CN102162005B - 用于测量低密度脂蛋白胆固醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于测量低密度脂蛋白胆固醇的方法。具体地说，本发明提供能够高选择性地测量体液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，其包括用具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物处理体液，以及使用(a)胆固醇酯酶和(b)胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶测量低密度脂蛋白胆固醇(LHL-C)。

Description

用于测量低密度脂蛋白胆固醇的方法
技术领域
本发明涉及测量样本中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，其中具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物特异地和非LDL(VLDL或者HDL)形成复合物。
背景技术
除了和白蛋白结合的游离脂肪酸外，存在于血液的脂质掺入脂蛋白的结构中，并且它们以乳糜微粒(CHM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等等的形式存在。胆固醇特别地分布于VLDL、LDL和HDL。已知LDL起运输胆固醇的作用，并且高水平的LDL促进动脉硬化。已知血液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的测量成为动脉硬化发生和进行的指示物。
Burstein M等人(Rapid Method for the Isolation of Lipoproteinsfrom Human Serum by Precipitation with Polyanions，J.Lipid Research11：583，1970)描述，主要地通过使用聚阴离子化合物使除了HDL外的脂蛋白特异凝集。然而，该文献描述的聚阴离子化合物特异地和非LDL(VLDL或者HDL)形成复合物是困难的。
CC Heuck和G Schlierf(Beta-lipoprotein cholesterol quantitationwith polycations，Clin Chem 1977 23：536-540)描述通过使用聚乙烯亚胺和阳离子交换树脂排除VLDL和HDL，从而定量脂蛋白胆固醇。然而，该文献描述的方法难以解决其要求孵育15分钟或更长，以及其需要两类试剂的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高选择性测量体液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL)的方法。
作为为实现上述目的而进行的深入研究的结果，本发明的发明人发现具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物，其能够和非LDL形成复合物。使用本发明的化合物，使得单一的化合物和非LDL(特别地，VLDL和HDL)在短时间形成复合物成为可能。因此，使得测量包含于LDL的成分(例如胆固醇、中性脂肪和脱辅基蛋白)成为可能。本发明基于这些发现而完成。
本发明提供减少或者除去样本中极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)的方法，其包括用具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物处理含有极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的样本。
本发明还提供测量体液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，其包括用具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物处理体液，并使用(a)胆固醇酯酶和(b)胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
优选地，使用具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物，其和脂蛋白中的极低密度脂蛋白(VLDL)形成复合物。
优选地，使用具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物，其和脂蛋白中的高密度脂蛋白(HDL)形成复合物。
优选地，所述具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物是聚(烯丙胺)、聚(烯丙胺)盐酸盐、烯丙胺盐酸盐共聚物、二烯丙胺盐酸盐聚合物和二烯丙胺盐酸盐共聚物中的任何，条件是根据需要任选修饰烯丙胺和二烯丙胺。
优选地，所述烯丙胺盐酸盐共聚物和二烯丙胺盐酸盐共聚物分别是烯丙胺盐酸盐和-SO2-的共聚物以及二烯丙胺盐酸盐和-SO2-的共聚物。
优选地，所述具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物是聚(烯丙胺)或者二烯丙胺盐酸盐和-SO2-的共聚物。
