CN102161754A

CN102161754A - 枝化状聚乙二醇衍生物的功能化修饰方法

Info

Publication number: CN102161754A
Application number: CN2010101185647A
Authority: CN
Inventors: 卢翠芬; 董念国; 史嘉玮; 洪昊; 陈思; 邹明晖; 周建良
Original assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2010-02-13
Filing date: 2010-02-13
Publication date: 2011-08-24
Anticipated expiration: 2030-02-13
Also published as: CN102161754B

Abstract

本发明提供了两种新的可以对蛋白质及多肽类药物实现定点修饰，且具有多个活性基团的枝化状PEG及其制备方法。与传统的线性PEG修饰剂相比，使枝化状PEG具备多个官能团，可同时携带多个生物活性分子，进一步改善被修饰药物的生物学性能。

Description

枝化状聚乙二醇衍生物的功能化修饰方法

技术领域

本发明属于生物医学和蛋白质化学领域，特别涉及枝化状聚乙二醇及其制备方法。

技术背景

聚乙二醇(PEG)是一种以重复乙二醇氧化乙烯为基础结构的长链大分子聚合物，因具有生物相容性好、对人体无毒、可降低被修饰物抗原性等优点而被广泛应用于蛋白质、多肽类药物及生物医用材料的改性修饰。然而在实际应用中，聚乙二醇修饰(PEG化)还存在一些问题，特别是蛋白质类药物PEG化后生物活性往往降低。近来有研究表明，当采用一种具有特殊结构的PEG进行修饰时，可以明显减少修饰后药物活性的损失，这种具有特殊结构的PEG被称为枝化状PEG(Branched PEG)。与直链PEG相比，枝化状PEG不仅可以最大限度地保留被修饰后药物的生物活性，而且其特有的“树枝状”结构更有效地保护蛋白质在体内不被水解，更有效地阻止抗体接近，从而大大增加蛋白质类药物在体内的循环半衰期，降低后者免疫源性。此外，枝化状PEG具有多个活性官能团，可携带多个生物活性分子如血管内皮生长因子(VEGF)、精-甘-天冬氨酸(RGD肽)等，进一步改善蛋白质、多肽类药物及生物医用材料的生物学性能。

利用氨基修饰是对蛋白质进行PEG化时的首选方案，然而这种方法存在不足，最突出的问题就是由于蛋白质分子中可反应的氨基通常不止一个而使产物中存在大量的异构体，而且如果氨基恰好处于蛋白质的生物活性位点上，则可能导致蛋白质的失活。对此目前的PEG化技术正朝着定点修饰方向发展，即修饰剂只在指定的位点发生反应。定点修饰不仅大幅度降低产物中异构体的生成，而且通过设计蛋白质分子上被修饰点的位置来尽可能地保留后者生物活性。

对半胱氨酸上的巯基进行修饰是修饰化学中最有效的定点修饰手段之一，因为在天然蛋白质中半胱氨酸通常含量很少，而通过基因工程技术可以用一个半胱氨酸替换蛋白质分子中的一个不重要的氨基酸残基。蛋白质化学中对巯基的研究由来已久，可与其反应的基团很多，其中丙烯酰基和乙烯砜基是最常用的两种官能团。巯基与丙烯酰基或乙烯砜基上的双键通过Michael加成反应结合，反应条件温和，且可在中性条件下反应。

丙烯酰基和乙烯砜基作为PEG衍生物的活性基团已被广泛地应用在对蛋白质及多肽药物的改性修饰上，但到目前为止，相关的修饰剂都是采用具有一至两个活性端基的线性PEG，对具有多个活性端基的枝化状PEG修饰剂尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供两种能够用于蛋白质、多肽类药物巯基定点修饰，且具有多个官能团的枝化状PEG及其制备方法。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：以市购PEG单体[HO(CH₂CH₂O)nH]为基础，在一定条件下合成两种枝化状PEG，其结构式为：

式中：n为50-500的整数，R为丙烯酰基或乙烯砜基。

制备该枝化状PEG的方法，包括下述步骤：

(1)取一定质量的PEG单体，溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺和甲基磺酰氯反应，得到中间体化合物3，反应温度为25-40℃，反应时间为6-12h，上述化合物的摩尔比为PEG∶甲基磺酰氯∶三乙胺＝1∶4-8∶4-8；

(2)取一定质量的化合物3，溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入碳酸铯和5-羟基间苯二甲酸甲酯，反应得到化合物4，反应温度为25-65℃，反应时间为6-24h，上述化合物的摩尔比为聚乙二醇甲基磺酸酯∶5-羟基间苯二甲酸甲酯∶碳酸铯＝1∶6-12∶6-12；

