CN104173283B - 一种以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂的纳米混悬剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂的纳米混悬剂及其制备方法，所述纳米混悬剂以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂与表面活性剂的重量比为1:0.1~1:10。本发明纳米混悬剂具有含药量高，辅料用量小，稳定性好，溶出速率稳定等特性，适用于多种给药途径（尤其可注射用），很好的解决了该类化合物水溶性差，给药困难，生物利用度低，毒副作用强等缺点，实现了该领域内的技术突破，首次为该类Hsp90抑制剂提供了一种可增加药物含量、生物利用度高、并具有被动靶向的给药新剂型，以加速其临床应用的进程。

Description

一种以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂的纳米混悬剂及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂的纳米混悬剂及其制备方法。

背景技术

以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂（Benzamide-Hsp90 inhibitor，BA-Hsp90类）是近几年筛选出的一类新型热休克蛋白90（Hsp90）抑制剂。Hsp90是国际公认的抗肿瘤靶点。Hsp90又称为应激蛋白90，广泛存在与生物界的原核和真核生物中，是细胞内含量最丰富的蛋白之一。由于Hsp90是协助细胞DNA复制的必需蛋白，并且其在肿瘤细胞的表达比正常细胞高210倍，造就了Hsp90抑制剂对症癌细胞的靶向性。体内、外实验证明，该类化合物在治疗白血病、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌以及食道癌多种癌症细胞均有显著的抑制效果，具广谱抗肿瘤活性。其抗癌作用是经典Hsp90抑制剂17-AAG的10倍以上，比常规化疗药物五氟尿嘧啶（5-FU）高出约100倍，同时，其对正常细胞的最大无毒浓度较大，仅对癌细胞具有特异性的抑制作用，是一种极具开发前景的抗肿瘤药物，且有化合物处于一期临床研究阶段。

然而，该类化合物在水中的溶解度很小，使得该化合物的应用以及开发受到了极大的限制。如SNX-2112在水中的溶解度仅为16μg/ml，在甲醇、乙醇、二甲基亚砜等有机溶剂中可溶。极低的水溶性不仅给静脉用药带来很大的困难，即使勉强口服给药，难溶性药物生物利用度低且难以预测，而目前国内外对该类化合物的制剂研究较少。

纳米混悬剂是一种通过极少量的稳定剂将药物粒子分散在水中而形成的分散度极好的固体药物粒子水分散体系。该递药体系特别适用于既难溶于水，又难溶于油的化合物。纳米混悬剂载药量大，大大减小给药体积，毒性大大降低；药物颗粒粒径为纳米级别，特别适合于难溶性药物的各种给药途径的需要，如静脉注射，静脉滴注，口服给药，鼻腔给药等；将药物制成纳米混悬剂后，由于处方中表面活性剂含量极少，大大降低了注射给药时附加成分所造成的刺激性和毒副作用，用药安全性大大提高；纳米混悬剂增大了药物的比表面积，使得药物可以迅速溶出，可以有效解决药物溶解度低的问题，能显著提高生物利用度。另外，纳米混悬剂处方简单、制备流程短、可广泛用于各种难溶性药物新制剂的制备。

发明内容

为了解决上述BA-Hsp90类抑制剂水溶性差、给药困难，生物利用度低，毒副作用强等缺点，本发明的首要目的在于提供一种以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂的纳米混悬剂，从而提高BA-Hsp90类抑制剂的水溶性及生物利用度。

本发明的另一目的在于提供上述纳米混悬剂的制备方法。

本发明通过如下技术方案实现：

一种以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂的纳米混悬剂，含有以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂和表面活性剂，以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂与表面活性剂的重量比为1：0.1 ~ 1:10，优选为1 ：1。

本发明所述以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂为SNX-2112、Xbj-B11或Xbj-B16，其结构式如下所示。

本发明所述的SNX-2112可通过市购得到；Xbj-B11的合成参见中国专利201010299617.X；Xbj-B16的合成参见中国专利201010299615.0。