优选地，所述低密度脂蛋白胆固醇通过使得过氧化物酶和色原体作用于从低密度脂蛋白胆固醇产生的过氧化氢以实施显色反应而测量，所述过氧化氢是由于胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的作用而从所述低密度脂蛋白胆固醇产生的。
本发明还提供用于测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的试剂，其包括(a)胆固醇酯酶、(b)胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶和(c)具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物。
本发明还提供用于测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的试剂盒，其包括(a)胆固醇酯酶、(b)胆固醇氧化酶、(c)过氧化物酶、(d)色原体和(e)具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物。
本发明还提供用于测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的干燥分析元件，其包括(a)胆固醇酯酶、(b)胆固醇氧化酶、(c)过氧化物酶、(d)色原体和(e)具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物。
根据本发明，可以仅使用单一化合物在短时间内高选择性地测量低密度脂蛋白胆固醇。
附图说明
图1显示实施例1中进行的琼脂糖凝胶电泳(胆固醇染色的结果)。
图2显示对比例1中进行的琼脂糖凝胶电泳(胆固醇染色的结果)。
图3显示实施例2中LDL-C测量的结果。
图4显示对比例2中LDL-C测量的结果。
具体实施方式
在下文中，本发明的实施方案将被详细描述。
在本发明说明书中，以％表达的浓度表示重量百分比浓度。
本发明涉及减少或者除去样本中极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)的方法，其包括用具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物处理含有极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的样本。此外，本发明涉及测量体液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，其包括用具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物处理体液，并使用(a)胆固醇酯酶和(b)胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
血液、血清、血浆、尿等等可以用作体液。这样的血液、血清、血浆或者尿可以直接用作体液样品。另外，也可以使用已经适当地预处理的血液、血清、血浆或者尿。
构成本发明所用的具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物的单体的实施例包括烯丙胺(伯胺)、二烯丙胺(仲胺)、烷基二烯丙胺(叔胺)和二烷基二烯丙胺(季胺)。胺既可以是游离形式，也可以是盐，如盐酸盐、乙酸盐或硫酸盐。氨基基团可以由烷基基团(例如甲基基团、乙烷基团等)、烷氧羰基基团(例如甲氧羰基基团)或其它基团保护。多胺可以是多胺的均聚物、或多胺和二氧化硫、顺丁烯二酸等等形成的共聚物。所述具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物优选是聚(烯丙胺)、聚(烯丙胺)盐酸盐、烯丙胺盐酸盐共聚物、二烯丙胺盐酸盐聚合物和二烯丙胺盐酸盐共聚物中的任何，条件是根据需要任选修饰烯丙胺和二烯丙胺。
应当指出，本发明中使用的术语“盐酸盐聚合物或者共聚物”，不是指单体盐酸盐聚合形成的产物，而是指单体聚合后形成的聚合物的胺的部分是盐酸盐，与生产方法无关。
具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物的分子量优选是从300至200000，更优选是从1000至50000，以及进一步优选从1000至10000。
本发明使用的具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物的具体实施例包括Nitto Boseki Co.，LTD的PAA系列和PAS系列。可以用于本发明的Nitto Boseki Co.，LTD的PAA系列和PAS系列聚合物化合物的性质将在下面描述。然而，可以用于本发明的化合物的类型并不受限于此。
表1
表2
表2中：l和m代表摩尔比；n代表聚合度。
具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物的使用量可以适当确定。当测量系统是溶液时，在试剂和样本混合的情况下这样的具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物的终浓度是0.001％至30％，优选是0.01％至10％，以及更优选是0.1％至5％。
对测量系统是干燥试剂的干燥分析元件而言，可以使用大约0.01至20克每平方米的量、更优选大约0.1至10克每平方米的量的具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物。
