CN102094073A - SYBR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SYBR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒，属于体外核酸诊断试剂盒领域。该试剂盒包括阴性参控品、阳性对照品、荧光聚合酶链式反应液、Taq酶和DNA提取液。本发明包括一个以荧光PCR技术为基础的PCR反应体系，包含针对沙眼衣原体特异序列的正、反向引物和荧光染料SYBR Green，可以简便快速地在临床样本中检测沙眼衣原体感染，特异性高，对沙眼衣原体的早期检出有很大的临床价值。
Description
技术领域
本发明属于体外核酸检测领域，在临床样本中检测沙眼衣原体感染的荧光PCR(聚合酶链式反应)试剂盒。
背景技术
沙眼衣原体(chlamydia trachomatis，CT)为革兰氏阴性病原体，没有合成高能化合物ATP的能力，必须由宿主细胞提供，因而是能量寄生物。衣原体是一类能通过细胞滤器，有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，比病毒大，比细菌小，呈球形，直径只有0.3～0.5mm。CT是重要的性传播疾病的病原体之一，它不仅会导致阴道、尿道感染；上行的生殖道感染还可能累及子宫内膜、输卵管和邻近的盆腔结构，导致盆腔炎、输卵管损伤直至不孕。此外，此种病原体还与人乳头瘤病毒(HPV)和人免疫缺陷病毒(HIV)的感染有关。
沙眼衣原体有独特发育周期，它的生长发育周期分两个阶段：①原体(elementary body)，是发育周期的感染阶段，外有包壁，具感染力；②始体，又称网状体(initial body)，是在感染细胞内的繁殖阶段，无包壁，无感染性，具增殖力。原体(约0.3μm)与易感细胞接触后通过吞饮作用进入细胞，形成空泡称为包涵体，包涵体外膜来自于感染细胞时的浆细胞膜。此时结构致密的原体逐渐发育成结构疏松的始体(约1μm)，开始了RNA与DNA的合成并以二分裂方式开始增殖，经过24～72h增殖始体重新形成原体，包涵体溶解，细胞释放出原体。
沙眼衣原体引发的病变主要有：
沙眼：由衣原体沙眼生物变种A、B、Ba、C血清型引起。主要经直接或间接接触传播，即眼-眼或眼-手-眼的途经传播。当沙眼衣原体感染眼结膜上皮细胞后，在其中增殖并在胞浆内形成散在型、帽型、桑椹型或填塞型包涵体。该病发病缓慢，早期出现眼睑结膜急性或亚急性炎症，表现流泪、有粘液脓性分泌物、结膜充血等症状与体征。后期移行为慢性，出现结膜瘢痕、眼睑内翻、倒睫、角膜血管翳引起的角膜损害，以致影响视力，最后导致失明。据统计沙眼居致盲病因的首位。1956年中国学者汤飞凡等人用鸡胚卵黄囊接种法，在世界上首次成功地分离出沙眼衣原体，从而促进了有关原体的研究。
包涵体包膜炎：由沙眼生物变种D-K血清型引起。包括婴儿及成人两种。前者系婴儿经产道感染，引起急性化脓性结膜炎(包涵体脓漏眼)，不侵犯角膜，能自愈。成人感染可因两性接触，经手至眼的的途径或者来自污染的游泳池水，引起滤泡性结膜炎又称游泳池结膜炎。病变类似沙眼，但不出现角膜血管翳，亦无结膜瘢痕形成，一般经数周或数月痊愈，无后遗症。
泌尿生殖道感染：经性接触传播，由沙眼生物变种D-K血清型引起。男性多表现为尿道炎，不经治疗可缓解，但多数转变成慢性，周期性加重，并可合并副睾炎、直肠炎等。女性能引起尿道炎、宫颈炎等，输卵管炎是较严重并发症。该血清型有时也能引起沙眼衣原体性肺炎。
性病淋巴肉芽肿：由沙眼衣原体LGV生物变种引起。LGV要通过两性接触传播，是一种性病。男性侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。女性可侵犯会阴、肛门、直肠，出现会阴，肛门，直肠组织狭窄。
目前沙眼衣原体的培养检查法是经典的检查方法，但由于需要特殊的设备及试剂且实验方法复杂，技术要求高，费时且费用较高而并不适合临床应用。目前检测衣原体技术发展很快，方法日渐增多。检测抗原的有改良荧光检测法，金标男女两用衣原体快速检测试剂盒，分子生物学技术应用于检测衣原体的方法更是日新月异，(1)连接酶链反应(LCR)，(2)转录介导的扩增试验(TMA)，(3)酶放大免疫反应(PCE)，(4)聚合酶链反应(PCR)，(5)半巢式聚合酶链反应-微空板杂交法，(6)巢式聚合酶链反应，(7)实时荧光聚合酶链反应定量检测。
荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。
荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针，SYBR Green法等，本方法涉及的是SYBR技术。其工作原理是：SYBR Green是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
发明内容
为克服传统方法对CT检测的缺点，本发明提供一种特异性高、成本低的检测产品。本发明技术方案如下：
一种SYBR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒，包括阴性参考品、阳性对照品、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR分型引物。
所述的阳性对照品为含有插入沙眼衣原体特异序列的PMD18-T载体质粒，所述插入的特异序列如下：
