剂为乙醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或1，2-丙二醇。
对于助乳化剂的优选主要考虑助乳化剂的加入对微乳稳定性和乳化效果的影响。助乳化剂链的长短对助乳化效果有一定的影响，直链的优于支链的，长链的优于短链的；当助表面活性剂链长达到表面活性剂碳链链长时，其效果最佳。上述助乳化剂的“优选”均表示对助乳化剂乳化能力和稳定性能的筛选。优选的组分在保证微乳稳定性和对药物的乳化能力方面更为强大。
当油相、乳化剂和助乳化剂确定之后，可以通过三元相图找出微乳区域，从而确定它们的用量。同时需要考虑乳化剂的安全性、助乳化剂对微乳的稳定性以及它们对牛蒡苷元的增溶效果。在保证能够制备成微乳的情况下最大限度的降低乳化剂的用量以保证尽量低的毒性。因此，本发明对微乳的油相、乳化剂、助乳化剂的重量比进行了优选，油相、乳化剂、助乳化剂的重量比为：油相5-85份、乳化剂20-60份、助乳化剂5-60份。进一步优选地，油相、乳化剂、助乳化剂的重量比为：油相20-40份、乳化剂35-55份、助乳化剂15-45份。
上述制备的牛蒡苷元的微乳浓缩物大部分具有液体的状态，为了使上述微乳浓缩物在室温下是固体或半固体，在上述微乳浓缩物中加入亲水组分。所述的亲水组分优选聚乙二醇、聚环氧乙烷或它们的混合物。聚乙二醇为聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或它们的混合物。
因此，在一个实施方案中，根据本发明形成的微乳浓缩物包含如下重量比的组分：牛蒡苷元1-10份、油相5-85份、乳化剂20-60份、助乳化剂5-60份、亲水组分20-70份。优选地，所述微乳浓缩物包含如下重量比的组分：牛蒡苷元1-10份、油相20-40份、乳化剂35-55份、助乳化剂15-45份、亲水组分30-50份。对于亲水组分种类和重量的优选表示优选的亲水组分的结晶结构不受影响或所受的影响较小。
上述的微乳制剂可以作为自乳化药物传递系统，含药的微乳浓缩物进入胃肠道后与胃肠道内的水接触后自动形成微乳，供人体吸收。也可以将微乳浓缩物加入赋形剂后制备成为各种微乳制剂。以增加患者对该药物微乳制剂的用药途径和剂型偏好的选择。所述的赋形剂为防腐剂、填充剂、PH调节剂、等渗调节剂、酸化剂、水或它们的混合物。赋形剂占微乳制剂重量的0.05％-80％。
优选地，上述防腐剂为抗坏血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯或它们的任意混合物。填充剂为微晶纤维素、二氧化硅、淀粉及其衍生物、乳糖、磷酸二钙、甘露醇或它们的任意混合物。酸化剂为柠檬酸、琥珀酸、富马酸、抗坏血酸、磷酸、癸酸、油酸、醋酞纤维素、乙酸-1，2，4-苯三酸纤维素、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、羧甲基乙基纤维素、卡波姆或它们的任意混合物。PH调节剂为磷酸盐的缓冲溶液、氢氧化钠、盐酸或它们的任意混合物。等渗调节剂为氯化钠溶液、氯化钾溶液或它们的混合物。
上述牛蒡苷元的微乳浓缩物与赋形剂可以制备成口服微乳制剂和静脉微乳制剂。口服微乳制剂包括片剂、颗粒剂和口服液。
由于自然形成，热力学稳定，牛蒡苷元的微乳制剂制备过程简单。牛蒡苷元微乳制剂可以制备成油包水型(W/O型)或水包油型(O/W型)两种，本发明优选制备成O/W型微乳制剂。牛蒡苷元微乳制剂的制备过程包括以下步骤：
(1)利用伪三元相图筛选处方，确定牛蒡苷元微乳制剂的油相、乳化剂、助乳化剂的种类及其它们之间的配比关系，确定能形成微乳的区域，并最终确定牛蒡苷元微乳的油相、乳化剂和助乳化剂的处方量；
(2)(a)将乳化剂溶于油相中，然后加入助乳化剂和牛蒡苷元；或
(b)可以直接将牛蒡苷元、油相、乳化剂和助乳化剂混合；
从而得到牛蒡苷元的微乳浓缩物；和/或
(3)将上述牛蒡苷元的微乳浓缩物加入上述赋形剂中，制备成微乳口服制剂和微乳静脉制剂。
在一个实施方案中，本发明提供本发明的牛蒡苷元微乳制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将乳化剂溶于油相中，然后加入助乳化剂，混合均匀，得到混合物；
(2)将牛蒡苷元加入上述混合物中，得到牛蒡苷元的微乳浓缩物；
(3)将水以重量比10-20∶1的比例加入到上述微乳浓缩物中，得到微乳；
(4)将上述微乳加入赋形剂中，制备成微乳制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供本发明的牛蒡苷元微乳制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将乳化剂溶于油相中，然后加入助乳化剂，混合均匀，得到混合物；
(2)将牛蒡苷元加入上述混合物中，经超声波处理，得到牛蒡苷元的微乳浓缩物；
(3)将水以重量比10-20∶1的比例加入到上述微乳浓缩物中，得到微乳；
(4)将上述微乳加入赋形剂中，制备成微乳制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供本发明的牛蒡苷元微乳制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将乳化剂、油相、助乳化剂和牛蒡苷元混合，得到牛蒡苷元的微乳浓缩物；
(2)将水以重量比10-20∶1的比例加入到上述微乳浓缩物中，得到微乳；
(3)将上述微乳加入赋形剂中，制备成微乳制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供本发明的牛蒡苷元微乳制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将乳化剂、油相、助乳化剂和牛蒡苷元混合，经超声波处理，得到牛蒡苷元的微乳浓缩物；
(2)将水以重量比10-20∶1的比例加入到上述微乳浓缩物中，得到微乳；
(3)将上述微乳加入赋形剂中，制备成微乳制剂。
牛蒡苷元的微乳制剂的制备过程还可以包含将微乳浓缩物加入适量的水性介质中稀释制备成自然可分散的微乳澄清浓缩液，从而可以制备成为牛蒡苷元的微乳口服液。当用水性介质稀释至1∶1-300，优选为1∶10-70，更优选为1∶10的稀释液，自然可分散的微乳预浓缩液形成O/W微乳。
本发明牛蒡苷元的微乳浓缩物还可以与上述的赋形剂混合加热，搅拌直至熔解。可以制备成为颗粒剂，或随后将所得到的颗粒进一步细化后装入胶囊壳中，可以形成软胶囊或硬胶囊。当颗粒或胶囊与水性介质包括胃液接触后，牛蒡苷元的微乳浓缩物可以被稀释成自然可分散的微乳。
另一方面，本发明提供了用于治疗病毒性感染、细菌性感染、肿瘤等病症或疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施予有效量的本发明的牛蒡苷元微乳制剂。所述病毒性感染包括但不限于例如流感病毒，副流感病毒，疱疹病毒，腮腺炎病毒等。所述细菌性感染包括但不限于金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、链球菌等。所述肿瘤包括肉瘤和癌，例如肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、乳腺癌等。此外，本发明的牛蒡苷元微乳制剂还可以用于治疗心血管疾病以及老年性痴呆等。