为了用具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物处理样本(体重等等)，可以将样本和聚合物化合物混合。然后，在混合1秒至60分钟、更优选1秒至30分钟以及进一步优选5秒至15分钟后，可以将获得的混合物进行离心或者过滤以除去非LDL。样本可以通过常规的混合操作与具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物混合，例如颠倒混合、涡旋或吸移(pipetting)。
用于本发明方法中的酶的实例包括胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶。也可以使用脂肪酶作为胆固醇酯酶。这些酶所来源的微生物类型没有特别的限制。例如，对于胆固醇酯酶，可以使用裂褶菌(Schizophyllum commune)来源或者假单胞菌(Pseudomonas sp.)来源的酯酶，或者来源于其它类型的微生物的酯酶。对于胆固醇氧化酶，可以使用裂褶菌来源、假单胞菌来源或者其它类型微生物来源的氧化酶。本发明使用的酶既可以是来源于这样的微生物的酶，也可以是通过公知的方法获得的重组酶。
来源于裂褶菌的胆固醇酯酶的一个实例是由Toyobo Co.，Ltd制备的COE-302。来源于假单胞菌的胆固醇酯酶的实例包括由ToyoboCo.，Ltd制备的COE-311、LPL-312和LPL-314以及Asahi KaseiCorporation制备的CEN。来源于假单胞菌的胆固醇氧化酶的实例包括由Kikkoman Corporation制备的CHO-PEL和CHO-PEWL。
在本发明的方法中，除了上述的试剂外，还可以使用公知的用于检测胆固醇的试剂，例如酶试剂、色原体和pH缓冲液。
更具体地，过氧化物酶可以作为这样的酶使用。4-氨基安替比林(4-AA)、由于供氢偶联而显色的酚或苯胺Trinder试剂、无色染料等等可以用作色原体。苯胺试剂可以优选用作所述的Trinder试剂。本文使用的这样的苯胺Trinder试剂的实例包括N-乙基-N-磺丙基-3-甲氧基苯胺(ADPS)、N-乙基-N-磺丙基苯胺(ALPS)、N-乙基-N-磺丙基-3-甲基苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(ADOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(TOOS)(由Dojindo Laboratories制备)。
pH缓冲液的实例包括碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐和Good缓冲液(描述于Biochenmistry，5，第467-477页，1996)。这些pH缓冲液可以参考出版物的描述而选择，例如Tanpakushitsu Koso no Kiso Jikken Ho(BasicExperimental Methods for Proteins and Enzymes)、Takeichi Horio等，Nankodo Co.，Ltd.1981和Biochemistry，5，第467-477页，1966。
根据使用的酶的最适pH可以确定上述缓冲液的pH。这样的pH可以调整为优选pH5.0至8.0，以及更优选pH6.0至7.0。
下面将在一个其测量系统是溶液的实例中描述本发明的测量方法。然而，下述实施方案并不旨在限制本发明的范围。试剂溶液优选具有含有下面(1)至(6)项的组成。
(1)胆固醇酯酶
(2)胆固醇氧化酶
(3)具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物
(4)过氧化物酶
(5)色原体(4-AA和Trinder试剂)
(6)pH缓冲液
将1至1000μl优选100至500μl的通过混合上述试剂至其最优浓度而制备的试剂溶液以恒定的温度预孵育1至10分钟，所述温度范围从大约20℃至大约45℃，优选大约30℃至大约40℃。然后，将0.5至50μl、优选1-20μl的溶液样品加至上述试剂溶液。在以恒定的温度孵育同时，测量由色原体显色造成的波长随时间的变化。使用之前准备的校准曲线，可以依据比色原理获得样本中测试物质的量。
酶的需要量可以适当地确定。例如，胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶均在0.2-500U/mL的范围内、优选在0.2-100U/mL的范围内、进一步优选在1-50U/mL的范围内使用。
当测量系统是溶液，如果有必要可以联合使用一或者二或更多类型的表面活性剂。这样的表面活性剂的浓度并没有具体的限制。例如，表面活性剂可以使用优选0.01％至20和更优选0.1％至15％的浓度。
下面将描述本发明使用干燥分析元件的测量方法，其中测量系统是干燥试剂。所述干燥分析元件可以配置为具有至少一个粘附层以及在不透水的支持体上的多孔展开层。
多孔层可以是用纤维或非纤维材料制造的。由于这样的多孔层起展开液体样品的作用，因此其优选是具有分配(measure)液体的作用。本文所用术语“分配液体的作用”意思是将点滴于层表面的液体样品按几乎恒定的每单元面积的量的比率伸展至层的侧向，其中基本上没有不均匀的成分分布。为了控制展开面积、展开率等等，可以将亲水性的聚合物或者表面活性剂(描述于日本专利公开60-222770A(1985)、63-219397A(1988)和62-182652(1987))混合至展开层。也可能将多环聚缩水甘油化合物作为表面活性剂混合至所述展开层。
