CN102141520B

CN102141520B - 三聚氰胺快速现场检测试剂及检测方法

Info

Publication number: CN102141520B
Application number: CN2010106161460A
Authority: CN
Inventors: 杨水云; 张孝宗; 段安虎; 房磊
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-12-30
Also published as: CN102141520A

Abstract

本发明公开了一种三聚氰胺快速现场检测试剂及检测方法，向20-25％的三氯乙酸水溶液中加入AlCl₃、ZnCl₂或MgCl₂得提取剂，使其离子浓度为10-30mmol/L；配制CuCl₂的饱和水溶液作为指示剂；按体积份数将4-5份液态试样与1份提取剂充分混合得提取液，去除提取液中的沉淀得待检测液；按体积份数将1份指示剂加入20份待检测液中混匀，并观察沉淀生成情况。与国标上已有的检测方法相比，本发明的检测原理不同于色谱分析检测方便快捷，检测时间缩短到10-20分钟，本检测方法下限不大于30mg/kg，满足一般检测要求，可以作为国标检测的辅助手段，检测对象的范围广。

Description

三聚氰胺快速现场检测试剂及检测方法

技术领域

本发明涉及食品及饲料安全监测中三聚氰胺的快速定性检测技术，特别涉及一种乳粉、蛋白粉、动物饲料和液体乳制品中三聚氰胺快速现场检测试剂及检测方法。

背景技术

三聚氰胺(Mel)是一种用途广泛的具有氮杂环结构的有机化工原料，因其结构中不仅有氮杂环且含有多个氨基氮，使其含氮量高达66％以上，因此Mel被一些不法商贩添加到商品中以虚高商品蛋白含量。2007年美国发生的猫狗宠物非正常死亡事件以及2008年国内的奶粉事件都由此造成。

目前，检测Mel的主要方法是高压液相色谱法、液质联用和气质联用等，不仅对仪器、操作人员素质及实验室要求都很高，检测费时且运行费用高，也难以满足现代食品安全现场监测对检测方法简单、快速、便携的要求。

自从2008年国家征集Mel快速监测方法以来，有数十个Mel检测专利技术问世，其中大部分是采用免疫学原理而研发的ELISA试剂盒，检测特异性强，敏感度相对高，但试剂盒制备中涉及Mel完全抗原的制备、动物免疫、Mel与酶的交联等复杂程序，试剂成本价格高。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种对奶粉、蛋白粉、饲料以及酸奶、鲜乳等样品中Mel进行简单、快速的定性检测、价格低廉、适宜于非专业人员操作的便携式三聚氰胺快速现场检测试剂。

本发明的第二个目的在于提供一种采用该检测试剂进行三聚氰胺快速现场检测的方法。

为达到上述目的，本发明三聚氰胺快速现场检测试剂包括三聚氰胺提取剂和三聚氰胺指示剂，所述提取剂由20-25g/100mL的三氯乙酸水溶液与AlCl₃、ZnCl₂或MgCl₂混合而成，三聚氰胺提取剂中Al、Zn或Mg的离子浓度为10-30mmol/L，所述三聚氰胺指示剂为CuCl₂的饱和水溶液。

本发明的检测方法包括如下步骤：

1)提取剂制备：向20-25g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入AlCl₃、ZnCl₂或MgCl₂得提取剂，提取剂中Al、Zn或Mg的离子浓度为10-30mmol/L；

2)指示剂制备：配制CuCl₂的饱和水溶液作为指示剂；

3)提取：将液态试样与提取剂按3-4∶1的体积比充分混合得提取液，去除提取液中的沉淀得待检测液；

4)检测和结果判读：将指示剂与待检测液按1∶20的体积比混匀，若混匀后的溶液为天蓝色浑浊液，则说明试样中含有三聚氰胺，浊度越高则含量越大，含量低于30mg/kg的待检测液则为清澈透亮的天蓝色溶液。

所述液态试样包括液态样品以及35-50g/100mL的固态样品水溶液。

所述提取液中沉淀的去除方法为：将提取液超声处理2分钟，然后于4000g离心力下离心3-5分钟；或者用经过4-5倍稀释的提取剂润湿滤纸，然后用润湿的滤纸过滤提取液。

