CN102202663A - 肠外与口服苯并咪唑类药物制剂 - Google Patents

肠外与口服苯并咪唑类药物制剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了多种给药系统，包括：自行纳米微乳化的给药系统，自乳化的给药系统，非口服形式的微乳化剂型，以及纳米混悬剂剂型，以便以口服或非口服的给药形式给予治疗对象。这些以乳化剂为基础的给药系统在其微乳化剂型中可以包括以下组分：一种苯并咪唑衍生物，例如甲苯咪唑，和一种油，一种表面活性剂，一种辅助表面活性剂，以及一种偶极非质子溶剂。这些以纳米混悬剂为基础的给药系统可以包括以下组分：一种苯并咪唑衍生物，例如甲苯咪唑，和几种表面稳定剂，例如嵌段聚合物，例如普朗尼克F108，和一种或多种表面活性剂，例如吐温-80，以及，可选择地包括，或不包括，水。本发明提供了以下方法，以定义苯并咪唑衍生物的纳米混悬剂在某治疗方案中能提供最高的疗效，此定义法基于苯并咪唑的衍生物在组织中的药物代谢动力学的参数而调整并且/或者选择药物颗粒的大小范围。同时本发明提供了以下方法，以增加苯并咪唑的衍生物的生物利用度，所述生物利用度的提高发生在治疗病理生理状态或癌症的过程中，所述增效效果通过上述的微乳化剂型或纳米混悬剂剂型来实现。

Description

肠外与口服苯并咪唑类药物制剂
与相关专利申请文书的交互索引
依据35 U.S.C.§120，本国际专利申请文请求享受与以下专利同等的优先权：2008年7月24日递交的正在接受审批的美国专利申请文序列号12/220,364和美国专利申请文序列号12/220,374。专利申请文12/220,364和12/220,374的全部因此依索引录入本文。
发明的领域
本发明广义上属于药理学及药剂学领域。本发明具体相关的领域是：它涉及一种包括一种苯并咪唑、一种多元醇和一种偶极非质子溶剂的药物组合物。它还涉及一个包括一种苯并咪唑、一种油、一种偶极非质子溶剂和一种表面活性剂的药物组合物。
相关的背景知识的描述
给药改进方法的鉴定在广大人类疾病的治疗过程中至关重要。特别是，尽管科学研究也许已经能够确定某种药物在一个特定的条件下有治疗的潜在用途，但如果这种药物传送到病变组织的合适剂型未能确定，治疗方案可能被限制。
癌症是一种药剂学在其中发挥重大作用的疾病。在美国，癌症是导致死亡的第二大原因。美国有一半的男性和三分之一的女性都会在其一生中产生癌症。今天，数以百万计的人患有癌症或患过癌症。癌症越早被发现和开始治疗，生存的机会将越大。
对癌症有效的医药制剂领域是一种新兴的和不断扩大的研究领域，它有着潜在的商业发展前景。可以延迟或阻止癌症或可发展成癌症的癌前病变的药剂正在被研发。癌前病变包括，例如，可发展成乳癌的乳腺病变、可发展成恶性黑色素瘤或基底细胞癌的皮肤病变、可发展成结肠癌的结肠腺瘤样息肉、可发展成宫颈癌的宫颈细胞病变、可以发展成头颈癌的口咽癌前病变等。
因为化疗和单纯手术治疗往往对癌症无效，并且目前的癌症化疗有严重的副作用，因此对用于治疗和预防瘤生成最初阶段药物的搜索非常紧迫。这种预防性治疗也可对存在复发危险的已康复癌症患者，甚至对受益于化合物(能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无效的)的癌症患者有潜在的用途。
细胞凋亡诱导是一种用药物制剂来杀死癌细胞的机制。细胞凋亡，又称“细胞程序性死亡”，通常自然发生在人体组织中，在人体组织动态平衡中扮演着很重要的角色，也就是说，它保证了新生成的细胞数量与死亡细胞数量正好相抵消。细胞凋亡在自我更新的组织中尤为突出，比如骨髓、免疫细胞、肠道和皮肤。
标准的化疗不仅促进癌细胞的细胞凋亡，也促进正常人体组织的细胞凋亡。这些药剂通常对细胞凋亡比较突出的人体组织(如，头发、肠道和皮肤)有很强烈的作用。因此，标准化疗对癌症防治是不合适的，对长期性治疗尤为不适。
苯并咪唑类化合物(简称BZs)是一类广谱驱虫药，对寄生线虫有很好的治疗作用，对绦虫和吸虫也有一定疗效。BZs也被证明是一种高效抗原虫制剂，并有抗真菌活性。现代研究认为BZs通过结合到细胞微管体系上扰乱细胞功能来发挥其细胞毒性(Lacey，1988，Friedman和Platzer，1980)。通过富集提取蠕虫和哺乳动物的微管蛋白进行的药物结合研究显示微管蛋白是BZs类药物的作用靶点(Lacey，1988)。另外，用哺乳动物微管蛋白进行的竞争性药物结合研究显示，BZs结合与秋水仙素结合发生竞争并阻碍了L1210体外鼠白血病细胞的生长(Friedman和Platzer，1978；Lacey和Watson，1989)。但是，BZs被用作驱虫药时会选择性的对线虫产生毒性而对宿主不产生毒性。相反，BZs在体外会抑制哺乳动物微管蛋白的聚合。BZs对宿主生物大分子和寄生虫生物大分子亲和力的不同(Russell等，1992；Kohler和Bachmann，1981)与BZs在宿主和寄生虫中药代动力学的不同均被证明与BZs的选择性毒性有关(Gottschall等，1990)。但是这种选择性毒性的真实分子基础却还不清晰。
甲苯咪唑(MZ)，或5-苯甲酰-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯，是BZ类化合物的一员。最近，MZ被发现具有通过解聚微管蛋白而对非小型肺癌细胞产生抑制有丝分裂和促进细胞凋亡的作用(Sasaki等，2002)。MZ还被发现无论在体外还是体内都对人类肿瘤细胞系具有很强的抗肿瘤作用。(Mukhopadhyay等，2002)。
MZ最早依据Brugmans(1971)等的研究结果被引入蛔虫感染的治疗。它作为一种人畜通用广谱驱虫药(Van den Bossche等，1982)，是一系列广泛用于人畜的广谱驱虫药的原型(Michiels等，1982)。有驱虫效果的BZ相关衍生物还包括阿苯达唑和氟苯达唑。
MZ在蛔虫病、肠道毛线虫病、蛲虫病、鞭虫病、钩虫病(十二指肠钩虫和美洲钩虫)的单一及复合感染的治疗上非常有效。它对致病线虫的幼虫和成虫阶段都有活性，并且它能杀死蛔虫和鞭虫的卵(Keystone和Murdoch，1979；Van den Bossche等，1982)。易感胃肠道微生物的固化和死亡缓慢的发生，直到用MZ治疗几天之后胃肠道的清理才会结束。如果与阿苯达唑一起服用，MZ在包虫病的治疗上也展现出一些前景(Wilson等，1987)。
MZ使被其作用寄生虫表膜和肠细胞细胞胞浆微管发生选择性缺失，分泌物在高尔基体区域积聚，乙酰胆碱酯酶的分泌和葡萄糖的摄取受损，糖原衰竭。MZ的这些作用不会出现在宿主细胞中。MZ在体外对寄生虫微管蛋白有很强的亲和性，不过它同时也与宿主微管蛋白相连。它选择性作用的生化基础还不清晰(参考Van den Bossche，1981；Watts等，1982)。
MZ的传统剂型是片剂，片剂的MZ很难被吸收，血浆药物浓度低且难以反映服用剂量(Witassek等，1981)。这是因为MZ在低于1μg/ml的水溶液中有很强的亲脂性。所以，MZ的传统剂型导致药物具有低的生物利用度且难以被胃肠道正常吸收。很多其他的BZ类药物及BZ衍生物也有很强的亲脂性且难以被胃肠道正常吸收。
因此，改进口服BZ类和BZ衍生物类药物的需求变得显而易见，比如具有更好生物利用度的MZ，可用来治疗诸如癌症和有肠外表现的深度寄生虫病等全身性疾病。另外，相较于传统剂型能更好的释放BZ及BZ衍生物类药物的肠外剂型也将更有利于这些全身性疾病的治疗。类似这些的药物组成将导致更高的血药浓度，并因此得到更好的功效和治疗效果。下面展示的发明填补了这项长期需求和技术期望。
发明概述
本发明基于苯并咪唑及其衍生物新型剂型的研制。该新剂型提高了药物溶解度和生物利用度，改善了药物的释放。血清中高浓度的苯并咪唑或其衍生物利于此类药物在治疗其适应症中发挥较好的疗效。以甲苯咪唑为例，其适应症包括过增生性疾病，如癌症；肠外和深度寄生虫疾病，如棘球蚴(包虫)病。
本发明采用共溶解法和微乳液法配制甲苯咪唑，所获得的药物浓度为1.4-3.5mg/ml。与传统剂型相比，甲苯咪唑的溶解度提高了1400-3500倍。发明人通过体外美国药典溶出度的测定、大鼠体内生物利用度的研究以及多种癌症细胞系细胞生长抑制实验对甲苯咪唑的剂型进行了评价。与单纯悬浮液相比，这种剂型对甲苯咪唑从制剂中向外释放有实质性的改善，而且甲苯咪唑的生物利用度提高了130倍。与溶解在二甲亚砜中的对照剂型相比，这种剂型降低了甲苯咪唑的对肺癌细胞系的IC50值。并且这种剂型在临床前的药代动力学和药效学研究中表现出了良好的特性。因此，这种新型的苯并咪唑剂型可望增强其对癌症和其他过增生性疾病的治疗功效。
本发明的一些实施方案是一种包括苯并咪唑、多元醇和偶极非质子溶剂的药物组合物。对药物组合物的定义将在本文详述部分讨论，并包括一种对人或动物酌情用药时不会产生过敏或其他不良反应的组合物。
任何苯并咪唑、苯并咪唑的衍生物，或苯并咪唑的组合都在本发明的药物组合物考虑之内。本工艺技术人员熟悉这类广泛试剂，并且能够理解本发明的药物组合物是从属于这类药物中某一种类或某些种类的使用的。例如，这种药物组合物中的苯并咪唑可以是有如下结构的衍生物：
Figure BPA00001330497700051
其中R3可选基团包括氢原子、羧基(-CO2H)、羟基、氨基、氯原子、二氟甲氧基、苯甲酰基、苯硫基、吡啶基、丙硫基、二苯基、甲氧基(甲氧基-二甲基，吡啶基)甲基-(磺酰)、氟苯甲基-2-氯基、丙烯基、氯丙基或酯(-CO2R4)。其中R4可选基团包括烃氧基、卤代烷基、烯基和环烷基，其中烷基基团有1-8个碳原子，或为CH3CH2(OCH2CH2)n-、CH3CH2CH2(OCH2CH2CH2)n或(CH3)2CH(OCH(CH3)CH2)n-，其中n值取1-3。其中R1可选基团包括羟基、氯原子、巯基、氨基甲酸酯或哌啶-4基。其中R2可选基团包括氢原子、α-甲乙烯、3-氯丙基或哌啶-4基，也可以是具药剂学活性的有机或无机盐或混合物。
本发明的一些实施方案中，苯并咪唑的衍生物是甲基5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯(甲苯咪唑，MZ)。另外，在其他实施方案中，苯并咪唑的衍生物也可以是5-丙硫基-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯(芬苯达唑)或5-甲氧基-2[(4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶基)-甲基亚砜]-1H-苯并咪唑(奥美拉唑)。
在一些实施方案中，药物组分中的BZ衍生物可以是
Figure BPA00001330497700052
药物组分中的BZ衍生物也可以是
Figure BPA00001330497700053
在其它一些实施方案中，药物组分中也可包含如下的BZ衍生物
Figure BPA00001330497700061
本发明的药物组分考虑到使用多元醇。制药行业中的普通技术人员都会熟悉这一类多元醇试剂，且明白任何一种多元醇类成分都可以包含在本发明的药物组分里。例如，多元醇可以是聚乙二醇(PEG)200、PEG 300、PEG 400、PEG 600、1，2-丙烯二醇、甘油。在一些实施方案中，多元醇可以是PEG 400。本发明的药物组分可以包含单一多元醇或多种多元醇。
本发明的药物组分包含偶极非质子溶剂。偶极非质子溶剂是一种具有较高相对介电常数的溶剂，相对介电常数一般大于15，有可观测到的永久偶极矩，且不能贡献合适的活性氢原子来形成强氢键。但这个定义有些不太恰当，因为这种溶剂通常不是质子惰性的而是亲质子的，最多具有弱的产质子性。制药行业中的普通技术人员都会熟悉这一类典型的偶极非质子溶剂，且明白任何一种偶极非质子溶剂都可以包含在本发明的药物组分里。
例如，偶极非质子溶剂包含N，N-二甲基乙酰胺(DMA)或二甲基亚砜(DMSO)。在某些实施方案中，药物组分包含N，N-二甲基乙酰胺作为偶极非质子溶剂。在其他实施方案中，偶极非质子溶剂是二甲基亚砜。某些实施方案中，药物组分里包含多于一种的偶极非质子溶剂。比如，药物组分会同时包含N，N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜。
本发明的药物组分考虑多元醇和偶极非质子溶剂的任意重量配比。但是，在本发明的某些实施方案中，多元醇与偶极非质子溶剂的重量配比是3∶1。例如，本发明的药物组分可能以重量比3∶1的比例包含PEG 400和N，N-二甲基乙酰胺。或者，某些实施方案也会以重量比3∶1的比例包含PEG 400和二甲基亚砜。
在本发明药物组分的某些实施方案中，多元醇与偶极非质子溶剂的重量比达到7∶1。例如，药物可按重量比7∶1包含PEG 400和二甲基亚砜，或者按重量比7∶1包含PEG 400和N，N-二甲基乙酰胺。
某些具体实施方案中，本发明药物组分含水。任何含量的水都在本发明的考虑之内。但是，在某些实施例中，多元醇∶偶极非质子溶剂∶水的相对重量比例是3∶1∶1。例如，一些实施方案的药物组分按重量比3∶1∶1包含PEG 400、N，N-二甲基乙酰胺、水。或者，其它类似实施方案的药物组分按重量比3∶1∶1包含PEG 400、二甲基亚砜、水。
在其他一些实施方案的药物组分中，多元醇∶偶极非质子溶剂∶水的相对比例是7∶1∶2。例如，药物组分可按重量比7∶1∶2包含PEG 400、二甲基亚砜、水。
本发明的新增实施方案体现在药物组分上，包含(1)一种BZ类化合物；(2)一种油；(3)一种偶极非质子溶剂；和(4)一种表面活性剂。BZ和BZ衍生物家族的成员已在本文的前面及其它地方讨论过了。如同上文所讨论的，制药行业中的技术人员都会熟悉这一大类药物，且明白本发明的药物组分使用该类药物的单一成员或配合使用多种此类药物。例如，就像上文讨论的，BZ衍生物可用MZ。
任何一种油的使用都在本发明的考虑之内。制药行业中的普通技术人员都会熟悉多样化的可用于药物组分的油。例如，油可以用超级精炼的玉米油、超级精炼的棉籽油、橄榄油、超级精炼的花生油、超级精炼的大豆油、Captex 200、Captex 355、Miglyol 812，或者Myvacet9-45。在本发明药物组分的某些实施方案中，油采用Captex 200。在其他一些实施方案中，油采用Myglyol 812。本发明的药物组分还考虑使用多于一种油或者各种混合油。
本发明考虑到各种表面活性剂的使用。制药行业中的普通技术人员都会熟悉多样化的可用于本发明药物组分的表面活性剂。例如，在某些实施方案中本发明的药物组分包含作为表面活性剂的吐温80。在其他实施方案中，药物组分包含作为表面活性剂的Arelacel 80。本发明的药物组分可以包含单一表面活性剂或者混合表面活性剂。
本发明考虑使用各种亲水亲油平衡(HLB)的表面活性剂。表面活性剂的亲水亲油平衡是一个具有随意性的经验量，它是对单一或混合表面活性剂极性的一种测定。这是一个被广泛知晓和应用的术语，应该被制药行业普通技术人员所熟悉。总的来说，具有高HLB的表面活性剂一般其HLB等于或高于7，具有低HLB的表面活性剂其HLB低于7。组分中若含有多种表面活性剂可以提供更多功效，更好的稳定性，增强药物吸收度。例如，本发明的一些实施方案把吐温80和Arelacel 80混合起来作为表面活性剂。
在本发明药物组分的某些实施方案中，所使用的表面活性剂只有高HLB表面活性剂。本发明药物组分的其它实施方案包含只使用低HLB表面活性剂的情况。再者，本发明的药物组分还包含混合使用高HLB表面活性剂和低HLB表面活性剂的情况。
就像上文所说的，本发明的药物组分可被进一步定义为含水。只要任意量的先前定义过的组分存在，任何量的水都在本发明药物组分的考虑之内。
本发明的药物组分还可以被进一步定义为微乳液。微乳液于此处被定义为一种液相在界面膜表面活性剂的稳定作用下在另一种液相中热力学稳定地分散。分散可以是油在水中或是水在油中。由于液滴直径大概在100纳米或更小，微乳液一般是清液。但是，非清液在此处也被涵盖在微乳液的定义下，且定义考虑任何液滴直径。
本发明某些实施方案的药物组分包含：(1)MZ；(2)10％-60％质量百分比的油；(3)2％-30％质量百分比的偶极非质子溶剂；(4)5％-50％质量百分比的第一种表面活性剂；(5)5％-50％质量百分比的第二种表面活性剂。
