CN102203248A

CN102203248A - 鞣酸酶、编码其的基因及其制造法

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Publication number: CN102203248A
Application number: CN2009801421791A
Authority: CN
Inventors: 中川惠美; 松本直树; 天野仁; 山口庄太郎
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2009-10-02
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2029-10-02
Also published as: CN102203248B; JPWO2010047047A1; US20110195155A1; WO2010047047A1; EP2363466B1; DK2363466T3; US8911984B2; US20140093939A1; JP5719173B2; US8617865B2; EP2363466A1; EP2363466A4

Abstract

本发明的课题在于提供微生物来源的耐热性鞣酸酶。提供泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或黑曲霉(Aspergillus niger)来源的耐热性鞣酸酶。优选的一个方式的鞣酸酶具有下述酶化学性质：(1)作用：作用于缩酚酸键而进行水解；(2)分子量：约23万Da(通过凝胶过滤产生)；(3)温度稳定性：直到65℃都稳定(pH5.0、30分钟)。

Description

鞣酸酶、编码其的基因及其制造法

技术领域

本发明涉及曲霉菌(Aspergillus)属微生物产生的新型鞣酸酶。具体涉及曲霉菌(Aspergillus)属产生的耐热性优异的鞣酸酶、编码其的基因、其制造方法及其用途等。

背景技术

鞣酸酶(鞣酸酰基水解酶、EC3.1.1.20)是水解鞣酸类的缩酚酸键的酶。在食品工业中，可用于防止茶类饮料的冷后浑(Cream down)、防止果汁饮料的沉淀、啤酒的澄清化等。

到目前为止，报道了许多由于细菌、酵母和丝状真菌导致的鞣酸酶的产生(非专利文献1)。丝状真菌中关于曲霉菌(Aspergillus)属和青霉菌(Penicillium)属的报道较多。对于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)来源的鞣酸酶，已经清楚了其酶化学的性质、氨基酸序列和编码其的基因(参照专利文献1、2、非专利文献2)。

专利文献1中记载的鞣酸酶的最适pH范围在5.0～5.5附近的弱酸性、最适温度范围在40℃附近，在超过60℃的高温下10分钟之内就失活。因此，在工业利用时，就形成了在特别限定的条件下的反应。专利文献2中记载的鞣酸酶的热稳定性优异，柠檬酸缓冲液(pH5.5)中，65℃10分处理后的残留活性在80％以上、最适温度范围为60～80℃，克服了专利文献1中记载的鞣酸酶的缺点，但只报道了在重组体中的生产，未确认非重组体中的生产。因此，在食品产业中利用时，按照“利用基因重组微生物制造的添加物的安全性评价基准”(非专利文献3)的安全性确认是必需的。此外，在日本，对基因重组食品的排斥性也根深蒂固。因此，还不能说可在食品产业中直接利用。

另一方面，也有关于最适温度在60℃以上的热稳定性优异的鞣酸酶的报道(参照非专利文献4、5)。但是，只是确认了存在这些鞣酸酶，但其氨基酸序列和编码其的基因、酶科学性质等还没弄清楚，无法实现实用化。

专利文献

专利文献1：特开平8-80196

专利文献2：特开2003-250588

非专利文献

非专利文献1：Appl.Microbiol.Biotechnol.，Vol.76，p.47-59，2007

非专利文献2：Gene，Vol.175，p.215-221，1996

非专利文献3：食品安全委员会“利用基因重组微生物制造的添加物的安全性评价基准”平成16年3月25日决定

非专利文献4：Microbiology，Vol.149，p.2941-2946，2003

非专利文献5：Process Biochemistry，Vol.40(5)，April 2005，p.1553-1557，2005

发明内容

本发明的目的在于提供来源于自然界中存在的微生物的、耐热性优异的鞣酸酶。而且，目的还在于提供该鞣酸酶的基因、制造方法、用途等。本发明人为了解决上述问题进行了积极的研究。其结果是，在黑曲霉(Aspergillus niger)的3个菌株和泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的2个菌株总共5个菌株中确认产生了耐热性高的鞣酸酶。进而继续进行研究，成功分离了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)NBRC-4033(IFO-4033)产生的鞣酸酶，确定了其酶化学性质。此外，还成功鉴定了该鞣酸酶的氨基酸序列和编码该鞣酸酶的基因的碱基序列。将酶化学的性质和氨基酸序列与已经报道的鞣酸酶进行了比较，结果确认了成功获得并鉴定的鞣酸酶是新型酶。

本发明基于上述成果而完成，内容如下。

[1]一种鞣酸酶，来源于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或黑曲霉(Aspergillus niger)，对于65℃的热处理(pH5.0、30分钟)具有耐性。

[2]一种鞣酸酶，具有下述酶化学性质：

(1)作用：作用于缩酚酸键而进行水解；

(2)分子量：约23万Da(通过凝胶过滤测定)；

(3)温度稳定性：直到65℃都稳定(pH5.0、30分钟)。

[3]根据[2]所述的鞣酸酶，还具有下述酶化学性质：

(4)最适温度：约70℃；

(5)最适pH：约5.5；

(6)pH稳定性：在pH3～8的范围稳定(30℃、30分钟)

(7)底物特异性：良好地作用于鞣酸，作用于没食子酸酯。

[4]根据[2]或[3]所述的鞣酸酶，来源于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。

[5]一种鞣酸酶，具有序列号5所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列等价的氨基酸序列。

[6]根据[5]所述的鞣酸酶，所述等价的氨基酸序列是与序列号5所示的氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列。

[7]一种酶剂，以[1]～[6]中任一项所述的鞣酸酶为有效成分。

[8]一种鞣酸酶基因，由选自以下(A)～(C)中的任一项的DNA构成：

(A)编码序列号5所示的氨基酸序列的DNA；

(B)由序列号4所示的碱基序列构成的DNA；

(C)具有与序列号4所示的碱基序列等价的碱基序列，且编码具有鞣酸酶活性的蛋白质的DNA。

[9]一种重组载体，含有[8]所述的鞣酸酶基因。

[10]一种转化体，导入有[8]所述的鞣酸酶基因。

[11]一种鞣酸酶的制造方法，其特征在于，包含以下的步骤(1)和(2)，或包含以下的步骤(i)和(ii)：

(1)培养选自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和黑曲霉(Aspergillus niger)中的微生物的步骤，

(2)从培养后的培养液和/或菌体回收鞣酸酶的步骤；

(i)在产生前述基因编码的蛋白质的条件下培养[10]所述的转化体的步骤，

(ii)回收产生的前述蛋白质的步骤。

[12]根据[11]所述的鞣酸酶的制造方法，所述微生物是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)NBRC-4033(IFO-4033)。

[13]一种水解法，其特征在于，使[1]～[6]中任一项所述的鞣酸酶、[7]所述的酶剂、或用[11]或[12]所述的制造方法获得的鞣酸酶作用于鞣酸或含有鞣酸的组合物。

