CN102010902B

CN102010902B - 产前诊断和监测的标记

Info

Publication number: CN102010902B
Application number: CN2010102663595A
Authority: CN
Inventors: 卢煜明; 赵慧君; 詹兆冲; 徐宝贤
Original assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Current assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2006-03-17
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2026-03-17
Also published as: AU2006224973A1; HK1186756A1; EP2612927A2; EP2612927B1; EP2612927A3; HK1115169A1; WO2006097051A1; CA2601735C; HK1142100A1; US20100267034A1; US7718367B2; CN101137761A; TWI367260B; US10731217B2; JP2008524993A; CA2894337C; US10006087B2; JP5629051B2; CA3007182A1; CN102010902A

Abstract

本发明通过对母体血液中衍生自一系列遗传座位的一种或多种RNA类型的含量进行定量测定，并将所述RNA类型含量与标准对照相比较，提供了诊断、监测或预测孕妇先兆子痫、胎儿的18号染色体三体和21号染色体三体、以及妇女怀孕的方法和试剂盒。

Description

产前诊断和监测的标记

相关申请的相互参考

本申请要求在2005年3月18日提交的美国临时申请第60/663,293号的优先权，将其内容全部引用作为参考。

发明背景

通过例如绒毛膜绒毛取样(CVS)或羊膜穿刺术的方法，可以使用从胎儿分离到的细胞进行常规产前诊断。然而，尽管操作极其小心，但是这些常规的方法依然是侵入性的，并且对母亲和胎儿具有明显的危险(Tabor et al.，Lancet 1：1287-1293，1986)。

现已开发出对这些侵入性方法的替代方法，例如，依据在母体循环中可以找到几种胎儿细胞这一发现，可以对胎儿异常进行测定(Johansen et al.，Prenat.Diagn.15：921-931，1995)，更重要的是可以在母体血浆和血清中对非细胞的循环胎儿DNA进行测定(Lo et al.，Lancet350：485-487，1997)。现已证明，与分离和富集母体循环中胎儿细胞的必须步骤相比，无需对血浆或血清进行复杂的处理，母体血液中胎儿DNA的量就已足够进行遗传分析。使用基于聚合酶链反应(PCR)的技术，已经在母体血液中通过胎儿DNA测定实现了胎儿恒河猴D(RhD)基因型测定(Lo et al.，N.Engl.J.Med.339：1734-1738，1998)，胎儿性别测定(Lo et al.，Hum.Genet.90：483-488，1993)以及若干胎儿病症的诊断(Amicucci et al.，Clin.Chem.46：301-302，2000；Saito et al.，Lancet 356：1170，2000；及Chiu et al.，Lancet 360：998-1000，2002)。

此外，已经有报道说明在先兆子痫(Lo et al.，Clin.Chem.45：184-188，1999and Zhong et al.，Am.J.Obstet.Gynecol.184：414-419，2001)，胎儿21号染色体三体(Lo et al.，Clin.Chem.45：1747-1751，1999 and Zhong et al.Prenat.Diagn.20：795-798，2000)以及妊娠剧吐(Sekizawa et al.，Clin Chem.47：2164-2165，2001)中母体血浆/血清中胎儿DNA的数量异常。美国专利第6,258,540号中也已经公开了用于产前遗传分析的母体血液中胎儿核酸测定的内容。

当对胎儿DNA进行分析时，研究人员通常将仅存在于男性胎儿中的Y染色体标记用作胎儿特异性标记。该方法将其技术的应用局限于50％的孕妇，即怀有男性胎儿的。而且，其它遗传多态现象的使用也增加了基于胎儿DNA分析的复杂性。在母体血浆中发现的胎儿RNA为克服这些限制提供了可能的新方法(Poon et al.，Clin.Chem.46：1832-1834，2000)。