纤维多孔层优选用聚酯纤维制造，包括描述于日本专利公开55-164356A(1980)、57-66359A(1982)和60-222769(1985)的聚酯纤维，作为典型的实例。非纤维多孔层优选用有机聚合物制造，例如聚磺酸。
粘附层是具有使得上述不透水支持体粘附于上述多孔层的功能的层。可以在本文中使用的这样的粘附层的实例包括亲水性聚合物例如明胶及其衍生物(如邻苯二甲酸明胶)、纤维素衍生物(如羟丙基纤维素)、琼脂糖、丙烯酰胺聚合物、甲基丙烯酰胺聚合物以及丙烯酰胺或者甲基丙烯酰胺和各种乙烯基单体的共聚物。
通过公知的方法均匀地施加含有亲水性聚合物的水溶液。可以使用施加水溶液的已知方法。为了施加含有亲水性聚合物的水溶液可以适当选择然后使用选自浸渍涂布、挤压涂布、刮刀涂布、料斗涂布、帘幕涂布等等的方法。
也可以将多孔层置于粘附层上。然而，优选在粘附层上层合先前已经作为织物提供的织物或多孔膜。对于层合方法，如于日本专利公开55-164356A(1980)中描述，含有亲水性聚合物的粘附层表面用水均匀润湿，然后将织物或多孔膜置于粘附层上。然后，在其上轻轻地和均匀地施加压力，使得织物或多孔膜可以粘附至粘附层。这样的粘附层的厚度优选是0.5至50μm，以及更优选是1至20μm。
用于透光的支持体的优选材料包括聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯乙烯和纤维素酯例如纤维素三乙酸酯。为了将作为亲水层的水吸收层、检测层、基本上无孔的试剂层等牢固地结合至支持体，通常可以在支持体上设置底涂层，或在其上进行亲水处理。支持体的厚度没有特别的限制。优选10至1000μm，和更优选300至800μm。在透光的支持体的情况下，最终检测既可以在支持体一侧也可以在多孔层一侧实施。另一方面，在不透光的支持体的情况下，最终检测在多孔层一侧实施。
如果必要，可以使用稳定剂、pH缓冲液、交联剂(硬化剂或固化剂)、表面活性剂、聚合物等等。这些物质可以包含于粘附层或多孔层。
下面将描述用于检测LDL-C的干燥分析元件的优选的层结构。
用于检测LDL-C的干燥分析元件包括多孔层和涂有明胶水溶液的粘附层。所述粘附层包含明胶、过氧化物酶和显色试剂。粘附层与织物或者膜层合。胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶、表面活性剂和pH缓冲液涂布在所述织物或膜上。
下面将描述在干燥分析元件中使用的用于测量胆固醇的试剂组合物，其以及引起光学变化的试剂组合物。
试剂组合物可以包含于第一多孔层中。或者，试剂组合物可以包含于粘附层和多孔层。另外，全部或者大部分的试剂组合物可以包含于任何这样的层，或者这样的试剂组合物可以事先加至除了粘附层和多孔层外的任何层。
在用于检测LDL-C的干燥分析元件中，所有的酶，即，胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶，各自可以使用优选大约0.1至30kU每平方米以及更优选大约0.5至15kU每平方米的量。
表面活性剂可以以大约0.2-30g/m2的量、优选约1-20g/m2的量使用。
过氧化物酶的类型没有具体限制。优选辣根过氧化物酶。过氧化物酶可以使用优选大约1至200kU/m2以及更优选大约10至100kU/m2的量。
对于上述的色原体，优选与4-氨基安替比林(4-AA)联合显色的上述试剂的组合。特别优选可以使用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(TOOS)。色原体的用量没有具体限制。例如，4-AA和供氢偶联剂可以各自使用优选大约0.1至10g/m2以及更优选大约0.1至5g/m2。
作为其它试剂组合物，如必要，用于检测LDL-C的干燥分析元件还可以包含一或二或更多类型的添加剂例如稳定剂、pH缓冲液、交联剂(硬化剂或固化剂)、表面活性剂和聚合物。这些添加剂可以包含于干燥分析元件的粘附层和/或多孔层。
根据使用的酶的最适pH可以确定缓冲液的pH。这样的pH可以调整为优选pH5.0至8.0，以及更优选pH6.0至7.0。
所述干燥分析元件可以切割成小片，例如边长大约5mm至30mm的正方形或者具有几乎相同大小的圆形，然后可以放置在底板(slide)框中(描述于日本专利公开57-283331B(1982)、日本实用新型公开58-32350U(1983)、日本专利公开58-501144A(1983)等)，使得其可以用作化学分析底板。该实施方案在生产、包装、运输、储藏、测量等方面是优选的。基于使用目的，干燥分析元件可以以长带状置于盒或夹中使用。或者，其小片可以置于有开口的容器中使用，或者附于或置于开放的卡中使用。另外，小切片还可以直接使用。
在应用干燥分析元件时，将含水液体样品溶液(例如，体液样品如血液或尿)以大约2μl至大约30μl、优选4μl至15μl点滴在干燥分析元件中的多孔液体样品展开层上。然后，将样品溶液已经点滴于其上的干燥分析元件任选在恒定的温度孵育1至10分钟，温度范围从大约20℃至大约45℃，优选大约30℃至大约40℃。干燥分析元件中的显色或者变色可以从透光支持体侧反射测量(reflex-measured)。根据比色原理可以使用事先制备的校准曲线确定样本中测试物质的量。使用描述于于日本专利公开60-125543A(1985)、60-220862A(1985)、61-294367A(1986)和58-161867(1983)的化学分析仪可以非常容易的实施所述测量过程，从而进行高精度的定量分析。根据目的和必要的精度，可以通过视觉观察估计显色的程度而进行半定量测量。