附图说明

[图1]是表示泡盛曲霉(Aspergillus awamori)来源的鞣酸酶的最适温度的图。

[图2]是表示泡盛曲霉(Aspergillus awamori)来源的鞣酸酶的最适pH的图。●：柠檬酸缓冲液pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。□：磷酸缓冲液pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

[图3]是表示泡盛曲霉(Aspergillus awamori)来源的鞣酸酶的温度稳定性的图。

[图4]是表示泡盛曲霉(Aspergillus awamori)来源的鞣酸酶的pH稳定性的图。●：柠檬酸缓冲液pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。□：磷酸缓冲液pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

[图5]表达质粒pTALC-TAN的结构。

具体实施方式

(用语)

本发明中所谓“编码蛋白质的DNA”，是指使其表达时可以获得该蛋白质的DNA，即，具有与该蛋白质的氨基酸序列对应的碱基序列的DNA。因此，也考虑了密码子的简并性。

本说明书中的用语“分离的”可以与“纯化的”交换使用。与本发明的酶(鞣酸酶)相关使用时的所谓“分离的”，是指本发明的酶是来源于天然材料时，该天然材料中实质上不含该酶以外的成分(尤其是实质上不含杂质蛋白质)的状态。具体而言，例如，本发明的分离的酶中，杂质蛋白质的含量按重量换算不到整体的约20％，优选不到约10％，更优选不到约5％，更为优选不到约1％。另一方面，本发明的酶按照基因工程方法制备时的用语“分离的”是指实质上不含使用的宿主细胞来源的其它成分和培养液等。具体而言，例如，本发明的分离的酶中，杂质蛋白质的含量按重量换算不到整体的约20％，优选不到约10％，更优选不到约5％，更为优选不到约1％。而且，只要不明确表明与其有不同的含义，本说明书中仅记载“鞣酸酶”时是指“分离状态的鞣酸酶”。代替鞣酸酶而使用的用语“本酶”也是一样。

关于DNA使用时的“分离的”，是指原本天然存在的DNA的情况，典型的是，从天然状态下共存的其它核酸分离的状态。但是，还可以含有天然状态下邻接的核酸序列(例如启动子区域的序列或终止子序列等)等一部分其它核酸成分。例如，基因组DNA情况的“分离的”状态下，优选实质上不含有天然状态下共存的其它DNA成分。另一方面，cDNA分子等通过基因工程方法制备的DNA情况中的“分离的”状态下，优选实质上不含细胞成分和培养液等。同样，通过化学合成制备DNA时的“分离的”状态下，优选实质上不含dNTP等前体(原材料)和合成过程中使用的化学物质等。而且，只要不明确表明与其有不同的含义，本说明书中仅记载“DNA”时是指“分离状态的DNA”。

(鞣酸酶及其生产菌)

本发明的第1方面是提供鞣酸酶(以下，也称为“本酶”)及其生产菌。如后述的实施例所示，本发明人进行了积极的研究，结果发现泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和黑曲霉(Aspergillus niger)产生对65℃的热处理有耐性的耐热性鞣酸酶。而且，进行了进一步研究，成功实现了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)来源的鞣酸酶的分离和纯化，并且，如下所示，成功确定了其酶化学性质。

(1)作用

本酶是鞣酸酶，作用于缩酚酸键而进行水解。

(2)分子量

本酶通过凝胶过滤，显示出约23万Da的分子量。SDS-PAGE中显示9～10万Da的分子量。本酶具有糖链，用内切糖苷酶H(EndoH)处理显示出分子量的显著减少。

(3)温度稳定性

本酶即使在50mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)中、65℃的条件下进行30分钟处理，也可维持90％以上的活性。

(4)最适温度

本酶的最适温度为约70℃。本酶在约60℃～约70℃下显示高活性。最适温度是用后述的鞣酸酶活性测定方法(50mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)中)进行的测定计算的值。

(5)最适pH

本酶的最适pH为约5.5。本酶在pH约5.0～约6.0下呈现高活性。最适pH，例如，对于pH3～6的pH域，是基于在柠檬酸缓冲液中测定的结果而判断的，对于pH 6～8，是基于在磷酸缓冲液中测定的结果而判断的。

(6)pH稳定性

本酶在pH 3～8这样宽的pH域内显示稳定的活性。即，如果提供给处理的酶溶液的pH如果在此范围内，在30℃、30分钟的处理后，呈现最大活性的80％以上的活性。pH稳定性，例如，对于pH 3～6的pH域，是基于在柠檬酸缓冲液中测定的结果而判断的，对于pH 6～8，是基于在磷酸缓冲液中测定的结果而判断的。

(7)底物特异性

本酶良好地作用于鞣酸。也作用于没食子酸酯(没食子酸甲酯、没食子酸乙酯等)。而且，本酶的反应性和底物特异性可以用后述的实施例所示的方法(鞣酸酶活性测定方法和底物特异性测定方法的栏)测定和评价。

本酶优选是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)来源的鞣酸酶。这里的所谓“泡盛曲霉(Aspergillus awamori)来源的鞣酸酶”是指，利用分类为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的微生物(可以是野生株，也可以是变异株)生产的鞣酸酶、或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(可以是野生株，也可以是变异株)的鞣酸酶基因，通过基因工程方法获得的鞣酸酶。因此，由导入了从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中获得的鞣酸酶基因(或改变了该基因的基因)的宿主微生物生产的重组体，也相当于“泡盛曲霉(Aspergillus awamori)来源的鞣酸酶”。

为了说明的方便，将本酶所来源的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)称为本酶的生产菌。

如上所述，已经弄清楚了成功获得的本酶的性状的详细情况。其结果判明了本酶的耐热性优异，pH稳定性优异。因此，本酶特别适于食品加工。

本发明人进行了进一步研究的结果是，确定了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的鞣酸酶的氨基酸序列(序列号5)。因此，本发明的一个方式，具备由具有序列号5的氨基酸序列的蛋白质构成这样的特征。这里，一般来说，存在对某个蛋白质的氨基酸序列的一部分进行改变时，改变后的蛋白质与改变前的蛋白质具有同等功能的情况。即，有时氨基酸序列的改变对蛋白质的功能没有实质影响，蛋白质的功能在改变前后得以维持。因此，本发明，作为其它方式，提供了由与序列号5所示的氨基酸序列等价的氨基酸序列构成，且具有鞣酸酶活性的蛋白质(以下，也称为“等价蛋白质”)。这里所谓的“等价的氨基酸序列”是指，与序列号5所示的氨基酸序列一部分有差异，但这种差异对蛋白质的功能(这里是鞣酸酶活性)没有实质影响的氨基酸序列。所谓“具有鞣酸酶活性”是指，作用于以鞣酸为代表的没食子酸酯、二没食子酸、五倍子鞣质(Gallotannin)、鞣花单宁(Ellagitannin)等具有缩酚酸键的分子进行水解的活性，但其活性的程度只要能够发挥作为鞣酸酶的功能就没有特别限定。但是，优选与由序列号5所示的氨基酸序列构成的蛋白质程度相同或比其更高。