对于这些应用，本发明的牛蒡苷元微乳制剂可以与增强其药效的其他药物组合，所述其他药物的实例包括，但不限于抗病毒药、抗生素、抗肿瘤药、免疫增强剂等其它治疗剂。
根据本发明的另外的实施方案，本发明提供本发明的牛蒡苷元微乳制剂在制备用于治疗病毒性感染、细菌性感染、肿瘤等疾病的药物中的应用。
本发明通过实施例1-30描述了本发明牛蒡苷元微乳制剂及其制备方法，本发明的所有的微乳制剂或微乳浓缩物稀释后的微乳制剂均符合微乳制剂的质量标准。离心试验后微乳仍为澄清透明，不出现分层、混浊现象。牛蒡苷元微乳浓缩液及稀释液的粒径及粒度分布测定结果表明，平均粒径10-90nm，均未超过100nm，分布范围窄且均匀，符合微乳的关于粒径和粒度的分布要求。
本发明通过考察牛蒡苷元微乳制剂的口服生物利用度，结果发现本发明提供的牛蒡苷元微乳制剂(含实施例1-31)将CN101036643A公开的牛蒡苷元乳剂口服生物利用度明显提高了1.39-4.73倍。本发明还通过牛蒡苷元对抗S180肉瘤细胞小鼠移植瘤实验发现本发明提供的牛蒡苷元的微乳制剂较CN101036643A公开的牛蒡苷元乳剂对抗小鼠S180瘤的效果显著提高；本发明牛蒡苷元的微乳制剂较CN101036643A公开的牛蒡苷元乳剂抑制H22肝癌实体瘤和小鼠Lewis肺癌实体瘤都有显著的优势；在剂量相同的情况下，与牛蒡苷元乳剂和替加氟的联合用药相比，本发明的牛蒡苷元微乳制剂和替加氟的联合用药在抑制H22肝癌实体瘤和小鼠Lewis肺癌实体瘤方面都具有显著的优势，且抑瘤率具有显著的提高。
以上实验结果进一步说明了，本发明的牛蒡苷元的微乳制剂较牛蒡苷元的乳化剂具有更好的抑瘤作用，这可能与牛蒡苷元的微乳制剂较牛蒡苷元的乳化剂提高了口服利用度、增加了药物吸收有关。
总之，微乳改善了药物的传递，与乳剂及常规制剂相比，它们可以增加药物载量、增强通透性、降低粒径、改善粒径均匀度、增加药物溶出率、增加生物利用度并且降低药物动力学中的个体间和个体内差异。当口服施用时，本发明的微乳制剂显示出有利的性质，例如在标准生物利用度试验中获得的高水平的生物利用度。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。
第一部分牛蒡苷元的微乳浓缩物及微乳制剂
实施例1牛蒡苷元微乳的制备及质量评价
1、牛蒡苷元微乳浓缩物处方
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  辛癸酸甘油酯   15
  壬烷基酚聚氧乙烯醚   50
  1，2-丙二醇   12.5
  无水乙醇   12.5
2、牛蒡苷元微乳的制备工艺
称取处方量辛癸酸甘油酯、壬烷基酚聚氧乙烯醚、1，2-丙二醇、无水乙醇，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元，超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为牛蒡苷元微乳浓缩物。将上述所得的微乳浓缩物加水按照1∶10-20的重量比稀释至澄清溶液，即得微乳。
3、牛蒡苷元微乳理化性质的考察及其质量评价方法
3.1外观性状
观察牛蒡苷元微乳的外观性状
3.2微乳类型的鉴别
取少量的牛蒡苷元微乳浓缩液，分别加入亚甲基兰和苏丹红溶液，观察2种不同颜色的溶液在微乳中的扩散速度的快慢。
3.3离心实验
将牛蒡苷元微乳于DT5-3离心机中离心30min，观察现象，考察其物理稳定性。
3.4粒径及粒度分布的研究
取牛蒡苷元微乳适量，用激光粒度测定仪测定其粒径和粒度分布；取牛蒡苷元微乳适量，用水稀释50倍，用激光粒度测定仪测定其稀释液的粒径与粒度分布。
3.5牛蒡苷元含量测定方法的建立
3.5.1色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18(size：5μm，-150mm×4.6mm)；流动相：甲醇-乙睛-水(40∶20∶40)；流速：0.8ml/min；紫外检测波长：280nm；柱温：室温。
3.5.2标准曲线
精密称取牛蒡苷元对照品0.1562g(相当于牛蒡苷元0.1381g)，置于25ml棕色量瓶中，加入甲醇溶解至刻度，摇匀；取1ml置于25ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；分别取此稀释液1、2、3、4、5、6ml置于10ml棕色瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得到浓度为22.1、44.2、66.3、88.4、110.5、132.6μg/ml的系列标准溶液，按照色谱条件分别进样。
3.5.3精密度与样品稳定性
取牛蒡苷元标准溶液66.3μg/ml，重复测定6次，计算峰面积RSD；分别在第0、2、4、6、8、12、24h分别进样，计算峰面积RSD。
3.5.4含量测定
取牛蒡苷元微乳1ml，置于100ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，测定牛蒡苷元的含量。
4、牛蒡苷元微乳理化性质的考察及其质量评价结果
4.1外观性状
4.2微乳类型
红色在微乳中的扩散速度比蓝色快，说明该微乳为O/W型微乳。
4.3离心试验
微乳仍为澄清透明，未产生沉淀，不出现分层、混浊现象。说明其物理稳定性良好，可间接说明自然静置较长时间后仍可保持较好的稳定性。
4.4粒径及粒度分布
牛蒡苷元微乳浓缩液及稀释液的粒径及粒度分布测定结果表明，实验制备的牛蒡苷元微乳平均粒径25nm，多分散系数为0.105；牛蒡苷元微乳稀释液的平均粒径22nm，多分散系数为0.078；可见制备的牛蒡苷元微乳和微乳的稀释液的粒径较小，分布范围窄且均匀。符合微乳的关于粒径和粒度的分布要求。
4.5牛蒡苷元的含量测定
在1.916×10-4-4.79×10-2μg/ml范围内，色谱峰面积与牛蒡苷元的进样量(μg)呈良好线性关系，回归方程为：Y＝1119986X+1508.8，r＝0.9993。
实施例2微乳浓缩物
 组分   重量/g
 牛蒡苷元   1
 辛酸甘油酯   5
 聚氧乙烯蓖麻油EL-40   20
 1，2-丙二醇   5
制备工艺：称取处方量辛酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油EL-40、1，2-丙二醇，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元溶解，超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为牛蒡苷元微乳浓缩物。将上述所得的微乳浓缩物加水按照1∶10-20的重量比稀释至澄清溶液，即得微乳。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为15nm。
实施例3微乳浓缩物
 组分   重量/g
 牛蒡苷元   10
 辛癸酸甘油酯   85
 聚氧乙烯蓖麻油EL-40   60
 1，2-丙二醇   60
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为35nm。
实施例4微乳浓缩物
 组分   重量/g
 牛蒡苷元   1
 玉米油   20
 聚氧乙烯蓖麻油EL-35   35
 1，2-丙二醇   15
