CN102123730A - 热稳定的乳铁蛋白水性组合物及其制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水性组合物，所述水性组合物含有乳铁蛋白、占所述水性组合物总重量的35-70wt％的碳水化合物和/或多元醇稳定剂，所述组合物表现出大于2而小于5的pH。在这些条件下，所述水性组合物以及其中所含的乳铁蛋白可经过热处理而不会显著影响所述乳铁蛋白的生理活性。因此，本发明特别涉及经过热处理从而含有热稳定的乳铁蛋白的上述水性组合物。

Description

热稳定的乳铁蛋白水性组合物及其制备和用途
发明领域
本发明涉及加热乳铁蛋白而不损失其生理活性并延长其在液体制剂中的贮存期的方法。更具体而言，本发明涉及在超过60℃的温度的酸性条件下加热乳铁蛋白的方法。本发明还涉及由此处理的乳铁蛋白的用途。
发明背景
已知乳铁蛋白为分布于泪液、唾液、外周血、乳汁等中的铁结合蛋白。已知乳铁蛋白具有各种生理活性，例如对于有害细菌的抗细菌活性、促进肠中铁吸收的活性、抗炎活性等。US-A-2007/161541中给出了乳铁蛋白用途的综述，通过引用的方式将其内容并入本文。
因此，向食品、加工的食品、药物、美容用品等添加乳铁蛋白或作为补充剂直接摄取是有益的。这些产品通常需要加热处理，例如巴氏杀菌或灭菌，从而使其成为微生物学安全的并可长期稳定贮存。
然而，如果不采取措施，乳铁蛋白会表现出对加热不稳定并且乳铁蛋白的热处理可以导致生理pH下乳铁蛋白的变性。本领域中已有报道，62.5℃加热30分钟使乳铁蛋白几乎丢失生理活性，并且70℃加热15分钟发生完全变性。
由上文可以清楚地看出，在乳铁蛋白作为需要利用其生理活性的成分时，不可以对其施加充分的热处理。乳铁蛋白的液体制剂或储液必须经过灭菌以获得长的贮存期(使用前数周或数月)。
EP 454.084和EP 1.040.766均教导了富含铁的乳铁蛋白饮料。具有贫血趋向(anemic drift)的人、孕妇或哺乳母亲需要铁强化。
虽然EP’084和EP’766中没有明确地提及，但是本领域技术人员应当立即意识到铁饱和对于目的乳铁蛋白恢复的影响。根据Brisson et al.“Effect of iron saturation on the recovery of lactoferrin in rennet whey coming from heat-treated skim milk”J.Dairy Sci.90：2655-2664，乳铁蛋白与铁复合，这种复合作用改善乳铁蛋白的热稳定性。然而，在营养学领域中使用铁常常是不希望的，例如从味觉的角度考虑。此外，虽然铁复合作用能够增加乳铁蛋白的稳定性，但是随着时间仍然会发生变性。因此，需要另外的和改进的方法以实现热稳定。
GB 2,361,703教导了通过与乳铁蛋白复合而使维生素B12和/或叶酸稳定，由此延长叶酸和维生素B12的贮存期，否则它们在氧的存在下会表现出低的热稳定性和贮存稳定性。使用了来自任何来源的乳铁蛋白，包括铁稳定的乳铁蛋白。但是，如果从不同角度考虑，即寻找稳定乳铁蛋白的方法的角度，将乳铁蛋白与叶酸和维生素B12结合的溶液用于食品不是理想的方法。这些化合物比较昂贵，干扰所有与其相关的代谢途径，将这些化合物给予人群并不是无限制性的。
为了解决其热稳定性，Morinaga Milk Industry名下的EP-A-437.958中提示，在1.0-6.5的pH下将乳铁蛋白在超过60℃的温度下加热。从该文的表1所列的液相色谱结果可以得出，在酸性条件下，在60℃下加热5分钟时乳铁蛋白是稳定的。该表1还显示，当将温度上升至70、80、90或甚至100℃时，成功的窗口显著变窄。在100℃以上时，所有乳铁蛋白都变性。所有测量均是在热处理后短时间内进行的。EP-A-437.958未提及乳铁蛋白随时间的稳定性和贮存温度。EP-A-437.958的内容通过引用的方式并入本文。