所谓“氨基酸序列的一部分有差异”，典型的是指，通过构成氨基酸序列的1个～数个氨基酸缺失、取代、或1～数个氨基酸添加、插入、或它们的组合，氨基酸序列产生变异(变化)。这里的氨基酸序列的差异只要保持鞣酸酶活性，就是可以允许的(活性也可以有少许变化)。只要满足该条件，氨基酸序列差异的位置就没有特别限定，还可以在多个位置产生差异。其中，所谓“多个”是指例如相当于小于全部氨基酸约30％的数目，优选相当于小于约20％的数目，更优选相当于小于约10％的数目，进一步优选相当于小于约5％的数目，最优选相当于小于约1％的数目。即等价蛋白质与序列号5的氨基酸序列具有例如约70％以上、优选约80％以上、更优选约90％以上、进一步优选约95％以上、最优选约99％以上的同一性。

优选，通过在不是鞣酸酶活性所必需的氨基酸残基上发生保守的氨基酸取代来获得等价蛋白质。这里所谓的“保守的氨基酸取代”，是指将某氨基酸残基取代成具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链被分类为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)这样的几个家族。保守的氨基酸取代优选是在同一家族内的氨基酸残基之间的取代。

“等价蛋白质”还可以有额外的性质。作为这种性质，可以列举，例如，稳定性比由序列号5所示的氨基酸序列构成的蛋白质更好这样的性质、仅在低温和/或高温下发挥不同的功能这样的性质、最适pH不同这样的性质等。

可是，两个氨基酸序列或二个核酸(以下，使用“两个序列”作为包括它们的用语)的同一性(％)例如可以按照以下方法确定。首先，以能够进行最佳比较的方式排列两个序列(例如，可以通过在第一序列中导入空位使得与第二序列的比对最优化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列中的相应位置的分子相同时，即称该位置的分子是相同的。两个序列的同一性是在这两个序列中共通的相同位置的数目的函数(即、同一性(％)＝相同位置的数目/位置的总数×100)，优选也将比对的最优化所需要的空位数目和大小考虑在内。

两个序列的比较和同一性的确定可以使用数学算法来实现。作为可以用于序列比较的数学算法的具体例子，有在Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68中记载的、在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中改变的算法，但并不限于此。这样的算法被整合到Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中记载的NBLAST程序和XBLAST程序(2.0版本)中。为了得到与本发明的核酸分子等价的核苷酸序列，可以例如用NBLAST程序、设score＝100、wordlength＝12进行BLAST核苷酸检索。为了获得与本发明的多肽分子等价的氨基酸序列，可以例如用XBLAST程序、设score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索。为了得到用于比较的空位比对，可以利用Altschul等人(1997)Amino Acids Research 25(17)：3389-3402中记载的Gapped BLAST。利用BLAST和Gapped BLAST时，可以使用对应的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。详细而言，请参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov。作为能够用于序列比较的其他数学算法的例子，有Myers和Miller(1988)Comput Appl Biosci.4：11-17中记载的算法。这样的算法被整合到例如可以在GENESTREAM网站服务器(IGH Montpellier、法国)或ISREC服务器中利用的ALIGN程序中。氨基酸序列的比较中使用ALIGN程序时，例如，可以使用PAM120残基质量表，设空位长度罚分＝12、空位罚分＝4。

可以使用GCG软件包的GAP程序、使用Blossom 62Matrix或PAM250Matrix，设空位权重＝12、10、8、6、或4、空位长度权重＝2、3、或4来确定两个氨基酸序列的同一性。此外，可以使用GCG软件包(可以利用http://www.gcg.com)的GAP程序，设空位权重＝50、空位长度权重＝3来确定两个核酸序列的相同度。

本酶也可以是更大的蛋白质(例如融合蛋白质)的一部分。作为在融合蛋白质中添加的序列，可以列举例如，多重组氨酸残基这种有助于纯化的序列、确保重组生产时的稳定性的添加序列等。

具有上述氨基酸序列的本酶可以通过基因工学方法容易地制备。例如，可以通过用编码本酶的DNA转化适当的宿主细胞(例如大肠杆菌)，回收转化体内表达的蛋白质来制备。回收的蛋白质根据目的适当纯化。如果获得了作为这样的重组蛋白质的本酶，可以进行各种修饰。例如，如果编码本酶的DNA与其它适当的DNA插入到相同的载体中，用该载体进行重组蛋白质的生产，可以获得由连接了任意肽或蛋白质的重组蛋白质构成的本酶。此外，还可以实施产生糖链和/或脂质的添加或N末端或C末端的加工的这样的修饰。通过以上这样的修饰，可以进行重组蛋白质的提取，简化纯化、或添加生物学功能等。

(编码鞣酸酶的DNA)

本发明的第2方面提供了编码本酶的基因、即新的鞣酸酶基因。在一个方式中，本发明的基因由编码序列号5的氨基酸序列的DNA构成。该方式的具体例子是由序列号4所示的碱基序列构成的DNA。

可是，一般来说，对编码某蛋白质的DNA的一部分实施改变时，改变后的DNA所编码的蛋白质有时与改变前的DNA编码的蛋白质具有同等的功能。即，有时DNA序列的改变对编码的蛋白质的功能没有实质性影响，编码的蛋白质的功能在改变前后得到维持。因此，本发明，作为其它方式，提供了具有与序列号4所示的碱基序列等价的碱基序列，且编码具有鞣酸酶活性的蛋白质的DNA(以下，也称为“等价DNA”)。这里的所谓“等价的碱基序列”是指与序列号4所示的核酸有部分差异，但其编码的蛋白质的功能(这里指鞣酸酶活性)实质不受这种差异影响的碱基序列。

等价DNA的具体例子，是与序列号4所示的碱基序列的互补碱基序列在严紧条件下杂交的DNA。这里所谓的“严紧条件”是指形成所谓的特异性杂交，不形成非特异性杂交的条件。这样的严紧条件可以参照本领域技术人员公知的例如分子克隆(第3版，冷泉港实验室出版，纽约)或Current protocols in molecular biology(由Frederick M.Ausubel等人编辑，1987)进行设定。作为严紧条件，可以列举例如使用杂交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约42℃～约50℃下温育，然后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃～约70℃下进行清洗的条件。作为更优选的严紧条件，可以列举例如使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))作为杂交液的条件。