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为10nm。
实施例5微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   10
  大豆油   40
  聚氧乙烯氢化蓖麻油   55
  1，2-丙二醇   45
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为19nm。
实施例6微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   1
  辛酸油酸乙酯   5
  吐温-80   20
  1，2-丙二醇   5
  聚乙二醇3350   20
制备工艺：称取处方量辛酸油酸乙酯、吐温-80、1，2-丙二醇、聚乙二醇3350，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元溶解，超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为牛蒡苷元微乳浓缩物。将上述所得的微乳浓缩物加水按照1∶10-20的重量比稀释至澄清溶液，即得微乳。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为40nm。
实施例7微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   10
  油酸乙酯   85
  泊洛沙姆   60
  1，2-丙二醇   60
  聚乙二醇1450   70
制备工艺同实施例6。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为35nm。
实施例8微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   1
  肉豆蔻酸异丙酯   20
  壬基酚聚氧乙烯醚   35
  1，2-丙二醇   15
  聚乙二醇4000   30
制备工艺同实施例6。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为40nm。
实施例9微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   10
  辛酸乙酯   40
  聚氧乙烯-23-月桂基醚   55
  1，2-丙二醇   45
  聚乙二醇8000   50
制备工艺同实施例6。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为48nm。
实施例10微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   10
  辛酸油酸乙酯   40
  壬基酚聚氧乙烯醚   55
  1，2-丙二醇   45
  聚乙二醇3350   40
制备工艺同实施例6。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为44nm。
实施例11微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  玉米油   30
  泊洛沙姆   50
  1，2-丙二醇   20
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为46nm。
实施例12微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  辛酸油酸乙酯   30
  聚氧乙烯-23-月桂基醚   50
  甘油   20
制备工艺同实施2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为45nm。
实施例13微乳浓缩物
 组分   重量/g
 牛蒡苷元   5
 辛酸甘油酯   30
 聚氧乙烯蓖麻油EL-35   50
 1，2-丙二醇   20
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为36nm。
实施例14微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  肉豆蔻酸异丙酯   30
  吐温-80   50
  1，2-丙二醇   20
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为26nm。
实施例15微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  辛酸乙酯   30
  泊洛沙姆   50
  1，2-丙二醇   20
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为16nm。
实施例16微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  大豆油   30
  聚氧乙烯-23-月桂基醚   50
  1，2-丙二醇   20
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为51nm。
实施例17微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  留兰香油   30
  聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚   50
  1，2-丙二醇   20
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为56nm。
实施例18微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  辛酸油酸乙酯   30
  壬基酚聚氧乙烯醚   50
  1，2-丙二醇   20
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为27nm。
实施例19微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯   30
  辛酸油酸乙酯   50
  甘油   20
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为82nm。
实施例20微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  薄荷油   30
  辛酸油酸乙酯   50
  乙二醇   20
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为68nm。
实施例21微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  留兰香油   30
  辛酸油酸乙酯   50
  乙醇   20
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为54nm。