在尝试再现EP-A-437.958所报道的结果的过程中，本发明人发现HPLC(高效液相色谱)实际上不适于测定变性的程度。本发明人发现了更好的技术包括FPLC(快速液相色谱)和/或ELISA，并且发现HPLC容易过高估计“未变性”的程度。因此，EP-A-437.958的表1中的结果实际上并没有所宣称的那么好。此外还发现，即使能获得EP-A-437.958中的热稳定的乳铁蛋白，它也是短暂持续的。在的贮存期内，在一定温度下，仍然会在几周内发生变性。EP-A-437.958本身未提及热处理对于贮存期的影响。此外，当延长加热时间时，Morinaga所主张的方法的有限的成功显著下降。实际上，所述专利本身也承认了这一点。这段中的观察可见于本发明附加的比较实施例中。最后，本发明人观察到，EP-A-437.958的方法所产生的含乳铁蛋白的水性组合物仅在保持为7℃或更低时是较长时间稳定的，从而就必然需要冷却系统。
总而言之，由于在巴氏灭菌中，实际的生产线经常涉及加热时间和温度的更严格的组合，因此，通过根据EP-A-437.958在酸性条件下热处理乳铁蛋白得到的乳铁蛋白的所谓热稳定性是相当受限的。在实际生产中经常会使用沸水，并且特别是在批量生产中，这容易延长加热时间。此外，如果需要使水性乳铁蛋白组合物保持稳定较长的时间，例如数个月，则涉及昂贵的和后勤上不便操作的冷却系统。很多含有乳铁蛋白的应用或营养制剂应具有数周甚至数月的贮存期。上述方法不能满足该条件。
本发明人致力于研发加热乳铁蛋白而不损失其生理活性，并且得到在延长的时间，包括在7℃以上的贮存温度下，保持稳定的热处理的乳铁蛋白的改进的方法。此外，本发明人希望摆脱将乳铁蛋白与铁或诸如维生素B12和叶酸的化合物复合的限制。
发明概述
本发明的目的是提供热处理乳铁蛋白(LF)而不损失其生理活性的方法，所述生理活性例如抗细菌活性、铁结合活性、抗原性。这种热稳定方法应该承受延长的加热时间和高温度，并且所得的乳铁蛋白应当在延长的时间保持稳定，例如数周或甚至数月。本发明的另一目的是提供加热乳铁蛋白的方法，所述方法导致乳铁蛋白在延长的时间和7℃以上的较高温度下贮存的热稳定性。
已经发现，如果在酸性条件下、在大量亲水碳水化合物或多元醇稳定剂的存在下加热乳铁蛋白，则可实现这些目的。高水平的稳定剂使乳铁蛋白在酸性溶液中稳定相当长的时间，根据贮存温度和溶液的pH，所述稳定的时间至少为两周、优选为至少四周。所述加热步骤破坏残留的蛋白酶，否则，所述蛋白酶导致乳铁蛋白在贮存时的降解。
在高温下，乳铁蛋白与糖类的成功相互作用被限制为大于2且小于5的pH。在低pH时，发生乳铁蛋白的酸降解或水解，这可以通过FPLC来证实。在pH上限时，热稳定作用滞后并且由大量存在的糖所诱导的Maillard反应开始产生干扰。
虽然EP-A-437.958的实施例公开了在热处理中存在糖类，但是这显然不是当时该发明的一部分。糖类仅作为添加食品成分而存在，例如橙汁。如后附实施例中所证实的，在EP-A-437.958中提供的低水平下，未观察到糖类的效果。事实上，EP-A-437.958的实施例5教导了凝胶，而不是按照本发明的液体制剂。对于这些情况，不稳定性的影响相对不显著。现在发现，一定量的碳水化合物或多元醇稳定剂，即高于30wt％的糖类，对于在液体制剂中使乳铁蛋白热稳定是必需的。
如此，本发明人使提供贮存稳定的、灭菌的、含LF的液体制剂成为可能。到目前为止，含LF的溶液具有贮存稳定性低的问题。商业上可选的其他方式是提供喷雾干燥的粉末的形式的LF。有利的是，现在可用的贮存稳定的、灭菌的LF液体组合物的生产需要较少的能量(无需多余溶剂的蒸发)。而且，灭菌的形式便于向触手可及的诸如婴儿配方的各种制剂进行无菌添加。液体制剂可以直接用于最终制剂，而无需溶解。
发明详细描述
因此，本发明涉及水性组合物，所述水性组合物含有乳铁蛋白、占所述水性组合物总重量的35-70wt％的碳水化合物和/或多元醇稳定剂，所述组合物表现出大于2而小于5的pH。在这些条件下，所述水性组合物以及其中所含的乳铁蛋白可经过热处理而不会显著影响所述乳铁蛋白的生理活性。因此，本发明特别涉及经过热处理从而含有热稳定乳铁蛋白的上述水性组合物。按照该方式，提供热稳定的乳铁蛋白而无需复合作用。