作为等价DNA的其它的具体例子，可以列举以序列号4所示的碱基序列为基础的含有1个或多个碱基的取代、缺失、插入、添加、或倒位的碱基序列构成，且编码具有鞣酸酶活性的蛋白质的DNA。碱基的取代或缺失等也可以在多个部位发生。这里的所谓“多个”是指根据该DNA所编码的蛋白质的立体构造中的氨基酸残基的位置、种类的不同而不同，例如是2～40个碱基、优选2～20个碱基、更优选2～10个碱基。以上这样的等价DNA可以利用通过例如限制性酶处理、采用核酸外切酶或DNA连接酶等进行的处理、定点突变导入法(分子克隆，第3版，第13章，冷泉港实验室出版，纽约)或随机突变导入法(分子克隆，第3版，第13章，冷泉港实验室出版，纽约)进行的变异的导入等，通过改变具有序列号4所示的碱基序列的DNA以便其含有碱基的取代、缺失、插入、付加、和/或倒位而获得。而且，通过紫外线照射等其他方法也可以得到等价DNA。作为等价DNA的另外的例子，可以列举确认了由SNP(单核苷酸多态)作为代表的多态引起的上述这样的碱基差异的DNA。

本发明的基因可以参考本说明书或附带的序列表公开的序列信息，使用标准的基因工程法、分子生物学方法、生物化学方法等，制备成分离的状态。具体的是，可以从适当的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的基因组DNA文库或cDNA文库、或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的菌体内提取液中，适当利用可以与本发明的基因特异性杂交的寡核苷酸探针、引物来制备。寡核苷酸探针、引物可以使用市售的自动化DNA合成装置等容易地合成。而且，用于制备本发明基因而使用的文库的制作方法可以参照例如分子克隆，第3版，冷泉港实验室出版，纽约。

例如，如果是具有序列号4所示的碱基序列的基因，可以利用以该碱基序列或其互补序列的整体或其一部分作为探针的杂交法进行分离。此外，可以利用使用被设计成与该碱基序列的一部分特异性杂交的合成寡核苷酸引物的核酸扩增反应(例如PCR)，进行扩增和分离。此外，还可以基于序列号5所示的氨基酸序列或序列号4所示的碱基序列的信息，通过化学合成，得到目的基因(参考文献：Gene，60(1)，115-127(1987))。

以下，公开本发明的基因的获得方法的具体例子。首先，从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中分离并纯化本酶(鞣酸酶)，获得与该部分氨基酸序列相关的信息。作为部分氨基酸序列测定方法，例如，将纯化的鞣酸酶，直接按照常规方法提供给通过Edman分解法〔Journal of Biological Chemistry、第256卷、第7990～7997页(1981)〕进行的氨基酸序列分析〔Protein-sequencer 476A、Applied Biosystems公司制等〕。使蛋白质水解酶作用进行限制性水解，分离纯化所获得的肽片段，对获得的纯化肽片段进行氨基酸序列分析是有效的。

基于这样获得的部分氨基酸序列的信息，克隆鞣酸酶基因。例如，可以利用杂交法或PCR，进行克隆。在利用杂交法时，还可以使用例如，分子克隆(第3版，冷泉港实验室出版，纽约)中记载的方法。

在利用PCR法时，可以使用以下的方法。首先，以产生鞣酸酶的微生物的基因组DNA作为模板，使用基于部分氨基酸序列的信息设计的合成寡核苷酸引物，进行PCR反应，获得目的基因片段。PCR法按照PCRTechnology[PCR Technology，Erlich HA编辑、Stocktonpress公司、1989年发行]中记载的方法进行。进而，就该扩增DNA片段而言，如果用通常使用的方法、例如、双脱氧链终止法测定其碱基序列，测定的序列中除了合成寡核苷酸引物的序列以外，还发现有与鞣酸酶的部分氨基酸序列对应的序列，可以获得目的鞣酸酶基因的一部分。通过以获得的基因片段作为探针，再进行杂交法等，可以克隆编码全长鞣酸酶的基因。

在后述的实施例中，利用PCR法测定编码泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的鞣酸酶的基因的序列。编码泡盛曲霉(Aspergillus awamori)来源的鞣酸酶的基因的全碱基序列示于序列号4。此外，测定了该碱基序列编码的氨基酸序列(序列号5)。而且，序列号5所示的氨基酸序列所对应的碱基序列除了序列号4所记载的之外，还存在多个。

通过使用已经清楚了全碱基序列的鞣酸酶基因(序列号4)的整体或其一部分作为杂交用探针，可以从其它产生鞣酸酶的微生物的基因组DNA文库或cDNA文库中选择出与序列号4的鞣酸酶基因具有高同源性的DNA。

同样，还可以设计PCR用的引物。通过使用该引物进行PCR反应，还可以检测出与上述鞣酸酶基因同源性高的基因片段，进而获得其完整基因。

通过制造获得的基因的蛋白质，测定其鞣酸酶活性，可以确认是否是编码具有鞣酸酶活性的蛋白质的基因。此外，还可以通过将获得的基因的碱基序列(或其编码的氨基酸序列)与上述鞣酸酶基因的碱基序列(或其编码的氨基酸序列)进行比较，研究基因结构和同源性，判断是否编码具有鞣酸酶活性的蛋白质。

由于弄清楚了一级结构和基因结构，因此通过随机变异或定点突变的导入可以获得改良型鞣酸酶(实施了1个或多个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代中的至少一个的基因)。因此，可以获得编码具有鞣酸酶活性，而最适温度、稳定温度、最适pH、稳定pH、底物特异性等性质不同的鞣酸酶的基因。此外，可以基因工程的方式制造改良型鞣酸酶。

这里，导入变异时的计划，例如，参考基因序列上的特征序列进行。特征序列的参考，可以通过例如，该蛋白质的立体结构预测、考虑与已知的蛋白质的同源性来进行。

如要要例示导入随机变异的方法，作为化学处理DNA的方法，是使亚硫酸氢钠作用，发生胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的转换型突变的方法〔Proceedings of the national academy of Sciences of the USA、第79卷、第1408～1412页(1982)〕、作为生物化学方法，是在〔α-S〕dNTP存在下，在合成双链的过程中发生碱基取代的方法〔Gene、第64卷、第313～319页(1988)〕、作为使用PCR的方法，是在反应系中加入锰进行PCR，减少核苷酸整合的正确性的方法〔Analytical Biochemistry、第224卷、第347～353页(1995)〕等。

如要例示导入定点突变的方法，利用琥珀型突变的方法〔gapped duplex法、Nucleic Acids Research、第12卷、第24号、第9441～9456页(1984)〕、利用限制性酶的识别部位的方法〔Analytical Biochemistry、第200卷、第81～88页(1992)、Gene、第102卷、第67～70页(1991)〕、利用dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶DNA糖基化酶)变异的方法〔Kunkel法、Proceedings of the national academy of Sciences of the USA、第82卷、第488～492页(1985)〕、利用使用DNA聚合酶和DNA连接酶的琥珀型突变的方法〔Oligonucleotide-directed Dual Amber：ODA法、Gene、第152卷、第271～275页(1995)、特开平7-289262号公报〕、利用使DNA的修复系统被诱导的宿主的方法(特开平8-70874号公报)、利用催化DNA链交换反应的蛋白质的方法(特开平8-140685号公报)、通过使用了添加了限制性酶的识别部位的2种变异引入用引物的PCR进行的方法(USP5,512,463)、通过使用具有失活耐药性基因的双链DNA载体和2种引物的PCR进行的方法〔Gene、第103卷、第73～77页(1991)〕、通过利用琥珀型突变的PCR进行的方法〔国际公开WO98/02535号公报〕等。