GACAGGGACT AAGGATGCCT CTATTGACTA CCATGAGTGG CAAGCAAGTT TAGCCCTTTC TTACAGATTA
AATATGTTCA CTCCTTACAT TGGAGTTAAA TGGTCTAGAG TAAGTTTTGA TGCCGACACG ATCCGTATCG
CTCAGCCTAA ATTGGCTGAA GCAATCTTGG ATGTCACTAC TCTAAACCCG ACCATCGCTG GTAAAGGAAC
TGTGGTCGCT TCCGGAAGCG AAAACGACCT GGCTGATAC 249bp
所述的阳性对照品重组质粒的扩增结果循环值小于30.0。
所述的阴性参考品为沙眼衣原体阴性血清。
所述的PCR分型引物序列如下：
扩增检测沙眼衣原体的正向引物 GACAGGGACTAAGGATGCCTCTAT 24；
扩增检测沙眼衣原体的反向引物 GTATCAGCCAGGTCGTTTTCG 21。
所述的荧光PCR反应液加入了SBRY Green的荧光染料。如此可以通过荧光信号的收集判断有无沙眼衣原体的存在。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
①具有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；
②SYBR Green与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低；
③利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定；
④检测速度快，加上样本提取总共仅需2-3个小时，操作步骤简单；
⑤可同时进行高通量的样本检测。
总之荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间可控制在两个半小时以内，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取代传统细胞检测或者普通PCR检测进行CT的早期诊断。
附图说明：
图为临床样本的CT荧光PCR扩增曲线。
具体实施方式：
应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1：试剂盒的制备
1.引物设计与合成
使用Primer premier5.0，针对CT的外膜主蛋白基因(研究表明外膜主蛋白基因的特异性极好)，设计上下游引物。引物委托专业公司(生工)合成，其中引物为PAGE纯化。扩增序列如表1：
表1.特异性引物序列
| 序列名称 | 寡核苷酸序列(5’-3’) | 碱基长度(bp) |
| CT正向引物 | CCATGAGTGGCAAGCAAGTTTAGC | 24 |
| CT反向引物 | CAGCGATGGTCGGGTTTAGAG | 21 |
2.CT质粒阳性参考品的制备
本实施例中CT质粒作为阳性模板用于阳性对照品。
根据步骤1中合成的扩增CT特异性序列的引物，在整个外膜蛋白基因的序列中选取一段覆盖设计引物的序列进行分片段合成，然后将合成好的片段序列进行拼接，拼接好的序列经过纯化连接到PGEM-Teasy载体(购自TAKARA)上；然后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞(购自TAKARA)中；通过蓝白斑筛选，构建CT的重组质粒DNA作为阳性参考品。构建的CT重组质粒经双向DNA测序鉴定。提取质粒，紫外分光光度计定量，稀释到2.0×1010拷贝/微升于-20℃保存。
3.对照品选择：使用无CT血清为阴性对照；CT重组质粒(2×106拷贝/微升)为阳性对照。
4.荧光PCR反应液组成
表2.PCR反应液组成
| 原料名称 | 终浓度 |
| PCR Buffer | (0.8-2)× |
| MgCl2 | 2-5mM |
| dNTP | 0.1-0.5mM |
| CT引物 | 0.1-0.50μM |
| SYBR Green | 0.1-0.50μM |
| Taq酶 | 0.5-3U |
| H2O | 适量 |
| DNA模版 | 2μL |
| 总体积 | 20μL |
实施例2：试剂盒的使用
1.样本提取
使用DNA提取液提取待测样品中的CT病毒核酸
1)样本前处理：拭净宫颈口过多的分泌物，用生理盐水浸润的棉拭子紧贴宫颈口粘膜稍用力转动2周以取得分泌物和脱落细胞，将取样后的棉拭子放入备有1ml无菌生理盐水的EP管中充分漂洗，贴壁挤干。碱裂解法提取CT病毒。
裂解液配方：60mmol/L TrisHCl，pH 8.0；0.5％SDS；200mmol/L NaCl；
2)操作步骤：取500μl分泌物混匀于13000rpm离心10min，弃上清；加50μl裂解液，100℃保温20min，13000rpm离心1min，取上清1μl做PCR反应。
2.CT阳性对照品的准备
将CT质粒阳性对照品用去离子水进行稀释，浓度为2.0×106拷贝/ml。
3.样本检测
分别取步骤1中提取的核酸，步骤2中获得的阳性对照品，作为DNA模板，加入到荧光反应液中，组成PCR反应体系。反应体系如下：
表3.反应体系
4.反应程序
设置收集SYBR荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入荧光PCR仪(ABI7500)开始扩增，反应程序如下：
表4.PCR反应程序
6.结果判断
基线范围的Ct值(循环数)为6-15或由软件自动选择，设定阈值使之超过无规则扩增曲线的最高值。荧光PCR仪不同，所得基线范围的Ct值会有所不同。