本发明的药物组分考虑到了任意浓度的MZ。比如，在某些实施方案中MZ的浓度高于1.4mg/ml。MZ的浓度可以约为1.5mg/ml，约为1.6mg/ml，约为1.7mg/ml，约为1.8mg/ml，约为1.9mg/ml，约为2.0mg/ml，约为2.1mg/ml，约为2.2mg/ml，约为2.3mg/ml，约为2.4mg/ml，约为2.5mg/ml，约为2.6mg/ml，约为2.7mg/ml，约为2.8mg/ml，约为2.9mg/ml，约为3.0mg/ml，约为3.1mg/ml，约为3.2mg/ml，约为3.3mg/ml，约为3.4mg/ml，约为3.5mg/ml，或处于任何浓度范围或发生可导浓度增量。
在另一些实施方案中，MZ的浓度是0.3-3.0mg/ml。比如，MZ的浓度可约为0.4mg/ml，约为0.5mg/ml，约为0.6mg/ml，约为0.7mg/ml，约为0.8mg/ml，约为0.9mg/ml，约为1.0mg/ml，约为1.1mg/ml，约为1.2mg/ml，约为1.3mg/ml，约为1.4mg/ml，约为1.5mg/ml，约为1.6mg/ml，约为1.7mg/ml，约为1.8mg/ml，约为1.9mg/ml，约为2.0mg/ml，约为2.1mg/ml，约为2.2mg/ml，约为2.3mg/ml，约为2.4mg/ml，约为2.5mg/ml，约为2.6mg/ml，约为2.7mg/ml，约为2.8mg/ml，约为2.9mg/ml，或处于任何浓度范围或发生可导浓度增量。还有一些实施方案中，MZ的浓度是0.5mg/ml到2.5mg/ml或0.3mg/ml到3.0mg/ml。
在一些特定实施方案中，MZ的浓度约为1.2mg/ml。另一些实施例中，MZ的浓度约为1.5mg/ml。还有一些实施方案，MZ的浓度约为1.7mg/ml。还有一些实施方案，MZ的浓度约为1.8mg/ml。还有一些实施方案，MZ的浓度约为1.85mg/ml。还有一些实施方案，MZ的浓度约为1.9mg/ml。还有一些实施方案，MZ的浓度约为2.0mg/ml。还有一些实施方案，MZ的浓度约为2.1mg/ml。还有一些实施方案，MZ的浓度约为2.3mg/ml。更有一些实施方案，MZ的浓度约为2.6mg/ml。
本发明药物组分中BZ的浓度有可能由行业技术人员所了解的方法决定。行业中普通的技术人员都应当熟悉决定药物组分中BZ或BZ衍生物浓度的技术。比如，BZ的浓度有可能由HPLC(高效液相色谱)决定。在MZ作为BZ衍生物存在的实施方案中，HPLC可被用于决定MZ的浓度。用HPLC决定本发明药物组分中MZ浓度的方法将在下文的详细描述部分进一步讨论。
在本发明的一些实施方案中，药物组分可以包含水。在其他必需组分存在的前提下，本发明考虑到了任意含量的水。另外，本发明考虑到了除已确定成分以外其他组分的存在。关于潜在的其它添加物的讨论将放在下文的详细描述部分展开。
一些实施方案的药物组分把吐温80作为第一种表面活性剂，把Arelacel 80作为第二类表面活性剂。比如，在某些实施方案中，药物组分包含10％-60％质量百分比的Captex 200，3％-30％质量百分比的N，N-二甲基乙酰胺，5％-50％质量百分比的吐温80，5％-50％质量百分比的Arelacel 80，还有2％-20％质量百分比的水。在一些实施方案中，药物组分包含28.9％质量百分比的Captex 200，13.7％质量百分比的N，N-二甲基乙酰胺，28.8％质量百分比的吐温80，28.8％质量百分比的Arelacel 80，和13％质量百分比的水。
在某些实施方案中，药物组分包含10％-60％质量百分比的Captex200，2％-20％质量百分比的二甲基亚砜，10％-40％质量百分比的吐温80，10％-40％质量百分比的Arelacel 80，和10％-20％质量百分比的水。比如，药物组分可能包含50.1％质量百分比的Captex 200，12.6％质量百分比的二甲基亚砜，12.6％质量百分比的吐温80，12.6％质量百分比的Arelacel 80，和12.1％质量百分比的水。药物组分也可以包含42.6％质量百分比的Captex 200，10.7％质量百分比的二甲基亚砜，16.1％质量百分比的吐温80，16.1％质量百分比的Arelacel 80，和14.5％质量百分比的水。在其他例子中，药物组分包含38.4％质量百分比的Captex 200，9.6％质量百分比的二甲基亚砜，19.2％质量百分比的吐温80，19.2％质量百分比的Arelacel 80，和13.6％质量百分比的水。另一些例子中，药物组分包含34.7％质量百分比的Captex 200，8.7％质量百分比的二甲基亚砜，21.7％质量百分比的吐温80，21.7％质量百分比的Arelacel 80，和13.2％质量百分比的水。
本发明的药物组分也可能包含10％-60％质量百分比的超级精炼大豆油，2％-20％质量百分比的二甲基亚砜，10％-40％质量百分比的吐温80，10％-40％质量百分比的Arelacel 80，和0.5％-15％质量百分比的水。比如，药物组分可能包含56.5％质量百分比的超级精炼大豆油，14.1％质量百分比的二甲基亚砜，14.1％质量百分比的吐温80，14.1％质量百分比的Arelacel 80，和1.2％质量百分比的水。在本发明的其它实施方案中，药物组分包含44.2％质量百分比的超级精炼大豆油，11.1％质量百分比的二甲基亚砜，16.6％质量百分比的吐温80，16.6％质量百分比的Arelacel 80，和11.5％质量百分比的水。另一些实施方案中，药物组分包含40.0％质量百分比的超级精炼大豆油，10.0％质量百分比的二甲基亚砜，20.0％质量百分比的吐温80，20.0％质量百分比的Arelacel 80，和10.0％质量百分比的水。还有一些实施方案中，药物组分包含35.7％质量百分比的超级精炼大豆油，8.9％质量百分比的二甲基亚砜，22.3％质量百分比的吐温80，22.3％质量百分比的Arelacel 80，和10.8％质量百分比的水。
本发明实施方案的药物组分还包含10％-60％质量百分比的Miglyol 812，2％-20％质量百分比的二甲基亚砜，10％-40％质量百分比的吐温80，10％-40％质量百分比的Arelacel 80，和5％-10％质量百分比的水。比如，药物组分可以包含50.4％质量百分比的Miglyol 812，12.6％质量百分比的二甲基亚砜，12.7％质量百分比的吐温80，12.7％质量百分比的Arelacel 80，和11.6％质量百分比的水。在另一些实施例中，药物组分包含42.4％质量百分比的Miglyol 812，10.6％质量百分比的二甲基亚砜，15.9％质量百分比的吐温80，15.9％质量百分比的Arelacel 80，和15.2％质量百分比的水。还有一些实施例中，药物组分包含39.2％质量百分比的Miglyol 812，9.8％质量百分比的二甲基亚砜，19.6％质量百分比的吐温80，19.6％质量百分比的Arelacel 80，和11.8％质量百分比的水。本发明的药物组分还可以包含34.7％质量百分比的Miglyol 812，8.7％质量百分比的二甲基亚砜，21.8％质量百分比的吐温80，21.8％质量百分比的Arelacel 80，和13.0％质量百分比的水。
药物组分可依照行业技术人员所熟悉的任何方法来制定。例如，在一些实施方案中，药物组分被制定用来进行肠外治疗。肠外治疗被定义为采用除通过消化道和非侵入性区域治疗方法以外的其它方法进行的治疗。比如，肠外治疗可以包括对病人的静脉、皮内、动脉、腹腔、肠套叠、颅内、关节腔内、前列腺内、胸腔内、气管、玻璃体内、瘤内、肌肉、皮下、结膜、脉管内、心包腔内、脐下进行注射和输液。
在本发明的其他实施方案中，药物组分进一步被定义为要适于通过消化道或通过非侵入性区域进行治疗。比如，药物制备要适于口服。在其他实施方案中，药物制备要适于滴鼻、要有局部性、适于吸入、适于连续输液、或适于通过导管或灌洗直接对靶细胞进行局部灌注浸泡。
本发明的实施方案还包含由微乳液合成的和由纳米乳液合成的BZ衍生物药物的输送机制，用来提升药物在细胞或组织的释放率及生物利用度。这些乳液可能包含纳米自乳化药物输送体系和一般的自乳化药物输送体系。在一些实施方案中，药物输送体系被定义为包含1)BZ衍生物2)一种油3)一种表面活性剂4)一种助表面活性剂5)一种偶极非质子溶剂。在其他实施方案中，药物输送体系还有可能含水，如50％质量百分比的水。在特定的实施方案中，BZ衍生物是浓度约为0.9mg/ml到2mg/ml的甲基5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯(甲苯咪唑)。
药物输送系统的构成可包含一种油，如Captex 200或Myglyol，质量百分比约为14％到42％。还可包含一种表面活性剂如吐温80和一种助表面活性剂如二乙二醇单乙基醚或Capmul MCM。助表面活性剂的单独质量比例约为6％到48％，且表面活性剂与助表面活性剂的比例约为1∶0.5到1∶1。药物输送系统还可包含一种偶极非质子溶剂如二甲基亚砜，重量比率约为5％-10％。体系形成一种液滴直径约从35nm到低于500nm不等的乳液。自纳米乳化药物输送系统所包含液滴的直径约从35到低于100nm。自乳化药物输送系统所包含液滴直径约在141nm到低于500nm。
在某些实施方案中，药物输送系统可能包含甲基5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯，质量百分比约为4％到42％的一种油，质量百分数约在20％到41％的一种表面活性剂和一种助表面活性剂，且二者比例约在1∶0.75到1∶1，以及质量百分数约在5％到10％的二甲基亚砜。在这些实施方案中，甲基5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯的浓度约在0.9mg/ml到2mg/ml。在一个特定的例子中，药物传输系统包含约4％到9％质量百分比的Captex 200与质量百分比均为20％到41％的吐温80，二乙二醇单乙基醚和Capmul。在这个特定的例子中，药物传输系统可能包含约50％质量百分比的水。同时，当液滴直径为约35nm到37nm时，该系统可为自纳米乳化药物传输系统。在另一个特定的例子中，药物传输系统可能包含约42％质量百分比的Myglyol，约27％质量百分比的吐温80和二乙二醇单乙基醚，还有约21％质量百分比的Capmul。在这个例子中，当液滴直径为约141-145nm时，系统可为自乳化药物传输系统。
在本发明的其他一些实施方案中，药物传输系统被要求为要适于针对治疗的病理生理条件提升BZ衍生物药物的生物利用度。传输BZ衍生物药物，无论肠外还是口服，都要设法提升其生物利用度，因为体系内液滴直径与乳液中表面活性剂∶助表面活性剂比率的有效组合可以增加BZ衍生物在组织内的半衰期。在特定实施方案中，液滴直径在约34nm到143nm且表面活性剂∶助表面活性剂比率约为1∶1。因此，本发明的药物组成和药物传输系统适合于处理如癌症等疾病的病理生理状况。比如，肺癌，或与其他抗菌药物配合处理肺部感染。
在相关的实施方案中，药物传输系统被要求要适于提升BZ衍生物在肺中所需浓度和保留值。配置一份微乳液，需要BZ衍生物和其他药物传输系统的组分，且微乳液中液滴大小要在约35nm到低于100nm之间，以用来提供微乳液中BZ衍生物在肺及其后肠外治疗时增长的浓度和保留值。
在其他一些实施方案中，药物输送系统被要求要适于保证在治疗过程中BZ衍生物的微乳液的溶血安全。配置一份包含BZ衍生物和其他药物传输系统组分，表面活性剂比助表面活性剂的比率低且质量百分比在约27％到42％的微乳液，将会降低肠外治疗中微乳液的溶血潜力。
本发明实施方案的药物传输系统还包含具有BZ衍生物颗粒的纳米混悬剂配置，以用于提升药物对细胞或组织的缓释性和生物利用度。在某些实施方案中，药物传输系统包含1)BZ衍生物，在其他一些实施方案中，还包含两种到多种表面稳定剂，如2)一种或多种嵌段聚合物，3)一种或多种表面活性剂，有时还可能有4)水。纳米混悬剂可能由各10％浓度百分百的嵌段聚合物与表面活性剂组成，各约5％浓度百分比更好，各约1％浓度百分比最好。同时，BZ衍生物可以包含200mg/ml左右各种浓度的纳米混悬剂。另外，包含纳米混悬剂的颗粒也许会广泛具有相同的大小和直径，或者是不同大小直径的混合。在非限制性的例子中，颗粒大小或直径的范围在5nm到约2000nm之间，更好一些的在约100nm到2000nm。
在一些特定的实施方案中，药物传输系统所含纳米混悬剂的配置包含一种嵌段共聚物叫普朗尼克F108和一种表面活性剂叫吐温80，当然很多其他的嵌段共聚物和表面活性剂也可以使用。可选择的，剂型中可能含水。在这些实施方案中，BZ衍生物是甲基5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯(甲苯咪唑)，其浓度为不超过200mg/ml的任意浓度。
在本发明的一些实施方案中，药物传输系统被设计要适于使BZ衍生物的纳米混悬剂在对组织的治疗过程中达到最佳疗效。纳米混悬剂中BZ衍生物的颗粒大小要依据BZ衍生物在被治疗组织中的药代动力学参数来选择和调整。比如，颗粒大小被调整在5nm到2000nm的区间内。因此，被调整过的颗粒大小决定了纳米混悬剂的性质并使治疗过程中的疗效最大化。用于衡量调整颗粒大小的药代动力学参数可以是浓度、保留值、生物学分布、生物体内分布、BZ衍生物在特定组织的毒性等参数中的一个或多个。在另一个实施方案中，合适颗粒大小的纳米混悬剂在治疗过程中被用于对个体进行肠外治疗。
在本发明的相关实施方案中，药物传输系统被要求要适于增加在一定病理生理条件下BZ衍生物在特定组织治疗过程中的生物利用度。纳米混悬剂颗粒在一定的大小直径范围内配置。颗粒中BZ衍生物的保留值随颗粒大小直径的增加而增加。在纳米混悬剂治疗上，从颗粒中持续不断的释放BZ衍生物到特定组织的的时间是由颗粒大小决定的。比如，纳米混悬剂可被用于肠外治疗。在特定实施方案中，颗粒大小和直径在5nm到2000nm的范围内。因此，本发明的药物传输系统适于治疗诸如癌症这类的病理生理情况，如肺癌或肝癌。
在其他相关实施方案中，药物传输系统被进一步要求要适于治疗癌症这种迫切的疾病。运用纳米混悬剂治疗时，将纳米混悬剂颗粒中的BZ衍生物释放到癌组织上可以达到相同的疗效。在进一步的实施方案中，在运用纳米混悬剂进行治疗之前，纳米混悬剂中颗粒具有宽泛的大小和直径范围，颗粒直径越大在颗粒中的BZ衍生物的保留值也越大，其在组织内的生物利用度也就提高。特殊的，能用于进行肠外治疗的纳米混悬剂的颗粒直径范围从约5nm到2000nm不等。
其他方面或更深的层次，本发明的特色和优势将在下述对本发明优秀实施方案的描述中变得显而易见。
有关所附示意图的简述
下面的示意图是当前详述的一部分，且进一步展示了本发明的一些方面。综合参考这些示意图和对所展示实施方案的细致描述可以更好的理解本发明。
图1.MZ的可靠高效液相色谱图(MZ 0.1μg/mL，100μL＝10ng)。
图2.表3-E描述的微乳液剂型的代表性伪三元相图(表3E)。
图3.剂型为A4和E4的微乳液中MZ的体外释放图。
图4.在给大鼠静脉推注混合制剂P7(3.25mg/kg)后MZ的平均药代动力学特征图(n＝3)。
图5.在给大鼠口服微乳液E4(4.89mg/kg)后MZ的平均药代动力学特征图(n＝4)。
图6.在给大鼠口服混悬剂(50mg/kg)后MZ的平均药代动力学特征图(n＝4)。
图7.在给大鼠静脉推注共溶剂型P7(3.25mg/kg)后MZ的半对数药代动力学特征图。
图8.MZ E4-微乳液对三个皮肤癌细胞系(SRB1、A375、2237)的细胞毒性图。
图9.MZ E4-微乳液和MZ-DMSO对比安慰剂在H1299细胞系中的细胞杀伤效果图。
图10A-10B.SNEDDs和Captex200/1∶1的吐温/二乙二醇单乙基醚/水(图10A)与Myglyol/1∶1吐温/二乙二醇单乙基醚/水(图10B)组合的代表性伪三元相图。
图11A-11B.SNEDDsSEDDS
Figure BPA00001330497700152
共溶剂
Figure BPA00001330497700153
和单纯悬浮液
Figure BPA00001330497700154
中甲苯咪唑相对释放特征图(图11A)和含安慰剂SNEDDs
Figure BPA00001330497700155
的单纯悬浮液与单纯药物中甲苯咪唑相对释放特征图(图11B)。
图12A-12G.Sprague-Dawley大鼠体内甲苯咪唑的平均血浆浓度时间特征图：静脉注射肠外共溶剂后(图12A)，口服SNEDDS后(图12B)，口服SEDDS后(图12C)，口服单纯悬浮液(图12D)，静脉注射肠外微乳液PM1后(图12E)，静脉注射肠外微乳液PM2后(图12F)。图12G用于确定PM1剂型的溶血潜力。