通过使用市售的试剂盒，也可以容易地导入定点突变。作为市售的试剂盒，可以使用例如，使用gapped duplex法的Mutan(注册商标)-G(TakaraBio公司)、使用Kunkel法的Mutan(注册商标)-K(TakaraBio公司)、使用ODA法的Mutan(注册商标)-ExpressKm(TakaraBio公司)、使用变异引入用引物和激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)来源的DNA聚合酶的QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit〔STRATAGENE公司〕等，而且，作为利用PCR法的试剂盒，可以使用TaKaRa LAPCR in vitro Mutagenesis Kit(TakaraBio公司)、Mutan(注册商标)-Super Express Km(TakaraBio公司)等。

这样，通过本发明提供鞣酸酶的一级结构和基因结构，就可以便宜地高纯度地以基因工程方式制造具有鞣酸酶活性的蛋白质。

(重组载体)

本发明的另一个方面涉及含有本发明基因的重组载体。本说明书中用语“载体”是指可以将插入其中的核酸分子输送到细胞等靶内的核酸性分子，其种类和形态没有特别限定。因此，本发明的载体可以形成质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体(腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体等)的形态。

根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，并考虑宿主细胞种类，选择适当的载体。如果要列举载体的具体例子，有以大肠杆菌作为宿主的载体(M13噬菌体或其变异体、λ噬菌体或其变异体、pBR322或其变异体(pB325、pAT153、pUC8等)等)、以酵母作为宿主的载体(pYepSec1、pMFa、pYES2等、以昆虫细胞作为宿主的载体(pAc、pVL等)、以哺乳类细胞作为宿主的载体(pCDM8、pMT2PC等)等。

本发明的重组载体优选是表达载体。所谓“表达载体”是指可以将插入于其中的核酸导入到目标细胞(宿主细胞)内、且在该细胞内能够使之表达的载体。表达载体通常含有所插入的核酸表达所必需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。还可以使用含有选择标记的表达载体。在使用所述表达载体时，可以利用选择标记确认表达载体是否导入(及其程度)。

本发明的基因向载体插入、选择标记基因的插入(必要时)、启动子的插入(必要时)等，可以使用标准的重组DNA技术(例如，可参照分子克隆，第3版，1.84，冷泉港实验室出版，纽约，使用限制性酶和DNA连接酶的公知方法)进行。

(转化体)

本发明还涉及导入了本发明基因的转化体。本发明的转化体中，本发明的基因作为外源性分子存在。本发明的转化体优先通过使用上述本发明的载体的转染或转化来制备。转染、转化可以通过磷酸钙共沈降法、电穿孔(Potter，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7161-7165(1984))、脂质法(Felgner，P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，7413-7417(1984))、显微注射(Graessmann，M.& Graessmann，A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73，366-370(1976))、Hanahan的方法(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.166，557-580(1983))、醋酸锂法(Schiestl，R.H.et al.，Curr.Genet.16，339-346(1989))、原生质体-聚乙二醇法(Yelton，M.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81，1470-1474(1984))等实施。

作为宿主细胞，可以使用微生物、动物细胞、植物细胞等。作为微生物，可以列举大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus)属、链霉菌(Streptomyces)属、乳球菌(Lactococcus)属等的细菌、酵母菌(Saccharomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母菌(Kluyveromyces)属等酵母、曲霉菌(Aspergillus)属、青霉菌(Penicillium)属、木霉菌(Trichoderma)属等丝状真菌。作为动物细胞，可以列举杆状病毒的系统。

(鞣酸酶的制造方法)

本发明的另一个方面提供鞣酸酶的制造方法。本发明的制造方法的一个方式中，进行培养选自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和黑曲霉(Aspergillus niger)中的微生物的步骤(步骤(1))和从培养后的培养液和/或菌体中回收鞣酸酶的步骤(步骤(2))。如后述的实施例所示，根据本发明人的研究发现泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(表3的No.1725、NBRC-4033)、黑曲霉(Aspergillus niger)(表3的No.1332、No.1349、No.1363)是产生耐热性优异的鞣酸酶的菌株。本发明的制造方法，优先使用这些微生物中的任一种实施步骤(1)。更优选的是，使用高生产耐热性优异的鞣酸酶的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)NBRC-4033(IFO-4033)实施步骤(1)。培养法和培养条件只要是产生目的酶的，就没有特别限定。即，作为生产本酶的条件，可以适当设定适于使用的微生物的培养的方法和培养条件。作为培养法，可以是液体培养、固体培养中的任意一种，但优选利用液体培养。以液体培养为例来说明其培养条件。

作为培养基，只要是使用的微生物可以生长的培养基，就可以是任意一种。例如，可以使用添加了葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源，以及硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、醋酸铵、或蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麸子、肉提取物等氮源，以及钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。为了促进使用的微生物的生长，还可以在培养基中添加维生素、氨基酸等。而且，为了诱导鞣酸酶的生产，还可以在培养基中添加鞣酸。培养基的pH调整到例如，约3～10，优选约5～6左右，培养温度通常在约10～50℃，优先在约27～33℃左右，在1～7天，优选3～4天左右的需氧条件下培养。作为培养法，可以利用例如振荡培养法、用罐式发酵罐进行的需氧的深部培养法。

在以上条件下培养后，从培养液或菌体中回收鞣酸酶(步骤(2))。在从培养液中回收时，通过例如对培养上清进行过滤、离心处理等除去不溶物后，适当组合通过超滤膜进行的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、离子交换树脂等各种层析等，进行分离和纯化，获得本酶。

另一方面，在从菌体内回收时，例如，可以在通过加压处理、超音波处理等破碎菌体后，与上述方式一样，进行分离和纯化，获得本酶。而且，可以在通过过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、纯化)。本酶的纯化度没有特别限定。而且，最终形态既可以是液体状也可以是固体状(包括粉体状)。而且，表达的确认或表达产物的确认，简便的是使用针对鞣酸酶的抗体进行，但也可以通过测定鞣酸酶活性进行表达的确认。

在本发明的其它方式中，使用上述转化体制造鞣酸酶。该方式的制造方法中，首先，在其中导入的基因编码的蛋白质产生的条件下培养上述转化体(步骤(i))。各种载体宿主系统相关的转化体的培养条件是公知的，如果是本领域技术人员，就可以容易地设定适当的培养条件。在培养步骤之后，回收产生的蛋白质(即、鞣酸酶)(步骤(ii))。回收和其后的纯化，也可以与上述方式的情况一样进行。