根据目前报道的纳米混悬剂的制备方法，发明人选用了多个表面活性剂作为稳定剂制备BA-Hsp90类化合物纳米混悬剂，BA-Hsp90类化合物与表面活性剂的质量比为1:1，如卵磷脂、吐温80（T-80）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆407（P407）、十二烷基硫酸钠（SDS）、胆酸钠（SCH）、聚乙烯吡络烷酮（PVP）、羟丙基甲基纤维素（HPMC）等。结果表1所示，采用不同的表面活性剂时，得到的纳米混悬剂粒径大小、zeta电位值和PDI均差异很大。卵磷脂制备的纳米混悬液有严重的絮凝现象，卵磷脂在高温下易氧化，且容易染菌，故不选用；应用HPMC时，制得的纳米粒子粒径在500nm以上，PDI在0.3以上，Zeta电位绝对值小于10，稳定性较差，故不选用；SDS和SCH制得的粒径及Zeta 电位均符合要求；T-80和PVP制得的粒径及Zeta 电位也符合要求；泊洛沙姆188或泊洛沙姆407制得的粒径、PDI、Zeta电位均符合要求，性能最佳，因此本发明所述表面活性剂为吐温80、PVP、SDS、 SCH、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407中的一种或几种的混合，优选泊洛沙姆188或泊洛沙姆407中的一种或两种的混合。

表1 不同表面活性剂的纳米混悬剂的粒径、PDI及Zeta 电位

在确定表面活性剂的成分后，我们还发现表面活性剂用量太少，药物颗粒无法被润湿而纳米化；表面活性剂用量太多时，并不能显著提高纳米混悬剂的稳定性，甚至反而会更差。另外，还要考虑表面活性剂用量过高引起的毒性问题。以泊洛沙姆P188为例，表2示出了不同用量的表面活性剂所制备的纳米混悬剂的粒径、PDI及Zeta电位，试验结果表明，当药物与表面活性剂的比例低于1:0.1或大于1:10时，样品粒径偏大；当药物与表面活性剂重量比为1:0.1 ~ 1:10，样品粒径在200nm左右，PDI在0.15左右，其粒径分布更窄，更均匀，因此，优选药物与表面活性剂重量比为1:0.1 ~ 1:10，且当药物与表面活性剂质量比为1：1，性质最佳。

表2 不同用量的表面活性剂所制备的纳米混悬剂的粒径、PDI及Zeta 电位

本发明制备的纳米混悬剂，通过静脉给药，可以达到与有机溶液共溶剂同等的生物利用度如图5所示，因此可以将其制成注射剂。

进一步的，本发明所述的纳米混悬剂还可以加入冻干支架剂冷冻干燥后制成冻干粉，所述以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂与冻干支架剂的重量比为1:25 ~ 1:175，所述冻干支架剂为蔗糖、果糖、葡萄糖、海藻糖或甘露醇中的一种或任意两种混合物。冻干粉加入水后给药，或将冻干粉制成其它固体制剂，如胶囊、普通片剂、缓控释制剂等。冻干粉具有良好的长期稳定性，且有利于药物长期储存和运输。

本发明所述的纳米混悬剂的制备方法，包括球磨法和高压均质法两种；

方法一：球磨法，包括如下步骤：

a. 将表面活性剂分散在三蒸水中，磁力搅拌使其充分溶解；

b. 将以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂、研磨介质加入表面活性剂溶液中，其中研磨介质是不同粒径的混合玻璃珠或氧化锆珠；

c. 1000-1500rpm研磨24h制得纳米混悬剂。

方法二：高压均质法，包括如下步骤：

a. 将表面活性剂分散在三蒸水中，磁力搅拌使其充分溶解；

b、将以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂加入表面活性剂溶液中，循环通过高压均质机的狭缝，制得纳米混悬剂；其中高压均质机进行均质，在压力为400-600 bar下循环6-10次，压力800-1200bar下循环3-5次，压力1200-1800bar下循环10-15次。

本发明所述的纳米混悬剂的评价结果如下：

1、拍摄SNX-2112、Xbj-B11纳米混悬剂的扫描电镜照片

将本发明所制得的SNX-2112、Xbj-B11纳米混悬剂以适量三蒸水稀释后，滴加在铜网样品台上，干燥。透射电子显微镜下观察药物纳米结晶形貌，结果分别见图1和图6。图1、图6显示，本发明制得的SNX-2112、Xbj-B11纳米混悬剂颗粒大小均匀，呈不规则针状晶型。

2、测定SNX-2112、Xbj-B11、Xbj-B16纳米混悬剂的粒径和zeta电位

将本发明制得SNX-2112、Xbj-B11、Xbj-B16纳米混悬剂以适量三蒸水稀释后，用Malvern ZetasizerNano ZS纳米粒度仪测定粒径大小及其分布，结果分别见图2-3、图7-8、图9-10。结果表明本发明所制得的SNX-2112、Xbj-B11、Xbj-B16纳米混悬剂粒径在200 nm左右，多分散性系数PDI为0.15，粒径分布范围较窄，体系zeta电位为-10 ~ -20 mV。