实施例22微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   10
  留兰香油   30
  辛酸油酸乙酯   30
  聚氧乙烯硬脂酸酯   50
  乙二醇   20
  乙醇   5
制备工艺同实施2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为76nm。
实施例23微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  氢化椰油甘油酯   30
  聚氧乙烯硬脂酸酯   50
  吐温-20   50
  吐温-40   50
  1，2-丙二醇   20
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为63nm。
实施例24微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  PEG-2-硬脂酸酯   30
  吐温-20   50
  1-己醇   20
  PEG3350   25
制备工艺同实施例6。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为80nm。
实施例25微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  辛癸酸甘油酯   30
  氢化椰油甘油酯   50
  1-丁醇   20
  抗坏血酸   0.05
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为66nm。
实施例26微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  氢化椰油甘油酯   30
  1-丙醇   20
  二氧化硅   11.67
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为86nm。
实施例27微乳浓缩物
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  PEG-2-硬脂酸酯   30
  氢化椰油甘油酯   50
  乙醇   20
  甘露醇   1.06
制备工艺同实施例2。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为74nm。
实施例28牛蒡苷元的微乳注射液
  组分   含量
  牛蒡苷元   5g
  月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯   30g
  氢化椰油甘油酯   50g
  1，2-丙二醇   20g
  生理盐水   加至100ml
制备工艺：
称取处方量月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯、氢化椰油甘油酯、1，2-丙二醇，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元溶解，超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，搅拌下缓慢加入适量的生理盐水。同时加入磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，调节PH值至5.0-7.0。0.2μm滤膜过滤灭菌，充氮5ml灌封，即得牛蒡苷元微乳注射液。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为54nm。
实施例29牛蒡苷元的微乳口服液
  组分   含量
  牛蒡苷元   5g
  薄荷油   30g
  氢化椰油甘油酯   50g
  1，2-丙二醇   20g
  乳糖   10g
  5％苯扎溴铵溶液   10ml
  蒸馏水   加至100ml
制备工艺：
称取处方量薄荷油、氢化椰油甘油酯、1，2-丙二醇，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元溶解，超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，搅拌下缓慢加入适量的蒸馏水、处方量的乳糖和5％苯扎溴铵溶液，即得牛蒡苷元的微乳口服液。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为57nm。
实施例30含牛蒡苷元微乳的胶囊
  组分   重量/g
  牛蒡苷元   5
  辛酸油酸乙酯   30
  氢化椰油甘油酯   50
  1，2-丙二醇   20
  PEG3350   100
  二氧化硅   20
制备工艺：
称取处方量辛酸油酸乙酯、氢化椰油甘油酯、1，2-丙二醇，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元溶解，超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，搅拌下缓慢加入处方量的PEG3350和二氧化硅，充分混合后将混合物加入至胶囊壳中，即得牛蒡苷元微乳胶囊。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为90nm。
实施例31微乳浓缩物
 组分   重量/g
 牛蒡苷元   1
 氢化椰油甘油酯   5
 聚氧乙烯蓖麻油EL-40   25
 1，2-丙二醇   6
制备工艺：称取处方量氢化椰油甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油EL-40、1，2-丙二醇，混合后搅拌均匀，然后加入牛蒡苷元溶解，超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为牛蒡苷元微乳浓缩物。将上述所得的微乳浓缩物加水按照1∶10-20的重量比稀释至澄清溶液，即得微乳。激光粒度测定仪测定其粒径，平均粒径为80nm。
将实施例2-31制备的牛蒡苷元的微乳浓缩物或微乳制剂，重复实施例1中关于“牛蒡苷元微乳理化性质的考察及其质量评价”，结果发现所有微乳制剂或微乳浓缩物稀释后的微乳制剂均符合微乳制剂的质量标准。离心试验后微乳仍为澄清透明，不出现分层、混浊现象。牛蒡苷元微乳浓缩液及稀释液的粒径及粒度分布测定结果表明，实施例2-31制备的牛蒡苷元微乳平均粒径10-90nm，均未超过100nm，分布范围窄且均匀，符合微乳的关于粒径和粒度的分布要求。
将实施例1-31制备的牛蒡苷元的微乳浓缩物或微乳制剂，置40℃75％RH条件下进行加速试验，并于第1、2、3、6月取样，用激光粒度测定仪进行粒径检测，结果见表1(单位nm)。由表1可以看出，本发明制备的牛蒡苷元微乳具有很好的稳定性，尤其实施例1-18制备的牛蒡苷元微乳浓缩物或微乳制剂的稳定性更好，同时粒径更小。
表1牛蒡苷元的微乳粒径变化结果
Figure BDA0000053491440000181
Figure BDA0000053491440000191
第二部分牛蒡苷元微乳制剂主要药动学和药效学考察