干燥分析元件可以在干燥状态储藏直到分析。因此，不必在使用前制备试剂。另外，在干燥状态的试剂通常具有高稳定性。因此，该方法比必须在使用前制备试剂溶液的所谓的溶液方法更方便和快速。本发明的方法也是能够使用痕量液体样品进行高精度快速检查的优秀的检查方法。
将在下面的实施例中更具体地描述本发明。然而，这些实施例不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1
(1)多胺水溶液的制备
使用聚(烯丙胺)PAA-05(Nitto Boseki Co.，Ltd)或者二烯丙胺盐酸盐-二氧化硫共聚物PAS-92(Nitto Boseki Co.，Ltd)，用0.1M的MOPS缓冲液(pH 7.0)制备2％的多胺水溶液。
(2)脂蛋白溶液的制备
使用低密度脂蛋白LDL(Athens Research & Technology，Inc)、极低密度脂蛋白VLDL(Athens Research & Technology，Inc)、高密度脂蛋白(Athens Research & Technology，Inc)、人血清白蛋白HSA(Sigma-Aldrich)以及人血清球蛋白HSG(Sigma-Aldrich)制备下面的脂蛋白溶液。
150mg/dL LDL-C和60mg/dL VLDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG)
150mg/dL LDL-C和100mg/dL HDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG)
(3)通过琼脂糖凝胶电泳的检测
将100μl上述(1)中制备的2％的多胺水溶液加至100μl上述(2)中制备的脂蛋白溶液，混合物通过吸移混合(多胺终浓度：1％)。这样混合后，混合物立即以3000rpm离心10分钟，然后收集上清液。
使用琼脂糖凝胶电泳REP系统(Helena laboratories)，在REP LIPO-30板(Helena laboratories)上对1μl上清液进行电泳。用Chol/Trig ComboCH/TG对胆固醇和中性脂肪染色，然后检测存留在上清液的脂蛋白。
图1显示使用LDL-VLDL混合溶液作为样本获得的结果以及使用LDL-HDL混合溶液作为样本获得的结果。在图1左边，发现与仅0.1MMOPS缓冲液(泳道1)比较时，VLDL的条带在PAA-05(泳道2)和PAS-92(泳道3)中都消失了。而且，在图1右边，发现HDL的条带在PAA-05(泳道2)中消失，在PAS-92(泳道3)中这样的HDL的条带的浓度降低至初始浓度的三分之一。
从这些结果，确认了通过使用本发明的多胺水溶液可以从非LDL中除去特别是VLDL，以及HDL。
对比例1
(1)聚乙烯亚胺水溶液的制备
使用聚乙烯亚胺1800(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，用0.1M的MOPS缓冲液制备2％的聚乙烯亚胺水溶液。
(2)脂蛋白溶液的制备
使用低密度脂蛋白LDL(Athens Research & Technology，Inc)、极低密度脂蛋白VLDL(Athens Research & Technology，Inc)、高密度脂蛋白(Athens Research & Technology，Inc)、人血清白蛋白HSA(Sigma-Aldrich)以及人血清球蛋白HSG(Sigma-Aldrich)制备下面的脂蛋白溶液。
60mg/dL VLDL-C的溶液(含有5％HSA和2％HSG)
150mg/dL LDL-C和60mg/dL VLDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG)
100mg/dL HDL-C的溶液(含有5％HSA和2％HSG)
150mg/dL LDL-C和100mg/dL HDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG)
(3)通过琼脂糖凝胶电泳的检测
将100μl上述(1)中制备的2％的聚乙烯亚胺水溶液加至100μl上述(2)中制备的脂蛋白溶液，混合物通过吸移混合(多胺终浓度：1％)。这样混合后，混合物立即以3000rpm离心10分钟，然后收集上清液。
使用琼脂糖凝胶电泳REP系统(Helena laboratories)，在REP LIPO-30板(Helena laboratories)上对1μl上清液进行电泳。用Chol/Trig ComboCH/TG对胆固醇和中性脂肪染色，然后检测存留在上清液的脂蛋白。
图2显示使用VLDL溶液以及LDL-VLDL混合溶液作为样本获得的结果，以及使用HDL溶液以及LDL-HDL混合溶液作为样本获得的结果。在图2左边，发现与仅0.1M MOPS缓冲液比较时，用PEI处理的VLDL的条带迁移，并大量存留。另外，在图2右边，HDL的条带没有消失，并大量存留。从这些结果，发现VLDL和HDL不能通过使用聚乙烯亚胺除去。
实施例2
(1)脂蛋白溶液的制备