本发明的优点在于：

1）本发明通过表面活性剂的筛选及药物与表面活性剂的用量关系的确定，制备得到的BA-Hsp90纳米混悬剂具有含药量高，辅料用量小，稳定性好，溶出速率稳定等特性，适用于多种给药途径（尤其可注射用），很好的解决了该类化合物水溶性差，给药困难，生物利用度低，毒副作用强等缺点，实现了该领域内的技术突破，首次为该类Hsp90抑制剂提供了一种可增加药物含量、生物利用度高、并具有被动靶向的给药新剂型，以加速其临床应用的进程。

2）本发明无需采用任何有机溶剂，产品可以制成口服制剂及注射剂，不用考虑有机溶剂残留，且有效避免了溶剂残留带来的副作用；工艺过程简单，易于放大工业化生产，具有较大的实用价值。

附图说明

图1为SNX-2112纳米混悬剂的扫描电镜照片。

图2为SNX-2112纳米混悬剂的粒径分布图。

图3为SNX-2112纳米混悬剂的zeta电位分布图。

图4为SNX-2112纳米混悬剂与原料药及共溶剂溶解的溶液的释放曲线。

图5为SNX-2112纳米混悬剂与共溶剂在大鼠体内的血药浓度-时间曲线图。

图6为Xbj-B11纳米混悬剂的扫描电镜照片。

图7为Xbj-B11纳米混悬剂的粒径分布图。

图8为Xbj-B11纳米混悬剂的zeta电位分布图。

图9为Xbj-B16纳米混悬剂的粒径分布图。

图10为Xbj-B16纳米混悬剂的zeta电位分布图。

图11为Xbj-B16纳米混悬剂与原料药及共溶剂溶解的溶液的释放曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例 1

称取泊洛沙姆188 0.5g，加入50 ml三蒸水中，微温加热并磁力搅拌使其充分溶解；加入SNX-2112原料药0.5g，并加入湿磨介质（其中研磨介质是不同粒径的混合玻璃珠或氧化锆珠）；高速度湿磨24 h，得到乳白色纳米混悬剂，测粒径为202 nm，zeta电位为-11.6mV。

实施例 2

称取吐温800.5 g，加入50 ml三蒸水中，微温加热并磁力搅拌使其充分溶解；加入Xbj-B11原料药0.5 g，循环通过高压均质机的狭缝，制得纳米混悬剂。用高压均质机进行均质，在压力500 bar的条件下，循环10次，1000bar循环5次，1500bar循环5次，均质过程中维持温度在25 °C以下，得到乳白色纳米混悬剂，测粒径为216 nm，zeta电位为-21.2mV。

实施例 3

称取SDS0.05 g，加入50 ml三蒸水中，微温加热并磁力搅拌使其充分溶解；加入Xbj-B16原料药0.5 g，并加入湿磨介质（其中研磨介质是不同粒径的混合玻璃珠或氧化锆珠）；高速度湿磨24 h，得到乳白色纳米混悬剂，测粒径为190 nm，zeta电位为-35.4mV。

实施例 4

称取SCH 0.1 g，加入50 ml三蒸水中，微温加热并磁力搅拌使其充分溶解；加入SNX-2112原料药1 g，循环通过高压均质机的狭缝，制得纳米混悬剂。用高压均质机进行均质，压力500 bar循环3次，1000 bar循环5次，压力1500 bar 10次，均质过程中维持温度在25 °C以下，得到乳白色纳米混悬剂，测粒径为159 nm，zeta电位为-30.9mV。

实施例 5

将实施例1-4所制备纳米混悬剂样品于分装5 ml与15 ml西林瓶中，加入75 mg甘露醇，在-80°C预冻6小时后置于冷冻干燥机内冻干24 小时，得到疏松冻干样品粉末，用三蒸水可以迅速复溶，粒径增大约10%。