试验例1牛蒡苷元微乳制剂的口服生物利用度研究
1、实验材料
1.1药品与试剂
牛蒡苷元乳剂：处方和制备工艺同CN101036643A说明书第4页实施例3，牛蒡苷元乳剂的处方：牛蒡子苷元1.0g+蛋黄磷脂3.0g+中链油15g+油酸0.08g+甘油3.0g。
牛蒡苷元微乳剂：本发明实施例1制备的微乳剂；
牛蒡苷元对照品(纯度99.5％)；肝素钠，生理盐水，甲醇，乙睛(均为色谱纯试剂)，其他均为分析纯试剂。
1.2实验仪器
LC-10A高效液相色谱仪；SPD-10AV紫外检测器：ShimazuClass-vp Version 5.03workingstation；KQ-100型超声波清洗器；台式离心机TGL-16C；手动匀浆器。
1.3实验动物
新西兰家兔，体重1400-1500g，雌雄均有，山东新时代药业动物中心提供。
2、实验方法
2.1血浆中药物浓度的测定方法
2.1.1对照品溶液的配制
精密称取牛蒡苷元对照品9.58mg，置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得0.958mg/ml的对照品溶液。
2.1.2血浆样品预处理
取样品0.5ml置于分液漏斗中，加入5ml二氯甲烷，摇匀，提取两次。分取二氯甲烷层并合并，40℃水浴蒸干二氯甲烷液，残渣加乙睛0.5ml溶解，作为供试品溶液，置于冰箱中(-20℃)待测，进样10μl。
2.1.3生物样品中药物含量测定方法的建立
2.1.3.1色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18(size：5μm，150mm×4.6mm)；流动相：乙睛-水(35∶65)；流速：0.8ml/min；紫外检测波长：280nm；柱温：室温。
2.1.3.2方法专属性考察
将实验动物的血浆按上述方法处理后，取10μl注入高效液相色谱仪。同法处理空白血浆样品。结果，在上述色谱条件下，牛蒡苷元色谱峰与其它峰有良好的分离度，与邻近峰分离度R：2.5，理论塔板数为3566块/米，空白血浆对其分析测定没有干扰。
2.1.3.3最低检测浓度的测定
按峰高为基线噪音3倍计算，血浆中牛蒡苷元最低检测量为9.58×10-3μg/ml。
2.1.3.4线性范围
取空白生物样品，加入不同浓度牛蒡苷元标准溶液，使样品浓度为：1.916×10-2、4.79×10-2、9.58×10-2、4.79×10-1、9.58×10-1、2.874、4.79μg/ml，各进样10μl，以进样量(μg)为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果：在1.916×10-4-4.79×10-2μg范围内，色谱峰面积与牛蒡苷元的进样量(μg)呈良好线性关系，回归方程为：Y＝1119986X+1508.8，r＝0.9993。
2.1.3.5回收率和精密度
回收率：取空白生物样品，配制4.79×10-2μg/ml、4.79×10-1μg/ml、4.79μg/ml三个浓度生物样品及同样浓度的牛蒡苷元标准溶液，分别在前述HPLC色谱条件下各测定5次，并将测定结果进行比较，计算绝对回收率。结果表明：本方法在低、中、高三种浓度水平上的回收率最低为：75.6％，能满足生物样品的测试要求。
精密度：取4.79×10-2μg/ml、4.79×10-1g/ml、4.79μg/ml三个浓度血浆在同一天内分别进行五次测定，计算其日内相对标准差，精密度RSD分别为2.22％、1.67％、0.98％。经测定其他生物样品的日内、日间相对标准差均小于5％，符合生物样品的测试要求。
2.1.4血浆等生物样品预处理方法选择
血浆样品在注入色谱柱测定前需去除蛋白质等杂质，以防止堵塞色谱柱，造成柱效降低，一般采用加入水溶性有机溶媒如甲醇、乙腈等，或加入10％三氯醋酸等强酸除蛋白，或用有机溶媒提取。本实验中采用对牛蒡苷元有较好溶解度的二氯甲烷提取生物样品，考虑到二氯甲烷的挥发性较大，故将二氯甲烷液挥干后加较为稳定的乙腈来溶解，进样。
2.2分组与给药
2.2.1牛蒡苷元微乳剂组
将禁食12小时，自由饮水的家兔10只，取1ml空白血后分别给30mg/kg牛蒡苷元微乳灌胃剂灌胃，分别于给药后0.5小时、1小时、1.5小时、2.0小时、2.5小时、3.0小时、4.0小时、5.0小时、6.0小时耳缘静脉取血1ml，置涂有肝素的离心管中，离心(3O00rpm)10min，取血浆0.5ml，保存于-20℃冰箱中，按前述生物样品制备方法进行处理，并制备，保存于-20℃冰箱中，测定血药浓度时取10μl进样分析。
2.2.2牛蒡苷元乳剂组
将禁食12小时，自由饮水的家兔10只，取1ml空白血后分别给30mg/kg牛蒡苷元乳剂灌胃，分别于给药后0.5小时、1小时、1.5小时、2.0小时、2.5小时、3.0小时、4.0小时、5.0小时、6.0小时耳缘静脉取血1ml，置涂有肝素的离心管中，离心(3000rpm)10min，取血浆0.5ml，保存于-20℃冰箱中，按前述生物样品制备方法进行处理，并制备，保存于-20℃冰箱中，测定血药浓度时取10μl进样分析。
2.3数据处理
将血药浓度-时间曲线用中国药学会数学药理专业委员会编写的3p87实用药代动力学程序进行处理，经计算机进行曲线拟合，求得主要药动力学参。
2.4实验结果
结果见表1。由此可见，将牛蒡苷元制备成微乳制剂后，口服生物利用度(F)较乳剂提高了2倍多。
表2牛蒡苷元乳剂和微乳剂灌胃给药的相对生物利用度
  组别   给药剂量(mg/kg)  AUC(μg·ml-1·h)   AUC/D   F(％)
  乳剂组   30   1.4978   0.0499   14.56
  微乳剂组   30   4.6520   0.1550   45.21
将实施例2～31制备的牛蒡苷元的微乳浓缩物或微乳制剂替代试验例1中使用的实施例1的牛蒡苷元的微乳制剂，CN101036643A说明书公开实施例1～7替换试验例1中的乳剂重复试验例1，结果发现CN101036643A说明书公开实施例1～7牛蒡苷元的乳剂口服生物利用度为9.60％～16.23％，本发明的牛蒡苷元的微乳制剂的口服生物利用度为38.80％～55.02％，较牛蒡苷元的乳剂口服生物利用度明显提高了1.39～4.73倍。
试验例2牛蒡苷元对抗S180肉瘤细胞小鼠移植瘤实验
1、受试药物和实验动物
昆明种小鼠18～22g，雌雄各半，共50只。小鼠肉瘤S180细胞，替加氟、牛蒡苷元乳剂(牛蒡苷元乳剂：处方和制备工艺同CN101036643A说明书第4页实施例3，即牛蒡苷元乳剂的处方：牛蒡子苷元1.0g+蛋黄磷脂3.0g+中链油15g+油酸0.08g+甘油3.0g)，牛蒡苷元微乳剂(本发明实施例1制备的牛蒡苷元微乳剂)。
2、S180肉瘤细胞小鼠移植瘤模型的建立
S180细胞培养于1640培养液中，37℃，5％CO2下常规培养，平均每2天传代一次，至对数生长期时用生理盐水制备成密度为3.0×107/mL单细胞悬液，于无菌条件下接种于小鼠腹腔内(约5只小鼠，雌雄均有)，接种后10天左右见小鼠腹腔明显肿大，此时脱颈处死小鼠，放入盛有75％乙醇的烧杯中浸泡2～3min，将消毒过的小鼠放于超净工作台中，用镊子夹起腹中部皮肤，于下腹部用手术剪剪开皮肤暴露腹部，用无菌注射器穿过腹部肌肉抽取腹水，放入无菌试剂瓶内备用。