图13.服用共溶剂(◆)、肠外微乳液PM1(v)和PM2(----)剂型的老鼠体内的甲苯咪唑血浆浓度特征图。
图14A-14C.共溶剂(图14A)、PM1(图14B)和PM2(图14C)剂型在老鼠体内的生物学分布。
图15A-15C.在注射共溶剂、PM1(37nm)、PM2(478nm)后老鼠(n＝4-5)体内甲苯咪唑在器官中浓度的比较图：5分钟(图15A)、2小时(图15B)和4小时(图15C)。
图16.用于连接Mbz在肺部和血浆中浓度的三室模型示意图。
图17A-17F.与Mbz平均血浆浓度和平均肺部浓度的半对数图相匹配的三室模型：注入共溶剂(图17A-17B)、PM1(图17C-17D)和PM2(图17E-17F)剂型。
图18A-18F.观测到的和预测的三室模型血浆和肺部浓度对比：共溶剂(图18A-18B)、PM1(图18C-18D)、PM2(图18E-18F)。
图19A-19F.Mbz清除(图19A-19C)与Mbz Vss(图19D-19F)和体重异速生长的关系(log-log)：共溶剂(图19A、19D)、PM1(图19B、19E)、PM2(图19C、19F)。
图20A-20F.Mbz t1/2，α(图20A-20C)与Mbz t1/2，β(图20D-20F)和体重异速生长的关系(log-log)：共溶剂(图20A、20D)、PM1(图20B、20E)、PM2(图20C、20F)。
图21A-21B.37℃含0.2％吐温80的PBS中的甲苯咪唑共溶剂(自由Mbz)和具有不同颗粒大小(NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm)的纳米混悬剂的释放特征图：10小时图(图21A)和48小时图(图21B)。*和**指不同大小纳米混悬剂中Mbz的不同释放度等级。采用事后Tukey检验进行单因素方差分析，若P＜0.05，则**在统计学上不同于*。
图22A-22B.37℃血浆中的甲苯咪唑共溶剂(自由Mbz)和具有不同颗粒大小(NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm)的纳米混悬剂的释放特征图：10小时图(图22A)和48小时图(图22B)。*和**指不同大小纳米混悬剂中Mbz的不同释放度等级。采用事后Tukey检验进行单因素方差分析，若P＜0.05，则**在统计学上不同于*。
图23.共溶剂(6.5mg/kg)、NS-167nm(30mg/kg)和NS-1700nm(30mg/kg)中Mbz在老鼠血浆中的浓度特征图。共溶剂◆；
Figure BPA00001330497700171
1700nm----。
图24A-24B.NS-167nm(图24A)和NS-1700nm(图24B)在老鼠体内(n＝3-5)的生物学分布。Mbz在血浆中的浓度单位是(μg/ml)/(mg/kg)。5分钟(空白)；24小时(灰色)；48小时(条纹)。
图25A-25B.不同颗粒大小的纳米混悬剂中Mbz的药代动力学特性图：初始药代动力学样本(图25A)和在已完成的药代动力学样本(图25B)。141nm◆(n＝3)；
Figure BPA00001330497700172
253nm----(n＝2)；
Figure BPA00001330497700173
Figure BPA00001330497700174
图26A-26E.来自于共溶剂(图26A)、NS-167nm(图26B)、NS-400n(图26C)、NS-700nm(图26D)和NS-1700nm(图26E)中的Mbz在大鼠体内的生物学分布。血液中Mbz的浓度单位是(μg/ml)/(mg/kg)。n＝3-5。*、**和***指不同Mbz共溶剂剂型中Mbz的不同浓度等级。当P＜0.05时，**在统计学上不同于*。当P＜0.05时，***在统计学上不同于**。5分钟(空白)；1小时(灰色)；2小时(条纹)。
图27A-27C.大鼠血液内共溶剂、NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm中的总Mbz浓度(图27A-27B)；大鼠血浆内共溶剂、NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm中的总Mbz浓度(图27C)。
图28A-28C.给大鼠注射共溶剂(n＝4-5)、NS-167nm(n＝4-5)、NS-400nm(n＝5)、NS-700nm(n＝4-5)和NS-1700nm(n＝1-3)5分钟后(图28A)、24小时后(图28B)和48小时后(图28C)Mbz在肝和脾的浓度比较图。
图29A-29D.来自NS-167nm(图29A)、NS-400nm(图29B)、NS-700nm(图29C)和NS-1700nm(图29D)的Mbz母体药物在大鼠肝和脾的浓度图。
图30A-30D.来自NS-167nm(图30A-30B)和NS-1700nm(图30C-30D)的Mbz母体药物在小鼠和大鼠肝(图30A，30C)和脾(图30B，30D)的浓度。
图31A-31L.共溶剂、NS-167nm、NS-1700nm的Mbz CL(图31A-31C)、Mbz Vss(图31D-31F)、Mbz t1/2，α(图31G-31I)、Mbz t1/2，β(图31J-31L)和体重之间异速生长的关系(对数-对数)。
本发明的详细描述
在本文中，当“一个”这个词作为连词和“包括”一起出现在说明和/或叙述中时，有可能就指“一个”，但也有可能指“一个或多个”、“至少一个”、“一个或多于一个”。本发明的一些实施方案有可能包括或本质上包含一种或多种元素、方法步骤和/或本发明的一些方法。可以预期，这里描述的任何一种方法或组成都是可以实施的。
在本文中，“或”这个词在说明中相当于“和/或”，除非“或”被明确地指明只指向其他可替代物或其他可替代物之间是相互排斥的。即使“或”广为人知的定义是仅指其他可替代物与“和/或”。
在本文中，术语“药物”、“药物地”或“药理学上可接受的”指的是一些分子实体和组分。它们通过给药进入动物体，或在恰当的时候进入人体时不会产生相反的作用、过敏或其它不好的反应。术语“药物”包含任何一种以及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、电解质和吸收延缓剂及其他类似物。这些药物活性成分的使用媒介和试剂用法在制药业已经广为人知了。除了其活性组分与某种传统的媒介或试剂不能相容外，它在治疗组分中的用途可被预期。辅助活性成分，比如，其它抗癌制剂或驱虫药，也可以被加入到药物组成中来。
在本文中，术语“溶血潜力”或“H10％”指的是一种微乳液剂型在血液中的比例，其中90％的血细胞存活。
在本文中，术语“纳米混悬剂”指由表面修饰试剂稳定的纳米级药物颗粒构成的分散体系。它们是很有前景的药物传输系统，既适用于难溶于水的药物也适用于难溶于油的药物。纳米混悬剂相较于其他纳米制剂如脂质体、胶束、微乳液等等的一个很大的优势在于纳米混悬剂只包含纯药物不包含载体或有机溶剂，这样就大大地降低了药剂潜在的中毒风险。另外，用纳米混悬剂作为配料可制备高浓度的药物。因此，只需要较少的体积。纳米混悬剂适用于多种药物传输系统如口服、肠外、经眼滴入、经肺吸入和靶向药物传输。
在本文中，术语“受体”指任意一个接受体，接受通过所描述的药物组成或药物传输系统的一种苯并咪唑衍生物。
本发明寻求开发发明者们的发现来提供BZs和BZ衍生物的具有可预见较高生物利用度的生物制剂。由于BZs和BZ衍生物在水溶液中溶解度很差，因此通常具有有限的和不稳定的口服生物利用度。结果，这些药物以传统剂型方式很难被有效传输。比如，MZ在水溶液中的溶解度低于1μg/ml。发明者开发了一系列BZ和BZ衍生物的口服和肠外制剂，比如MZ分别用共溶剂和微乳的方式处理。MZ肠外制剂的开发是为了规避MZ在口服时广泛产生首过代谢的短处。这些制剂可被应用于治疗那些对高生物利用度的BZs和BZ衍生物敏感的疾病，如过度增生疾病、肿瘤疾病、肠外寄生虫病。
A.苯并咪唑和苯并咪唑衍生物
苯并咪唑类化合物(简称BZs)是一类广谱驱虫药，对寄生线虫有很好的治疗作用，对绦虫和吸虫也有一定疗效。BZs也被证明是一种高效抗原虫制剂，并有抗真菌活性。现代研究认为BZs通过结合到细胞微管体系上扰乱细胞功能来发挥其细胞毒性(Lacey，1988；Friedman和Platzer，1980)。通过富集提取蠕虫和哺乳动物的微管蛋白进行的药物结合研究显示微管蛋白是BZs类药物的作用靶点(Lacey，1988)。另外，用哺乳动物微管蛋白进行的竞争性药物结合研究显示，BZs结合与秋水仙素结合发生竞争并阻碍了L1210体外小鼠白血病细胞的生长(Friedman和Platzer，1978；Lacey和Watson，1989)。但是，BZs被用作驱虫药时会选择性的对线虫产生毒性而对宿主不产生毒性。相反，BZs在体外会抑制哺乳动物微管蛋白的聚合。BZs对宿主生物大分子和寄生虫生物大分子亲和力的不同(Russell等，1992；Kohler和Bachmann，1981)与BZs在宿主和寄生虫中药代动力学的不同均被证明与BZs的选择性毒性有关(Gottschall等，1990)。但是这种选择性毒性的真实分子基础却还不清晰。
苯并咪唑和苯并咪唑衍生物拥有如下分子结构
Figure BPA00001330497700201
其中R的可选基团包括H原子、羧基(-CO2H)、羟基、氨基或酯基(-CO2R′)。其中R′的可选基团包括烷氧基、卤烷基、烯基和环烷基。其中烷基基团有1-8个碳原子或CH3CH2(OCH2CH2)n-或CH3CH2CH2(OCH2CH2CH2)n或(CH3)2CH(OCH(CH3)CH2)n。这里n为1-3，且为药理学上可接受的有机或无机添加盐。其中R3可选基团包括氢原子、羧基(-CO2H)、羟基、氨基、氯原子、二氟甲氧基、苯甲酰基、苯硫基、吡啶基、丙硫基、氯丙基或酯(-CO2R4)。其中R4可选基团包括烃氧基、卤代烷基、烯基和环烷基，其中烷基基团有1-8个碳原子，或为CH3CH2(OCH2CH2)n-、CH3CH2CH2(O CH2CH2CH2)n或(CH3)2CH(OCH(CH3)CH2)n-，其中n值取1-3。其中R1可选基团包括羟基、氯原子、巯基、氨基甲酸酯或哌啶-4基。其中R2可选基团包括氢原子、α-甲乙烯、3-氯丙基或哌啶-4基，也可以是具药剂学活性的有机或无机盐或混合物。对于R4，最适宜的烷基基团是直链，最好端基碳上有卤原子取代，最好是氯原子取代。最适宜的环烷基基团是具有3-6个碳原子的基团，且也包含对烷基链取代形成的环烷基、2-环丙基乙烷、环丙基甲烷、2-环丙基丙烷或环己基甲烷。
BZs在体外具有一些抗肿瘤生长活性(WO 98/513304；WO98/32440)。BZs在体内作为一种抗肿瘤药物的效果被限制在已经回归化疗的肿瘤上。
可替代的BZ类药物有：芬苯达唑、阿苯达唑、阿苯达唑砜、奥苯达唑、阿苯达唑亚砜、噻唑、磺唑氨酯、氟苯达唑和多菌灵。可替代的驱蠕虫药有咪唑、硝咪唑、左旋咪唑、哌嗪、乙胺嗪、异硫氰酸酯、硝硫氰胺和CGP 6140。另外，苏拉明、伊维菌素、海恩酮、美曲磷酯、羟胺硝喹和吡喹酮也是驱蠕虫药。
B.苯并咪唑的癌症治疗
有证据显示，正像上述所讨论的一样，BZs或BZ衍生物可能对过度增生疾病的治疗很有用，比如癌症。具体来讲，利用BZs对癌症进行治疗在美国专利申请No.10/043,877中讨论的很细致，这项专利在本文参考文献部分也可以找到。另外，MZ也被发现无论在体内还是体外都对人类癌症细胞系具有潜在的抗肿瘤作用(Mukhopadhyay等，2002；Liang等，2002)。Mukhopadhyay等，2002和Liang等，2002的论文也被包含在本文的参考文献中。
一个很有趣的现象是，病人自身拥有野生型肿瘤抑制功能(例如P53蛋白)。肿瘤细胞系的肿瘤抑制状态可由很多传统方法达到，其中一些例子如下。病人可以，但不必须，接受先前的化疗、放疗或基因疗法，这样在最好的情况下，病人就可以拥有强健的骨髓功能(指周边绝对粒细胞数目＞2000/mm3且血小板数目在100,000/mm3)、强健的肝功能(肝红素≤1.5mg/dl)和强健的肾功能(肌酐＜1.5mg/dl)。
癌症患者可以用药理学上接受的BZ药物剂型来治疗，或者接受类似治疗功能模拟。治疗的形式可以是瘤内注射，或进一步讲，任何可利用的成熟到被行业中的技术人员所熟稔的方法都可以，如口服、全身治疗、局部治疗、区域治疗。可对被注射病灶进行活体切片检验且储存相关组织要起来以备免疫组化分析。
BZ的剂量通常要在给药前重新设定到一个药理学可接受的形式。BZ的剂量一般取决于临床医疗条件。例如，如果疾病是癌症，起始剂量约为0.1到1mg BZ/kg体重。当然，这十分依赖所治疗的疾病、肿瘤的大小、肿瘤增长的速率等等。
C.药物组成与摄取路线
1.概述
本发明的目的是建立BZ和BZ衍生物的肠外与口服制剂，比如MZ，用于达到较高的可预测的生物利用度。本发明源自要解决许多BZs和BZ衍生物由于水溶性不好造成口服时低生物利用度问题的需求。下文详细描述的BZs肠外和口服制剂分别建立在共溶剂和自乳化/微乳液方法的基础上。BZ的肠外制剂被用来规避MZ和其它BZs在口服时存在广泛首过代谢的短处。
发明者调查了MZ在不同溶剂中的溶解度，如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、DMSO和聚乙烯乙二醇-400(PEG)，在下述实施例中都有详细讨论。作为一级溶剂，应该与二级溶剂互溶，比如普通盐水、葡萄糖水溶液(5％或10％)和水。这些溶剂都是载体，BZs类药物如MZ可以在其中被稳定地溶解，从而在单独作用或与其他药物混合作用时为人体摄入更加安全。单个溶剂载体中BZ的溶解度见表1。
事实上，没有任何MZ药物在口服后被肠道吸收，使得把这类药物用作对抗系统感染的口服抗菌剂都变得不大可能。肠外制剂因此对MZ和其它BZs类药物来说是一个比较合逻辑的方式，它可用于治疗深度系统性真菌感染，也用于治疗癌症和其它过度增生型疾病。
2.BZs和BZ衍生物的有效量
本发明的药物组分将包含一定有效量的BZ或一种BZ衍生物或一种在临床上对治疗特定疾病有效的混合药剂。例如，一个癌症病人体内BZ或BZ衍生物的有效浓度可以促进野生型肿瘤抑制基因的表达，且/或抑制血管生成。或者，一定有效量的一种BZ或BZ衍生物或BZ类混合物可以促使寄生虫死亡和/或使与感染相关的临床所见回归。这些药物组分会随着药理学可接受的载体被溶解或分散。
在癌症病人中，由于癌症病人在化疗后肠道吸收的紊乱使各类药物本就不稳定的肠道吸收更加不稳定，因此用于肠外BZs如MZ的给药通道十分重要。肠外路线也可以规避无法预测的肝中首过代谢效应。肝脏中的首过代谢效应改变过很多药理活性药物口服试剂的生物利用度。进一步讲，基于有效可信赖的系统治疗，MZ可利用度第一次使得MZ与其它疗法在治疗癌症和深度真菌感染上进行临床比较成为可能。
3.口服摄入
除用于肠外治疗的化合物--比如那些用于静脉、肌肉，或皮下注射的药物剂型外，其它药理学可接受的剂型包含适于口服的溶液。术语“口服药剂”包含任何通过口腔进入消化道的药物剂型。本发明的药物成分可以被制成各种剂型。例如，药物可被制成漱口水，口腔漱剂，通过鼻胃管或其它类似渠道治疗的剂型，诸如此类。
4.适应于肠外摄入的组分
就像在本发明的总述部分所讨论的，本发明的活性化合物通常被用于肠外治疗，用于各种注射而不是通过消化道吸收，比如通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射，甚至腹腔注射。肠外摄入的定义在本发明的总述部分进一步讨论。通常，药物组分可被制成注射剂，即适于肠外而非静脉注射的溶液或混悬剂。适用于配置溶液或混悬剂的固体制剂也可以制备，它们在使用前加上溶剂就可以变成注射剂，配置品也可以是乳化剂。
5.剂型原理
活性化合物以自由碱或药理学上可接受的盐形式存在的溶液可由水配置，溶液适于与表面活性剂混合。可用的表面活性剂有羟丙基纤维素或聚山梨酯。乳液还可以在甘油、液态聚乙二醇、类似混合溶剂和油中制备。在通常的储存与使用条件下，这些原料制剂包含防腐剂以阻碍微生物的生长。
适于注射使用的药物剂型包括无菌水溶液或分散剂，下文讨论的剂型还包含花生油、芝麻油、水和丙二醇或其它溶剂。在所有情况下，制剂必须是无菌的且必须具有一定程度的流动性使得注射容易进行。在操作和储存的条件下制剂必须保持化学和物理上的稳定，且在保存时要防止微生物如细菌和真菌的污染。