近来，美国专利申请第09/876,005号公开了基于在母体血液中对胎儿/胎盘RNA进行测定的非侵入性技术。此外，美国专利申请第10/759,783号还公开了某些胎盘表达的mRNA标记(例如人绒毛膜促性腺激素β亚基和人促肾上腺皮质素释放激素)，这些标记可用来对诸如先兆子痫、胎儿染色体非整倍性以及未足月生产的妊娠和妊娠相关病症进行测定。已经在母体血液中对多种胎盘来源的其它RNA类型进行了测定，参见，例如Oudejans et al.，Clin Chem.2003，49(9)：1445-1449，以及Go et al.，Clin.Chem.2004，50(8)：1413-1414。本发明还公开了其它的衍生自胎儿/胎盘的RNA类型，如表1至表6所示，这些RNA类型是在母体血液中发现的，并且可用作检测妊娠、或胎儿基因型分析、或对先兆子痫和诸如18号染色体三体和21号染色体三体的胎儿染色体非整倍性进行诊断、监测和预测的标记。因此，本发明还提供了非侵入性产前诊断的其它工具以及妊娠检测的替代方法。

发明概述

在第一方面，本发明涉及诊断、监测或预测孕妇先兆子痫的方法。该方法包括以下步骤：首先，定量测定所述孕妇生物样品中的一种或多种RNA类型的含量。所述RNA类型独立地选自从包含IGFBP3、ABP1、FN1、SLC21A2、KIAA0992、TIMP3、LPL、INHBA、LEP、ADAM12、PAPPA、PAPPA2和SIGLEC6的遗传座位衍生得到的RNA类型，且所述生物样品为血液、生殖道的洗涤物、羊水、尿液、唾液或绒毛膜绒毛。其次，将第一步中所述RNA类型的量与正常非先兆子痫孕妇对应样品中的所述RNA类型的量的标准对照相比较。所述RNA类型含量比所述标准对照升高或降低说明先兆子痫或发展为先兆子痫的高易感性。

在一些实施方案中，所述RNA类型衍生自ADAM12、PAPPA2、FN1、INHBA、LEP或SIGLEC6，且所述RNA类型含量比所述标准对照升高说明先兆子痫或发展为先兆子痫的高易感性。在其它实施方案中，所述RNA类型衍生自PAPPA，所述RNA类型的量比所述标准对照降低说明先兆子痫或发展为先兆子痫的高易感性。

在一些实施方案中，所述的第一步包括使用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)。可选择地，所述第一步还可包括在RT-PCR之后使用质谱。在其它实施方案中，所述第一步包括使用多聚核苷酸杂交方法，或使用引物延伸反应。

在一些实施方案中，被检测的孕妇处于妊娠的头三个月。在其它实施方案中，所述孕妇处于妊娠的中三个月或末三个月。

在一些实施方案中，对血液进行分馏并对血浆部分进行分析。在其它实施方案中，对血液进行分馏并对血清部分进行分析。在一些实施方案中，所述RNA含量比标准对照升高超过2倍。在其它实施方案中，所述RNA含量比标准对照降低超过50％。

本发明还提供了诊断、监测或预测孕妇先兆子痫的试剂盒。该试剂盒包括：(i)对所述孕妇生物样品中的一种或多种RNA类型含量进行定量测定的PCR引物，其中所述RNA类型独立地选自从包含IGFBP3、ABP1、FN1、SLC21A2、KIAA0992、TIMP3、LPL、INHBA、LEP、ADAM12、PAPPA、PAPPA2和SIGLEC6的遗传座位衍生得到的RNA类型，其中的所述生物样品为血液、生殖道的洗涤物、羊水、尿液、唾液或绒毛膜绒毛；及(ii)代表正常非先兆子痫孕妇对应样品中的所述RNA类型含量的标准对照。

在第二方面，本发明涉及测定孕妇中胎儿存在18号染色体三体的方法，所述方法包含以下步骤：首先，对所述孕妇的生物样品中的RNA类型含量进行定量测定，其中所述RNA类型衍生自RPL17。所述生物样品为血液、生殖道的洗涤物、羊水、尿液、唾液或绒毛膜绒毛。其次，将第一步中所述RNA类型的量与具有正常染色体胎儿的孕妇对应样品中的所述RNA类型含量的标准对照相比较。所述RNA类型含量比所述标准对照的偏差说明所怀胎儿具有18号染色体三体的高易感性。

在一些实施方案中，所述RPL17RNA含量比标准对照的升高说明所怀胎儿18号染色体具有三体的高易感性；而在其它情况下，所述RPL17RNA的量比标准对照降低也可说明所怀胎儿具有18号染色体三体的高易感性。