将上述抽取的腹水用台盼蓝计数，采用肿瘤细胞＞95％的移植液用生理盐水稀释，调整细胞数至2×107～6×107个/ml，得肿瘤细胞悬液。
一人固定小鼠，另一人左手捏起小鼠右前腋窝部皮肤，顺皱褶将1mL注射器针头插入皮下，每只小鼠接种0.2mL肿瘤细胞悬液。
3、分组与给药
接种后次日称重，选体重相近且健康小鼠随机分为4组，每组10只，雌雄各半，每只称重记录。于接种肿瘤细胞24h后灌服给药。每只0.2mL，每日1次，连续14d。
表3各组给药方案
  组别   给药浓度(mg/kg)
  阴性对照组   0
  替加氟组   50
  牛蒡苷元微乳剂组   10
  牛蒡苷元普通乳剂组   10
4、测定指标
末次给药后空腹24h，脱颈处死小鼠，称重，剥取瘤块并称重。计算抑瘤率(％)＝(阴性对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％，取瘤进行病理学检查。
5、结果
经病理切片实验观察，所切除的组织为肿瘤组织，组织异型性较小。牛蒡苷元乳剂组的抑瘤率仅仅为17.0％，而牛蒡苷元微乳剂组的抑瘤率为46.4％。这表明，牛蒡苷元微乳制剂相对于乳剂组对抗小鼠S180瘤的效果显著提高。
表4给药前后体质量对照与抑瘤率
Figure BDA0000053491440000231
将实施例2～31制备的牛蒡苷元的微乳浓缩物或微乳制剂替代试验例2中使用的实施例1的牛蒡苷元的微乳制剂，用CN101036643A说明书公开实施例2～7替换实施例33中的乳剂，重复试验例2，结果发现本发明的牛蒡苷元的微乳制剂的抑瘤率为35.60％～53.82％，而CN101036643A说明书公开实施例2～7乳剂的抑瘤率为10.5％～18.3％，这表明本发明提供的牛蒡苷元微乳制剂较CN101036643A公开的乳剂对抗小鼠S180瘤的效果显著提高。
试验例3牛蒡苷元对KM小鼠H22肝癌的抑制试验
1研究目的
研究牛蒡苷元对腋下种植H22肝癌的KM小鼠的实体瘤抑制作用。
2供试品及对照品
2.1供试品
牛蒡苷元微乳，冷藏，密闭保存
2.2对照品
替加氟，白色颗粒，室温，密闭避光保存
2.3供试品及对照品配制
2.3.1供试品配制：
牛蒡苷元微乳剂分别按处方量称取辛癸酸甘油酯、壬烷基酚聚氧乙烯醚和丙二醇，混合均匀，加入处方量牛蒡苷元超声，使溶解，即得牛蒡苷元微乳浓缩液。使用前需高压灭菌处理。牛蒡苷元微乳测定：取牛蒡苷元微乳1g加至100g水中，搅拌至乳化完全后测粒径，平均为25nm，符合微乳要求(小于100nm)。
2.3.2对照品：牛蒡苷元乳剂(处方和制备工艺同CN101036643A说明书第4页实施例1)
3实验动物分组及识别方法
SPF级KM小鼠60只，合格证号：0008062，雌雄各半，4周龄，20～24g。
3.1分组方法：根据完全随机分组方法进行分组；雌雄分别分组。
3.2识别方法：采用3％苦味酸染色法，组别间标记如表4所示。
表5小鼠组间标记
  小鼠组别   1   2   3   4   5   6
  染色部位   白   头   背   尾   左前   左中
3.3动物饲养环境条件
普通环境，20～25℃，日温差≤3℃；湿度为40％～70％；动物照度：15～20lx；工作照度：150lx以上；试验开展前及试验结束后对房间进行彻底清洁消毒。每天全部作业结束后清扫、消毒。
3.4饲养条件
笼具名称及规格：笼具名称及规格：鼠笼架(L×W×H 1450mm×400mm×1500mm)
鼠盒(L×W×H 300mm×100mm×150mm)
饲养密度：5只/笼
更换频率：鼠盒隔两天更换一次。
清洁消毒：笼架每天湿擦消毒，消毒剂为0.1％的新洁尔灭和75％的乙醇溶液，消毒剂每周交替使用。
3.5饲料、垫料及饮水
SPF鼠料，辐照饲料(批号：10063011)，常规饲养，自由采食，自由饮水；
4试验方法
4.1剂量设计：给药组剂量设计见表5。
将接种后的小鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半。
表6小鼠给药剂量及方式
  组别   组名      给药剂量   给药方式
  1   模型组      -   灌胃
  2   乳剂低剂量组      15mg/kg   灌胃
  3   乳剂高剂量组      45mg/kg   灌胃
  4   微乳低剂量组      15mg/kg   灌胃
  5   微乳高剂量组      45mg/kg   灌胃
  6   替加氟组      10mg/m2   灌胃
  7   乳剂高剂量+替加氟组      45mg/kg+10mg/m2   灌胃
  8   微乳高剂量+替加氟组      45mg/kg+10mg/m2   灌胃
4.2试验方法：
小鼠H22细胞培养于1640培养液中，37℃，5％CO2下常规培养，平均每两天传代一次，至对数生长期时用生理盐水制备成密度为3.0×107个/ml单细胞悬液，在无菌条件下注射于小鼠腹腔内，接种后7天见小鼠腹腔明显肿大，此时，脱颈处死，放入盛有75％乙醇的烧杯中浸泡2～3分钟，将消毒后的小鼠放入超净工作台中，暴露腹部，用无菌注射器抽取腹水放入无菌试剂瓶内备用。将上述腹水用台盼蓝计数，用生理盐水稀释，调整细胞数至1.0×107个/ml，接种于小鼠右腋下，每只0.2ml。
动物接种肿瘤后第四天开始给药，每天按表6灌胃给药1次(每天上午给药)，给药容积为10ml·kg-1；模型组灌胃等量的生理盐水。连续给药10天。
5指标检测
5.1体重
检测频率：分组前及解剖前称量动物空腹体重。
仪器设备：ACS-3A-a型计价电子秤，上海大华电子秤厂
5.2肿瘤质量
检测频率：给药10天后结束试验，放血处死，剖检。
称量重量的组织器官：腋下肿瘤
剖检方法：腹腔注射2％戊巴比妥钠(0.3ml·kg-1)麻醉，腹主静脉取血完毕后，剪断腹主动脉放血处死，然后进行常规腋下取瘤。
仪器设备：BS224S型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司
ACS-6A型电子计价秤，上海大华电子秤厂
6数据统计处理方法
试验数据以表示，采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理。
7实验结果
实验结果显示(实验结果见表6)：
(1)与乳剂高剂量组、乳剂低剂量组比较，微乳高剂量组和微乳低剂量组的抑瘤率明显提高，并具有显著性差异；
(2)本发明还同时考察了牛蒡苷元与替加氟联合用药的情形，结果发现，在剂量相同的情况下，与牛蒡苷元乳剂和替加氟的联合用药相比，牛蒡苷元微乳制剂和替加氟的联合用药在抑制H22肝癌实体瘤方面具有显著的优势，且抑瘤率具有显著的提高。
以上实验结果进一步说明了，牛蒡苷元的微乳制剂较牛蒡苷元的乳化剂具有很好的抑瘤作用，这可能与牛蒡苷元的微乳制剂较牛蒡苷元的乳化剂提高了口服利用度、增加了药物吸收有关。
表7牛蒡苷元对KM小鼠瘤重和抑瘤率的影响
Figure BDA0000053491440000262
  组别   剂量   瘤重   抑瘤率
  模型组    -   2.05±0.89   -
  乳剂低剂量组   15mg/kg   1.92±1.55   6.3
  乳剂高剂量组   45mg/kg   1.85±0.96   9.8
  微乳低剂量组   15mg/kg   1.69±1.55△▲   17.6