(酶剂)

本酶以例如酶剂的形态提供。酶剂除了有效成分(本发明的酶)之外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理食盐水等。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露糖醇、白糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对氧基苯甲酸、三氯叔丁醇等。

(鞣酸酶的用途)

本发明的另一个方面提供，使用本酶(或含有本酶的酶剂)的水解法作为本酶的用途。本发明的水解法中，使本酶(或含有本酶的酶剂)作用于鞣酸或含有鞣酸的组合物。本发明的水解法对于含有鞣酸的食品的品质改善是有效的。例如，可用于防止茶类饮料的冷后浑(Cream down)、防止果汁饮料或蔬菜饮料或啤酒类饮料等的沉淀或浑浊。这里所谓的“茶类饮料”，是含有茶叶或茶叶以外的植物的提取成分的饮料。茶类饮料的例子，是绿茶、红茶、乌龙茶、杜仲茶、草药茶等。所谓“果汁饮料”是用通过果实榨汁等方式获得的果汁制造的饮料。同样，所谓“蔬菜饮料”，是使用蔬菜汁制造的饮料。“啤酒类饮料”中包括啤酒、发泡酒、和具有类似于啤酒的风味·口感的酒精饮料(酒税上，被分类为其它杂类·利口酒类，所谓的第3啤酒等)。而且，本发明的水解法的作为适用对象的饮料不限于上述例子。例如，在加入果汁的茶类饮料、使用果汁和蔬菜汁的蔬菜水果饮料等的品质改善中也可以使用本发明的水解法。

如上所述的本酶稳定作用的pH域很广。即，本酶在pH3.0～8.0下稳定，可以在弱酸性和中性域的食品等中使用。茶类饮料的pH处于中性域，果汁饮料pH处于弱酸性域，但本酶对二者都有良好的作用。另一方面，本酶由于其最适温度是60～70℃，例如，还可以在从茶叶中加热提取的同时进行反应。而且，本酶，可以响应“根据防腐的观点来说，在高温下的反应是理想的”这样的要求。而且，本酶由于在饮料的制造工序中的通常的加热杀菌条件(例如95℃以上)下迅速失活，因此不需要用于使本酶失活的特别的加热工序。不过，也不妨设置用于使本酶失活的加热工序。

实施例

<鞣酸酶活性测定方法>

如下所述，改变Deschamps的方法(J.Ferment.Technol.61[1]55-59，1983)，测定鞣酸酶的活性。

在含有1％鞣酸(Tannic acid，ACS Reagent〔SIGMA〕)的50mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)0.5mL中添加酶溶液0.5ml，37℃、温育30分钟后，添加含有2％BSA的0.2M醋酸缓冲液(pH5.0)停止反应。反应停止后，在冰中静置20分钟后，3000rpm、离心20分钟。将获得的上清稀释50倍，测定波长260nm的吸光度。使用没食子酸，制作校正曲线，以1分钟内游离1μmol的没食子酸的酶量作为1个单位。

<底物特异性测定方法>

如下所示，通过Sharma的方法(Anal.Biochem.279，85-89，2000)的改良方法研究底物特异性。

在含有0.17％鞣酸或10mM没食子酸酯(没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯和没食子酸异戊酯)的50mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)125μL中添加酶溶液125μL，37℃、温育30分钟后，添加并混合含有0.667％罗丹宁(Rhodanine)的甲醇300μL，静置10分钟。然后，添加并混合0.5N NaOH 200μL，静置10分钟。接着，用9mL的蒸馏水稀释，放置5分钟后，测定波长520nm的吸光度。使用没食子酸制成校正曲线，以1分钟内生产1μmol没食子酸的活性作为1个单位。

1.耐热性鞣酸酶产生菌的筛选

对于在固体培养的浸液或液体培养的培养上清中确认了鞣酸酶活性的各种菌株中，属于黑曲霉(Aspergillus niger)的5个菌株(1332株、1349株、1363株、9331株、9340株)和属于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的3个菌株(1725株、1736株、NBRC-4033株)，研究其是否产生耐热性鞣酸酶。将各个菌株在马铃薯右旋糖琼脂培养基(荣研化学)上，于30℃培养10-14天直至实现良好的孢子形成。用灭菌孢子悬浮用缓冲液(0.85％NaCl、0.05％TWEEN(注册商标)80)收集获得的菌落上形成的孢子，制备孢子悬浮液。将该孢子悬浮液接种于表1的培养基中，于30℃振荡培养3天。将该培养液接种于表2的培养基中，于30℃振荡培养4天。

[表1]

	(w/v)
		葡萄糖	1.0％

多聚蛋白胨	1.0％
		酵母提取物	0.5％
KH₂PO₄	0.2％
		MgSO₄	0.05％

pH5.5

[表2]

	(w/v)
		可溶性淀粉	3.0％
多聚蛋白胨	1.0％
		酵母提取物	0.5％
KCl	0.2％
		KH₂PO₄	0.1％
MgSO₄	0.05％
		鞣酸	0.2％

pH6.5

将获得的各培养上清于65℃处理规定时间(30分钟、60分钟、90分钟)后，用上述鞣酸酶活性测定方法测定鞣酸酶活性。测定结果示于表3。表3中，示出了经65℃下30分钟处理后的各培养上清的鞣酸酶活性(实测值)，和处理时间与残存鞣酸酶活性的变化。处理时间为60分钟或90分钟的残留鞣酸酶活性，用处理时间为30分钟时为基准(100％)的相对值来表示。

[表3]

如表3所示，表明供试菌株均产生耐热性鞣酸酶。

2.泡盛曲霉NBRC-4033(Aspergillus awamori)(IFO-4033)来源的鞣酸酶的生产和纯化

将1.所示的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)NBRC-4033(IFO-4033)的孢子悬浮液接种于表1的培养基中，于30℃振荡培养3天。将该培养液接种于表4的培养基中，于30℃振荡培养4天。该培养上清的鞣酸酶活性为0.35单位/ml。然后，使用硅藻土(Fineflow A)作为过滤助剂，过滤所获得的培养液，获得滤液。用UF module(ACP-2010、旭化成)对该滤液进行脱盐，浓缩。该浓缩液的鞣酸酶活性为6.9单位/ml。

[表4]

	(w/v)
		葡萄糖	1.0％
谷蛋白	0.5％
		NaNO₃	0.5％
KH₂PO₄	0.2％
		MgSO₄	0.05％
鞣酸	2.0％

pH5.5

然后，用20mM柠檬酸缓冲液(pH3.5)将浓缩液稀释2倍，用0.45μm过滤器过滤后，提供给用相同缓冲液平衡化了的HiTrap^TM Sepharose FF5ml，用含有1M NaCl的20mM柠檬酸缓冲液(pH3.5)，通过浓度线性梯度法洗脱，获得了鞣酸酶级分。在该鞣酸酶级分中添加并溶解硫酸铵，使得其终浓度为3M，用经含有3M硫酸铵的20mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)平衡化了的HiTrap^TM Phenyl HP 5ml分级。用PD-10柱对获得的鞣酸酶级分进行脱盐，用Amicon(注册商标)Ultra-15(MWCO 10000)浓缩，获得纯化酶制品。对获得的该纯化酶进行下述各性质的研究，并且进行N末端氨基酸序列分析。