7.质控标准
各类对照质控品判断结果如下表：
表5.质控品标准检测结果
| 质控品 | 标准检验结果 | |
| 1 | 阴性对照 | 无扩增 |
| 2 | 阳性对照 | 20.0＜Ct值≤25.0 |
8.结果报告：
图为临床样本的CT荧光PCR扩增曲线。所测得阳性对照品Ct值在18.0～22.0之间。样本结果的判断标准如下：
表6.报告样本检测结果
序列表
<110>上海裕隆临床检验中心有限公司
<120>SYBR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒
<160>3
<210>1
<211>249
<212>DNA
<213>沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)
<400>1
gacagggact aaggatgcct ctattgacta ccatgagtgg caagcaagtt tagccctttc 60
ttacagatta aatatgttca ctccttacat tggagttaaa tggtctagag taagttttga 120
tgccgacacg atccgtatcg ctcagcctaa attggctgaa gcaatcttgg atgtcactac 180
tctaaacccg accatcgctg gtaaaggaac tgtggtcgct tccggaagcg aaaacgacct 240
ggctgatac 249
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作SYBR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒中扩增检测CT的正向引物。
<400>2
GACAGGGACTAAGGATGCCTCTAT 24
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作SYBR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒中扩增检测CT的反向引物。
<400>3
GTATCAGCCAGGTCGTTTTCG 21
Claims (6)
1.一种SYBR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括阴性参考品、阳性对照品、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR分型引物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品为含有插入沙眼衣原体特异序列的PMD18-T载体质粒，所述插入的特异序列如下：
GACAGGGACT AAGGATGCCT CTATTGACTA CCATGAGTGG CAAGCAAGTT TAGCCCTTTC TTACAGATTA
AATATGTTCA CTCCTTACAT TGGAGTTAAA TGGTCTAGAG TAAGTTTTGA TGCCGACACG ATCCGTATCG
CTCAGCCTAA ATTGGCTGAA GCAATCTTGG ATGTCACTAC TCTAAACCCG ACCATCGCTG GTAAAGGAAC
TGTGGTCGCT TCCGGAAGCG AAAACGACCT GGCTGATAC 249bp。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品重组质粒的扩增结果循环数小于30.0。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的阴性参考品为沙眼衣原体阴性血清。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR分型引物序列如下：
扩增检测沙眼衣原体的正向引物GACAGGGACTAAGGATGCCTCTAT 24；
扩增检测沙眼衣原体的反向引物GTATCAGCCAGGTCGTTTTCG 21。
6.如权利要求1或5所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光PCR反应液加入了SBRY Green的荧光染料。
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| CN1873023A (zh) * | 2006-04-14 | 2006-12-06 | 武汉大学 | 快速检测沙眼衣原体的荧光定量pcr试剂盒 |
| CN101117646A (zh) * | 2007-07-06 | 2008-02-06 | 上海申友健海生物技术有限责任公司 | 检测人泌尿生殖道病原体的引物、探针及方法 |
| CN101550454A (zh) * | 2008-03-31 | 2009-10-07 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 人偏肺病毒实时荧光pcr检测试剂盒 |
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2009
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