  微乳高剂量组   45mg/kg   1.56±0.96△▲   23.9
  替加氟组   10mg/m2   1.54±0.52△▲   24.9
  乳剂高剂量+替加氟组   45mg/kg+10mg/m2   1.48±0.67   27.8
  微乳高剂量+替加氟组   45mg/kg+10mg/m2   1.23±0.51■△▲   40.0
注意：▲与乳剂低剂量组比较，p＜0.05；△与乳剂高剂量组比较，p＜0.05；
■与乳剂高剂量+替加氟组比较，p＜0.05。
试验例4牛蒡苷元对移植性小鼠Lewis肺癌抑瘤率影响
1研究目的
研究牛蒡苷元对腋下种植肺癌Lewis瘤株的小鼠的实体瘤抑制作用。
2供试品及对照品
2.1供试品
牛蒡苷元微乳，冷藏，密闭保存
2.2对照品
替加氟，白色颗粒，室温，密闭避光保存
2.3供试品及对照品配制
2.3.1供试品配制：
Figure BDA0000053491440000271
分别按处方量称取辛癸酸甘油酯、壬烷基酚聚氧乙烯醚和丙二醇，混合均匀，加入处方量牛蒡苷元超声，使溶解，即得牛蒡苷元微乳浓缩液。使用前需高压灭菌处理。牛蒡苷元微乳测定：取牛蒡苷元微乳1g加至100g水中，搅拌至乳化完全后测粒径，平均为25nm，符合微乳要求(小于100nm)。
2.3.2对照品：牛蒡苷元乳剂(处方和制备工艺同CN101036643A说明书第4页实施例1)
3实验动物分组及识别方法
SPF级KM小鼠60只，合格证号：0008062，雌雄各半，4周龄，20～24g。
3.1分组方法：根据完全随机分组方法进行分组；雌雄分别分组。
3.2识别方法：采用3％苦味酸染色法，组别间标记如表4所示。
表8小鼠组间标记
  小鼠组别   1   2   3   4   5   6
  染色部位   白   头   背   尾   左前   左中
3.3动物饲养环境条件
普通环境，20～25℃，日温差≤3℃；湿度为40％～70％；动物照度：15～20lx；工作照度：150lx以上；试验开展前及试验结束后对房间进行彻底清洁消毒。每天全部作业结束后清扫、消毒。
3.4饲养条件
笼具名称及规格：笼具名称及规格：鼠笼架(L×W×H 1450mm×400mm×1500mm)
鼠盒(L×W×H 300mm×100mm×150mm)
饲养密度：5只/笼
更换频率：鼠盒隔两天更换一次。
清洁消毒：笼架每天湿擦消毒，消毒剂为0.1％的新洁尔灭和75％的乙醇溶液，消毒剂每周交替使用。
3.5饲料、垫料及饮水
SPF鼠料，辐照饲料(批号：10063011)，常规饲养，自由采食，自由饮水；
4试验方法
4.1剂量设计：给药组剂量设计见表5。
将接种后的小鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半。
表9小鼠给药剂量及方式
  组别   组名   给药剂量   给药方式
  1   模型组   -   灌胃
  2   乳剂低剂量组   15mg/kg   灌胃
  3   乳剂高剂量组   45mg/kg   灌胃
  4   微乳低剂量组   15mg/kg   灌胃
  5   微乳高剂量组   45mg/kg   灌胃
  6   替加氟组   10mg/m2   灌胃
  7   乳剂高剂量+替加氟组   45mg/kg+10mg/m2   灌胃
  8   微乳高剂量+替加氟组   45mg/kg+10mg/m2   灌胃
4.2试验方法：
小鼠肺癌Lewis瘤株细胞培养于1640培养液中，37℃，5％CO2下常规培养，平均每两天传代一次，至对数生长期时用生理盐水制备成密度为3.0×107个/ml单细胞悬液，在无菌条件下注射于小鼠腹腔内，接种后7天见小鼠腹腔明显肿大，此时，脱颈处死，放入盛有75％乙醇的烧杯中浸泡2～3分钟，将消毒后的小鼠放入超净工作台中，暴露腹部，用无菌注射器抽取腹水放入无菌试剂瓶内备用。将上述腹水用台盼蓝计数，用生理盐水稀释，调整细胞数至1.0×107个/ml，接种于小鼠右腋下，每只0.2ml。
动物接种肿瘤后第四天开始给药，每天按表6灌胃给药1次(每天上午给药)，给药容积为10ml·kg-1；模型组灌胃等量的生理盐水。连续给药10天。
5指标检测
5.1体重
检测频率：分组前及解剖前称量动物空腹体重。
仪器设备：ACS-3A-a型计价电子秤，上海大华电子秤厂
5.2肿瘤质量
检测频率：给药10天后结束试验，放血处死，剖检。
称量重量的组织器官：腋下肿瘤
剖检方法：腹腔注射2％戊巴比妥钠(0.3ml·kg-1)麻醉，腹主静脉取血完毕后，剪断腹主动脉放血处死，然后进行常规腋下取瘤。
仪器设备：BS224S型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司
ACS-6A型电子计价秤，上海大华电子秤厂
6数据统计处理方法
试验数据以表示，采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理。
7实验结果
实验结果显示(实验结果见表7)：
(1)与乳剂高剂量组、乳剂低剂量组比较，微乳高剂量组和微乳低剂量组的抑瘤率明显提高，并具有显著性差异；
(2)本发明还同时考察了牛蒡苷元与替加氟联合用药的情形，结果发现，在剂量相同的情况下，与牛蒡苷元乳剂和替加氟的联合用药相比，牛蒡苷元微乳制剂和替加氟的联合用药在抑制肺癌Lewis实体瘤方面具有显著的优势，且抑瘤率具有显著的提高。
以上实验结果进一步说明了，牛蒡苷元的微乳制剂较牛蒡苷元的乳化剂具有很好的抑瘤作用，这可能与牛蒡苷元的微乳制剂较牛蒡苷元的乳化剂提高了口服利用度、增加了药物吸收有关。
表10牛蒡苷元对小鼠肺癌瘤重和抑瘤率的影响
  组别   剂量   瘤重   抑瘤率
  模型组   -   3.86±1.12   -
  乳剂低剂量组   15mg/kg   3.52±1.55   8.8
  乳剂高剂量组   45mg/kg   3.35±1.01   13.2
  微乳低剂量组   15mg/kg   2.89±1.44△▲   25.1
  微乳高剂量组   45mg/kg   2.60±0.89△▲   32.6
  替加氟组   10mg/m2   2.29±0.77△▲   40.6
  乳剂高剂量+替加氟组   45mg/kg+10mg/m2   2.18±0.50   43.5
  微乳高剂量+替加氟组   45mg/kg+10mg/m2   1.82±0.51■△▲   52.8
注意：▲与乳剂低剂量组比较，p＜0.05；△与乳剂高剂量组比较，p＜0.05；
■与乳剂高剂量+替加氟组比较，p＜0.05。
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰，这些改变和修饰对于本领域技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。

Claims (29)

1.一种牛蒡苷元的微乳制剂，其包含牛蒡苷元和微乳载体，其中所述微乳载体包含油相和乳化剂，所述的微乳制剂的平均粒径为10-90nm。
2.如权利要求1所述的微乳制剂，其中所述的微乳载体还包含助乳化剂。
3.如权利要求2所述的微乳制剂，其中所述的牛蒡苷元与微乳载体各组分按重量份数的配比为：牛蒡苷元1-10份、油相5-85份、乳化剂20-60份、助乳化剂5-60份。