在另一方面，本发明涉及制备本发明的含热稳定的乳铁蛋白的组合物的方法，所述方法包括：a)提供含有乳铁蛋白、占水性组合物总重量的35-70wt％的碳水化合物和/或多元醇稳定剂的水性组合物，所述组合物表现出大于2而小于5的pH；以及b)使所述水性组合物经过热处理，优选为至少60℃的温度。
在另一方面，本发明涉及含有热稳定的乳铁蛋白的水性组合物在(健康)食品、饲料、营养补充剂、美容用品和药物中的用途，并且涉及含有热稳定乳铁蛋白的这些(健康)食品、饲料、营养补充剂、美容用品和药物产品。本发明的乳铁蛋白特别适用于婴儿配方、医学营养剂、运动食品、健康食品以及诸如饮料、酸奶和乳酸饮品中的补充剂。此外，含有LF和糖类的溶液也可以被用作补充剂而无需除了上述热处理之外的其他处理。
热稳定的乳铁蛋白与市售可得的热处理的乳铁蛋白的明显区别在于其在升高的温度下，即高于7℃下，的长期稳定性。因此，在本发明的背景下，“热稳定的”表示：当含有所述乳铁蛋白的酸性组合物贮存于正常贮存条件下，即7-25℃，优选高于7℃，持续两周、更优选为三周、最优选为四周时，所述热处理的乳铁蛋白的诸如铁结合活性的生理性质仍然无显著改变。从以下方面监测生理性质的改变：例如按照实施例中所详述，使用FPLC和/或ELISA监测变性程度和监测铁结合能力。关于进行FPLC、ELISA和铁结合测量的方法，本领域技术人员可以参见表3和表4下方给出的参考文献。在那些文献中还表明了FPLC和ELISA都是研究LF含量及其变化的合适技术。小于5％的变性程度的改变被认为是不显著的或其实是在实验误差内的。应该注意到，根据本发明热处理的乳铁蛋白的稳定性并不限于上文给出的时间间期，而是容易延长至数月(参见实施例)。然而，上述相对短的间期足以使本发明的热处理的乳铁蛋白区别于商业可获得的那些乳铁蛋白，例如EP-A-437.958中所报道的。热处理的组合物优选为热灭菌的组合物，例如UHT处理的组合物。在另一实施方案中，将所述组合物沸煮，即在100℃进行处理。
本文所使用的词语“乳铁蛋白”包括来源于任何和所有乳铁蛋白来源的乳铁蛋白(LF)，所述乳铁蛋白来源例如任何哺乳阶段(例如初乳、过渡乳、成熟乳和哺乳晚期的乳)的哺乳动物的乳(例如人乳，以及牛乳、绵羊乳、山羊(goat)乳、马乳、山羊(caprine)乳、骆驼乳等)、加工过的乳和诸如脱脂乳、乳清等的乳加工中的副产品(在下文中它们被统称为乳汁或类似术语)。优选使用牛乳铁蛋白。
本文所使用的词语“乳铁蛋白”包括任何和所有乳铁蛋白物质，例如重组乳铁蛋白；仅通过常规方法(例如离子交换色谱)分离的来自任何和所有乳铁蛋白来源的天然乳铁蛋白；通过使用盐酸、柠檬酸等将铁从天然乳铁蛋白中去除而获得的脱铁乳铁蛋白(apolactoferrin)；通过将脱铁乳铁蛋白与诸如铁、铜、锌、锰等的金属螯合而获得的金属饱和的乳铁蛋白；或以上的合适的混合物(在下文中它们被统一缩写为LF)。
也可以是未纯化的乳铁蛋白，即从乳或抗乳血清或在重组乳铁蛋白情况下的其他介质中直接提取而未经过其他纯化步骤的乳铁蛋白。纯的乳铁蛋白的分子量预计为78kDa。对于本领域技术人员显而易见的是，乳铁蛋白组合物中存在的其他高或低分子量的少量组分表明乳铁蛋白的来源。在一个实施方案中，使用了天然乳铁蛋白，“天然”被定义为使用ELISA测定的＞85％天然。
使用本发明的方法获得的“热稳定的乳铁蛋白”，该术语涵盖下述实施方案，其中在热处理后，所存在的乳铁蛋白中至少90％仍然是稳定的、优选为天然的，优选至少95％仍然是稳定的。使用本说明书中所述的ELISA、FPLC可以容易地测定这些数值。
如果从上文尚未清晰理解，术语“热稳定的”或就此而言的“热稳定性”应理解为包括热处理的LF随时间的稳定，而不是例如EP-A-437.958中针对该术语给出的含义，即LF在热处理中的稳定。在本领域中，长期热稳定的LF有时被称为“贮存稳定的热处理的LF”。本文可以采用这一定义。