(3)取上述生成的化合物4在四氢呋喃溶液中，经氢化铝锂还原，得到化合物5，反应温度为0-70℃，反应时间为12-24h，上述化合物的摩尔比为化合物4∶氢化铝锂＝1∶6-12；

(4)取化合物5溶解于二氯甲烷溶液中，加入三乙胺和丙烯酰氯，反应得到本发明产物—枝化状聚乙二醇a-双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇。反应温度为25-40℃，反应时间为6-12h，上述化合物的摩尔比为化合物5∶丙烯酰氯∶三乙胺＝1∶6-12∶6-12。

(5)取化合物5溶解于二氯甲烷溶液中，加入氢化钠和二乙烯基砜，化合物5与二乙烯基砜反应得到本发明产物—枝化状聚乙二醇b-双(3，5-二乙烯磺酰氧甲基)苯基聚乙二醇。反应温度为25-40℃，反应时间为48-72h，上述化合物的摩尔比为化合物5∶氢化钠∶二乙烯基砜＝1∶10-20∶100-200。

上述化合物3、4、5的名称及结构式如下：

上述反应过程由如下反应式表示：

本发明提供了两种新型的可以对蛋白质及多肽类药物实现定点修饰，且具有多个活性基团的枝化状PEG及其制备方法。与传统的线性PEG修饰剂相比，使枝化状PEG具备多个官能团，可同时携带多个生物活性分子，进一步改善被修饰药物的生物学性能。

具体实施方式

通过以下实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1

取5g干燥的PEG₃₄₀₀溶于50mL无水二氯甲烷中，氩气保护条件下，加入3.34mL三乙胺和0.45mL甲基磺酰氯，室温反应12h(反应过程如下图)。反应液用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，冰乙醚重结晶，过滤。取过滤后的固体再次用冰乙醚洗涤三次，真空干燥，得到白色粉末状物质5.17g。该物质经红外光谱和¹H核磁共振检测分析，结果如下：IR(NaCl)：2883，1467，1280，1114，1061，946，842cm^-1；¹H NMR(CDCl₃)：2.84(6H，CH₃)，3.63-3.75((OCH₂CH₂)n)，3.85-3.90(4H，CH₂OSO₂)。该结果分析证实白色粉末为聚乙二醇甲基磺酸酯(化合物3)，经计算其纯度为99％。

实施例2

取5.0g干燥的聚乙二醇甲基磺酸酯溶于50mL二甲基甲酰胺中，氩气保护条件下，分别加入2.74g Cs₂CO₃和1.76g 5-羟基间苯二甲酸甲酯，室温反应24h，反应过程如下图：

减压蒸馏除去二甲基甲酰胺，残余物用50mL二氯甲烷溶解，过滤除去不溶物。取过滤后的固体再次用冰乙醚洗涤三次，真空干燥，得到5.31g白色粉末状物质。该物质经红外光谱和¹H核磁共振检测分析，结果如下：IR(NaCl)：2885，1725，1466，1280，1111，963，842，760cm^-1；¹H NMR：3.60-3.96(CH₃，(OCH₂CH₂)n)，4.22(4H，CH₂OAr)，7.77(4H，Ar)，8.28(2H，Ar)。结果分析证实，白色粉末物质为双(3，5-二甲氧羰基)苯基聚乙二醇(化合物4)。经计算其纯度为95.5％。

实施例3

取4.85g干燥的双(3，5-二甲氧羰基)苯基聚乙二醇溶于50mL无水四氢呋喃中，在0℃下缓慢加入0.29g氢化铝锂(LiAlH₄)，搅拌过夜，反应方程式如下：

冰浴搅拌下缓慢滴加2.5mL 10％HCl，过滤，二氯甲烷洗涤三次。洗涤后的滤液经减压浓缩得白色固体物质，然后用二氯甲烷溶解白色固体，饱和氯化钠水溶液洗涤三次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，冰乙醚重结晶，过滤。取过滤后的固体再次用冰乙醚洗涤三次，真空干燥，得到4.36g白色粉末状物质。该物质经红外光谱和¹H核磁共振检测分析，结果如下：IR(NaCl)：3459，2882，1467，1280，1115，946，842cm^-1；¹H NMR：3.65-3.94((OCH₂CH₂)n)，4.18(4H，CH₂OAr)，4.82(8H，CH₂Ar)，6.58-6.69(6H，Ar)。结果分析证实，白色粉末状物质为双(3，5-二羟甲基)苯基聚乙二醇(化合物5)。经计算其纯度为92.9％。