使用低密度脂蛋白LDL(Athens Research & Technology，Inc)、极低密度脂蛋白VLDL(Athens Research & Technology，Inc)、高密度脂蛋白(Athens Research & Technology，Inc)、人血清白蛋白HSA(Sigma-Aldrich)以及人血清球蛋白HSG(Sigma-Aldrich)制备下面的脂蛋白溶液。
50mg/dL LDL-C的溶液(含有5％HSA和2％HSG)
75mg/dL LDL-C的溶液(含有5％HSA和2％HSG)
150mg/dL LDL-C的溶液(含有5％HSA和2％HSG)
250mg/dL LDL-C的溶液(含有5％HSA和2％HSG)
75mg/dL LDL-C和30mg/dL VLDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG)
75mg/dL LDL-C和60mg/dL VLDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG)
150mg/dL LDL-C和50mg/dL HDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG)
150mg/dL LDL-C和100mg/dL HDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG
(2)用于测量LDL-C的干燥分析元件
将含有4-氨基安替比林、TOOS(由Dojindo Laboratories制备)和过氧化物酶(Toyobo Co.，Ltd.)的明胶水溶液涂布在已经涂以明胶底涂层的180μm聚对苯二甲酸乙二醇酯无色透明平滑薄膜上，使得干燥后的涂层厚度为14μm，然后将其干燥。随后，以大约30g/m2的提供量向上述薄膜的整个表面提供水，使薄膜变湿。将由大约50丹尼尔聚酯纺纱在36隔距(gauge)编织制备的经编纺织物(tricot knit fabric)轻轻压在所获得的薄膜上，使得其层合在薄膜上，然后将其干燥。之后，将具有如下组成的水溶液涂在上述的纺织物上，然后将其干燥。
MOPS(pH7.0)                                              1.67g/m2
聚甘油联苯乙烯基苯基醚(polyglyceryl distyl phenyl ether) 2.98g/m2
Pluronic L121                                            14.90g/m2
胆固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，Toyobo Co.，Ltd)                3.21kU/m2
胆固醇氧化酶(重组体大肠杆菌，Kikkoman Corp.)             4.52kU/m2
PVP K90                                                  15.00g/m2
PAS-92                                                   1.03g/m2
(3)LDL-C测量评价
将10μl上述(1)中制备的脂蛋白溶液点滴于上述(2)中产生的底板上。然后在37℃反应6分钟，测量反应起始6分钟后的540nm的OD。用仅LDL的样本产生校准曲线，然后基于校准曲线计算出其它样本(LDL+非LDL)的胆固醇浓度。如图3所显示，确认了在由非LDL(HDL或VLDL)和LDL组成的混合样品中，没有和LDL-C一起测量到那么多非LDL。
对比例2
(1)脂蛋白溶液的制备
使用低密度脂蛋白LDL(Athens Research & Technology，Inc)、极低密度脂蛋白VLDL(Athens Research & Technology，Inc)、高密度脂蛋白(Athens Research & Technology，Inc)、人血清白蛋白HSA(Sigma-Aldrich)以及人血清球蛋白HSG(Sigma-Aldrich)制备下面的脂蛋白溶液。
50mg/dL LDL-C的溶液(含有5％HSA和2％HSG)
75mg/dL LDL-C的溶液(含有5％HSA和2％HSG)
150mg/dL LDL-C的溶液(含有5％HSA和2％HSG)
250mg/dL LDL-C的溶液(含有5％HSA和2％HSG)
75mg/dL LDL-C和30mg/dL VLDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG)
75mg/dL LDL-C和60mg/dL VLDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG)
150mg/dL LDL-C和50mg/dL HDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG)
150mg/dL LDL-C和100mg/dL HDL-C的混合溶液(含有5％HSA和2％HSG
(2)用于测量LDL-C的干燥分析元件
将含有4-氨基安替比林、TOOS(由Dojindo Laboratories制备)和过氧化物酶(Toyobo Co.，Ltd.)的明胶水溶液涂布在已经涂以明胶底涂层的180μm聚对苯二甲酸乙二醇酯无色透明平滑薄膜上，使得干燥后的涂层厚度为14μm，然后将其干燥。随后，以大约30g/m2的提供量向上述薄膜的整个表面提供水，使薄膜变湿。将由大约50丹尼尔聚酯纺纱在36隔距编织制备的经编纺织物轻轻压在所获得的薄膜上，使得其层合在薄膜上，然后将其干燥。之后，将具有如下组成的水溶液涂在上述的纺织物上，然后将其干燥。