未采用影响乳铁蛋白的盐强度的手段。当提供乳铁蛋白的来源溶解为大于10％(w/w)的LF溶液时，其离子强度通常相当于至少0.01M的水平。并不认为盐水平是关键的因素，只要离子强度，特别是在热处理中，高于0.01M。较低水平时，可能会发生沉淀。
水性组合物中所含有的乳铁蛋白的量优选为占所述水性组合物总重量的0.05-20wt％。乳铁蛋白的量优选为至少0.1，更优选为至少0.5，甚至更优选为至少1wt％，最优选为至少2wt％。乳铁蛋白的最高量优选为18wt％，更优选为15wt％，甚至更优选为10wt％。正如下文更详述解释的，可以根据乳铁蛋白后续的应用来调整乳铁蛋白的量。
作为碳水化合物稳定剂，优选使用单糖、二糖、三糖、四糖、五糖、六糖和/或寡糖，优选含有多至10个单糖单元。根据需要，优选的实例包括葡萄糖(dextrose)、果糖、蔗糖、葡萄糖(glucose)、麦芽糖、海藻糖、菊糖或寡果糖和/或以上的混合物。组合物中可以存在具有延长的链长度的组分或甚至其部分，但是不符合上述碳水化合物稳定剂定义的那些不被计入本发明的重量数中。可选择地或另外地，也可以使用麦芽糊精或葡萄糖糖浆作为碳水化合物稳定剂。优选地，碳水化合物稳定剂的DE(葡萄糖(dextrose)当量)为1至99，更优选为5至99。在本发明的背景下，碳水化合物稳定剂的合适来源为转化糖或诸如HFCS(高果糖玉米糖浆)的玉米糖浆。转化糖是近似相等的重量比例的葡萄糖和果糖的混合物。优选地，所述碳水化合物稳定剂含有占组合物中存在的碳水化合物稳定剂总量的至少45wt％、优选地至少50wt％的葡萄糖和/或果糖。可选择地或另外地，所述碳水化合物稳定剂含有的葡萄糖和果糖的相对量优选为1.5∶1-1∶1.5、更优选为1.2∶1-1∶1.2。在优选实施方案中，转化糖还含有蔗糖。在这种情况下，所述稳定剂优选含有至少65wt％的葡萄糖、果糖和/或蔗糖。在另一实施方案中，HFCS被用作碳水化合物稳定剂的来源；其优选含有占碳水化合物稳定剂总重量的至少40wt％的果糖。
合适的多元醇包括甘露醇、半乳糖醇、肌醇、木糖醇、山梨醇、丙三醇和/或乳糖醇。
上述稳定剂的量优选为30-70wt％，更优选为至少35wt％、更优选为至少40wt％。稳定剂的量优选低于65wt％，更优选低于60wt％。这些数值是基于水性组合物的总重量。超过本领域中偶尔使用的次要量的糖的量的效果在后附的实施例中展示。在15％甚至是30％的糖时，不能提供具有理想的贮存期稳定性的乳铁蛋白。
乳铁蛋白水性组合物优选为液体制剂。按照使用例如旋转粘度计(Brookfield)在20℃下所测量，所述液体的粘度优选小于3000mPa.s、更优选小于1000mPa.s、更优选小于500mPa.s。在优选实施方案中，所述组合物因此不含凝胶，其中稳定性问题经常是被忽略的。
所述水性组合物的pH优选为2.5-4.5、更优选至少为pH3。所述水性组合物的pH更优选为4或更低。高pH会引起Maillard反应，即发生不希望的深棕色变色和/或苦味。
根据本发明的方法，可以通过加入无机酸(例如盐酸、硫酸、磷酸等)和/或有机酸(例如乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、苹果酸等)实现pH调整。当然，如果组合物本身的pH值已经在所述范围，不需要pH调整，但是仍然优选根据将要使用的加热条件(加热温度和加热时间)以及加热的目的(例如灭菌、沸煮等)将本发明组合物的pH调整到最佳。
制备含热稳定的乳铁蛋白的组合物的方法涉及水、乳铁蛋白和一种或多种上述稳定剂的混合以及任选的pH调整。作为乳铁蛋白的来源，可以使用喷雾干燥的或冷冻干燥的乳铁蛋白，或者从例如乳铁蛋白生产过程容易获得的含乳铁蛋白的溶液。认为混合的顺序不受限制，只要在热处理之前完成所有步骤。为了改进乳铁蛋白的分散，可以任选地在加入水和调整pH之前将其与(至少部分的)稳定剂混合。
