CN102127518B - 一种用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基 - Google Patents
一种用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基。每升本发明选择性培养基由如下组分组成：葡萄糖1~10g，酵母膏1~5g，胰蛋白胨5~10g，氯化钙0.2~2g，硫酸镁0.1~1g，琼脂15~20g和抑菌剂100~500IU。本发明用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基通过变温培养，可以提高常规平板计数法对芽孢杆菌的选择性，消除待测样品中其它微生物或杂质的影响，达到快速定量检测芽孢杆菌的目的。
Description
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌检测领域，具体涉及一种用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基。
背景技术
随着养殖环境的恶化，养殖过程中水质问题日益突出。目前芽孢杆菌制剂作为主要水质改良产品，广泛应用于水产养殖行业。在养殖池塘中芽孢杆菌的生长繁殖是芽孢杆菌发挥作用的前提条件。同时池塘中芽孢杆菌的数量变化情况是确定产品使用频率的依据。因此跟踪检测池塘中芽孢杆菌的数量变化至关重要。但是由于池塘中细菌种类繁多，而且芽孢杆菌在水体中往往不属于优势种群，芽孢杆菌的数量往往都在104CFU/ml以下，目前常规的检测方法都存在一定的缺陷。
目前常见的芽孢杆菌计数方法有平板计数法，最大或然数法和定量PCR法等。由于其他细菌的干扰，常规的平板计数法和最大豁然数法不能选择性的检测芽孢杆菌数量。目前检测水体中芽孢杆菌的方法为先将样品80℃水浴处理20min后进行平板计数，该方法的缺陷在于不能检测芽孢杆菌的总数，而是仅仅检测芽孢杆菌中处于休眠状态的芽孢杆菌数量。该方法得到的数据不能用于跟踪芽孢杆菌在水体中的繁殖情况。常用的荧光定量PCR的方法可以水体中特定菌株的含量，但该方法需要昂贵的仪器设备，工序复杂，且检测费用大。同时其他细菌会干扰引物和探针的特异性，水体中存在的有机和无机悬浮物会影响RNA的提取，进而降低荧光定量PCR方法的可重复性。中国专利申请（200510126211.0）公开了一种微生物肥料中的芽孢杆菌数量的检测方法，该方法主要是将待测样品稀释液先进行高温处理，这样可以打破产品中成熟芽孢的休眠，使之很快萌发形成菌落，同时杀死样品中未能形成芽孢的菌体，使之提前死亡，但该申请中所用到的培养基是传统的营养琼脂培养基，并未作出改进。专利申请（200910196640.3）公开了一种芽孢杆菌活菌数量的检测方法，主要是将样品中加入营养肉汤萌发剂培养，然后再涂板、计数。这种方法主要是通过高温处理刺激成熟芽孢萌发，再经过萌发剂培养，让芽孢复苏，从而使检测的准确度提高。但该申请中所用到的培养基依然是传统的营养琼脂培养基，并未作出改进。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的芽孢杆菌定量检测中存在的准确度低、无法检测芽孢杆菌总数以及使用荧光定量PCR时带来的成本高的问题，提供一种成本低、准确度高的用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基。
本发明另一目的在于提供上述选择性培养基的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种选择性培养基，每升该选择性培养基由如下组分组成：葡萄糖1~10g，酵母膏1~5g，蛋白胨5~10g，氯化钙0.2~2g，硫酸镁0.1~1g，琼脂15~20g和抑菌剂100~500 IU。
作为一种优选方案，每升上述选择性培养基由如下组分组成：葡萄糖10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钙1g，硫酸镁0.5g和抑菌剂200 IU。
更进一步地，上述蛋白胨优选为胰蛋白胨，所述抑菌剂为多粘菌素，其中，以硫酸多粘菌素B为最佳。
本发明选择性培养基可以用于定量检测芽孢杆菌。检测方法是：以选择性培养基制备平板，将待测样品稀释后涂布于平板上，培养，培养完毕后进行计数（待测样品的前处理、平板的制备及涂布方法均根据GB4789.2-94《中华人民共和国国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的规定实施）。
