CN102146421A - 一种避孕药中间体的发酵还原新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种紧急避孕药左炔诺孕酮的中间体羟化物D-18-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-Δ1，3，5(10)，9(11)-雌甾四烯-17-β-醇-14-酮的发酵还原新方法，其特征在于：本方法采用干酿酒酵母作为菌种，发酵还原左炔诺孕酮中间体缩合物，得到中间体羟化物。本方法发酵过程易于控制，菌种活性易于保持，降低了生产周期，产物收率高，质量稳定，适合于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物中间体的合成，具体地说是避孕药左炔诺孕酮中间体--D-18-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-Δ1，3，5(10)，9(11)-雌甾四烯-17-β-醇-14-酮的发酵还原新方法。
背景技术
左炔诺孕酮：(L-(-)17a-乙炔基-17B-羟基-18-甲基雌甾-4-烯-3-酮，英文名Levonorgestre，CAS号797-63-7)为长效雌激素，口服后经胃肠道吸收，贮存于脂肪组织内，缓慢释放出炔雌醇，通过抑制丘脑下部-垂体-卵巢轴来抑制卵巢排卵，达到长效避孕作用，孕激素与其配伍，对抑制排卵既有协同作用，是目前应用较广的一种口服避孕药。羟化物D-18-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-Δ1，3，5(10)，9(11)-雌甾四烯-17-β-醇-14-酮是合成左炔诺孕酮的重要中间体，其结构如下：
目前该羟化物的制备方法是：通过萘满酮经格氏反应与乙基D环缩合得到缩合物18-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-Δ1，3，5(10)，9(11)-雌甾四烯-14，17-双酮(I)，再用啤酒酵母发酵还原缩合物得到羟化物D-18-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-Δ1，3，5(10)，9(11)-雌甾四烯-17-β-醇-14-酮(II)。发酵过程需经过选种，一、二、三级种子培养，发酵还原等步骤。需经过十天时间，还原收率65％。因此，这一流程存在生产周期长、设备占用量大、成本能耗高，不利于工业化规模生产。而且，啤酒酵母在选种、培养过程中条件要求苛刻，易染杂菌，难以控制。
为了控制甾体结构上17位酮基能够被充分还原，选择酵母菌菌种是十分关键的。有一部分的啤酒酵母能够起到定向还原的作用。一般来说，这部分菌种还不能直接用于发酵，需要经过紫外诱变筛选，将诱变后的菌种置于培养基和培养液中逐级培养，从中提取菌丝体用于发酵还原缩合物。这一过程需要经过种子筛选、诱变、恒温培养、一二三级种子发酵、菌丝体制备及发酵还原等步骤，时间需要12-15天，还原的效率低，需要被还原底物10倍大大过量的菌丝体。很显然，该方法在生产周期、物料消耗、能源消耗、产品收率等方面都不尽如人意。
发明内容
本发明针对上述问题，需要找到一种效率更高的菌种，用于避孕药左炔诺孕酮中间体D-18-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-Δ1，3，5(10)，9(11)-雌甾四烯-17-β-醇-14-酮的发酵还原，提高定向还原的收率，同时能够缩短还原发酵的时间，降低成本，提高产率。
本发明所述的中间体羟化物D-18-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-Δ1，3，5(10)，9(11)-雌甾四烯-17-β-醇-14-酮是由缩合物18-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-Δ1，3，5(10)，9(11)-雌甾四烯-14，17-双酮发酵还原生成，其特征在于：本方法中采用干酿酒酵母作发酵还原菌体，先活化干酿酒酵母后制得发酵液，再加入缩合物在催化剂下进行发酵还原，生成羟化物。
在本发明中，羟化物是通过下述步骤得到：
(一)干酿酒酵母的活化
在该步骤中，干酿酒酵母选用的是具有特定还原活性的酵母菌菌丝体，活化剂选用蔗糖、葡萄糖、果糖或麦芽糖，优选蔗糖。干酿酒酵母的活化是将干酿酒酵母和活化剂加入到以干酿酒酵母质量计5～10倍的水中，在29±1℃条件下活化时间2～5小时，制成具有还原活性的干酿酒酵母液。
干酿酒酵母用量为以缩合物质量的1～3倍。
活化剂的用量为以干酿酒酵母质量计的8～15％。
制得的干酿酒酵母液用4～6倍量的水稀释而制成发酵液。
(二)缩合物的发酵还原
缩合物的发酵还原生成羟化物的反应条件为在催化剂的存在下，在29±1℃条件下通入空气，发酵72～120小时。
所述催化剂为山梨醇或甘露醇，优选山梨醇；用量为以缩合物质量计0.01～0.05倍。
发酵温度要求十分严格，只能在29±1℃条件下进行。
发酵时，空气通入量为发酵液体积的1～2倍。
发酵的进程通过HPLC或薄板层析等方法进行监测，一般来说，发酵时间为72～120小时。
本发明的有益效果：经过大量的菌种筛选、培养和试验工作，用干酿酒酵母作还原发酵菌体，即，先用活化剂活化干酿酒酵母，再在催化剂作用下还原缩合物，转化为羟化物。该技术方案省去了种子筛选、诱变、培养、一二三级种子发酵、菌丝体制备等多道工序，大大简化了方法。由于干酿酒酵母的还原活性优于啤酒酵母，还原后羟化物的收率能达到75～80％，提高了10～15个百分点。