本发明的有益效果体现在：

1)与国标检测方法相比，本发明的检测原理不同于色普分析，对设备要求低耗资少，而且大大提高检测效率，节省劳动量。国标法(高压液相色谱法等)除过需要昂贵的设备和专业的操作人员外，过程步骤复杂，一个样品检测需数小时才能完成；本检测方法无需设备，检测试剂廉价、简单，而且检测时间缩短到10-20分钟，满足科技部对快速检测方法的时间(30分钟)要求。

2)本检测方法可组装成试剂盒，检测方便快捷。由于检测试剂简单、检测组件体积小巧，依此组装的试剂盒小巧便携；检测方法简单；沉淀反应快速，适合于现场快速报告；结果鲜明便于目测辨别，使用极其方便简单，大大简化了检测程序。满足当前食品安全检测对检测方法“简单、快速、便携”的要求，适合于现场筛查和监督。

3)本检测方法灵敏度不高于3mg/100mL或30mg/kg。，满足一般检测要求，可以作为国标检测的辅助手段。凡使用此法检测结果为阳性者，均可肯定三聚氰胺掺假，无需再用高精仪器检测。这样便可大大减轻工作量，减少耗资并缩短检测时间，提高检测效率。

4)检测对象的范围广，市场范围宽，可以提供给食品安全监管相关部门用于劣质产品筛查。

附图说明

图1为不同金属水溶液与三聚氰胺的定性反应；

图2为三聚氰胺分子式；

图3为Cu(II)与三聚氰胺分子间的配合体平面结构；

图4为不同含量MEL掺假鲜乳的检测结果；

图5为不同含量MEL掺假玉米面的检测结果；

图6为MEL掺假酸牛乳的检测结果；

图7为不同含量MEL掺假蛋白粉的检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

一、三聚氰胺快速现场检测试剂包括三聚氰胺提取剂和三聚氰胺指示剂：

三聚氰胺提取剂的制备：向20-25g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入AlCl₃、ZnCl₂或MgCl₂得三聚氰胺提取剂，三聚氰胺提取剂中Al、Zn或Mg的离子浓度为10-30mmol/L；本发明采用低浓度金属离子破坏蛋白胶体水化膜协助三氯乙酸彻底沉淀蛋白质，提取剂是能沉淀蛋白质但可溶解三聚氰胺的溶液。乳品蛋白质完全沉淀需要采用终浓度为12g/100mL的三氯乙酸(ISO8968)；但实验证明，此浓度不适宜于三聚氰胺检测，因为10g/100mL以上浓度的三氯乙酸将会导致三氯乙酸共沉，因而可能导致假阴性结果。本发明在多次实验基础上，采用低浓度金属离子的联合作用，降低了蛋白质完全沉淀对三氯乙酸的浓度要求，协助三氯乙酸在较低浓度下快速彻底沉淀蛋白，此方案未见报道。经实验证实该提取剂对蛋白质的沉淀效果十分理想，也不会使三聚氰胺产生沉淀。

三聚氰胺指示剂的制备：三聚氰胺指示剂为氯化铜的饱和溶液，参考质量体积浓度为75g/100mL。指示剂是可以与三聚氰胺发生特异性沉淀反应、表现出肉眼可见浑浊现象的溶液。

二、具体的检测操作方法：

2)指示剂制备：配制CuCl₂的饱和水溶液作为指示剂；

3)样品中Mel的提取：此步骤目的是将样品中的Mel抽提至提取剂中，并使样品中的蛋白质和对后续检测有干扰的物质被沉淀除去。操作过程为，如果待检样为粉末状固体(蛋白粉、奶粉、饲料等)，首先要将其配制成35-50g/100mL的液态试样待用。若为液体样品(鲜乳，发酵乳等)则直接作为液态试样；将液态试样与提取剂按3-4∶1的大体积比充分混合得提取液，将提取液超声处理2分钟，然后于4000g离心力下离心3-5分钟，去除沉淀并取上清液做为待检测液，或者用经过4-5倍稀释的提取剂润湿滤纸，然后用润湿的滤纸过滤提取液去除沉淀，取滤液作为待检测液。