活性化合物可以中性或盐的形式存在。药理学可接受盐类包含酸加成盐(由蛋白质中的自由氨基形成)，还包含无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。由自由羧基构成的盐也源于无机碱如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁，或一些有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等诸如此类。
运输载体可以是一种溶剂或分散剂，如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇液体等)，或合适的混合溶剂以及植物油。BZs或BZ衍生物共溶剂剂型和微乳剂剂型在下述实施例中将被进一步详细探讨。
适当流动性可以得到维持，如用分散剂和表面活性剂来保持需要的颗粒大小。防止微生物的污染可用多种抗细菌和抗真菌药剂实现，如苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在很多情况下，包含一些等渗溶液会更好，如蔗糖或氯化钠溶液。对注射药物组分的缓慢长期吸收可用一些延缓吸收的成分来实现，如明胶。
无菌注射液的制备：把所需量的活性化合物加入到适当的溶剂中，添加上述枚举的多种其它组分，然后过滤除菌。总体来说，分散剂是把多种无菌活性成分加入一种包含基本分散介质和上述枚举的所需其它组分的无菌载体而制成的。
在某些实施例中，本发明的治疗剂型也可以采用传统的治疗剂型，如胶、膏和乳液。这些剂型可被用于处理皮肤相关疾病，如各种肉瘤疾病。
在剂型之上，溶液摄入还要兼顾到剂量，以确保在这种含量下能达到有效的治疗。剂型在不同剂量下都很容易摄入，如上文所述的注射液，相应的药物释放胶囊和类似可用剂型。
在肠外水溶液给药时，溶液在必要时应当添加缓冲剂。这些特定的溶液尤其适合静脉注射、肌肉注射、皮下和腹腔注射。依据作用对象的条件，一些剂量的变化也是必要的。给受体合适药物剂量在任何情况下都要由对治疗负责的人来决定。
6.较难溶于水：共溶剂体系的BZs和BZ衍生物剂型
很多BZs只能较少的溶于水溶液。所以，就像上述讨论的，本发明的一个落点就是开发BZ化合物的剂型以实现BZ具有更好的溶解度或得到更有效的分散剂。
本发明一些药物成分的制定基于共溶剂原则(Spiegel和Noseworthy，1963；Yalkowsky和Roseman，1981)。实施例显示，MZ的入药成分可在不破坏其抗癌活性的前提下得到。另外，动物研究证明，首选载体对治疗是无毒和安全的，且应当按照所提出的浓度和总剂量用于人类治疗。DMA、DMSO和PG被溶解用于人体的多种药物活性成分(NIH Pub.84-2141，1984；Weiss等，1962；Kim，1988)。肠外治疗中的PEG在猴模型中被细致的研究(Lockard等，1979)，且PEG随后就被用于临床作为(共价键键和)L-天冬酰胺酶的载体用于治疗淋巴细胞性白血病和淋巴瘤(Keating等，1993)。DMSO也被广泛的用作低温储存人体骨髓和用于高剂量化疗后移植的造血干细胞的冷冻保护剂(McGann，1978；Gorin，1986；Davis和Rowley，1990；Gorin，1992)。在这些载体溶剂的使用中没有发现严重的副作用。临床上利用生理盐水、(5-70％)的葡萄糖水溶液和水乳剂是用来改变液体和电解质平衡、供给肠外营养的成熟方法。生理盐水和葡萄糖水溶液被广泛的用于稀释各种药物以达到注射可用浓度。
7.较难溶于水：微乳液体系的BZs和BZ衍生物剂型
在药物、蛋白质等剂型中制备和利用微乳液是制药业所熟知的。微乳液在这里被定义为一种液相在另一种液相中达到热力学稳定时形成的分散剂，其由表面活性剂界面层所稳定。这种分散剂可以是水包油也可以是油包水。微乳液通常是清液，因为液滴直径约在100纳米及以下。但是，非清液也包含在这里微乳液的定义中，且任何液滴直径都在考虑范围之内。
表面活性剂可被加入水溶液中来增加溶液或分散剂的溶解度和稳定性。将在本发明的总述部分详细讨论的表面活性剂是同时包含亲水端和亲油端的有机分子。亲水端具有极性或已离子化而易溶于水。亲油端无极性不溶于水且趋向于尽可能远离水的地方。当向水中加入小浓度的表面活性剂后，亲油端将立即升到表面或指向相对弱极性的相。向BZ溶液中加入表面活性剂得到的BZ-表面活性剂溶液较BZ溶液有更好的溶解度和/或稳定性。
D.测定组分中药物浓度的方法
本发明药物组分的下述制备方法可利于确定BZ或BZ衍生物在药物组分中的含量。测定某种组分中的一种药物浓度的方法包含着很多行业技术人员所熟悉的技术。代表性的例子包括色谱技术。有很多种色谱可以用于本发明：药物特定检测色谱、吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和分子筛；还有很多使用它们时所需的特定技术，包括柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱和高效液相色谱(HPLC)。行业中的普通技术人员都会熟悉这些技术和其它相关技术。
下面这些举例是为了阐明本发明较好的实施方案。行业中的技术人员应当会从下面这些实施例披露的技术中学到很多。这些技术是发明者在与本发明相关的实践中发现的，且可以作为建立更好实践模型的基石。但是，行业中的技术人员在阅读这些被披露的技术时应该明白，对于这些被披露的在没有脱离发明意图和范围的前提下就得到了一些好的或是相似结果的特定实施方案还有很多可以改进之处。
实施例1
材料
甲苯咪唑(MZ，产品标识码90K1145)、聚乙二醇(PEG)400(产品标识码121H0052)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)(产品标识码129H3498)和二甲基亚砜(DMSO)(产品标识码94H0358)均从Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo.)购买得到。丙二醇(产品标识码940629)和橄榄油(产品标识码CAS8001-25-0)从Wood Scientific，Inc(Houston，Tex.)获得。三醋酸甘油酯从Lancaster Synthesis，Inc(Windham，N.H.)购买得到。超级精炼棉籽油(产品标识码GAB-217NP)，超级精炼花生油(产品标识码BSS-429NP)和超级精炼大豆油(产品标识码SB4-393NP)由Croda(Mill Hall，Pa)提供。Captex 200(C8/C10丙烯乙二醇酯，产品标识码10505-6)和Captex 355(C8/C10椰子油中的甘油三酯)由Abitec公司(Janesville，Wisc.)提供。Miglyol 812(C8/C10椰子油中的甘油三酯，产品标识码1995050866)和Myvacet 9-45(蒸馏单甘酯乙酰；产品标识码960225)从Eastman Chemical Products获得。吐温80(聚氧乙烯[20]失水山梨醇单油酸酯；产品标识码32332)和Arelacel 80(失水山梨醇单油酸酯NF，NLB＝4.3，产品标识码27255)由ICI Americans Inc.(Wilmington，Del.)提供。Cremophor RH 40(PEG-40氢化蓖麻油，HLB＝13.5)来自BASF(Parsippany，N.J.)。
MZ的HPLC检验
HPLC检验是为了确定MZ在剂型和释放样本中的含量。检验使用反相mu.Bondapak C18柱(300x3.9mm，10μm，Waters Corporation，Milford，Mass.)，前置C.sub.18保护柱。使用前经过过滤和除气的流动相包含乙腈/0.05M磷酸二氢钾，pH 6.5(40∶60，v/v)。强的松被用作内标(IS)。流速是1.2ml/min。溶剂输送系统是ConstaMetric 3500LDC分析模型系统。MZ和IS由SpectroMonitor 3200可编程多波段UV探测仪在254nm处探测。由Milton Ray CI-4100数据模块集成(LDCAnalytical)测定的峰面积比被用于建立标准曲线和决定MZ在样本中的浓度。像下文所描述的那样，检验后来被更改以量化MZ在血液样本中的含量。
不同溶剂介质中MZ溶解度评价
MZ在水中和其它十四种溶剂介质包括六种药物溶剂(甲醇、PEG400、丙二醇、三醋酸甘油酯、DMA和DMSO)和八种自然存在或合成的油类(超级精炼棉籽油、橄榄油、超级精炼花生油、超级精炼大豆油、Captex 200、Captex 355、Myglyol 812和Myvacet 9-45)中的溶解度都被评价过。MZ在每一种溶剂介质中溶解度的测定是先向溶剂中加入过量的MZ，然后在室温下摇动至少48小时。在达到平衡后，未溶解药品被回收并用孔径在0.45μm的薄膜过滤。洁净的滤液用适当体积的DMA稀释并用HPLC法分析。
用共溶剂法建立肠外剂型
一百毫克MZ在60度水浴加热下溶解在11ml DMA中。溶液随后与PEG 400按1∶1到1∶7(v/v)的比例混合。加入最后一部分水以得到最终具有体积比DMA∶PEG 400∶水为2∶2∶1、1∶3∶1和1∶7∶2的共溶剂剂型。用此方法，十个不同成分和比例的共溶剂体系被评估和优化以达到肠外给药的最大药物溶解度。个体共溶剂剂型中MZ的溶解度由HPLC法决定。最佳剂型被选出用于静脉治疗(I.V.)，作为从精选先导口服微乳液剂型的临床前生物可利用度研究中参考选择出的最佳生物利用度剂型。
微乳液剂型的建立
六组自乳化药物输送系统(SEDDS)通过混合一种油，一种低HLB的表面活性剂和一种高HLB的表面活性剂制得。具体来讲，100mg MZ在60℃水浴下溶解在5.5ml的DMSO或DMA中。溶液随后以不同比例与吐温80、Aralacel 80以及多种不同类型的油混合。
洁净透明的剂型是稳定微乳液形成的指示标志。每个体系中成分的六种不同比例构建出完整相图。具体过程是给予SEDDS中水相(去离子水)一点增量直到体系变浑浊，达到相分离，以此决定稳定微乳液的区域组成边界。
当相图上稳定微乳液所含区域确定之后，微乳液就可以通过混合适量的四种组分(油、偶极非质子溶剂、表面活性剂和水)制得。缓慢的手摇或搅动可以确保溶于DMA或DMSO的MZ彻底与其它组分混合均匀。
两种最佳微乳液剂型被选出用于进一步评估体外药物释放。其中的一种被认为在细胞培养模型中会产生细胞生长抑制，并在大鼠体内临床前生物利用度方面也做了评估。先导微乳液剂型也将适用于在小鼠体内抗肿瘤效果的评估。
药物释放测定
两种所选SEDDS剂型的药物释放特性被用于与MZ粉末和MZ的PEG 400溶液进行比较评估。所有四种剂型被人工用注射器填充进亲水性充气软胶囊里(R.P.Scherer，Basking Ridge，N.J.)，且最终所留孔洞通过热烤进行密封。USP XXII，溶出度仪2(Dissolution Apparatus 2)(VanKel Industrial，Inc.)被用于描绘MZ在体外的释放动力学曲线。包含SEDDS、MZ溶液或MZ粉末的软胶囊被分别放置在铜线圈中来保持胶囊处于盛装它们的容器的底部。容器装有500mL 37度的含有0.5％Cremphor RH 40(CMC＝0.039％)的去离子水。C.Cremphor RH 40被用于保持水槽中的药物释放条件。药物释放介质由带有特富龙涂层的搅拌桨以50rpm的速度的匀速搅动。依次释放的样本用0.45μm的微孔过滤器过滤，再经HPLC法分析。
利用E4剂型和安慰剂对非小细胞肺癌与皮肤癌细胞的细胞生长抑制 研究
细胞在96孔板上以5x106细胞/毫升的浓度于Dulbecco改良的Eagle培养基中培养。该培养基(DMEM)包含100U/ml盘尼西林，100mu.g/ml链霉素和10％胎儿血清白蛋白。细胞在37℃，5％CO2/95％空气加湿培养器中培养24小时，然后用新鲜的包含连续稀释E4剂型或安慰剂的DMEM进行培养基转换后再培养48小时。细胞的存活数由MTT法监测。MZ的抗肿瘤活性也用细胞存活检测法(台盼蓝计数法)进行评估。
实施例2
微乳液E4的临床前生物利用度
动物
重300-400g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，Id)在7天驯化期后使用。动物被圈养在12h明/暗循环下。在进行研究的前一天每只大鼠的右颈静脉中植入一根永久导管，并用氯胺酮∶乙酰丙嗪∶甲苯噻嗪按照50∶3.3∶3.3mg/kg来麻醉。动物被彻夜禁食，水随意给予。在进行试验的早晨，大鼠被放置在单独的代谢笼内。
剂型
大鼠按3或4只一组被随机分到3个组里。组1的大鼠从颈静脉导管中静脉注射给予单剂量(3.25mg/kg)共溶剂体系P7剂型药物。组2大鼠口服单剂量5mg/kg微乳液E4剂型药物，用动物饲喂针(18x3″W/2-1/4mm球)灌胃口服。组3大鼠用相似手法灌胃口服50mg/kgMZ水相单纯悬浮液。MZ混悬剂为10mg/ml且含有痕量甘油作为润湿剂。
血液取样
每个约0.6ml的血样通过导管在24小时内以固定的时间间隔依次收集在肝素管里。血样立即以14,000rpm的速度离心3分钟，上清液与血浆被转移进1.7ml的离心管内并立即冷冻保存在-80℃，直到进行HPLC分析。
血浆样本的HPLC分析
血浆样本中的MZ浓度由在实施例1中描述的略作修改的HPLC法决定。简而言之，300μl血浆与300μl乙腈混合以沉淀蛋白质。乙腈包含2μg/mL的奎尼丁(QD)作为内标。强的松不用作血浆样本的内标，因为它会被血浆空白中广泛的溶剂峰前沿所干扰。血浆与乙腈的混合物通过涡旋离心后，100μl的上清液被分离并直接注射进HPLC体系。流动相由35％(v/v)乙腈和0.05M KH.Sub.2PO.sub.4的水溶液组成，pH值6.5。流速1.2ml/min，流出物在313nm处被监测(0.01AUFS)。
药代动力学分析
药代动力学参数通过WinNonlin程序拟合每只大鼠的血浆浓度-时间数据来决定。血浆中药物的峰浓度和达到峰浓度的时间通过电脑拟合曲线决定。浓度时间曲线下的面积，所测定浓度从0min到最末端720min的积分(AUC0→720)由线性梯形法则决定，从最终测定浓度到无穷大的时间AUC积分(AUC720→infin)由被终端相消除速率常数所除的最终确定浓度决定。终端相消除速率常数起初可以通过末端直线段的最小二乘斜率来估算。终端相半衰期由终端相消除速率常数相除计算得到为0.693。其它非房室药代动力学参数通过面积/力矩分析得到。总血浆清除率(CLT)通过Dose/AUC计算得到，平均停留时间(MRT)通过AUMC/AUC计算得到，稳态分布容积(V.sub.ss)通过[(DoseAUMC)/AUC2]计算得到。在口服治疗时，生物利用度(F)由下述方程决定：
F＝[AUC口服/AUCiv]x[Doseiv/Dose口服]x100％
统计分析
任何两个平均值之间的不同都可以通过成对或不成对的学生t检验来评估，随后通过统计学证明相关的变量是同质或相等。
实施例3
MZ的HPLC检测
MZ与内标(强的松)在上述实施例1中HPLC的洗脱条件下的保留时间分别为9.3分钟和5.6分钟。固定相是C18柱，300x3.9mm(WatersCorp.)，流动相是乙腈/0.05M KH2PO4(40∶60V.V；pH＝6.5)。流速是1.2ml/min，检测器是UV检测器(检测254nm)，用Milton Ray CI-4100数据整合仪进行整合。用于检测MZ的可信HPLC色谱柱如图1所示。MZ标准曲线在浓度0.05μg/ml到5.0μg/ml的范围内建立。
在针对血浆样本修正的方法中，MZ和内标(QD)的保留时间分别为10min和7min。对血浆样本分析的每一天都要建立一条校准曲线以计算MZ在血浆样本中的浓度。曲线的线性在MZ浓度0.05μg/ml到2.5μg/ml的范围内建立，r2≥0.998。校准曲线以MZ/QD与大鼠血浆空白中标定的已知MZ浓度的峰面积比进行绘制。
实施例4
MZ在不同溶剂介质中的溶解度
25℃下MZ在水中和十四种被测试溶剂中的溶解度整理见表1。
表1
Figure BPA00001330497700311
MZ在水中难溶，溶解度为0.025μg/mL。MZ在其它溶剂介质如超级精炼棉籽油、超级精炼花生油和Captex 355中的溶解度都显著高于在水中的溶解度，其相对于水的增强因子从232到200,000不等。
MZ易溶于六种药物溶剂(甲醇、PEG 400、丙二醇、三醋酸甘油酯、DMA和DMSO)，且增强因子在1392到200000之间。PEG 400、DMA和DMSO在六种所测溶剂中具有前三位的高溶解度。PEG 400单独使用可得0.528mg/ml溶解度，但仍比目标值1.5mg/mL低得多。