作为一种优选方案，上述检测方法中，所述培养时间为20~36h。培养为变温培养，前6~12h为恒温40~55℃培养，后12~35h为恒温30~40℃培养。可否详细说明采用变温培养的原因，以及通过变温培养可以带来怎样的有益效果？
作为一种最优选方案，所述培养的前12h为恒温45℃培养，后12h为恒温37℃培养。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过使用特定配方及用量组分组成的选择性培养基，使用变温培养的方法，可以提高常规平板计数法对芽孢杆菌的选择性，消除待测样品中其它微生物或杂质的影响，达到快速准确定量检测芽孢杆菌的目的。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1 检测半咸水养虾塘中芽孢杆菌菌数
将芽孢杆菌含量为20×108CFU/g的产品使用到南美白对虾池塘中，使用剂量为1ppm，1天后采样检测池塘水体中芽孢杆菌数量。具体检测方法如下：
（1）样品预处理：
取水样进行梯度稀释，变温培养组取1×，10×，100×三个稀释梯度的稀释液备用；恒温培养组取100×，1000×，10000×三个稀释梯度的稀释液备用。
（2）选择性培养基平板的制备
按照以下配方配制固体培养：葡萄糖10g/L、酵母膏 5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钙1 g/L、硫酸镁 0.5 g/L、硫酸多粘菌素 200IU/L和琼脂15 g/L，调节PH为7.2，121℃灭菌20min。待培养基冷却到45℃后，将约15ml培养基倾入无菌培养皿中，凝固后备用；
（3）涂布和培养
变温培养组取1×，10×，100×三个稀释梯度的稀释液备用；恒温培养组取100×，1000×，10000×三个稀释梯度的稀释液进行涂布，每个平板添加稀释液0.1ml，每个梯度采用3个重复；然后将变温组的培养皿45℃恒温培养箱，培养12小时，然后将培养皿转移到37℃恒温培养箱培养12小时；同时将恒温组的培养皿放入37℃，培养24小时。培养完毕后即可进行计数统计。
具体数据：
表1 变温培养后菌落计数数据
表2 恒温培养后菌落计数数据
备注：“/”表示不可计数。
实施例2 检测高位池虾塘中芽孢杆菌菌数
将芽孢杆菌含量为20×108CFU/g的产品使用到南美白对虾高位池中，使用剂量为1ppm，1天后采样检测池塘水体中芽孢杆菌数量。具体检测方法如下：
（1）样品预处理：
取水样进行梯度稀释，变温培养组取1×，10×，100×三个稀释梯度的稀释液备用；恒温培养组取100×，1000×，10000×三个稀释梯度的稀释液备用。
（2）选择性培养基平板的制备
按照以下配方配制固体培养：葡萄糖5g/L、酵母膏 3g/L、胰蛋白胨5g/L、氯化钙1 g/L、硫酸镁 0.5 g/L、硫酸多粘菌素 200IU/L和琼脂15 g/L，调节PH为7.2，121℃灭菌20min。待培养基冷却到45℃后，将约15ml培养基倾入无菌培养皿中，凝固后备用；
（3）涂布和培养
变温培养组取1×，10×，100×三个稀释梯度的稀释液备用；恒温培养组取100×，1000×，10000×三个稀释梯度的稀释液进行涂布，每个平板添加稀释液0.1ml，每个梯度采用3个重复；然后将变温组的培养皿45℃恒温培养箱，培养12小时，然后将培养皿转移到37℃恒温培养箱培养12小时；同时将恒温组的培养皿放入37℃，培养24小时。培养完毕后即可进行计数统计。
具体数据
表3 变温培养后菌落计数数据
表4 恒温培养后菌落计数数据
Claims (2)
1.一种用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基在定量检测芽孢杆菌中的应用，所述选择性培养基由如下组分组成：葡萄糖10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钙1g，硫酸镁0.5g和抑菌剂200 IU；所述蛋白胨为胰蛋白胨；所述抑菌剂为硫酸多粘菌素B；其特征在于所述检测方法如下：
以选择性培养基制备平板，将待测样品稀释后涂布于平板上，培养，培养完毕后进行计数；
所述培养时间为20~36h；
所述培养为变温培养，前6~12h为恒温40~55℃培养，后12~35h为恒温30~40℃培养。
2.根据权利要求1所述选择性培养基的应用，其特征在于所述培养的前12h为恒温45℃培养，后12h为恒温37℃培养。
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