MOPS(pH7.0)                                        1.67g/m2
聚甘油联苯乙烯基苯基醚                             2.98g/m2
Pluronic L121                                      14.90g/m2
胆固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，Toyobo Co.，Ltd)          3.21kU/m2
胆固醇氧化酶(重组体大肠杆菌，Kikkoman Corp.)       4.52kU/m2
(3)LDL-C测量评价
将10μl上述(1)中制备的脂蛋白溶液点滴于上述(2)中制备的底板上。然后在37℃反应6分钟，测量反应起始6分钟后的540nm的OD。用仅LDL的样本产生校准曲线，然后基于校准曲线计算出其它样本(LDL+非LDL)的胆固醇浓度。如图4所显示，确认了在由非LDL(HDL或VLDL)和LDL组成的混合样品中，和LDL-C(LDL浓度：110％或更高)一起测量出大量的非LDL。

Claims (13)

1.一种用于减少或除去样本中极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)的方法，其包括用具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物处理含有极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的样本。
2.具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物、(a)胆固醇酯酶和(b)胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶用于制备测量体液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)用的试剂、试剂盒或干燥分析元件的用途，其中用所述聚合物化合物处理体液，以及使用(a)胆固醇酯酶和(b)胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
3.根据权利要求2的用途，其中使用具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物，其和脂蛋白中极低密度脂蛋白(VLDL)形成复合物。
4.根据权利要求2的用途，其中使用具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物，其和脂蛋白中高密度脂蛋白(HDL)形成复合物。
5.根据权利要求2的用途，其中所述具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物是聚烯丙胺、聚烯丙胺盐酸盐、烯丙胺盐酸盐共聚物和二烯丙胺盐酸盐聚合物中的任何，条件是根据需要任选修饰烯丙胺和二烯丙胺。
6.根据权利要求5的用途，其中所述二烯丙胺盐酸盐聚合物是二烯丙胺盐酸盐共聚物。
7.根据权利要求5的用途，其中所述烯丙胺盐酸盐共聚物是烯丙胺盐酸盐和-SO2-的共聚物。
8.根据权利要求6的用途，其中所述二烯丙胺盐酸盐共聚物是二烯丙胺盐酸盐和-SO2-的共聚物。
9.根据权利要求4的用途，其中所述具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物是聚烯丙胺或者二烯丙胺盐酸盐和-SO2-的共聚物。
10.根据权利要求2的用途，其中所述低密度脂蛋白胆固醇通过使得过氧化物酶和色原体作用于从低密度脂蛋白胆固醇产生的过氧化氢以实施显色反应而测量，所述过氧化氢是由于胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的作用而从所述低密度脂蛋白胆固醇产生的。
11.用于测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的试剂，其包括(a)胆固醇酯酶、(b)胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶和(c)具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物。
12.用于测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的试剂盒，其包括(a)胆固醇酯酶、(b)胆固醇氧化酶、(c)过氧化物酶、(d)色原体和(e)具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物。
13.用于测量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的干燥分析元件，其包括(a)胆固醇酯酶、(b)胆固醇氧化酶、(c)过氧化物酶、(d)色原体和(e)具有烯丙胺或二烯丙胺单元的聚合物化合物。
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