4.如权利要求1-3中任一项所述的微乳制剂，其中所述的油相为固体或半固体油相组分，其选自脂肪酸甘油酯、醇酯、脂肪醇和多糖基化的饱和甘油酯中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的微乳制剂，其中所述的脂肪酸甘油酯选自氢化椰油甘油酯、氢化棕榈油PEG-6酯和氢化棕榈橄榄油PEG-6酯中的一种或多种，所述的醇酯选自丙二醇硬脂酸酯、PEG-2-硬脂酸酯和鲸蜡醇十六酸酯中的一种或多种，所述的脂肪醇为肉豆蔻醇，所述多糖基化的饱和甘油酯为月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯。
6.如权利要求1-3中任一项所述的微乳制剂，其中所述的油相为液体油相组分，其选自甘油酯类、天然植物油及其级分、精油、挥发油和合成油中的一种或多种。
7.如权利要求6所述的微乳制剂，其中所述的甘油酯类为单甘油酯和二甘油酯的混合物、辛酸甘油酯、中链脂肪酸甘油酯、单亚油酸甘油酯或辛癸酸甘油酯，所述的天然植物油及其级分为红花油、芝麻油、玉米油、蓖麻油、椰子油、棉籽油、大豆油、柠檬油、薄荷油、薄荷醇、香芹芬、麝香草酚或它们的任意混合物，所述的挥发油为留兰香油、丁香油、柠檬油、薄荷油或它们的任意混合物，所述的合成油为三醋精、丁酸乙酯、辛酸油酸乙酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、辛酸乙酯或它们的任意混合物。
8.如权利要求1-3中任一项所述的微乳制剂，其中所述的油相选自辛酸甘油酯、辛癸酸甘油酯、玉米油、大豆油、辛酸油酸乙酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、辛酸乙酯或它们的任意混合物。
9.如权利要求1-3中任一项所述的微乳制剂，其中所述的乳化剂选自壬基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、脱水山梨醇衍生物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯烷基醚、聚甘油脂肪酸酯和亚烷基多元醇酯中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的微乳制剂，其中所述的聚氧乙烯脂肪酸酯为聚氧乙烯硬脂酸酯、PEG-40-硬脂酸酯或它们的混合物，所述的脱水山梨醇衍生物为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80或它们的混合物，所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为泊洛沙姆，所述的聚氧乙烯烷基醚为聚氧乙烯-2-鲸蜡基醚、聚氧乙烯-10-鲸蜡基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚、聚氧乙烯-23-月桂基醚、聚氧乙烯-20-油基醚、聚氧乙烯-2-硬脂基醚、聚氧乙烯-10-硬脂基醚、聚氧乙烯-20-硬脂基醚或它们的混合物，所述的聚甘油脂肪酸酯为十甘油单硬脂酸酯、六甘油单硬脂酸酯、四甘油单硬脂酸酯或它们的混合物，所述的亚烷基多元醇酯为硬脂酰基、月桂酰基聚乙二醇-32-甘油酯或它们的混合物。
11.如权利要求10所述的微乳制剂，其中所述的聚氧乙烯烷基醚为聚氧乙烯-23-月桂基醚或聚氧乙烯-20-油基醚。
12.如权利要求1-3中任一项所述的微乳制剂，其中所述的乳化剂选自壬基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、吐温-80、泊洛沙姆、聚氧乙烯-23-月桂基醚或它们的混合物。
13.如权利要求2所述的微乳制剂，其中所述的助乳化剂为以下组分之一或它们的任意混合物：短链醇、有机氨、烷基素酸、单双烷基酸甘油酯和聚氧乙烯脂肪酸酯。
14.如权利要求13所述的微乳制剂，其中所述的助乳化剂为短链醇，其选自聚乙二醇、乙醇、正丁醇、正己醇、乙二醇、丙二醇和甘油中的一种或几种。
15.如权利要求14所述的微乳制剂，其中所述的助乳化剂为乙醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或1，2-丙二醇。
16.如权利要求3所述的微乳制剂，其中所述的牛蒡苷元与油相、乳化剂、助乳化剂的重量比为：牛蒡苷元1-10分、油相20-40份、乳化剂35-55份、助乳化剂15-45份。
17.如权利要求1所述的微乳制剂，其中所述的微乳载体还包含亲水组分。
18.如权利要求17所述的微乳制剂，其中所述的牛蒡苷元和微乳载体各组分按重量份数的配比为：牛蒡苷元1-10份、油相5-85份、乳化剂20-60份、助乳化剂5-60份、亲水组分20-70份。
19.如权利要求18所述的微乳制剂，其中所述的牛蒡苷元和微乳载体各组分按重量份数的配比为：牛蒡苷元1-10份、油相20-40份、乳化剂35-55份、助乳化剂15-45份、亲水组分30-50份。
20.如权利要求17-19中任一项所述的微乳制剂，其中所述的亲水组分为聚乙二醇、聚环氧乙烷或它们的混合物。
21.如权利要求20所述的微乳制剂，其中所述的聚乙二醇为聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或它们的混合物。
22.如权利要求1-3中任一项所述的牛蒡苷元的微乳制剂，其还包含赋形剂，所述的赋形剂选自如下的一种或多种：防腐剂、填充剂、PH调节剂、等渗调节剂、酸化剂和水。
23.如权利要求22所述的微乳制剂，其中所述的防腐剂为抗坏血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯或它们的任意混合物，所述的填充剂为微晶纤维素、二氧化硅、淀粉及其衍生物、乳糖、磷酸二钙、甘露醇或它们的任意混合物，所述的酸化剂为柠檬酸、琥珀酸、富马酸、抗坏血酸、磷酸、癸酸、油酸、醋酞纤维素、乙酸-1，2，4-苯三酸纤维素、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、羧甲基乙基纤维素、卡波姆或它们的任意混合物，所述的PH调节剂为磷酸盐的缓冲溶液、氢氧化钠、盐酸或它们的任意混合物，所述的等渗调节剂为氯化钠溶液、氯化钾溶液或它们的混合物。
24.如权利要求22所述的微乳制剂，其中所述的赋形剂占微乳制剂重量的0.05％-80％。
25.制备权利要求1-24中任一项所述的微乳制剂的方法，所述方法包括：
(1)将乳化剂溶于油相中，然后加入助乳化剂，混合均匀，得到混合物；
(2)将牛蒡苷元加入上述混合物中，得到牛蒡苷元的微乳浓缩物；
(3)将水以重量比10-20∶1的比例加入到上述微乳浓缩物中，得到微乳；
(4)将上述微乳加入赋形剂中，制备成微乳制剂。
26.如权利要求25所述的方法，进一步包括将步骤(2)中加入混合物中的牛蒡苷元经超声处理，得到牛蒡苷元的微乳浓缩物。
27.治疗感染或肿瘤的方法，所述方法包括使用权利要求1-24中任一项所述的微乳制剂给予患有感染或肿瘤的患者。
28.权利要求1-24中任一项所述的微乳制剂，其用于治疗感染或肿瘤。
29.权利要求1-24中任一项所述的微乳制剂在制备用于治疗感染或肿瘤的药物中的应用。
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