4)检测与结果判读：将指示剂与待检测液按1∶20的体积比混匀，若混匀后的溶液为蓝色浑浊液，则说明试样为含Mel且浓度超过30mg/kg的问题乳，浊度越高，含量越大；含量低于30mg/kg的待检测液则为清澈透亮的天蓝色溶液。

所使用技术原理及产品工作原理

本检测过程实质上是顺序偶联的2个选择性沉淀反应。首先采用提取剂从样品中提取溶解Mel，同时沉淀去除蛋白质等悬浮态大分子杂质，方便下步反应现象观察；第二步则是用Mel特异的沉淀反应指示提取液中究竟有没有Mel存在。以下分别介绍待检样品中杂质和Mel的性质及其检测原理。

1、待检样品的理化性质和其中蛋白质的沉淀原理

人为添加Mel的目的都是为了虚高产品的蛋白含量以欺骗消费者，因此被加入Mel的产品常常是对蛋白含量有要求的商品。比如动物饲料、乳制品、蛋白粉等。因此本发明方法的检测对象主要为蛋白质相关食品和动物饲料。

乳制品和蛋白粉中，影响Mel沉淀现象观察的主要成分为蛋白质，饲料中还包括一些固体颗粒。按照Mel提取剂的功能要求，既不能含有导致Mel沉淀的任何组分，又要能去除可溶性沉淀蛋白质。饲料中的固体小颗粒可以通过离心或者过滤方便去除，而悬浮在水溶液中的蛋白质胶体颗粒理论上可以采用传统的三氯乙酸沉淀而去除。

传统蛋白沉淀的三氯乙酸浓度为12％[国际标准ISO 8968-4]，但当体系中三氯乙酸浓度超过10％时，将会和浓的Mel作用使其沉淀析出，但在7％以下时只沉淀蛋白不沉淀Mel。本发明通过在三氯乙酸溶液中加入少量不与Mel发生作用的硬酸金属离子，Al(III)、Zn(II)和Mg(II)可以降低蛋白质特异沉淀对三氯乙酸浓度的要求，也可加快三氯乙酸沉淀蛋白的速度，达到低浓度三氯乙酸快速完全沉淀蛋白质的目的。

其原理是，硬酸金属盐不和Mel发生沉淀反应，但硬酸金属离子的加入促进蛋白质胶体的水化膜破坏，使蛋白质分子与三氯乙酸便于直接接触而沉淀，金属盐相当于催化剂的作用。三氯乙酸是蛋白质变性剂[郭立安，阎哲，张晓楠，三氯乙酸对蛋白质结构稳定性的影响.第四军医大学学报，2001.22(22)：p.2113]，在水溶液中以三氯乙酸根负离子形式存在，在酸性条件下蛋白质带正电荷，-NH₃ ⁺基团则与三氯乙酸根负离子结合形成不溶性三氯乙酸蛋白盐而沉淀。

2、Mel检测用特异性沉淀原理

实验采用不同盐离子进行了Mel的沉淀实验，结果如图1所示。其中a为AICl₃、b为MgCl₂、c为ZnCl₂、d为CuCl₂和三聚氰胺的定性反应，各组左侧为纯水替代三聚氰胺溶液的空白对照。a、b、c右：10mmol/L金属盐溶液和0.2g/100mL三聚氰胺等体积混合液；d右，0.1g/100mL三聚氰胺溶液中加入一滴饱和CuCl₂溶液，可见Al(III)、Mg(II)、Zn(II)不能沉淀Mel，因此可以选用其作为三氯乙酸沉淀蛋白质的催化剂；而Cu(II)可导致Mel沉淀，因此Cu(II)可作为提取液中Mel的检测指示剂。