实施例 6

实施例1的纳米混悬剂与SNX-2112原料药及复合有机试剂溶解的溶液进行溶出度对比实验，溶出度实验方法：

取SNX-2112原料药5mg，用1ml水分散；

5mg原料药用1ml共溶剂溶解（共溶剂溶媒为50%丙二醇/水体系）；

实施例1的纳米混悬剂适量（含SNX-2112 5mg）各六份，按照药典中的“桨法”进行测定，溶出介质为含0.2%吐温80的磷酸缓冲液（PBS，pH=7.4）900ml，转速为100r/min，水温为37±0.5°C。分别在15、30、45、60、90、120、240、360、480、600min时吸取5ml液体立即经0.45mm滤膜过滤，同时补充等量新鲜介质，试样经含量测定后计算不同时间的累积溶出度。结果见图4所示，图4显示本发明所制得的SNX-2112纳米混悬剂溶出速率和溶出度明显高于SNX-2112原料药；且和共溶剂溶解的SNX-2112溶液相当。

实施例 7

采用实施例1制备的纳米混悬剂组、SNX-2112原料药5mg用1ml共溶剂溶解（共溶剂溶媒为50%丙二醇/水体系），共溶剂组和纳米混悬剂组均以2mg/kg颈静脉给药，每组雄性健康SD大鼠6只，给药前一天下午做颈静脉插管手术（给药及取血用）。给药后10min，20min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，12h，18h取血，用肝素浸润过的离心管放置血样，5000rpm/min离心5min，取血浆，-80度保存直至分析。采用UPLC-MS/MS分析血浆样品中药物含量。结果如图5所示。

图5所示的血药浓度-时间曲线显示共溶剂组和纳米混悬剂组静脉给药后均表现出明显的分布相。在10min以后，纳米混悬剂组与共溶剂组血药浓度没有显著性差异，表现出高度一致。曲线下面积AUC表明该纳米混悬剂与共溶剂溶液剂无生物利用度差别。

实施例 8

实施例3的纳米混悬剂与及复合有机试剂溶解的溶液进行溶出度对比实验，溶出度实验方法：

5mg原料药用1ml共溶剂溶解（共溶剂溶媒为50%丙二醇/水体系）；

实施例3的纳米混悬剂适量（含Xbj-B16 5mg）各六份，按照药典中的“桨法”进行测定，溶出介质为含0.2%吐温80的磷酸缓冲液（PBS，pH=7.4）900ml，转速为100r/min，水温为37±0.5°C。分别在15、30、45、60、90、120、240、360、480、600min时吸取5ml液体立即经0.45mm滤膜过滤，同时补充等量新鲜介质，试样经含量测定后计算不同时间的累积溶出度。结果见图11所示，图11显示本发明所制得的Xbj-B16纳米混悬剂溶出速率和溶出度和共溶剂溶解的Xbj-B16溶液相当。

Claims (8)

1.一种以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂的纳米混悬剂，其特征在于，含有以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂和表面活性剂，以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂与表面活性剂的重量比为1:0.1~1:10；所述以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂为SNX-2112、Xbj-B11或Xbj-B16；所述表面活性剂为吐温80、聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基硫酸钠、胆酸钠、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407中的一种或几种的混合。

2.根据权利要求1所述的纳米混悬剂，其特征在于，所述以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂与表面活性剂的重量比为1：1。

3.根据权利要求1所述的纳米混悬剂，其特征在于，所述表面活性剂为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407中一种或两种的混合。

4.根据权利要求1所述的纳米混悬剂，其特征在于，还含有冻干支架剂。

5.根据权利要求4所述的纳米混悬剂，其特征在于，所述以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂与冻干支架剂的重量比为1:25~1:175。

6.根据权利要求4所述的纳米混悬剂，其特征在于，所述冻干支架剂为蔗糖、果糖、葡萄糖、海藻糖或甘露醇中的一种或任意两种混合物。

7.根据权利要求1-6任一项所述的纳米混悬剂，其特征在于，所述纳米混悬剂的粒径范围为150-260nm。

8.权利要求1-6任一项所述的纳米混悬剂的制备方法，其特征在于，包括如下两种方法

之一：

方法一：

a. 将表面活性剂分散在三蒸水中，磁力搅拌使其充分溶解；

b. 将以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂、研磨介质加入表面活性剂溶液中，其中研磨介质是不同粒径的混合玻璃珠或氧化锆珠；

c. 1000-1500rpm研磨24h制得纳米混悬剂;

或方法二：

a. 将表面活性剂分散在三蒸水中，磁力搅拌使其充分溶解；

b. 将以苯甲酰胺为基本骨架的Hsp90抑制剂加入表面活性剂溶液中，循环通过高压均质机的狭缝，制得纳米混悬剂；其中高压均质机进行均质，在压力为400-600 bar下循环6-10次，压力800-1200bar下循环3-5次，压力1200-1800bar下循环10-15次。