DMA与DMSO可自由溶解MZ，但是不能在药理学可接受的范围内用作纯溶剂。对啮齿动物，静脉注射这些溶剂中的LD.sub.50为3.1mg/kg，口服为7.92mg/kg。到目前为止，通过FDA认证的口服和肠外药物制剂只含有不超过40％的DMA或DMSO。因此，PEG 400、DMA和DMSO被选作与多种其它成分以不同比例构成MZ肠外共溶剂体系。
MZ在其余五种油(橄榄油、超级精炼大豆油、Captex 200、Miglyol812和Myvacet 9-45)中的溶解度显著高于在水溶液中的溶解度，增强因子在232到1624的范围内(表1)。但是它们中没有哪一种油在单独使用时可以达到1.5mg/ml的目标溶解浓度。这五种油都可被用于制备MZ微乳液。
实施例5
肠外制剂的建立：共溶剂体系
以不同的比例包含PEG 400和DMA或PEG 400和DMSO的十种共溶剂体系，依次被称作P1到P10，按溶解MZ的能力被系统性的评估。MZ在单一共溶剂体系中的溶解度见表2。
Figure BPA00001330497700331
已研制出的肠外制剂中MZ的溶解度在0.46-3.49mg/ml的范围内，比其在水溶液中的溶解度高出18,360-139,520倍。除了P2之外的所有制剂MZ溶解度均高于在单纯PEG 400中的溶解度，且是后者的1.09-6.61倍。十种制剂中的六种：P3、P4、P7、P8、P9和P10中的MZ溶解度高于1.44mg/ml，且被认为在进一步的体内体外评估中是合适和有前景的。基于其最低的DMSO含量和因此而生的在六种有前景体系中最高的安全度，MZ溶解度为1.83mg/ml的P7剂型被选用进行未来体内生物利用度研究。
实施例6
微乳液剂型的开发：与水结合能力的测定
剂型
对三十六种微乳液(A1-A6、B1-B6、C1-C6、D1-D6、E1-E6和F1-F6)进行制备并对它们与水结合溶解MZ的能力进行有效评估。这些体系包含一种油(超级精炼大豆油、Captex 200、Miglyol 812或Myvacet9-45)，一种溶剂(DMA或DMSO)，一种高HLB表面活性剂吐温80和低HLB表面活性剂Arelacel 80(按比例1∶1或2∶1)的混合物，和一种水相。它们的成分见表3A-3F。这些表中使用了下列代号：J＝超级精炼大豆油；K＝Captex 200；M＝Miglyol 812；N＝Myvacet 9-45；D＝DMA；E＝DMSO；O＝吐温80；P＝Arelacel 80。
在已经配置的微乳液中，二十二种剂型(A1-A3、B1-B3、C1-C4、D1-D4、E1-E4和F1-F4)可产生浓度在1.5到2.64mg/ml范围内的MZ，符合浓度1.5mg/ml的目标。当考虑到可共结合的最多水量，二十二种微乳液剂型中的十六种(A3，B3，C1-C4，D3-D4，E1-E4和F1-F4)包含10％(质量分数)或更多水分，这些剂型被认为比其它剂型更稳定。十二种微乳液(C1-C4，E1-E4和F1-F4)被认为是最具前景的剂型。微乳液E4被选出进行外药物释放和进一步体内生物利用度及抗肿瘤活性研究。在释放研究中，A4剂型也被选出进行比较性评估。图2展示了微乳液E1-E6成分的代表性伪三元相图。
微乳液A4和E4中MZ的释放
对药物粉末、PEG 400溶液、微乳液A4(包含DMA)和微乳液E4(精选口服剂型，包含DMSO)中MZ体外释放动力学进行比较评估并总结在表4中。累积释放特征图见图3。微乳液A4和E4经过30分钟溶解后分别以78.7％和74.2％的比率释放MZ，相较于单纯药物粉末60分钟内0.3％的释放率得到了很大提升。在胶囊外壳解体后，MZ的PEG400溶液在接触释放介质时发生沉淀。之后MZ缓慢溶解，在60分钟内达到17.1％的释放度(表4)。
E4的临床前生物利用度评估
在三次独立实验中，十一只大鼠被用于先导口服微乳液剂型的临床前生物利用度评估。大鼠被随机组合成三个治疗组：(a)I.V.3.25mg/kg剂量n＝3；(b)口服E4微乳液4.89mg/kg剂量n＝4；(c)口服混悬剂50mg/kg剂量n＝4(表5)。表6显示P7、E4和口服混悬剂在大鼠体内的MZ药代动力学参数。
Figure BPA00001330497700401
Figure BPA00001330497700411
建立I.V.E4和单纯悬浮液的MZ血浆浓度-时间特征曲线(图4-6)。图7展示用I.V.对个体大鼠进行治疗后的MZ特征曲线半对数图，该图显示有双阶段性且平均浓度在90分钟内从7699ng/ml快速下降到2662ng/ml。曲线拟合为二室模型，说明MZ在大鼠体内的分配具有一个独特的组织周边腔室。当MZ通过口服给药时，分配过程快于吸收过程。口服E4和混悬剂的MZ特征曲线没有显示出任何双阶段性下降且很好的符合典型一室模型，具有一级动力学吸收过程。尽管混悬剂的剂量比E4高出10倍，混悬剂(10-168ng/ml)的药物浓度明显低于E4(83-1064ng/ml)。
血浆特征曲线通过WinNonlin程序按非房室模型计算出并用于比较药代动力学参数。E4的MZ峰值浓度是856.+-.155ng/ml，是混悬剂中MZ峰值浓度131.+-.47ng/ml(表V)的6.5倍。两种药剂的峰值时间是可比较的，E4和混悬剂分别为210.+-.60min和315.+-57.min。吸收半衰期也很相似，E4和混悬剂分别是100.+-.57min和184.+-.63min。在100-162min范围内不同剂型(I.V.溶液，E4微乳液和混悬剂)的生物半衰期数据差异并不显著，不同治疗方式(I.V.和口服)的生物半衰期也是如此。
当数值按各自给予的剂量进行标准化处理后，给予不同剂型的MZ系统暴露值通过AUC0-720测定。E4和混悬剂相对I.V.药剂的绝对生物利用度分别是30.6％和0.31％(表5)。E4相对单纯悬浮液的相对生物利用度是98.7。这说明在微乳液剂型中添加MZ时，E4的生物等效剂量约为单纯悬浮液的1/100(分数)。
NSCLC与皮肤癌细胞系的细胞生长抑制
用E4剂型和安慰剂进行皮肤癌细胞系(SRB1、A375和2237)和非小肺癌细胞系(NSCLC)的细胞生长抑制研究。在1.7-170ng/ml的范围内建立皮肤癌细胞的细胞生长抑制剂量-反馈曲线(图8)，在2.5-250ng/ml的范围内建立NSCLC的曲线(图9)。皮肤癌细胞SRB1、A375和2237中MZ的IC.sub.50分别是91、129和171ng/ml(图8)。NSCLC细胞中两种微乳液剂型里MZ的IC.sub.50分别是8和10ng/ml，与DMSO溶解的MZ控制组分(图9)相比有8-9倍的增长。因此，这项在培育细胞中进行的抗肿瘤活性研究提供了E4剂型有效传递MZ的证据。已建立的微乳液剂型在药物释放、临床前疗效和大鼠临床前药代动力学方面都展示出良好的特性。
实施例7
优化SNEDDS、SEDDS和微乳液用于提高肠外给药生物利用度 预剂型研究
水缓冲溶液和血浆样本的甲苯咪唑用HPLC法鉴定，结果在0.02-10μg/ml的线性范围内。甲苯咪唑作为一个弱碱，log P值为2.51，属于生物制药药品分类系统中II类药物。因此，对甲苯咪唑来讲，渗透性不是限制药物吸收的的主要因素，而溶解性被认为是整体药物吸收的限速步骤。pH稳定性研究指出，药物在室温下pH值1-7的范围内可以充分稳定存在33天。因此，甲苯咪唑没有任何与pH值相关的稳定性问题限制药物吸收。甲苯咪唑剂型的有效pH值在3-7的范围内。
在不同油类中甲苯咪唑的溶解性
为了定义先导SEDDS和SNEDDS选择样本中的微乳液区域构建了相图(图10A-10B)，不同载体和相图的Mbz溶解度被确定。甲苯咪唑在多种天然或其它油类中的溶解度见表7，在多种表面活性剂和助表面活性剂中的溶解度见表8。被选择用于建立SNEDD和SEDD的油和表面活性剂/助表面活性剂用(*)标注。表7和表8中每个值都代表三个独立变量的平均±SD(标准偏差)。
表7
表8
Figure BPA00001330497700442
图10A是一张用表面活性剂/助表面活性剂混合溶剂的SNEDDs伪三元相图。点A1-A6代表剂型中表面活性剂、助表面活性剂、油和水的不同重量组成，用于描绘微乳液的存在区域。连接点A1-A6的线是边界线。边界线以上的区域代表相分离区域，线以下区域是微乳液存在区域。评估微乳液所在封闭区域内的不同组分以决定有效微乳化区域。从属于“感兴趣区域”的成分是那些具有高微乳化效率且可以被稀释添加最大水量而不会出现药物沉淀和相分离的成分。“感兴趣区域”成分被优化以寻找具有液滴大小＜50nm且目标药物溶解度在1.96mg/ml的IIIB类体系/SNEDDS制剂类型。
图10B是一张运用高低HLB表面活性剂混合液的SNEDDs伪三元相图。点B1-B5代表剂型中表面活性剂、助表面活性剂、油和水的不同重量组成，用于描绘微乳液的存在区域。连接点B1-B5的线是边界线。边界线以上的区域代表相分离区域，线以下区域是微乳液存在区域。评估微乳液所在封闭区域内的不同组分以决定有效微乳化区域。从属于“感兴趣区域”的成分是那些具有高微乳化效率且可以被稀释添加最大水量而不会出现药物沉淀和相分离的成分。“感兴趣区域”成分被优化以寻找具有液滴大小＜200nm且目标药物溶解度在1.96mg/ml的II类体系/SNEDDS制剂类型。
表9列出了利用所选油、表面活性剂和助表面活性剂制备的SNEEDs、SEDDs和肠外微乳液(PMs)剂型或成分。
表9
Captex 200/吐温80/二乙二醇单乙基醚和Myglyol/吐温80/Capmul MCM体系分别致使形成有效的SNEDDS和SEDDS，导致高效微乳化且可被稀释添加最大量的水而不产生相分离。在配制好的SNEDDS和SEDDS甲苯咪唑10％w/w溶液中，没有观察到任何液滴大小的变化，平均液滴直径分别是34.8±2.1nm和143.0±2.0nm，与安慰剂剂型中液滴大小相似。
甲苯咪唑释放特征
药物释放速率是很快的，SNEDDS和SEDDS的药物释放速率常数分别是0.053±0.002％min-1和0.078±0.004％min-1，显著大于单纯悬浮液的速率常数0.004±0.001％min-1。甲苯咪唑容易从SNEDDs和SEDDs中释放，30分钟内分别释放92.4％和89.4％，与共溶剂和单纯悬浮液60分钟内药物分别释放79.6％和0.30％的对比见图11A。每一点都代表三个独立变量的平均±SD值。SNEDDS和SEDDS的释放特征非常相似。
在60分钟末，释放介质中单纯悬浮液和带有安慰剂SNEDDS单纯药物的药物释放程度分别是0.30％和1.10％(图11B)。每一点均代表三个独立变量的平均±SD值。在溶出介质中安慰剂SNEDDS的出现不会显著增强从SNEDDS和SEDDS得到的溶出甲苯咪唑的速率和程度。因此，润湿剂、甘油和安慰剂SNEDDS的效用与从SEDDS和SNEDDS中溶出甲苯咪唑的增加无关。观察到的SEDDS和SNEDDS中溶解度增加也是来自剂型效应而非溶剂效应。
60分钟后SNEDDS和SEDDS中自由药物释放程度分别是77.9±3.6％和74.7±9.4％。自由药物分子占总释放甲苯咪唑的79.4％和75.2％，而在SNEDDS和SEDDS中分别是98.1％和99.4％(未显示数据)。因此，从SNEDDS和SEDDS中释放药物分子的主要存在形式是自由分子状态。表10列出了运用下述方程计算得到的SNEDDs、SEDDs和共溶剂剂型的f2相似值。在50-100区间内的f2值表明两个剂型溶解特征是相似的。星号*表示在采用事后Tukey检验进行方差分析比较时组群间差异显著，显著性阈值p＜0.05。
表10
  f2相似度/释放度   SNEDDS/共溶剂   SEDDS/共溶剂   SNEDDS/SEDDS
  0-20分钟   71.0   77.1   92.6
  20-60分钟   56.0*   54.5*   97.3
  释放速率0-20分钟   75.6   78.5   94.9
SNEDDS与SEDDS在GI流体中都保持物理学稳定性，不发生液滴大小的变化。此外，在GI流体(SGF，SIF)中药物能保持4小时的化学稳定性。进一步的稀释不会影响剂型的物理稳定性和药物的化学稳定性。SNEDDS和SEDDS剂型在室温下1-1.5年内也具有化学稳定性，药物浓度分别在97.8±0.6％和98.2±0.4％。
先导肠外共溶剂剂型作为研究口服生物利用度的参考，在两周内都能保持稳定且药物浓度在2.0±0.1(n＝6)mg/ml，DMSO(10％w/w)含量最少。SNEDDS、SEDDS和单纯悬浮液的绝对口服生物利用度分别为70.7％、37.4％和0.3％(参考表4共溶剂剂型)。SNEDDS和SEDDS相对于单纯悬浮液的相对生物利用度分别为228％和120％，且SNEDDS剂型相对于SEDDS具有约两倍高的口服生物利用度。SNEDDS和SEDDS剂型设计的很合理，可以识别生物利用度提升过程中颗粒大小和脂质消化作用的相对贡献。颗粒大小是提升35nmSNEDDS吸收的驱动因素，而在提升SEDDS的生物利用度过程中，脂质吸收则扮演重要角色。
表11提供了口服SNEDDS、SEDDS、单纯悬浮液和肠外共溶剂剂型后大鼠体内甲苯咪唑的重要药代动力学参数总结。
表11
Figure BPA00001330497700481
平均血浆浓度时间特征图
多组Sprague-Dawley大鼠通过肠外丸剂或口服灌胃的方式摄入甲苯咪唑，并在12小时的区间内建立平均血浆浓度-时间特征图。SD大鼠摄入1)3.25mg/kg(n＝6)静脉注射肠外共溶剂剂型(图12A)；2)5.0mg/kg(n＝4)口服SNEDDS(图12B)；3)5.0mg/kg(n＝5)口服SEDDS(图12C)；4)50.0mg/kg(n＝4)口服单纯悬浮液(图12D)；5)1.60mg/kg(n＝3)每只静脉注射肠外微乳液PM1和PM2(图12E-12F)。请注意在图12D中，该血浆药物浓度的标准差很高是因为单纯悬浮液甲苯咪唑的吸收非常缓慢和不稳定。图12G插值显示剂型的溶血潜力H10％为0.2。因此，由于表面活性剂/助表面活性剂含量很低，即约6％至48％左右，更适宜为约27％至42％左右的SNEDDS和微乳液PM1和PM2剂型，这些剂型在肠外摄入是溶血安全的。随着所使用的剂型体积增加，溶血以90％的细胞在剂型和血液比为1.5的方式而增加。
表12提供了静脉注射共溶剂和微乳液剂型后大鼠体内药代动力学参数汇总。所有的值以平均值±S.D的形式呈现。任意两个平均值之间的差异通过ANOVA进行统计学评估并进行Tukey事后检验分析，显著性阈值在p＜0.05。*p＜0.05用于共溶剂与微乳液剂型间的比较。
表12
Figure BPA00001330497700482
Figure BPA00001330497700491
共溶剂和微乳液PM1、PM2在小鼠体内的血浆药代动力学
共溶剂和微乳液(PM1与PM2)中的Mbz在小鼠体内的血浆药代动力学已被研究。通过计算剂型在每一个时间点的平均浓度得到原始平均数据，进而得到平均浓度-时间特征曲线。平均血浆药代动力学参数源于用WinNonlin法建立的每个剂型的平均浓度-时间曲线(表13)。因此，药代动力学参数值是从平均浓度-时间曲线得到的平均值。标准差和统计学分析没有在本文展示。生物利用度--BA，是PM1或PM2的AUC/剂量与共溶剂的AUC/剂量的比值。
在这三个剂型中，Mbz血浆浓度在注射后迅速下降且6小时后浓度过低以至于无法检测(图13)。这三个剂型在给小鼠注射后的血浆浓度-时间特征图能够很好的与二室模型相吻合。三个浓度-时间特征图曲线展现出短的分配α相(t1/2，α＜0.1hr)，说明存在一个快速分配相(表13)。Mbz的药代动力学参数如AUC/剂量、t1/2α、t1/2，β和CL在共溶剂、PM1、PM2实验组间是相近的。
但是，共溶剂的Cmax/剂量值为1.45(mg/L)/(mg/kg)，只有PM1(3.49(mg/L)/(mg/kg))和PM2(3.24(mg/L)/(mg/kg))的一半。另外，共溶剂的k10为1.27hr-1，也是PM1(2.87hr-1)和PM2(2.25hr-1)的一半。共溶剂的k21为3.57hr-1，比PM1(1.62hr-1)和PM2(1.76hr-1)高出两倍。PM1和PM2的相对生物利用度分别为1.07和1.26。相较于Mbz共溶剂与微乳液(PM1和PM2)的不同，PM1与PM2的血浆药代动力学参数之间是相近的。
表13
  药代动力学参数   单位   共溶剂   PM1   PM2