Mel的结构如图2所示，从结构化学基本理论可知，其6元杂环上的三个氨基(-NH₂)中的N是sp³杂化的四面体结构，N在四面体中心，2个H和六元环各占一个顶点，另一个顶点是N原子上的一对孤对电子。这孤对电子具有给出电子的能力，因此可以和具有空轨道的过渡金属形成配合物。而六元杂环中的三个N原子，杂化方式为sp²，杂化后剩余的一个单电子与碳的单电子形成六中心六电子的大π键，六个原子在一个平面上，因此环内N的配位能力非常弱而难以与金属离子发生作用。

虽然杂环p-π共轭体具有拉环外氨基N电子的作用，但鉴于环外具有足够数量(3个)的sp³杂化的氨基，使氨基N电子云向环内偏向的程度不会太大，因此推测杂环外氨基的软硬程度与属于交界碱的苯胺(C₆H₅NH₂)是相当的，属于交界碱的范畴。根据软硬酸碱理论，交界酸与交界碱反应速度快、且可形成稳定的配合物，Cu(II)离子属于偏软的交界酸之一，因此易和杂环外氨基形成配合物。

Mel属于三齿配体，从结构化学看属于C₃点群对称性分子，但因杂环平面的刚性结构，使分子内氨基之间难以接近，环外氨基与Cu(II)金属离子间的配合物更可能在分子间形成，因此属于非螯合多啮配位体。从配位化学原理可知，非螯合多啮配位体所形成的多核配位化合物往往是不溶性沉淀，常作沉淀剂使用。因此可以推知，Cu(II)等交界酸金属离子可以将溶液中的Mel分子彼此交联在一起，当交联物足够大的时候，就会形成沉淀而析出。理论上，体系中存在的所有Mel分子都可能被交联成超大分子结构而沉降，因此呈现出了高敏感性的特点。

Cu(II)离子与N之间的配位数是4，且属于D4h点群平面结构，因此可推测，Cu(II)与Mel之间形成的分子间配位化学物结构的如图3所示。

实施例1：鲜牛乳中系列浓度三聚氰胺的检测

模拟掺假乳制备：分别取0.5、2.5、5、7.5、10和12.5mL的2mg/mL的三聚氰胺母液，用鲜牛乳补足到100mL则形成10、50、100、150、200、250mg/L的梯度浓度的三聚氰胺模拟掺假乳液，同时取未加三聚氰胺的鲜牛乳为阴性对照；

提取剂配制：向20g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入ZnCl₂得提取剂，提取剂中Zn离子的浓度为20mmol/L；

指示剂制备：用纯水配制CuCl₂的饱和水溶液作为指示剂；

提取：分别将Mel掺假乳与提取剂按3∶1的体积比充分混合得提取液，发生蛋白质沉淀，用经过4倍稀释的提取剂润湿滤纸，然后用润湿的滤纸将沉淀过滤，收集滤液；

检测：将指示剂与滤液按1∶20的体积比将指示剂加入滤液中混匀(分别取滤液3mL并加入指示剂3滴(1滴相当于50uL))，当Mel含量低于30mg/kg时，溶液清澈透明，跟阴性对照相当；当Mel含量高于30mg/kg时，溶液产生Mel与氯化铜反应生成的天蓝色浑浊，浑浊度与掺假乳中Mel的含量成正相关，结果清晰可辨，结果如图4所示。

实施例2：玉米面饲料中三聚氰胺的检测

模拟掺假饲料制备：称取3份玉米面各50g，分别加入0、1和2.5mL的2mg/mL的三聚氰胺母液，相应的三聚氰胺含量则为0、40和100mg/kg。充分拌匀则成为掺假玉米面。分别加纯水至总体积为100mL，混匀成糊状待检；

配制提取剂：向25g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入MgCl₂得提取剂，提取剂中Mg离子的浓度为30mmol/L；

指示剂制备：用纯水配制CuCl₂的饱和水溶液作为指示剂；

提取：分别将糊状待检物与提取剂按4∶1的体积比充分混合得提取液，超声处理2分钟，然后在4000g离心力下离心3分钟，收集上清液，弃去沉淀；

检测：将指示剂与上清液按1∶20的体积比将指示剂加入上清液中混匀(分别取8mL上清液并加入指示剂8滴(一滴相当于50uL)混匀)，结果如图5所示，混有Mel的两个待检中出现天蓝色浑浊，而阴性对照则清澈透明无浑浊，清晰可辨。