将纯化酶的一部分提供给使用经含有0.15M NaCl的20mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)平衡化的HiLoad 16/60 Superdex^TM 200pg(Amersham公司)的凝胶过滤HPLC，测定分子量。根据分子量标记物的洗脱位置推定的本酶的分子量为约23万Da。

将纯化酶的一部分供给SDS-PAGE，结果出现9～10万Da这样宽的条带。用内切糖苷酶H(Roche公司)处理本纯化酶的一部分后，同样，提供给SDS-PAGE，结果出现了约67KDa的鲜明的条带。

3.耐热性鞣酸酶各性质

(1)最适反应温度

按照上述鞣酸酶活性测定法，使反应温度在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃进行反应。用以显示最高活性的温度的值作为100％的相对活性来表示各测定结果(图1)。最适反应温度在70℃附近。

(2)最适反应pH

使用1％鞣酸作为底物，在各缓冲液(柠檬酸缓冲液pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、磷酸缓冲液pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)中，37℃、30分钟的反应条件下进行测定。用以显示出最大活性值的pH的值作为100％的相对活性来表示各测定结果(图2)。最适反应pH为约5.5。

(3)温度稳定性

50mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)中，30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃的各温度下，热处理30分钟后，用上述鞣酸酶活性测定法测定残留活性。用以未进行热处理的活性作为100％的残留活性表示各测定结果(图3)。65℃、30分钟的热处理下，具有90％以上的残留活性，直至65℃都稳定。

(4)pH稳定性

各缓冲液(柠檬酸缓冲液pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、磷酸缓冲液pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)中，30℃下处理30分钟后，用0.2M醋酸缓冲液(pH5.0)稀释5倍，用上述鞣酸酶活性测定法测定活性。用以出现最大活性值的pH值作为100％的相对活性来表示各测定结果(图4)。稳定pH域是3～8。

(5)通过SDS-PAGE进行的分子量测定

SDS-PAGE按照Laemmli等人的方法进行。而且，所用的分子量标记物是蛋白质分子量标记物II(TEFCO)，作为标准蛋白质，包括肌球蛋白，兔肌肉(205KDa)、半乳糖苷酶，大肠杆菌(116KDa)、磷酸化酶b，兔肌肉(97.4KDa)、牛血清白蛋白(69KDa)、谷氨酸脱氢酶(55KDa)、乳酸脱氢酶，猪肌肉(36.5KDa)、碳酸酐酶，牛肝脏(29KDa)，胰蛋白酶抑制剂，大豆(20.1KDa)、溶菌酶，鸡蛋清(14.3KDa)、抑肽酶，牛肺(6.5KDa)、胰岛素B链，牛胰脏(3.5KDa)。使用凝胶浓度10～20％的梯度凝胶(第一化学)，以20mA/凝胶进行约60分钟电泳，求出分子量，结果出现了9～10万Da这样宽的条带。用内切糖苷酶H(Roche社)处理后，同样提供给SDS-PAGE，分子量为约67KDa。由此，确认了本酶具有糖链。而且，该分子量与根据本发明中公开的基因序列计算的大小一致。

(6)等电点

使用PhastSystem(GE Healthcare Bioscience公司)，通过等电点电泳进行测定，本酶的等电点为6.4。

(7)金属离子和抑制剂的影响

在50mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)中的鞣酸酶中分别加入20mM的各种金属离子和EDTA、或0.4M、0.8M、2M和4M尿素，30℃下30分钟处理后，用上述鞣酸酶活性测定法测定活性。其结果示于表5。用以不添加时的活性作为100％的相对活性表示各测定结果。不受金属离子和EDTA的抑制。而且，活性由于尿素添加而上升。

[表5]

(8)底物特异性

用上述底物特异性测定法测定对鞣酸和没食子酸酯(没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯和没食子酸异戊酯)的底物特异性。以对鞣酸的分解活性作为100％时的对各没食子酸酯的分解活性为，对各没食子酸甲酯的为41％、各没食子酸乙酯的为30％、各没食子酸丙酯的为29％、各没食子酸异戊酯的为27％。

4.编码泡盛曲霉(Aspergillus awamori)来源的鞣酸酶的基因片段的获得

(a)染色体DNA的分离

从2.中获得的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的菌体中，通过齐藤·三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta，72，619-629，1963)制备基因组DNA。

(b)部分氨基酸序列的测定

对2.获得的鞣酸酶的纯化制品进行氨基酸序列分析，测定7个残基的N末端氨基酸序列(序列号1)。参考判明的序列，用BLAST检索具有一致序列的鞣酸酶。其结果，7个残基全都一致的鞣酸酶只有黑曲霉CBS 513.88假定蛋白质(An04g04430)1种。而且，除了该鞣酸酶之外，BLAST上没有登录7个残基一致的曲霉菌属来源的蛋白质。

(c)通过PCR进行的DNA探针的制作

基于N末端氨基酸序列和黑曲霉CBS 513.88假定蛋白质(An04g04430)的序列，合成2种混合寡核苷酸，制成PCR引物(序列号2、3)。使用这些引物，以泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的染色体DNA作为模板，在以下条件下，进行PCR反应。

<PCR反应液>

10×PCR反应缓冲液(TakaraBio公司)5.0μl

dNTP混合液(各2.5mM、TakaraBio公司)4.0μl

25mM MgCl₂ 5μl

100μM正义引物3.0μl

100μM反义引物3.0μl

蒸馏水28.5μl

染色体DNA溶液(140μg/ml)1μl

LA Taq DNA聚合酶(TakaraBio公司)0.5μl

<PCR反应条件>

阶段1：变性(94℃、5分钟)1个循环

阶段2：变性(94℃、30秒)30个循环

退火(55℃、30秒)

延伸(72℃、1分钟)

将获得的约0.72kb的DNA片段克隆于pGEM-Teasy(Promega公司)中后，对碱基序列进行确认，结果发现在正义引物后紧接的是编码上述部分氨基酸序列的碱基序列。将该DNA片段作为用于克隆全长基因的DNA探针。

(d)基因文库的制作

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的染色体DNA的Southern杂交分析的结果是，在BamHI+XhoI分解物中确认了与探针DNA杂交的约3.6kb的单一条带。为了克隆该约3.6kb的BamHI+XhoI DNA片段，以下述方式制作基因文库。对上述(a)中制备的染色体DNA进行BamHI+XhoI处理。混合泡盛曲霉的基因组DNA 10μg、10×K缓冲液5μl、蒸馏水42μl、和3μl的BamHI，于30℃处理15小时。利用乙醇沉淀纯化获得的分解物后，混合10×H缓冲液5μl、蒸馏水42μl，和3μl的XhoI，37℃下处理15小时。将获得的分解物连接到以同样方式进行BamHI+XhoI处理的pBluescriptII KS(+)(Stratagene社)载体中，获得基因文库。