  剂量   mg/kg   6.5   3.25   2.5
  Cmax/剂量   (mg/L)/(mg/kg)   1.45   3.49   3.24
  AUC/剂量   (hr*mg/L)/(mg/kg)   1.14   1.22   1.44
  t1/2，α   hr   0.078   0.068   0.095
  t1/2，β   hr   1.34   1.52   1.27
  α   1/hr   8.84   10.01   7.28
  β   1/hr   0.51   0.46   0.54
  CL   L/hr   0.029   0.027   0.023
  Vss   L   0.051   0.044   0.032
  V1   L   0.023   0.009   0.010
  V2   L   0.028   0.035   0.022
  k10   1/hr   1.27   2.87   2.25
  k12   1/hr   4.52   6.17   3.81
  k21   1/hr   3.57   1.62   1.76
  相对生物利用度   1.07   1.26
共溶剂与微乳液(PM1和PM2)Mbz在小鼠体内的生物学分布
对共溶剂、PM1和PM2中Mbz在不同组织的分配模式的观测显示，分配并非像预期的那样基于它们的血浆药代动力学特征图(图14A-14C)。所有剂型中，Mbz在不同器官的峰浓度都在注射后5分钟内到达。对于共溶剂来说，两个最高峰浓度是1.82(μg/g)/(mg/kg)(肝)和1.50(μg/g)/(mg/kg)(肾)；PM1是4.28(μg/g)/(mg/kg)(肺)、1.94(μg/g)/(mg/kg)(肝)和1.82(μg/g)/(mg/kg)(肾)；PM2是7.46(μg/g)/(mg/kg)(肺)、2.40(μg/g)/(mg/kg)(肾)和2.24(μg/g)/(mg/kg)(肝)。表14展示了共溶剂剂型、肠外微乳液PM1(液滴大小37nm)和肠外微乳液剂型PM2(液滴大小478nm)在小鼠(n＝4-5)体内的生物学分布情况。
共溶剂中的Mbz在肝中存留时间最长(AUC为3.37(hr*μg/g)/(mg/kg))，接下来是肾(AUC为2.70(hr*μg/g)/(mg/kg))。但是，对PM1来说，肺中的AUC值(12.38(hr*μg/g)/(mg/kg))最高，接下来是肝(2.69(hr*μg/g)/(mg/kg))和肾(2.19(hr*μg/g)/(mg/kg))。对于PM2，肺中AUC(10.82(hr*μg/g)/(mg/kg))也是最高，接下来是肝(2.95(hr*μg/g)/(mg/kg))和肾(2.78(hr*μg/g)/(mg/kg))。比较微乳液组(PM1和PM2)和Mbz共溶剂，PM1与PM2在肺中的AUC值是Mbz共溶剂的6-7倍，在大脑中的AUC值是Mbz共溶剂的50％-60％。Mbz微乳液与共溶剂在其它器官的AUC值是相近的。
对于共溶剂而言，Mbz在心(1.96hr)、肺(1.60hr)、肝(1.63hr)、脾(1.79hr)和肾(1.83hr)的清除半衰期都是相近的。PM1在肺(4.54hr)的清除半衰期显著延长，约是共溶剂的3倍。PM1在脑以外其他器官的Mbz半衰期分别是心(1.38hr)、肝(1.55hr)、脾(1.40hr)、肾(1.44hr)，与共溶剂的对应数据相近。PM2在脑以外其他器官的Mbz半衰期分别是心(1.18hr)、肝(1.27hr)、脾(1.15hr)、肾(1.03hr)，与共溶剂和PM1的对应数据相近。PM1与PM2在脑部的Mbz半衰期是相近的，分别为1.05hr和0.93hr，但比共溶剂的数据(2.85hr)短的多。
比较共溶剂、PM1和PM2在5分钟时的Mbz浓度，PM2在5分钟时相较于共溶剂与PM1在脾脏存在一个很高的Mbz浓度。另外，5分钟时PM1与PM2在肺和脑部的Mbz浓度也显著高于共溶剂的相应数据。这三个剂型在肝和肾的Mbz峰浓度是相近的(图15A-15C)。在两小时时，PM1与PM2在肺部拥有相较于共溶剂而言很高的Mbz浓度。在四小时时，PM1与PM2仍然在肺部拥有相较于共溶剂很高的Mbz浓度。相反，PM1与PM2在脾、心和脑的Mbz浓度显著低于共溶剂的相应数据。
出乎意料之外，PM1和PM2中Mbz在肺部有大量的分布。PM1中Mbz在肺部的保留时间也比共溶剂的相应数据要长。不过，PM2在肺部存留的Mbz清除的很快，致使其与共溶剂拥有相似的半衰期。PM1在肺部所具有的高AUC和长Mbz半衰期为治疗肺癌和肺部感染提供了潜在的Mbz输送优异性。
表14
剂型和液滴大小对Mbz在不同种群间配置的影响比较
共溶剂与微乳液中的Mbz在注射给药后符合二室模型。在大鼠和小鼠中，Mbz微乳液与共溶剂都表现出相似的血浆药代动力学特性。Mbz微乳液的液滴大小对Mbz血浆药代动力学没有明显影响，PM1与PM2在大鼠和小鼠体内具有相似的血浆药代动力学特性(表15)。在表15中，组间差异用事后Tukey检验单因素方差分析进行统计学评估(P＜0.05)。星号*指P＜0.05时，共溶剂和微乳液剂型(PM1和PM2)在大鼠体内具有差异。
表15
Figure BPA00001330497700531
共溶剂和纳米制剂在小鼠体内Mbz配置的药代动力学模型的建立
有趣的是，静脉注射Mbz微乳液(PM1和PM2)导致Mbz在肺部有很高的分布量和保留值，与共溶剂剂型的体内生物学分布模式不同。一种药代动力学模型被建立，用来关联血浆药物浓度和Mbz肺部浓度。一种三室模型(图16)也被建立，包含中室(血液)和两个边室(肺部与其它器官)。描述三室关系的微分方程如下：
dA1/dt＝-(K12+K13+K10)*A1+K21 *A2+K31 *A3      (方程1)
dA2/dt＝K12 *A1-K21 *A2            (方程2)
dA3/dt＝K13 *A1-K31 *A2            (方程3)
其中，A1、A2和A3分别代表在中室、肺部和其它器官室的药物含量。k10是中室的清除速率微常数。k12、k21、k13和k31是中室和边室间转移药物微常数。
在这个模型中，两个输出量，包括Mbz在血浆和肺部的浓度在研究中受到监控。描述输出量的两个方程如下：
C1＝A1/V1                       (方程4)
C2＝A2 *K21/(V1 *K12)                (方程5)
通过ADAPT法(图17A-17F)拟合实验数据(表16)，分别评估方程1-3的药代动力学参数用于共溶剂、PM1和PM2(表17)。要注意的是，共溶剂没有95％C.I.值。AUC比率＝AUC0-6hr，肺/剂量：AUC0-6，血浆/剂量。
估算的PM1的k10、k12、k13和k31分别是2.88hr-1、2.99hr-1、8.18hr-1和1.41hr-1，与共溶剂和PM2的对应数据相似。估算的PM1的V1是6.74L，也与PM2(9.12L)相近，但远小于共溶剂的27.77L。估算的PM1的k21是1.82hr-1，比PM2(5.87hr-1)和共溶剂(5.00hr-1)慢得多，这就可以解释PM1中Mbz在肺部的t1/2(4.54hr)比PM2(1.27hr)和共溶剂(1.60hr)长的原因。这些估算的微常数可被用来预测Mbz微乳液中Mbz血浆浓度导致的Mbz在肺部的浓度。PM1和PM2的肺部和血浆AUC比率分别是8.64和9.13，比共溶剂的相应数据大得多(2.39)。
表16
Figure BPA00001330497700541
一系列Mbz在血浆和肺部的浓度被用于验证三室模型。表17为三室模型提供了估算的共溶剂、PM1和PM2的Mbz药代动力学参数。共溶剂95％C.I.是不可用的且AUC比率也一样。用观察到的Mbz在血浆和肺部的浓度与预测的Mbz浓度进行制图，以描述共溶剂(图18A-18B)、PM1(图18C-18D)和PM2(图18E-18F)。散点图说明已建立的模型可以预测共溶剂、PM1和PM2中Mbz在肺部的浓度。
表17
Figure BPA00001330497700551
用异速缩放预测共溶剂和微乳液(PM1和PM2)在人体内Mbz药代动力 学参数
Mbz药代动力学参数(CL、Vss、t1/2和t1/2)和共溶剂、PM1、PM2体重之间异速生长的关系被绘制为对数-对数图(图19A-19F和图20A-20F)。回归斜率具有95％的置信区间(C.I.)。所有数值以平均值±SD的形式显示。一个种群任何两个平均值的差异通过ANOVA法和Turkey事后分析来进行统计学评估。星号*指P＜0.05，用来指示大鼠体内共溶剂和微乳液药代动力学参数的比较。
表18
Figure BPA00001330497700552
人体药代动力学参数通过不同微乳液剂型中Mbz的物种间尺度关系进行估算和预测，95％C.I.也被编入表19。在人体内，与共溶剂具有95％C.I.(0.09-0.97L/hr)的CL比较，PM1的CL(3.05-28.50L/hr)和PM2的CL(0.94-10.84L/hr)要快得多。在人体内，PM1和PM2的Vss分别为(9.44-178.57，95％C.I.)41.14L/kg和(26.00-175.75，95％C.I.)67.59L/kg，大约是共溶剂相应数据的10-20倍。另外，尽管这三种剂型的α半衰期很相近，共溶剂与微乳液(PM1和PM2)的β半衰期却是有明显区别的。
Figure BPA00001330497700571
实施例8
甲苯咪唑纳米混悬剂的制备
5mL浓度为100mg/mL的甲苯咪唑纳米混悬剂的制备方法如下：向一个20mL的闪烁瓶中加入12.0g的研磨介质、0.47g的甲苯咪唑、0.47mL的10％普朗尼克F108溶液、0.47mL的10％吐温80溶液和3.37mL的注射用水。将夹持器中的闪烁瓶置于搅拌盘中心上方3-5mm，再将搅拌子放入杯中。加入珠子的目的是为了减小粒径。使用的珠子的直径有0.25-0.5mm、0.5-0.75mm和1-1.3mm三种。
1)将混合物以1600rpm搅拌300分钟能够制备平均粒径为167nm的纳米混悬剂(NS-167nm)；2)将混合物以1600rpm搅拌90分钟能够制备平均粒径为400nm的纳米混悬剂(NS-400nm)；3)将混合物以1600rpm搅拌50分钟能够制备平均粒径为700nm的纳米混悬剂(NS-700nm)；4)将混合物以25分钟能够制备平均粒径为1700nm的纳米混悬剂(NS-1700nm)。
实施例9
甲苯咪唑从纳米混悬剂的体外释放
水溶液中甲苯咪唑的高效液相色谱定量测定法
我们成功建立了一种稳定可靠的对水溶液中甲苯咪唑进行定量的高效液相色谱测定方法。内标和甲苯咪唑的平均保留时间分别为3.9分钟和8.4分钟。绘制的标准曲线包括8个点，其线性范围为0.025-10μg/ml，相关系数大于0.999。该方法的日内变异系数(n＝3)为1.27％，日间变异系数(n＝6)为2.77％，证明了其有效性。峰面积比值(Y)对甲苯咪唑浓度(X)的平均线性回归方程为Y＝1.3412X+0.0042。利用该方程测定体外释放研究以及体内和体外研究中制备的共溶剂和纳米制剂中的甲苯咪唑的浓度。
PBS中甲苯咪唑从共溶剂以及167nm、400nm、700nm、和1700nm纳 米混悬剂的体外释放
在37℃的条件下，甲苯咪唑共溶剂和不同粒径的纳米混悬剂(NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm)的体外释放研究在加入0.2％吐温80的PBS溶液中进行(图21A-21B)。由于甲苯咪唑的低水溶性，向PBS溶液加入0.2％吐温80以保持漏槽状态。甲苯咪唑从共溶剂释放很快，在4.5小时内即完全释放。相比之下，甲苯咪唑纳米混悬剂呈现出双阶段的释放模式，在前4个小时释放较快，随后释放速度变慢(图21A-21B)。
对PBS/0.2％吐温80溶液中甲苯咪唑从不同剂型的初始释放速率进行比较，甲苯咪唑纳米混悬剂的初始释放速率(＜30％/hr)较共溶剂剂型(115.66％/hr)小得多。表20显示了在PBS/0.2％吐温80溶液中甲苯咪唑从共溶剂剂型、NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm的初始释放速率。
表20
Figure BPA00001330497700591
*和**表示甲苯咪唑从不同粒径的纳米混悬剂的初始释放速率的不同等级水平，采用事后Tukey检验进行单因素方差分析，二者具有显著性差异(P＜0.10)。
在不同大小的甲苯咪唑纳米混悬剂中，甲苯咪唑从粒径最小的NS-167nm的初始释放速率显著大于其从大粒径的纳米混悬剂NS-700nm和NS-1700nm的初始释放速率(P＜0.1)。尽管我们没有在其他组中发现初始释放速率具有显著性差异，但我们发现初始释放速率的平均值随着甲苯咪唑纳米混悬剂粒径的增大而减小：NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm初始释放速率的平均值分别为27.14％/hr、17.86％/hr、11.83％/hr和9.99％/hr。
对PBS/0.2％吐温80溶液中甲苯咪唑从不同剂型的释放度进行比较，甲苯咪唑纳米混悬剂的释放度(10小时内＜70％)显著低于共溶剂剂型的释放度(4.5小时内100％)(图21A-21B和表21)。在不同大小的甲苯咪唑纳米混悬剂中，10小时内NS-167nm释放约63％的甲苯咪唑，NS-400nm释放70％的甲苯咪唑，二者都显著高于NS-1700nm的释放度(50％)(P＜0.05)。34小时内NS-167nm释放约80％的甲苯咪唑，NS-400nm释放90％的甲苯咪唑，二者都显著高于NS-1700nm的释放度(69％)(P＜0.05)。
Figure BPA00001330497700611
这些结果表明，甲苯咪唑纳米混悬剂释放药物比甲苯咪唑共溶剂剂型慢得多。此外，PBS/0.2％吐温80溶液中小粒径纳米混悬剂(NS-167nm)的初始释放速率显著大于那些大粒径的纳米混悬剂(NS-700nm和NS-1700nm)(P＜0.1)。10小时内NS-167nm和NS-400nm的释放度明显大于NS-1700nm。显然，甲苯咪唑纳米混悬剂的粒径对体外释放速率和药物释放度都有影响。不同大小的纳米混悬剂的不同释放速率和释放度可能会对纳米混悬剂的药代动力学性质产生影响。
大鼠血浆中甲苯咪唑从共溶剂以及167nm、400nm、700nm和1700nm 的纳米混悬剂的体外释放
37℃的条件下，在大鼠血浆中对甲苯咪唑从共溶剂和不同粒径纳米混悬剂(NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm)的体外释放进行测定(图22A-22B)。与PBS中甲苯咪唑的释放研究不同，将与不同剂型的甲苯咪唑混合的0.5ml大鼠血浆放入透析袋中。与PBS中的释放研究类似，也向释放介质中加入0.2％吐温80以保持漏槽状态。甲苯咪唑从共溶剂的释放较快，4小时内释放55％的药物。相比之下，甲苯咪唑纳米混悬剂呈现出两阶段的释放模式，前10小时释放较快，随后缓慢释放(图22A-22B)。
对大鼠血浆中甲苯咪唑从不同剂型的初始释放速率进行比较，甲苯咪唑纳米混悬剂的初始释放速率(＜3.0％/hr)比共溶剂(33.45％/hr)小得多。表22列出了大鼠血浆中甲苯咪唑从共溶剂剂型以及NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm的纳米混悬剂的初始释放速率(％/hr)。在不同大小的甲苯咪唑纳米混悬剂中，甲苯咪唑从最小粒径的NS-167nm的初始释放速率(2.97％)显著大于从最大粒径的纳米混悬剂NS-1700nm的初始释放速率(2.26％)(P＜0.05)。尽管我们没有在其他组中发现初始释放速率的显著性差异，但我们发现初始释放速率的平均值随着甲苯咪唑纳米混悬剂粒径的增大而减小：NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm的初始释放速率的平均值分别为2.97％/hr、2.53％/hr、2.47％/hr和2.26％/hr。
表22
*和**表示甲苯咪唑从不同粒径的纳米悬浮液的初始释放速率的不同等级水平。采用事后Tukey检验进行单因素方差分析，二者具有显著性差异(P＜0.05)。