产生本发明的热处理的组合物的热处理涉及的温度为至少60℃、优选至少70℃、优选至少75℃、更优选为80℃、最优选至少90℃。由于已经证实本发明的含乳铁蛋白的组合物可以在较长的加热时间保持稳定，因此加热时间不必受特别限制。所述热处理优选地涉及灭菌，例如UHT过程。可以在各种设备中进行加热，可以分批进行或连续进行。合适的加热条件为：对于连续加热为80℃至100℃，持续15-60秒；对于分批加热为70℃至90℃，持续5-30分钟。UHT步骤优选地涉及在135℃至150℃持续加热2-35秒，分批热处理优选地涉及在80℃-100℃持续加热5-30分钟。
在一个实施方案中，选择与WO-A-03/-11040中所提供的一致的加热条件，将该文献的内容通过引用的方式并入本文。所述热处理优选地包括将含LF的溶液加热至至少60℃、优选至少70℃并且低于200℃、更优选低于160℃，持续时间等于t或至少为t，加热时间t按照以下公式：
t＝(500/(T-59))-4，
其中t为加热的持续时间(秒)，T为加热温度(℃)。更优选地，所遵照的最大加热条件根据以下公式：
t＝(90000/(T-59))-900，
其中t和T具有如上所述的含义。
热处理涉及的时间优选为0.1秒至24小时。特别优选地，加热时间为10秒-1小时、更优选为至少10分钟。优选的相应最低温度和最高温度可以用上面的公式计算。
在加热步骤之前或之后可以加入其他成分，这要根据所述其他成分的热依赖性和/或与乳铁蛋白的相互作用。可以随后无菌添加在加热中干扰乳铁蛋白的成分。添加剂的非限制性实例为诸如维生素C的维生素、矿物质、缓冲剂、肽、诸如果胶的有时用于活化LF的多糖以及氨基酸、着色剂、香料等。
如上所述，本发明还涉及含有通过本发明的方法热稳定的乳铁蛋白的食品、饲料、营养补充剂、美容用品或药物产品。可以将溶液无菌添加到选择的产品。乳铁蛋白的量通常为总重量的0.05-10wt％、更优选为0.1-5wt％。本发明热稳定的和贮存稳定的LF区别于现有技术。受限制的pH条件下的常规热处理(参见例如EP-A-437.958)不能生成贮存稳定的LF。
在一个实施方案中，所述产品为组合套装，包括i)含有本发明的热稳定的LF的液体制剂，以及ii)液体食品配方。在液体配方中，需要将LF与其他食品成分分离，以避免可能导致LF活性丢失的任何相互作用。本发明的LF的贮存性质使其现在可以被最终使用者容易地利用，而无需另外溶解。这在婴儿配方应用中特别有利(当ii)的食品配方为婴儿配方组合物时)，例如在路途上不容易获得水的情况下。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗痤疮的方法，包括口服给予患有痤疮的人有效量的含有本发明热稳定的LF的液体制剂。EP-A-1.833.495中提供了更多的细节，通过引用的方式将该文献的内容并入本文。所述(预防性)治疗可以为美容产品或非美容产品。本领域技术人员可以容易地鉴定具有痤疮风险的人。在一个实施方案中，具有痤疮风险或患有痤疮的人为青少年，优选为12岁至20岁。
实施例
在所有的实验中，所使用的乳铁蛋白获自DMV International，The Netherlands。
实施例1：pH的影响
使用FPLC(快速液相色谱)研究了pH对于糖浆A(46w/w％)中含有LF的糖浆溶液(1％LF，w/w)的热处理(95℃，持续45秒)的影响。糖浆A包括重量比为1∶1∶1的葡萄糖∶果糖∶蔗糖的混合物，总共约70wt％的果糖、葡萄糖和蔗糖。热处理后直接获得的结果示于表1
所述结果表明，较高的pH会引起Maillard反应，由此减少LF的保留。在低pH下，可以发生水解反应。最佳pH为约3-3.5。
表1：不同pH下的LF保留。
 样品   pH   LF保留％   LF损失％
 样品1   2.4   90.3   9.7
 样品2   3.4   92.6   7.4
 样品3   4.2   84.7   15.3
LF保留：用相同的分析方法测量的样品中存在的LF相对于热处理前的相同样品的百分比。
比较实施例I：有糖和无糖时LF的贮存温度
