CN102079738A - 一种同时制备毛蕊异黄酮、芒柄花素化学对照品的方法 - Google Patents
一种同时制备毛蕊异黄酮、芒柄花素化学对照品的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种同时制备毛蕊异黄酮、芒柄花素化学对照品的制备新工艺。黄芪醇提物，经硅胶柱色谱纯化、重结晶两个步骤，即可获得纯度大于98％的毛蕊异黄酮、芒柄花素两种化学对照品。本发明工艺步骤简单、纯度高，并且易规模化生产。
Description
技术领域本发明涉及一种同时制备毛蕊异黄酮(Calycosin)、芒柄花素(Formononetin)化学对照品的制备新工艺。主要包括硅胶柱色谱纯化、重结晶二个步骤。
背景技术
黄芪为临床常用中药，有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效，所含的皂苷和黄酮类成分为其主要活性成分。毛蕊异黄酮和芒柄花素是黄芪中含量较高的两个异黄酮类化合物，为黄芪的潜在质控指标成分；同时现代药理表明，黄芪中的异黄酮类成分具有抗菌消炎、降血脂等多种药理作用，因此获取大量对照品，对于黄芪相关制品的质量控制和深入研究黄芪的功效等具有重要意义。
目前，从黄芪中制备黄酮类化合物的报道多为实验室规模，步骤较繁琐；有少量规模化生产的报道，但对照品纯度不高。中国专利(CN201010101961.3)报道采用匀浆萃取-混合酶诱导生物转化技术、负压空化提取技术、液液萃取、大孔吸附树脂、硅胶层析等步骤，从黄芪注射液废渣中提取毛蕊异黄酮和芒柄花素，但对照品纯度为95％。本发明通过合理简化步骤及优化各步骤的参数，达到快速从黄芪提取物中分离纯化两个高纯对照品的目的。
发明内容
本发明旨在提供一种工艺简单、易规模化的制备新方法，可以以黄芪粗提物为原料，同时制备纯度大于98％的毛蕊异黄酮和芒柄花素两种化学对照品，制备规模为克级。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案：
1)硅胶柱色谱纯化：
黄芪醇提物，用硅胶柱色谱分离，石油醚、乙酸乙酯混合溶剂洗脱，薄层色谱检测，收集Rf值在0.13-0.32的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀为毛蕊异黄酮粗品；收集Rf值在0.44-0.64的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀为芒柄花素粗品；
2)重结晶：
上述对照品粗品用适宜溶剂溶解，低温放置析晶，即可获得纯度大于98％的毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品，其外观为白色粉末。
所述步骤1)的具体过程为，硅胶柱色谱采用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，其体积比例为8∶2-5∶5；薄层色谱采用的薄层板为GF254荧光板，展开剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，其体积比例为7∶3～5∶5，紫外灯254nm处检视暗斑点。
所述步骤2)的具体过程为，重结晶的溶剂为体积比为3∶7～5∶5的石油醚-乙酸乙酯、体积比为3∶7～5∶5的石油醚-丙酮、或甲醇等；温度为-4℃～-20℃；放置时间为24-48小时。
以本发明从天麻中分离毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪甲苷化学对照品具有如下优点和进步：
1)本发明工艺简单，且可同时获取两个高纯度对照品。
本发明采用黄芪提取物直接进行硅胶层析，通过优选流动相洗脱条件及控制流份收集条件，相应流份直接浓缩即可析出结晶(或沉淀)，获得的对照品粗品的纯度可达85％以上；粗品再经过一次重结晶，即可获得纯度大于98％的对照品。与文献报道经乙酸乙酯萃取、反复硅胶柱层析、sephadex LH-20柱分离等比较，工艺较为简单。
2)本发明采用的技术手段非常适宜放大进行规模化生产。
原料要求不高，一般市售粗提物即可，易于批量备料；硅胶柱层析可用中压层析，也可用减压层析，而后者制备规模及通量较中压层析有大幅度的提升；硅胶填料便宜易得，所用溶剂仅涉及石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等常规溶剂，价廉易得。
附图说明
图1为硅胶柱层析后获得的毛蕊异黄酮粗品(第一次结晶)的HPLC图谱(254nm)；a毛蕊异黄酮粗品；
图2为硅胶柱层析后获得的芒柄花素粗品(第一次结晶)的HPLC图谱(254nm)；b芒柄花素粗品；
图3为毛蕊异黄酮对照品(第二次结晶)的HPLC分析图谱(254nm)；
图4为芒柄花素对照品(第二次结晶)的HPLC分析图谱(254nm)。
具体实施方式
现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1
1)硅胶柱色谱富集：
黄芪醇提物浸膏70g，加入约70g硅胶拌匀，60℃减压干燥，硅胶减压层析(21cm*12cm)分离，分别用5倍柱体积的石油醚∶乙酸乙酯(体积比8∶2)、石油醚∶乙酸乙酯(体积比7∶3)、石油醚∶乙酸乙酯(体积比5∶5)台阶梯度洗脱，薄层色谱检测，以石油醚∶乙酸乙酯(体积比1∶1)为展开剂，GF254荧光板，紫外灯254nm处检视暗斑点，收集Rf值为0.13的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀35mg(毛蕊异黄酮粗品，图1)；收集Rf值为0.44的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀11mg(芒柄花素粗品，图2)；