对大鼠血浆中甲苯咪唑从不同剂型的释放度进行比较，甲苯咪唑纳米混悬剂的释放度(10小时内＜26％)显著小于共溶剂剂型(4小时内为55％)(图22A-22B和表23)。在不同大小的甲苯咪唑纳米混悬剂中，10小时内甲苯咪唑从NS-167NM释放约26％，明显高于NS-700NM(21％)和NS-1700NM(18％)(P＜0.05)。在后三个时间点(24小时、34小时和48小时)，甲苯咪唑从NS-167NM的释放度明显高于NS-1700NM(P＜0.05)。
Figure BPA00001330497700641
这些结果表明，在大鼠血浆中甲苯咪唑纳米混悬剂释放药物比甲苯咪唑共溶剂剂型慢得多。另外，小粒径的纳米混悬剂(NS-167nm)的初始释放速率要明显大于大粒径混悬剂(NS-1700nm)(P＜0.05)。10小时后，NS-167nm的释放度要明显大于NS-1700nm。显然，甲苯咪唑混悬剂的粒径影响了药物在大鼠血浆中的体外释放速率和释放度。
对PBS/0.2％吐温80溶液和大鼠血浆中甲苯咪唑从共溶剂和纳米混悬剂的释放度进行比较，在这两种释放介质中，4.5小时内共溶剂的释放度比为约55％，48小时内纳米混悬剂的释放度比为40-50％。甲苯咪唑在大鼠血浆中释放度明显低于在PBS中的释放度，这可以通过甲苯咪唑与血浆蛋白的结合来解释。人们认为甲苯咪唑是一种高血浆蛋白结合率的药物，约90％的药物都与人的血浆蛋白结合。在PBS/0.2％吐温80溶液和大鼠血浆中，甲苯咪唑从共溶剂和纳米混悬剂的初始释放速率也明显不同。甲苯咪唑共溶剂在PBS溶液中的初始释放速率大约是大鼠血浆中的3.5倍，而甲苯咪唑纳米混悬剂是4到9倍。这表明血浆蛋白结合对甲苯咪唑共溶剂的初始释放速率的影响更大。总之，甲苯咪唑与血浆蛋白的结合导致了大鼠血浆中药物从共溶剂和纳米悬浮液的初始释放速率和释放度较在PBS溶液中要小。
实施例10
甲苯咪唑纳米混悬剂在小鼠体内的血浆药代动力学和生物学分布：高 效液相色谱法测定小鼠血浆和器官样品中的甲苯咪唑
为了定量测定小鼠血浆中的甲苯咪唑，我们首先测定了内标和甲苯咪唑的保留时间，二者的保留时间分别为3.9分钟和8.4分钟。空白小鼠血浆对甲苯咪唑的检测无干扰。绘制的甲苯咪唑浓度标准曲线包括6个浓度点，其线性范围为0.05-20μg/ml，相关系数大于0.999。该方法的日间变异系数(n＝3)为2.16％，证明了其有效性。甲苯咪唑的回收率约为95％。表24为小鼠血浆样品中甲苯咪唑浓度的标准曲线参数。峰比值(Y)对甲苯咪唑浓度(X)的平均线性回归方程为Y＝0.6907X+0.045。利用该方程测定了小鼠体内甲苯咪唑血浆药代动力学研究中的甲苯咪唑浓度。
表24
Figure BPA00001330497700661
为了定量测定小鼠大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺和脾脏6个器官中的甲苯咪唑，我们首先测定了内标和甲苯咪唑的保留时间，二者的保留时间也分别为3.9分钟和8.4分钟左右。6个器官样品均对甲苯咪唑的检测无干扰。绘制的甲苯咪唑浓度标准曲线的线性范围为0.05-10μg/ml，除脾脏中甲苯咪唑浓度标准曲线的相关系数为0.9988外，其他所有器官中甲苯咪唑浓度标准曲线的相关系数均大于0.999。该方法的日间变异系数(n＝3)证明其对各个器官都是有效的。脾脏的日间变异系数最高(3.43％)，大脑的日间变异系数最低(1.03％)，其他器官的日间变异系数都是相近的(2.00％-2.75％)。这些器官中甲苯咪唑的回收率在80％到87％之间。心脏中甲苯咪唑的回收率最高(87.47％)，然后依次是大脑(86.93％)、脾脏(84.53％)、肺(82.58％)、肝脏(82.58％)和肾脏(79.81％)。所有这些回收率都是可以接受的。利用峰比值(Y)对甲苯咪唑浓度(X)的线性回归方程测定了小鼠体内甲苯咪唑的生物学分布研究中各个器官中甲苯咪唑的浓度。对6个器官中甲苯咪唑浓度标准曲线的斜率进行比较，大脑和心脏中甲苯咪唑浓度标准曲线的斜率相近，约为0.37，而其他器官中甲苯咪唑浓度标准曲线的斜率约为0.33。
Figure BPA00001330497700671
甲苯咪唑纳米混悬剂(NS-167nm和NS-1700nm)在小鼠体内的血浆药 代动力学
我们对甲苯咪唑纳米混悬剂(NS-167nm和NS-1700nm)在小鼠体内的血浆药代动力学进行了研究。两种纳米混悬剂剂型都呈现出持续性的甲苯咪唑血药浓度，注射后可检出时间可达到24小时，而共溶剂为6小时(图23)。为了进行比较，用WinNolin软件推导出共溶剂、NS-167nm和NS-1700nm的血浆药代动力学参数并列于表26。所有药代动力学参数的值均为由平均血药浓度-时间曲线得到的平均值。表中未列出标准方差，也未进行统计学分析。与共溶剂相似，这两种剂型的甲苯咪唑对小鼠静脉注射后的血药浓度-时间曲线也符合二室模型。三种剂型的血药浓度-时间曲线都呈现出短α相(t1/2，α＜0.3hr)，说明其为快速分布相。
表26
  药代动力学参数   单位   共溶剂   NS-167nm   NS-1700nm
  剂量   mg/kg   6.5   30   30
  峰值浓度   (mg/L)/(mg/kg)   1.45   0.53   0.31
  药-时曲线下面积   (hr*mg/L)/(mg/kg)   1.14   0.55   0.45
  t1/2，αα   hr   0.078   0.23   0.14
  t1/2，β   hr   1.34   14.30   16.08
  α   1/hr   8.84   2.99   4.88
  β   1/hr   0.51   0.050   0.04
  CL   L/hr   0.029   0.059   0.071
  Vss   L   0.051   0.85   1.45
  V1   L   0.023   0.060   0.10
  V2   L   0.028   0.79   1.35
  k10   1/hr   1.27   0.96   0.69
  k12   1/hr   4.52   1.93   3.93
  k21   1/hr   3.57   0.15   0.31
  BA   0.48   0.39
从表26可以看出，纳米混悬剂和共溶剂的血浆药代动力学不同。NS-167nm和NS-1700nm的Cmax/剂量较低，分别0.53(mg/L)/(mg/kg)和0.31(mg/L)/(mg/kg)，仅为共溶剂[1.45(mg/L)/(mg/kg)]的1/3至1/4。NS-167nm和NS-1700nm的t1/2，α和t1/2，β较共溶剂长，特别是t1/2，β。其t1/2，β是共溶剂的10至12倍。此外，NS-167nm和NS-1700nm的V2分别为0.79L和1.35L，远大于共溶剂。NS-167nm和NS-1700nm的k21分别为0.15hr-1和0.31hr-1，较共溶剂(3.57hr-1)慢10至20倍。对NS-167nm和NS-1700nm进行比较，二者的Cmax/剂量都较低，并具有长时间的分布相和消除半衰期，以及较大的Vss和V2。NS-1700nm的Vss和V2分别为1.45L和1.35L，显著大于NS-167nm(0.85L和0.79L)。NS-167nm和NS-1700nm的相对生物利用率分别为0.48和0.39。
NS-167nm和NS-1700nm纳米混悬剂中甲苯咪唑的生物学分布
正如从两种剂型的血药浓度-时间曲线所预期的结果，我们观察到了共溶剂和纳米混悬剂剂型的不同组织分布模式(图24A-24B)。纳米混悬剂注射后，器官内的甲苯咪唑可检测时间可达到48小时，而共溶剂注射后可检测时间为4小时。除注射NS-1700nm的脾脏外，注射共溶剂和纳米混悬剂的器官在注射后5分钟均可达到甲苯咪唑的峰值浓度。NS-167nm和NS-1700nm在肝脏的最高峰值浓度(Cmax/剂量)分别为4.74(μg/g)/(mg/kg)和5.82(μg/g)/(mg/kg)，为共溶剂剂型最高峰浓度[1.82(μg/g)/(mg/kg)]的2.6-3.2倍(表27)。
Figure BPA00001330497700701
在这些器官中，共溶剂在肝脏中产生的甲苯咪唑最大暴露量的AUC0-∞为3.37(hr*μg/g)/(mg/kg)，然后依次在肾脏中为2.70(hr*μg/g)/(mg/kg)，在大脑中为2.49(hr*μg/g)/(mg/kg)。而NS-167nm在肝脏中的AUC0-48hr为136.15(hr*μg/g)/(mg/kg)，约为共溶剂的30倍。其在脾脏的AUC0-48hr为83.30(hr*μg/g)/(mg/kg)，在肺的AUC0-48hr为22.04(hr*μg/g)/(mg/kg)。NS-1700nm在肝脏中的AUC0-24hr为116.60(hr*μg/g)/(mg/kg)，在肺中的AUC0-24hr为44.07(hr*μg/g)/(mg/kg)。纳米混悬剂注射后六种器官中甲苯咪唑的消除半衰期为8至40小时，较共溶剂显著延长了2小时。对NS-167nm和NS-1700nm的器官药代动力学参数进行比较发现，除肝脏外，NS-1700nm在所有器官中的AUCs0-24显著大于NS-167nm。同时，在肺和肝脏中NS-1700nm具有比NS-167nm更长的t1/2。在肝脏和脾脏中，可观察到两种粒度的纳米混悬剂具有很高的甲苯咪唑暴露量。
实施例11
甲苯咪唑混悬剂在大鼠体内的生物学分布
大小依赖的药代动力学效应
在大鼠体内，可以观察到粒径为138-1781nm的纳米混悬剂剂型具有大小依赖的药代动力学效应(图25A-25B)。粒径＜小于253nm和粒径＞739nm的剂型组的甲苯咪唑的配置特性不同。然而，小粒径的138-141nm剂型组与253nm的剂型组的药代动力学参数是相近的。同样地，粒径为739-891nm和1554-1891nm的纳米混悬剂药代动力学参数也是相近的。与大粒径组(739-891nm和1554-1781nm)相比，小粒径组(138-141nm和253nm)具有较高的Cmax、β和k10，较短的β半衰期，较小的Vss、V1和V2，以及较慢的k21。
粒径＞739nm的纳米混悬剂能够保持持续性的血药浓度48至96小时，而粒径≤253nm的剂型的血药浓度可检测时间仅为48小时。这是由于粒径≤253nm的纳米混悬剂的β半衰期显著短于粒径＞739nm的纳米混悬剂。
共溶剂和混悬剂剂型中甲苯咪唑分布的含量均匀度考察
为了保证14C标记的甲苯咪唑在制剂中均匀分布，我们进行了含量均匀度考察。共溶剂的变异系数为5.97％，NS-167nm的变异系数为5.75％，NS-400nm的变异系数为2.93％，NS-700nm的变异系数为7.13％，NS-1700nm的变异系数为5.54％(表28)。引起变异的一个因素可能是取样时制剂附着在枪尖上所导致的。
表28
Figure BPA00001330497700721
猝灭研究
为了精确检测放射性，选取不同重量的大鼠器官切片(0.1g、0.2g和0.3g)进行猝灭效应实验。依器官不同，该实验的计数效率为80％至96％(表29)。由于0.2g重量的器官切片对猝灭效应无明显影响，选取0.2g作为适宜用量对大鼠器官进行放射性检测。以0.2g组织的计数效率修正大鼠生物学分布研究中单个器官的猝灭效应。
表29
  重量(g)   大脑   心脏   肾脏   肝脏   肺   脾脏
  0.1   93.26   86.30   93.94   92.48   97.41   91.90
  0.2   96.89   86.50   91.04   88.63   94.38   85.86
  0.3   96.92   83.34   92.00   85.78   91.65   79.87
大鼠器官中的甲苯咪唑分布的均一性研究
在大鼠生物学分布研究中，每个器官仅选取一部分(0.2g)进行甲苯咪唑定量检测。为了保证部分器官中检测到的甲苯咪唑含量能够代表整个器官的结果，我们对14C标记的甲苯咪唑在大鼠器官中的均一性进行了研究。为了测定特定器官不同部位的变化，从三个位置随机选取200mg的样品放入三个小瓶里。对每个小瓶的放射性进行计数，并计算三个样品的变异系数。如表30所列，除心脏的分布变异系数为14.02％外，其余器官的分布变异系数均小于8％。肾脏的变异系数为3.01％，肝脏的变异系数为3.44％，脾脏的变异系数为5.15％，肺的变异系数为5.67％，大脑的变异系数为7.96％。
表30
Figure BPA00001330497700731
共溶剂以及NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm纳米混
悬剂中甲苯咪唑在大鼠体内的生物学分布研究
我们对甲苯咪唑共溶剂和纳米混悬剂(NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm)在大鼠体内的生物学分布进行了研究(图26A-26E)。整个实验均选用雄性Sprague-Dawley大鼠(300-350g)。甲苯咪唑共溶剂按5mg/kg对大鼠进行静推，NS-700nm和NS-1700nm按30mg/kg对大鼠进行静推。以液体闪烁计数器对血浆(图27A-27C)和六种器官(心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏和大脑)中甲苯咪唑的放射性进行监测，共溶剂到注射后可检测时间为2小时，NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm注射后可检测时间达到48小时。绘制每种剂型的组织分布曲线。由于NS-1700nm引起的严重不良反应，在预定时间点时只有三分之一的大鼠存活下来(24小时和48小时)。
在图26A-26E、27A-27C和28A-28C中，Y轴为包括原型药物、代谢产物和降解产物的总甲苯咪唑的浓度。我们观察到了共溶剂和纳米混悬剂剂型的不同组织分布模式(图26A-26E)。纳米混悬剂注射后，器官中的甲苯咪唑浓度可检测时间达到48小时。而共溶剂注射后可检测时间为2小时。共溶剂剂型的甲苯咪唑在肝脏中药物浓度最高，其次为肾脏，其他四种器官(心脏、肺、脾脏和大脑)中药物浓度相近。2小时后，除肾脏中的甲苯咪唑浓度保持在初始水平外，其余所有器官中的总甲苯咪唑浓度显著下降。纳米混悬剂在肝脏、脾脏和肺中的甲苯咪唑浓度较高，而在其他器官如心脏、肾脏和大脑中药物浓度较低。
与共溶剂不同，甲苯咪唑纳米混悬剂在肝脏、脾脏和肺中有较高的药物浓度，较心脏、肾脏和大脑中总药物浓度高8倍以上。甲苯咪唑纳米混悬剂注射48小时后在肝脏和脾脏中依然保持较高的总药物浓度。与共溶剂相比，甲苯咪唑纳米混悬剂的总甲苯咪唑表现出较长的半衰期(表31)。
表31
甲苯咪唑的消除半衰期(hr)
注：除*标示的为甲苯咪唑母体的数值外，其余均为总甲苯咪唑的数值。
对不同粒径的甲苯咪唑混悬剂进行比较发现，NS-700nm的总甲苯咪唑的半衰期较NS-167nm和NS-400nm更长。NS-400nm在脾脏中总甲苯咪唑的半衰期较NS-167nm更长。由于甲苯咪唑在这些器官中的浓度在24小时达到最大值，而不是从5分钟到48小时持续下降，因此未检测到NS-1700nm在肝脏的总甲苯咪唑半衰期以及NS-700nm和NS-1700nm在脾脏的甲苯咪唑半衰期。
比较每个时间点四种粒径的纳米混悬剂在器官中总甲苯咪唑的浓度(图28A-28C)。5分钟时，纳米混悬剂在肝脏和脾脏的甲苯咪唑浓度显著高于共溶剂。而与共溶剂相比，纳米混悬剂在心脏、肾脏和大脑的甲苯咪唑浓度更低。大粒径的纳米混悬剂(NS-700nm和NS-1700nm)在肺的平均甲苯咪唑浓度较NS-167nm和NS-400nm要高。值得注意的是，甲苯咪唑的平均浓度随粒径增大而下降。除48小时时NS-700nm在脾脏的平均甲苯咪唑浓度稍低于NS-167nm和NS-400nm外，24小时和48小时时大粒径的纳米混悬剂(NS-700nm和NS-1700nm)在肺、肝脏和脾脏的平均甲苯咪唑浓度较小粒径的纳米混悬剂(NS-167nm和NS-400nm)要高。
5分钟时，四种粒径的甲苯咪唑纳米混悬剂在血液中的浓度显著高于共溶剂。纳米混悬剂的甲苯咪唑浓度在48小时时仍可检出，而共溶剂在4小时时就无法检出。NS-400NM和NS-700NM在血液中甲苯咪唑的浓度相近，均低于NS-167NM，但高于NS-1700NM。5分钟时血浆中的甲苯咪唑浓度随粒径增大而下降。
NS-167nm、NS-400nm、NS-700nm和NS-1700nm纳米混悬剂中甲苯 咪唑原型药物在大鼠肝脏和脾脏内的分布研究