将本发明方法与原方法的效果进行对比，如表1所示。
表1本发明方法与原方法效果对照表：
因此，本发明方法较原方法具有较大优势：设备需要量大幅减少；工序简单；工序用时大大减少，生产周期大幅缩短；收率有一定的提高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。本发明对其加入量进行限定，只是便于本发明的实施，并不说明在本发明所限定的范围外不能实施。
实施例1
2000ml三角瓶中加入600ml经灭菌的水，加入10g蔗糖，120g干酿酒酵母，用七层干净纱布扎口，于30℃恒温水浴中放置2小时，取样于计数板在显微镜下计数，菌数达8×1027/cm2以上时，完成活化。5L发酵罐中加入3000ml水，夹套通入0.3Mpa蒸汽加热至121℃并保温30分钟，然后降温至29℃。加入活化的发酵液。称取缩合物50g，用150ml乙醇60℃下溶解，慢慢滴入发酵罐中，加毕，再加入山梨醇2ml。设定发酵罐温度为29℃，空气流量5L/min，发酵96小时后取样点板，当原料点完全消失，发酵转化结束。用3000转/分离心机分离发酵菌丝，分别用200ml乙醇萃取菌丝2次，合并乙醇液，减压蒸馏至乙醇体积的一半，-5℃下结晶，过滤，烘干，得羟化物40g，HPLC纯度98.5％。
实施例2
2000ml三角瓶中加入600ml经灭菌的水，加入15g葡萄糖，100g干酿酒酵母，用七层干净纱布扎口，于30℃恒温水浴中放置3小时，取样于计数板在显微镜下计数，菌数达8×1027/cm2以上时，完成活化。5L发酵罐中加入3000ml水，夹套通入0.3Mpa蒸汽加热至121℃并保温30分钟，然后降温至29℃。加入活化的发酵液。称取缩合物50g，用150ml乙醇60℃下溶解，慢慢滴入发酵罐中，加毕，再加入甘露醇2ml。设定发酵罐温度为29℃，空气流量5L/min，发酵96小时后取样点板，当原料点完全消失，发酵转化结束。用3000转/分离心机分离发酵菌丝，分别用200ml乙醇萃取菌丝2次，合并乙醇液，减压蒸馏至乙醇体积的一半，-5℃下结晶，过滤，烘干，得羟化物38.3g，HPLC纯度98.5％。
实施例3
2000ml三角瓶中加入600ml经灭菌的水，加入15g麦芽糖，120g干酿酒酵母，用七层干净纱布扎口，于30℃恒温水浴中放置5小时，取样于计数板在显微镜下计数，菌数达8×1027/cm2以上时，完成活化。5L发酵罐中加入3000ml水，夹套通入0.3Mpa蒸汽加热至121℃并保温30分钟，然后降温至29℃。加入活化的发酵液。称取缩合物50g，用150ml乙醇60℃下溶解，慢慢滴入发酵罐中，加毕，再加入甘露醇2ml。设定发酵罐温度为29℃，空气流量5L/min，发酵96小时后取样点板，当原料点完全消失，发酵转化结束。用3000转/分离心机分离发酵菌丝，分别用200ml乙醇萃取菌丝2次，合并乙醇液，减压蒸馏至乙醇体积的一半，-5℃下结晶，过滤，烘干，得羟化物37.8g，HPLC纯度98.5％。
Claims (8)
1.一种避孕药中间体的发酵还原新方法，该中间体羟化物D-18-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-Δ1，3，5(10)，9(11)-雌甾四烯-17-β-醇-14-酮是由缩合物18-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-Δ1，3，5(10)，9(11)-雌甾四烯-14，17-双酮发酵还原生成，其特征在于：本方法中采用干酿酒酵母作发酵还原菌体，先活化干酿酒酵母后制得发酵液，再加入缩合物在催化剂下进行发酵还原，生成羟化物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵液的制备是将活化的干酿酒酵母液用4～6倍量的水稀释而制得。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：干酿酒酵母的活化是将干酿酒酵母和活化剂加入到以干酿酒酵母质量计5～10倍的水中，在29±1℃条件下活化时间2～5小时，制成具有还原活性的干酿酒酵母液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：干酿酒酵母用量为缩合物质量的1～3倍。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述活化剂选用蔗糖、葡萄糖、果糖或麦芽糖，用量为干酿酒酵母质量的8～15％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：缩合物发酵还原生成羟化物的反应条件为在催化剂的存在下，在29±1℃条件下通入空气，发酵72～120小时。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于：所述催化剂为山梨醇或甘露醇，用量为以缩合物质量计的0.01～0.05倍。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：空气通入量为发酵液体积的1～2倍。
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