将糖浆溶液A(46％固体)中1wt％的LF在热处理(95℃，持续45秒)后的贮存稳定性与相同pH(pH 3.5)的常规LF水性溶液在热处理(95℃，持续45秒)后的贮存稳定性，在高贮存温度和低贮存温度下进行了比较。贮存时间为2周。
结果示于表2。发现在糖浆中的LF浓度相对保持稳定，而水性溶液中的LF在较高贮存温度下衰减相对快。结论是糖类的存在具有保护作用。
表2：LF的贮存稳定性
  样品   LF-糖浆溶液(pH 3.5)**   LF水性溶液(pH 3.5)**
  t＝0*   100％   100％
  2周(7℃)   95％   96.1％
  2周(37℃)   91％   48.1％
*热处理后直接测定
**用柠檬酸调整pH值
实施例2：贮存时间
研究了45％水性葡萄糖溶液中的1wt％LF在90℃持续5分钟的热处理后经过4个月时间的长期贮存稳定性。贮存温度为7℃。
发现LF浓度保持不变，其水平近似为100％。
比较实施例II：无糖的LF％的分析方法(HPLC与FPLC对比)
将pH 3.5的水性溶液中4％牛LF溶液(DMV，The Netherlands)在95℃进行热处理，持续不同时间(5、10、20和60分钟)。在热处理后，使用FPLC(快速液相色谱)和HPLC(高效液相色谱，“Morinaga”法)对于活性分析LF浓度。
结果示于表3。发现FPLC能够区分天然的LF和变性的LF，而现有技术(EP-A-437.958)中使用的HPLC系统性地过高估计天然LF的浓度。因此，HPLC不是用于LF分析的满意的工具。
表3：使用HPLC和FPLC分析LF含量的方法比较
 加热时间(min)   LF％(FPLC)a)   LF％(HPLC)b)
  0   100％   100％
  5   97％   104％
  10   95％   103％
  20   94％   104％
  60   75％   93％
a)按照Mitoma et al.(2001)：The J.Biol.Chem.276：18060-18065所述进行FPLC方法；
b)按照Abe et al.(1991)J.Dairy Sci.74：65-71所述进行HPLC方法。
比较实施例III：糖含量的影响
通过pH3-9的等电聚焦凝胶电泳研究热处理(95℃，持续不同时间)中糖类的保护作用。
结果示于图1。从左至右：在90℃下热处理5、20和72分钟的5％牛LF溶液(pH 3.5)；在90℃下热处理5、20和72分钟的42％葡萄糖溶液(pH 3.5)中的5％牛LF溶液(pH 3.5)。
发现糖溶液中的LF比无糖水性溶液中的LF得到了更好的保护：凝胶电泳表明，在42％糖含量的条件下，5wt％LF的条带即使在90℃热处理20分钟后都保持不变。与之相反，无糖水性溶液中的LF的条带已经迁移到大于pH9的pH范围。
作为结论，在热处理中使用糖溶液不仅能够有利于LF溶液的贮存期，而且能够保护LF免受延长的加热时间所造成的失活。
出于论述的完整，应当注意到95℃下持续72分钟的热处理并不特别现实。
比较实施例IV：糖含量的影响
提供三种pH值均为3.7(使用柠檬酸盐和碳酸氢盐)但具有0％、15％和40％的不同蔗糖浓度的1％LF溶液。将组合物在93℃进行加热。
在不同时间(加热0、10、35和72分钟)，取出样品并比较它们随时间的颜色变化。观察到：对于0％和15％糖的样品，在10分钟内，初始的淡红色(t＝0时)消失。这表明LF变性。在40％糖水平时，即使加热75分钟后仍保留大部分初始的红色。这反映了在本发明的pH值和糖含量下热处理的LF的贮存稳定性。
附图2显示了上述样品间的差异，其中(A)、(B)和(C)分别代表0％(对照)、15％和40％的糖。在每一幅图中，从左至右，分别对0、10、35和72分钟后取出的样品进行比较。所有样品的LF含量均为1％。
实施例3：分析方法II