因为我们观察到甲苯咪唑纳米混悬剂在大鼠肝脏和脾脏的总药物浓度很高，所以采用高效液相色谱法对两种器官中原型药物甲苯咪唑的浓度进行测定。注射所有四种粒径的纳米混悬剂后，肝脏和脾脏中甲苯咪唑的原型药物浓度在48小时时仍可检测。在三个时间点(5分钟、24小时和48小时)上，NS-167nm释放的甲苯咪唑在肝脏内的最高浓度为5分钟时的4.30(μg/g)/(mg/kg)，在脾脏内最高浓度为5分钟时的3.83(μg/g)/(mg/kg)(图29A)。注射后5分钟至48小时，NS-167nm在肝脏和脾脏中的药物浓度下降。与此相似，NS-400nm在肝脏和脾脏中的最高浓度分别为5分钟时的6.26(μg/g)/(mg/kg)和3.63(μg/g)/(mg/kg)，且其药物浓度从5分钟至48小时下降(图29B)。NS-700nm在肝脏的最高浓度为5分钟时的3.14(μg/g)/(mg/kg)，且其浓度从5分钟至48小时下降(图29C)。与其他三种粒径的纳米混悬剂不同，NS-1700nm在肝脏和脾脏的甲苯咪唑浓度没有明显的下降(图29D)。我们计算了四种粒径的纳米混悬剂在大鼠肝脏和脾脏中的消除半衰期。很明显，消除半衰期随粒径增大而增加(表31)。
实施例12
比较剂型和粒径对甲苯咪唑在不同物种体内配置的影响
比较剂型和粒径对甲苯咪唑共溶剂、微乳剂和纳米混悬剂在小鼠和大 鼠体内药代动力学的影响
甲苯咪唑的共溶剂和纳米混悬剂剂型静脉注射后均遵从二室模型。在小鼠和大鼠体内，甲苯咪唑共溶剂和纳米混悬剂表现出不同的药代动力学特性。与共溶剂相比，甲苯咪唑混悬剂的Cmax/剂量较低，分布和消除半衰期较长，具有较大的Vss和V2(表19)。在小鼠和大鼠体内，NS-1700nm与NS-167nm相比，其Cmax/剂量较低，t1/2，α较短，t1/2，β较长，具有较大的Vss和V2。与NS-167nm相比，NS-1700nm在小鼠和大鼠体内的k10较慢，而k12和k21较快(表32)。甲苯咪唑纳米混悬剂的粒径对甲苯咪唑在小鼠和大鼠体内的血浆药代动力学影响一致。
Figure BPA00001330497700771
比较粒径对纳米混悬剂剂型的甲苯咪唑在小鼠和大鼠体内生物学分布 的影响
甲苯咪唑共溶剂和纳米混悬剂在小鼠和大鼠体内有相似的分布模式差异。在小鼠和大鼠体内，甲苯咪唑共溶剂在肝脏中的药物浓度最高，然后依次为肾脏和其他器官(图26A)。在小鼠和大鼠体内，甲苯咪唑混悬剂在肝脏和脾脏中的药物浓度高于其他器官(图25A-25B、26B、26E)。我们还分别对NS-167nm和NS-1700nm在小鼠和大鼠的肝脏和脾脏中原型药物甲苯咪唑的浓度进行了监测(图30A-30D)。
表33列出了由甲苯咪唑在肝脏和脾脏中分布曲线得到的药代动力学参数。与在大鼠体内相比，甲苯咪唑在小鼠的肝脏和脾脏中的浓度范围更相近。NS-167nm在小鼠肝脏中的甲苯咪唑浓度为5.43-2.01(μg/g)/(mg/kg)，而在大鼠肝脏中的甲苯咪唑浓度为4.30-1.56(μg/g)/(mg/kg)。NS-167nm在小鼠脾脏中的甲苯咪唑浓度为3.26-0.91(μg/g)/(mg/kg)，而在大鼠脾脏中的甲苯咪唑浓度为3.83-1.69(μg/g)/(mg/kg)。类似地，以同样剂量注射NS-1700nm，小鼠肝脏和脾脏中的甲苯咪唑浓度与大鼠相近。然而，甲苯咪唑在大鼠器官中的半衰期长于在小鼠器官中的半衰期。对于NS-167nm，甲苯咪唑在大鼠肝脏中的半衰期为32.66小时，长于小鼠的半衰期(26.06小时)。甲苯咪唑在大鼠脾脏中的半衰期为小鼠中的2.5倍。
表33
注：除计算NS-1700nm在小鼠肝脏中的AUC为0至24小时外，其余均为0至48小时。
实施例13
利用异速缩放预测其溶剂以及NS-167nm和NS-1700nm纳米混悬剂甲 苯咪唑的人体药代动力学参数
将共溶剂、NS-167nm和NS-1700nm所释放的甲苯咪唑的药代动力学参数(CL、Vss、t1/2，α、和t1/2，β)(表34)与实验鼠体重的异速生长关系在双对数坐标系下做图(图31A-31L)。回归曲线斜率的置信区间(C.I.)为95％。在95％置信区间下，通过种间放大得到的关系预测不同剂型甲苯咪唑在人体内的药代动力学参数，所有数据列于表35。在95％置信区间下，共溶剂在人体内的CL为0.09-0.97L/hr，NS-167nm(13.64-102。07L/hr)和NS-1700nm(12.92-75.91L/hr)较其快约100倍。NS-167nm和NS-1700nm的Vss分别为1230L/kg和3834L/kg，显著大于共溶剂，约为后者的400-1000倍。此外，尽管三种剂型的β半衰期较一致，但共溶剂与纳米混悬剂(NS-167nm和NS-1700nm)的α半衰期存在显著差异。
Figure BPA00001330497700801
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本说明书中提到的任何专利案或公开案对于本发明所属领域的技术人员都是指示性的。并且这些专利案和公开案系以引用的方式全部并入本文中，该引用的程度就如同已特定地及个别地将各个公开案之整体揭示内容以引用的方式并入一般。

Claims (62)

1.一种给药系统，包括：
a)一种有以下结构式的苯并咪唑的衍生物：
Figure FPA00001330497600011
其中R3可选基团包括氢原子、羧基(-CO2H)、羟基、氨基、氯原子、二氟甲氧基、苯甲酰基、苯硫基、吡啶基、苯硫基、二苯基、5-甲氧基、氟苄基-2-氯基、丙烯基、氯丙基或酯基(-CO2R4)。其中R4可选基团包括烃氧基、卤代烷基、烯基和环烷基，其中烷基基团有1-8个碳原子，或为CH3CH2(OCH2CH2)n-、CH3CH2CH2(O CH2CH2CH2)n或(CH3)2CH(OCH(CH3)CH2)n-，其中n值取1-3。其中R1可选基团包括羟基、氯原子、巯基、氨基甲酸酯或哌啶-4基。其中R2可选基团包括氢原子、α-甲乙烯、3-氯丙基或哌啶-4基，也可以是具药剂学活性的有机或无机盐或混合物，
b)一种油；
c)一种表面活性剂；
d)一种辅助表面活性剂；和
e)一种偶极非质子溶剂。
2.占有权限1中的给药系统，进一步包括水。
3.占有权限2中的给药系统，其中水大约占质量比率的50％。
4.占有权限1中的给药系统，其中苯并咪唑的衍生物是甲基-5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯，甲基-5-苯硫基-2-氨基甲酸甲酯，
Figure FPA00001330497600021
5.占有权限4中的给药系统，其中苯并咪唑的衍生物是甲基-5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯，其浓度约为0.9毫克/毫升至约2毫克/毫升。
6.占有权限1中的给药系统，其中油是Captex 200或Myglyol。
7.占有权限6中的给药系统，其中油所占的质量比例约为14％至约42％。
8.占有权限1中的给药系统，其中表面活性剂是吐温80而辅助表面活性剂是二乙二醇单乙基醚或Capmul MCM。
9.占有权限8中的给药系统，其中表面活性剂和辅助表面活性剂分别所占的质量比例约为6％至约48％。
10.占有权限9中的给药系统，其中表面活性剂和辅助表面活性剂的比例约为1∶0.5至约1∶1。
11.占有权限1中的给药系统，其中偶极非质子溶剂是二甲基亚砜。
12.占有权限11中的给药系统，其中偶极非质子溶剂所占的质量比例约为5％至约10％。
13.占有权限1中的给药系统，其中系统形成了一种乳剂，所述乳剂的液滴直径约为35纳米至约500纳米。
14.占有权限13中的给药系统，其中系统是一种自行纳米微乳化的给药系统，其中液滴的直径约为35纳米至约100纳米以下。
15.占有权限13中的给药系统，其中系统是一种自乳化给药系统，其中液滴的直径约为141纳米至约500纳米以下。
16.一种给药系统，包括：
甲基-5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯；
其系统中的油的质量比例约为4％至约42％；
其系统中的表面活性剂或辅助表面活性剂的质量比例约为4％至约42％，其中表面活性剂与辅助表面活性剂的比例约为1∶0.75至约1∶1；
其系统中的二甲基亚砜的质量比例约为5％至约10％。
17.占有权限16中的给药系统，其中包括：占质量比约4％至约9％的Captex 200，占质量比约20％至约41％的吐温80和二乙二醇单乙基醚或Capmul。
18.占有权限17中的给药系统，进一步包括占质量比例约50％的水。
19.占有权限17中的给药系统，其中系统是一种自行纳米微乳化的给药系统，其中液滴的直径约为35纳米至约37纳米。
20.占有权限16中的给药系统，其中包括：占质量比约42％的Myglyol，占质量比约27％的吐温80和二乙二醇单乙基醚以及占质量比约21％的Capmul。
21.占有权限20中的给药系统，其中系统是一种自乳化给药系统，其中液滴的直径约为141至145纳米。
22.占有权限16中的给药系统，其中甲基-5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯的浓度约为0.9毫克/毫升至约2毫克/毫升。
23.一种增加苯并咪唑衍生物的生物利用度，以治疗治疗对象的病理生理况态的方法，包括：
以占有权限1中的给药系统将苯并咪唑衍生物给予治疗对象，其中
乳剂中液滴的直径和表面活性剂与辅助表面活性剂的比例的组合构成所述系统，所述系统可以增加组织中苯并咪唑衍生物的半衰期，以增加其用于治疗的生物利用度。
24.占有权限23中的方法，其中液滴的直径约为34纳米至约143纳米。
25.占有权限23中的方法，其中表面活性剂与辅助表面活性剂的比例是1∶1。
26.占有权限23中的方法，其中苯并咪唑的衍生物的给药方法是口服或口服。
27.占有权限23中的方法，其中组织是肺组织。
28.一种增加苯并咪唑衍生物在所需治疗对象的肺内的浓度和滞留的方法，包括：
制备一种微乳剂型其包括苯并咪唑衍生物和其他占有权限1的给药系统中的组分以使液滴的直径约为35纳米至约100纳米以下；以及
以非口服形式将微乳剂给予治疗对象；其中液滴增加苯并咪唑衍生物在肺内的摄取和滞留。
29.一种方法以定义苯并咪唑衍生物的微乳剂在给治疗对象治疗的方案中不会造成溶血，包括：
制备一种微乳剂型其包括苯并咪唑衍生物和其他占有权限1的给药系统中的组分以使微乳剂中表面活性剂∶辅助表面活性剂的成分占低质量比处于约为6％至约48％；以及
在治疗方案中以非口服形式将微乳剂给予治疗对象；其中低的表面活性剂∶辅助表面活性剂的成分减少了苯并咪唑衍生物造成溶血的可能性。
30.一种给药系统，包括：
一种纳米混悬剂型，其包括一种苯并咪唑衍生物的颗粒，其颗粒大小范围约为5纳米至约2000纳米。
31.占有权限30中的给药系统，进一步包括两种或两种以上表面稳定剂。
32.占有权限31中的给药系统，其中表面稳定剂是一种或一种以上嵌段聚合物以及一种或一种以上表面活性剂。
33.占有权限32中的给药系统，其中嵌段聚合物是普朗尼克F108。
34.占有权限32中的给药系统，其中表面活性剂是吐温-80。
35.占有权限31中的给药系统，其中纳米混悬剂包括占浓度百分比最多为10％左右的嵌段聚合物和占浓度百分比最多为10％左右的表面稳定剂。
36.占有权限35中的给药系统，其中嵌段聚合物的浓度百分比和表面稳定剂的浓度百分比分别为5％左右的和1％左右。
37.占有权限30中的给药系统，进一步包括水。
38.占有权限30中的给药系统，其中苯并咪唑的衍生物有以下的结构式：
Figure FPA00001330497600061
其中R3可选基团包括氢原子、羧基(-CO2H)、羟基、氨基、氯原子、二氟甲氧基、苯甲酰基、苯硫基、吡啶基、苯硫基、二苯基、5-甲氧基、氟苄基-2-氯基、丙烯基、氯丙基或酯基(-CO2R4)。其中R4可选基团包括烃氧基、卤代烷基、烯基和环烷基，其中烷基基团有1-8个碳原子，或为CH3CH2(OCH2CH2)n-、CH3CH2CH2(O CH2CH2CH2)n或(CH3)2CH(OCH(CH3)CH2)n-，其中n值取1-3。其中R1可选基团包括羟基、氯原子、巯基、氨基甲酸酯或哌啶-4基。其中R2可选基团包括氢原子、α-甲乙烯、3-氯丙基或哌啶-4基，也可以是具药剂学活性的有机或无机盐或混合物。
39.占有权限38中的给药系统，其中苯并咪唑的衍生物是甲基-5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯，甲基-5-苯硫基-2-氨基甲酸甲酯，
Figure FPA00001330497600071
40.占有权限30中的给药系统，其中苯并咪唑的衍生物在纳米混悬剂中所占的浓度最多可达200毫克/毫升。
41.占有权限30中的给药系统，其中构成纳米混悬剂的颗粒有一致的大小或者一系列不同的大小组合。
42.占有权限30中的给药系统，其中颗粒的大小范围约为100纳米至约2000纳米。
43.占有权限30中的给药系统，其中苯并咪唑的衍生物是甲基-5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯，其最高浓度可达约200毫克/毫升。
44.一种给药系统，其包括：
一种纳米混悬剂的配方，其包括甲基-5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯，普朗尼克F108和吐温-80。
45.占有权限44中的给药系统，进一步包括水。
46.占有权限44中的给药系统，其中纳米混悬剂包括最高浓度百分比可达约10％的普朗尼克F 108和最高浓度百分比可达约10％的吐温-80。
47.占有权限46中的给药系统，其中普朗尼克F108和吐温-80的浓度百分比分别是约5％和约1％。
48.占有权限44中的给药系统，其中甲基-5-苯甲酰苯并咪唑-2-氨基甲酸酯在纳米混悬剂中的最高浓度可达约200毫克/毫升。
49.占有权限44中的给药系统，其中构成纳米混悬剂的颗粒有一致的大小或者一系列不同的大小组合。
50.占有权限44中的给药系统，其中颗粒的大小范围约为100纳米至约2000纳米。
51.一种增加苯并咪唑衍生物的在组织中生物利用度的方法，以治疗治疗对象的病理生理况态，包括：
制备一种占有权限30中给药系统含有的纳米混悬剂型，使此纳米混悬剂型中的颗粒在一定的大小范围内，使颗粒中含有的苯并咪唑衍生物的滞留度随颗粒大小的增加而增加，并且
将此纳米混悬剂型给予治疗对象，使从颗粒中释放出至组织的苯并咪唑衍生物的释放在一定的时间内是连续和持久的，所述苯并咪唑衍生物的释放由颗粒的大小决定。
52.占有权限51中的给药系统，其中颗粒的大小范围约为5纳米至约2000纳米。
53.占有权限51中的方法，其中的病理生理况态是癌症。
54.占有权限51中的方法，其中的纳米混悬剂是以非口服形式给予治疗对象。
55.一种治疗需要治疗的对象的癌症的方法，包括：
将占有权限30中的纳米混悬剂包括的给药系统给予治疗对象，使从所述纳米混悬剂的颗粒中释放出的苯并咪唑衍生物释放至癌组织，所述的释放药物方法可以提供持久的治疗效果。
56.占有权限55中的方法，进一步包括：
以制剂方法使纳米混悬剂中的颗粒保持一定的大小范围，使颗粒中含有的苯并咪唑衍生物的滞留度随颗粒大小的增加而增加，以提高苯并咪唑衍生物制剂对于组织的生物利用度。
57.占有权限55中的的方法，其中颗粒的大小范围约为5纳米至约2000纳米。
58.占有权限55中的方法，其中的纳米混悬剂是以非口服形式给予治疗对象。
59.一种方法以定义苯并咪唑衍生物的纳米混悬剂在给治疗对象的某组织的治疗方案中能提供最高的疗效，包括：
调整并且/或者选择占有权限30中的纳米混悬剂中的苯并咪唑衍生物的颗粒大小范围，此调整并且/或者选择基于苯并咪唑的衍生物在所治疗的组织中的药物代谢动力学的参数；其中调整后的颗粒大小范围在一起可以增加疗效；由此而定义苯并咪唑衍生物的纳米混悬剂的疗效。
60.占有权限30中的方法，进一步包括：
以制剂方法使纳米混悬剂中的颗粒的直径保持一定的大小范围，并且以非口服形式将所述制剂给予治疗对象。
61.占有权限30中的方法，其中苯并咪唑的衍生物在组织中的药物代谢动力学的参数包括以下之一或多种参数：浓度，滞留度，生物利用度，生物分布度，或毒性。
62.占有权限30中的方法，其中颗粒的大小范围约为5纳米至约2000纳米。
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