(e)基因文库的筛选

用DIG-High Prime(Roche公司)标记上述(c)中获得的0.72kb的DNA片段。将其作为DNA探针，通过菌落杂交筛选(d)中获得的基因文库。从获得的阳性菌落中获得了质粒pBluescriptII-TAN。

(f)碱基序列的测定

按照常规方法测定质粒pBluescriptII-TAN的碱基序列。编码鞣酸酶的碱基序列(1725bp)示于序列号4。此外，序列号4编码的氨基酸序列(574个氨基酸残基)示于序列号5。该氨基酸序列中发现了(b)中测定的N末端区域氨基酸序列(序列号1)。

5.泡盛曲霉(Aspergillus awamori)来源的鞣酸酶在构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)中的表达

(a)鞣酸酶在构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)中的表达质粒的构建

基于编码N末端区域氨基酸序列和C末端区域氨基酸序列的DNA序列，合成2种寡核苷酸(序列号6、7)，制成PCR引物。在正义引物中添加Eco22T限制性酶识别部位，在反义引物中添加KpnI限制性酶识别部位。使用这些引物，以具有鞣酸酶基因的质粒pBluescriptII-TAN作为模板，在以下条件下，进行PCR反应。

<PCR反应液>

10×PCR反应缓冲液(TOYOBO社)5.0μl

dNTP混合液(各2.5mM、TOYOBO社)5.0μl

10μM正义引物1.5μl

10μM反义引物1.5μl

25mM MgSO₄ 2μl

蒸馏水33μl

质粒pBluescriptII-TAN溶液1.0μl

KOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO社)1.0μl

<PCR反应条件>

阶段1：变性(94℃、2分)1个循环

阶段2：变性(94℃、15秒)30个循环

退火(50℃、30秒)

延伸(68℃、2分30秒)

用电泳确认获得的PCR产物后，用GENE CLEANE III纯化(15μl)、加入5μl的10×L缓冲液和KpnI 3μl和蒸馏水41μL，37℃下酶处理6小时。利用乙醇沉淀纯化获得的分解物后，混合5μl的10×H缓冲液和EcoT221 3μl和蒸馏水42μL，37℃下酶处理15小时。将获得的分解物用电泳进行确认、纯化后，连接到预先经KpnI和EcoT221处理的表达用载体pTALCPPb(特开2003-319786号记载)中，获得了表达质粒pTALC-TAN(图5)。pTALCPPb具有pyrG基因和米曲霉菌来源的高表达启动子。此外，确认了pTALC-TAN中的编码鞣酸酶的碱基序列是正确的。

(b)鞣酸酶在构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)中的表达

用表达质粒pTALC-TAN转化构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)的鸟氨酸氨甲酰转移酶基因缺损株ABPU1株(biA1；pyrG89；wA3；argB2；pyroA4：Mol.Gen.Genet.，253：520-528〔1997〕)。转化法通过原生质体化后，用聚乙二醇和氯化钙的方法(Mol.Gen.Genet.218：99-104，1989)进行。用上述表4的培养基培养作为尿苷非需求株获得的7株转化体。而且，作为对照的用pTALCPPb转化的构巢曲霉菌ABPU1也进行同样的培养。

对获得的试样，按照上述鞣酸酶活性测定法进行活性测定，结果示于下表6中。在7株中6株中确认了鞣酸酶活性。

[表6]

	U/mL
		构巢曲霉菌ABPU1株	ND
No.1	ND
		No.2	4.92
No.3	3.97
		No.4	0.41
No.5	0.17
		No.6	0.73

No.7

2.53

产业上利用的可能性

本发明的鞣酸酶的65℃30分钟处理后的残留活性显示出90％以上这样高的耐热性，适于所希望的高温下的反应的用途。如果使用本发明的鞣酸酶，就可以实施在杂菌污染的担忧少的高温下实施酶反应。因此，本发明的鞣酸酶在食品加工用途中特别有用。

本发明不受上述发明实施方式和实施例说明的任何限定。在不脱离请求保护的范围的记载，本领域技术人员能够容易想到的范围下的各种变化方式都包括在本发明中。

本说明书中明示的论文、公开专利公报和特许公报等内容，其所有内容通过援引进行引用。

Claims

1.一种鞣酸酶，来源于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或黑曲霉(Aspergillus niger)，对于65℃的热处理(pH5.0、30分钟)具有耐性。

2.一种具有下述酶化学性质的鞣酸酶：

(1)作用：作用于缩酚酸键而进行水解；

(2)分子量：约23万Da(通过凝胶过滤测定)；

(3)温度稳定性：直到65℃都稳定(pH5.0、30分钟)。

3.根据权利要求2所述的鞣酸酶，还具有下述酶化学性质：

(4)最适温度：约70℃；

(5)最适pH：约5.5；

(6)pH稳定性：在pH3～8的范围稳定(30℃、30分钟)

(7)底物特异性：良好地作用于鞣酸，作用于没食子酸酯。

4.根据权利要求2或3所述的鞣酸酶，来源于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。

5.一种鞣酸酶，具有序列号5所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列等价的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的鞣酸酶，所述等价的氨基酸序列是与序列号5所示的氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列。

7.一种酶剂，以权利要求1～6中任一项所述的鞣酸酶为有效成分。

8.一种鞣酸酶基因，由选自以下(A)～(C)中的任一项的DNA构成：

(A)编码序列号5所示的氨基酸序列的DNA；

(B)由序列号4所示的碱基序列构成的DNA；

(C)具有与序列号4所示的碱基序列等价的碱基序列、且编码具有鞣酸酶活性的蛋白质的DNA。

9.一种重组载体，含有权利要求8所述的鞣酸酶基因。

10.一种转化体，导入有权利要求8所述的鞣酸酶基因。

11.一种鞣酸酶的制造方法，其特征在于，包含以下的步骤(1)和(2)，或包含以下的步骤(i)和(ii)：

(2)从培养后的培养液和/或菌体回收鞣酸酶的步骤；

(i)在产生所述基因编码的蛋白质的条件下培养权利要求10所述的转化体的步骤，

(ii)回收产生的所述蛋白质的步骤。

12.根据权利要求11所述的鞣酸酶的制造方法，所述微生物是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)NBRC-4033(IFO-4033)。

13.一种水解法，其特征在于，使权利要求1～6中任一项所述的鞣酸酶、权利要求7所述的酶剂、或用权利要求11或12所述的制造方法获得的鞣酸酶作用于鞣酸或含有鞣酸的组合物。