实施例3：酸奶中三聚氰胺的检测

模拟掺假酸奶制备：取100mL的酸奶2份，其中一份加入4mL的2mg/mL的三聚氰胺母液，相应的三聚氰胺含量则为80mg/L；另一份作为阴性对照；

配制提取剂：向22g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入AlCl₃得提取剂，提取剂中Al离子的浓度为10mmol/L；

指示剂制备：用纯水配制CuCl₂的饱和水溶液作为指示剂；

三聚氰胺的提取：将掺假酸奶以及阴性对照与提取剂按3.5∶1的体积比充分混合得提取液，超声处理2分钟，然后在4000g离心力下离心5分钟，分别收集上清液，弃去沉淀；

三聚氰胺的检测：将指示剂与上清液按1∶20的体积比将指示剂加入上清液中混匀(分别取5mL上清液并加入指示剂5滴(一滴相当于50uL)混匀)，结果如图6所示，混有Mel的两个待检中出现天蓝色浑浊，而阴性对照则清澈透明无浑浊，清晰可辨。

实施例4 蛋白粉中三聚氰胺的检测

模拟掺假蛋白粉的制备：从市场上购买蛋白粉商品，称取6份，每份35g，给其中分别加入0、0.35、0.7、1.05、1.4和1.75mL的0.2g/100mL的三聚氰胺母液，相应蛋白粉中的三聚氰胺含量则分别对应为0、20、40、60、80和100mg/kg.充分拌匀则成为掺假蛋白粉。分别加水至总体积为100mL，混匀成蛋白溶液待检；

配制提取剂；向25g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入AlCl₃得提取剂，提取剂中Al离子的浓度为30mmol/L；

指示剂制备：用纯水配制CuCl₂的饱和水溶液作为指示剂；

提取：分别取6种糊状待检物与提取剂按3∶1的体积比充分混合得提取液，旋震荡充分混匀，发生蛋白质沉淀，用经过5倍稀释的提取剂润湿滤纸，然后用润湿的滤纸将沉淀过滤，收集滤液；

将指示剂与6分滤液分别按1∶20的体积比将指示剂加入滤液中混匀(分别取4mL滤液并加入指示剂4滴(一滴相当于50uL)混匀)，对比观察，结果如图7所示，可见，当Mel含量低于30mg/kg时，溶液清澈透明，跟阴性对照相当；当Mel含量高于30mg/kg时，溶液产生Mel与氯化铜反应生成的天蓝色浑浊，浑浊度与掺假乳中Mel的含量成正相关，Mel含量为20mg/kg的蛋白粉试样结果介于阴阳性之间，说明该浓度接近检测下限，阴性对照则清澈透明无浑浊，结果清晰可辨。

以上实施例说明该发明方法是可行的。

Claims

1.三聚氰胺快速现场检测试剂，其特征在于：包括三聚氰胺提取剂和三聚氰胺指示剂，所述提取剂由20-25g/100mL的三氯乙酸水溶液与AlCl₃、ZnCl₂或MgCl₂混合而成，三聚氰胺提取剂中Al、Zn或Mg的离子浓度为10-30mmol/L，所述三聚氰胺指示剂为CuCl₂的饱和水溶液。

2.三聚氰胺快速现场检测方法，其特征在于包括如下步骤：

2)指示剂制备：配制CuCl₂的饱和水溶液作为指示剂；

3.根据权利要求2所述三聚氰胺快速现场检测方法，其特征在于：所述液态试样包括液态样品以及35-50g/100mL的固态样品水溶液。

4.根据权利要求2所述三聚氰胺快速现场检测方法，其特征在于：所述提取液中沉淀的去除方法为：将提取液超声处理2分钟，然后于4000g离心力下离心3-5分钟；或者用经过4-5倍稀释的提取剂润湿滤纸，然后用润湿的滤纸过滤提取液。