使用FPLC、ELISA和铁结合活性测试来测定活性LF的含量，以研究各种分析方法的可应用性。含有LF的糖浆含有0.26wt％的LF和42％的固体糖浆A，并且将所述含有LF的糖浆在90℃下热处理5、20和60分钟。在不同时间取出样品并分析LF保留和功能活性的LF。结果示于表4。
发现FPLC是评估LF活性的可靠方法，因为其结果与使用公认的ELISA方法发现的结果密切匹配。使用铁结合检测会高估LF的浓度。该差异的可能解释归因于以下事实：在延长的热处理时，LF失去其天然结构，从而改变了FPLC的保留时间，但是它还保持铁结合活性。
表4：使用FPLC、ELISA和铁结合测试测得的LF保留(％)
  样品  加热时间(min)   ELISAa)  FPLC   铁结合活性b)
  1  0   100％  100％   100％
  2  5   87％  80％   97％
  3  20   51％  56％   94％
  4  60   17％  29％   65％
a牛乳铁蛋白ELISA试剂盒，购自Biocompare。方法参见Cheng et al.(2007)J.Dairy Sci.91：970-976
b按照Brisson et al.(2007)International Dairy Journal.17：617-624所述进行铁结合活性的测量。

Claims (15)

1.水性组合物，其含有乳铁蛋白、占所述水性组合物总重量的35-70wt％的碳水化合物和/或多元醇稳定剂，所述组合物表现出大于2而小于5的pH。
2.如权利要求1所述的组合物，所述组合物经过至少60℃的温度处理。
3.如权利要求2所述的组合物，所述组合物经过灭菌或沸煮。
4.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述碳水化合物和/或多元醇稳定剂选自：单糖、二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、寡糖、甘露醇、半乳糖醇、肌醇、木糖醇、山梨醇、丙三醇和乳糖醇及以上的混合物。
5.如权利要求4所述的组合物，所述碳水化合物稳定剂含有至少45％的葡萄糖和果糖单糖。
6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述乳铁蛋白的量占所述水性组合物总重量的0.05-20wt％。
7.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其表现出2.5-4的pH。
8.使乳铁蛋白热稳定的方法，所述方法包括：a)提供含有乳铁蛋白、占水性组合物总重量的35-70wt％的碳水化合物和/或多元醇稳定剂的水性组合物，所述组合物表现出大于2而小于5的pH；以及b)将所述水性组合物进行热处理。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述热处理涉及至少60℃的温度。
10.如权利要求1-7中任一项所述的组合物或者通过权利要求8-9中任一项所述的方法获得的组合物在(健康)食品、饲料、营养补充剂、美容用品和药物中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其用于痤疮的美容性(预防性)治疗。
12.如权利要求1-7中任一项所述的组合物或者通过权利要求8-9中任一项所述的方法获得的组合物在制备用于痤疮的(预防性)治疗的制剂中的非美容性用途。
13.含有通过权利要求8-9中任一项所述的方法而热稳定的乳铁蛋白的食品、饲料、营养补充剂、美容用品或医药产品。
14.如权利要求12所述的食品、饲料、营养补充剂、美容用品或医药产品，其含有占总重量0.05-10wt％的量的乳铁蛋白。
15.组合套装，其包括i)含有通过权利要求8-9中任一项所述的方法而热稳定的乳铁蛋白的液体制剂，和ii)液体食品组合物，优选为婴儿配方。
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