实施例4

取4.15g干燥的双(3，5-二羟甲基)苯基聚乙二醇(化合物5)溶解于50mL二氯甲烷中，在氩气保护条件下，加入0.94mL三乙胺，然后缓慢滴加0.58mL丙烯酰氯，室温搅拌过夜，反应方程式如下：

反应液用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，冰乙醚重结晶，过滤。取过滤后的固体再次用冰乙醚洗涤三次，真空干燥，得到3.86g白色粉末状物质。该物质经红外光谱和¹H核磁共振检测分析，结果如下：IR(NaCl)：2883，1723，1467，1280，1112，946，842cm^-1；¹H NMR(CDCl₃)：3.51-3.86((OCH₂CH₂)n)，4.14(4H，CH₂OAr)，5.16(8H，CH₂-Ar)，5.88(4H，CH＝)，6.16(4H，CH₂＝)，6.44(4H，CH₂＝)，6.90-6.96(6H，Ar)；¹³C NMR(CDCl₃)：166.2，159.3，137.5，131.2，128.0，113.9，70.5。结果分析证实，该白色粉末状物质为双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇。经计算其纯度为87.8％。

实施例5

取4.15g干燥的双(3，5-二羟甲基)苯基聚乙二醇(化合物5)溶于30mL无水二氯甲烷中，在氩气保护条件下，缓慢加入0.27g氢化钠和11.33mL二乙烯基砜，室温反应72h，反应方程式如下：

反应后的溶液用冰醋酸中和至pH＝7，过滤除去不溶物。再将滤液用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，冰乙醚重结晶，过滤。取过滤后的固体再次用冰乙醚洗涤三次，真空干燥，得到4.36g白色粉末状物质。该物质经红外光谱和¹H核磁共振检测分析，结果如下：IR(NaCl)：2885，1467，1330，1280，1112，946，842cm^-1；¹H NMR(CDCl₃)：3.51-3.86((OCH₂CH₂)n)，4.14(4H，CH₂OAr)，4.82(8H，CH₂-Ar)，6.12(4H，CH₂＝)，6.45(4H，CH₂＝)，6.82(4H，CH₂＝)，6.82-6.89(6H，Ar)；¹³C NMR(CDCl₃)：159.7，137.9，125.6，122.2，120.3，113.7，70.8，69.6，66.5。结果分析证实，该白色粉末状物质为双(3，5-二乙烯磺酰氧甲基)苯基聚乙二醇。经计算其纯度为95.8％。

Claims

1.枝化状PEG，其特征在于，具有以下结构式：

式中：

R为

n为50-500的整数。

2.权利要求1所述的枝化状PEG的制备方法，包括以下步骤：

(1)取一定质量的PEG单体，溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺和甲基磺酰氯反应，上述化合物的摩尔比为PEG∶甲基磺酰氯∶三乙胺＝1∶4-8∶4-8；反应温度为25-40℃，反应时间为6-12h，得到以下中间体化合物3；

(2)取一定质量的化合物3，溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入碳酸铯和5-羟基间苯二甲酸甲酯，上述化合物的摩尔比为聚乙二醇甲基磺酸酯∶5-羟基间苯二甲酸甲酯∶碳酸铯＝1∶6-12∶6-12，反应温度为25-65℃，反应时间为6-24h，反应得到以下化合物4；

(3)取上述生成的化合物4在四氢呋喃溶液中，经氢化铝锂还原，上述化合物的摩尔比为化合物4∶氢化铝锂＝1∶6-12；反应温度为0-70℃，反应时间为12-24h，得到以下化合物5，

(4)取化合物5溶解于二氯甲烷溶液中，加入三乙胺和丙烯酰氯，上述化合物的摩尔比为化合物5∶丙烯酰氯∶三乙胺＝1∶6-12∶6-12；反应温度为25-40℃，反应时间为6-12h，反应得到本发明产物枝化状聚乙二醇a-双(3，5-二丙烯酰氧甲基)苯基聚乙二醇；

或

取化合物5溶解于二氯甲烷溶液中，加入氢化钠和二乙烯基砜，化合物5与二乙烯基砜反应得到本发明产物枝化状聚乙二醇b-双(3，5-二乙烯磺酰氧甲基)苯基聚乙二醇，反应温度为25-40℃，反应时间为48-72h，上述化合物的摩尔比为化合物5∶氢化钠∶二乙烯基砜＝1∶10-20∶100-200。