2)重结晶：
上述对照品粗品分别以甲醇溶液加热溶解(＜60℃)，冰箱冷藏室低温放置(-4℃)，24h后析出白色沉淀，过滤，可得毛蕊异黄酮16mg，芒柄花素 5mg。经HPLC归一化检测，它们的纯度分别为99.00％(图3)和98.30％(图4)。
上述对照品的UV、MS均和文献相一致。
实施例2
1)硅胶柱色谱富集：
黄芪醇提物浸膏700g，加入约700g硅胶拌匀，60℃减压干燥，硅胶柱层析(8cm*80cm)分离，分别用4倍柱体积的石油醚∶乙酸乙酯(体积比8∶2)、石油醚∶乙酸乙酯(体积比7∶3)、石油醚∶乙酸乙酯(体积比5∶5)台阶梯度洗脱，薄层色谱检测，以石油醚∶乙酸乙酯(体积比3∶7)为展开剂，GF254荧光板，紫外灯254nm处检视暗斑点，收集Rf值为0.32的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀360mg(毛蕊异黄酮粗品)；收集Rf值为0.64的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀105mg(芒柄花素粗品)；
2)重结晶：
上述对照品粗品分别以石油醚∶乙酸乙酯(体积比3∶7)超声溶解，冰箱冷藏室低温放置(-4℃)，48h后析出白色沉淀，过滤，可得毛蕊异黄酮155mg，芒柄花素53mg。经HPLC归一化检测，它们的纯度分别为98.52％和98.92％。
实施例3
1)硅胶柱色谱富集：
黄芪醇提物浸膏7000g，加入约7000g硅胶拌匀，60℃减压干燥，硅胶柱层析(9.5cm*120cm)分离，分别用3倍柱体积的石油醚∶乙酸乙酯(体积比8∶2)、石油醚∶乙酸乙酯(体积比7∶3)、石油醚∶乙酸乙酯(体积比5∶5)台阶梯度洗脱，薄层色谱检测，以石油醚∶乙酸乙酯(体积比1∶1)为展开剂，GF254荧光板，紫外灯254nm处检视暗斑点，收集Rf值为0.20的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀3.58g(毛蕊异黄酮粗品)；收集Rf值为0.48的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀1.1g(芒柄花素粗品)；
2)重结晶：
上述对照品粗品分别以石油醚∶丙酮(体积比5∶5)超声溶解溶解，冰箱冷冻室低温放置(-20℃)，36h后析出白色沉淀，过滤，可得毛蕊异黄酮1.6g，芒柄花素528mg。经HPLC归一化检测，它们的纯度分别为98.75％和98.63％。
Claims (6)
1.一种同时制备毛蕊异黄酮、芒柄花素化学对照品的方法，其特征在于：黄芪醇提物，经硅胶柱色谱纯化、重结晶两个步骤，获得纯度大于98％的毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品。具体步骤如下：
1)硅胶柱色谱纯化：
黄芪醇提物，用硅胶柱色谱分离，石油醚、乙酸乙酯混合溶剂洗脱，薄层色谱检测，收集Rf值在0.13-0.32的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀为毛蕊异黄酮粗品；收集Rf值在0.44-0.64的洗脱液；浓缩，析出浅黄色沉淀为芒柄花素粗品；
2)重结晶：
上述对照品粗品用适宜溶剂溶解，低温放置析晶，即可获得纯度大于98％的毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品，其外观为白色粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：1)步骤中石油醚和乙酸乙酯的体积比例为8∶2-5∶5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：1)步骤中薄层色谱的展开剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，其体积比例为5∶5～3∶7。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：1)步骤薄层色谱中的薄层板为GF254荧光板，紫外灯254nm处检视暗斑点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：2)步骤中重结晶的溶剂为体积比为3∶7～5∶5的石油醚-乙酸乙酯、体积比为3∶7～5∶5的石油醚-丙酮、或甲醇。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：2)步骤中重结晶的温度为-4℃～-20℃，放置时间为12-48小时。
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| 《中国现代应用药学》 20020625 曹津铭 黄芪新的化学成分研究 201-202 1-6 第19卷, 第3期 * |
| 杨玲: "黄芪的化学成分及其质量研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 * |
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