在一些实施方案中，所述第一步包括使用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)。可选择地，所述第一步还可包括在RT-PCR之后使用质谱。在其它实施方案中，所述第一步包括使用多聚核苷酸杂交方法，或使用引物延伸反应。

在一些实施方案中，对血液进行分馏并对血浆部分进行分析。在其它实施方案中，对血液进行分馏并对血清部分进行分析。在一些实施方案中，所述RNA量比标准对照升高超过2倍。在其它实施方案中，所述RNA量比标准对照降低超过50％。

还提供了测定孕妇中胎儿存在18号染色体三体的试剂盒。所述试剂盒包含：(i)对所述孕妇的生物样品中的RNA类型含量进行定量测定的PCR引物，其中所述RNA类型衍生自RPL17，且其中所述生物样品为血液、生殖道的洗涤物、羊水、尿液、唾液或绒毛膜绒毛；及(ii)代表怀有正常染色体胎儿的孕妇对应样品中的所述RNA类型含量的标准对照。

在第三方面，本发明涉及测定孕妇中胎儿存在21号染色体三体的方法。所述方法包含以下步骤：首先，定量测定所述孕妇生物样品中的RNA类型含量，其中所述RNA类型独立地选自从包含COL6A1、COL6A2、SOD1、APP、BTG3、ATP5J、ADAMTS1、BACE2、DSCR5、ITSN1、PLAC4、ATP5O、LOC90625、EFEMP1和TFRC的遗传座位衍生得到的RNA类型，其中所述生物样品为血液、生殖道的洗涤物、羊水、尿液、唾液或绒毛膜绒毛。其次，将第一步中所述RNA类型含量与具有正常染色体胎儿的孕妇对应样品中的所述RNA类型含量的标准对照相比较。所述RNA类型含量比所述标准对照升高或降低说明所怀胎儿具有21号染色体三体的高易感性。

在一些实施方案中，所述RNA类型衍生自ADAMTS1、APP、ATP5O、EFEMP1或TFRC，其中所述RNA类型含量比所述标准对照中升高说明所怀胎儿具有21号染色体三体的高易感性。

还提供了测定孕妇中胎儿存在21号染色体三体的试剂盒。所述试剂盒包含：(i)对所述孕妇的生物样品中的RNA类型含量进行定量测定的PCR引物，其中所述RNA类型独立地选自从包含COL6A1、COL6A2、SOD1、APP、BTG3、ATP5J、ADAMTS1、BACE2、DSCR5、ITSN1、PLAC4、ATP5O、LOC90625、EFEMP1和TFRC的遗传座位衍生得到的RNA类型，且其中所述生物样品为血液、生殖道的洗涤物、羊水、尿液、唾液或绒毛膜绒毛；及(ii)代表怀有正常染色体胎儿的孕妇对应样品中的所述RNA类型含量的标准对照。

在第四方面，本发明涉及测定妇女怀孕的方法。该方法包括以下步骤：首先，对所述妇女的生物样品中的RNA类型含量进行定量测定。所述RNA类型独立地选自从包含COL6A1、COL6A2、SOD1、ATP5O、ADAMTS1、DSCR5和PLAC4的遗传座位衍生得到的RNA类型，其中所述生物样品为血液、生殖道的洗涤物、羊水、尿液、唾液或绒毛膜绒毛。其次，将第一步骤中所述RNA类型含量与正常非孕妇对应样品中的所述RNA类型含量的标准对照相比较。所述RNA类型的量比所述标准对照升高或降低说明怀孕。

在一些实施方案中，所述RNA类型衍生自COL6A1，COL6A2，ATP5O或PLAC4，所述RNA类型含量比所述标准对照升高说明怀孕。

在一些实施方案中，被检测的妇女处于妊娠的头三个月。在其它实施方案中，所述妇女处于妊娠的中三个月或末三个月。

在一些实施方案中，对血液进行分馏并对血浆部分进行分析。在其它实施方案中，对血液进行分馏并对血清部分进行分析。在一些实施方案中，所述RNA量比标准对照升高超过2倍。在其它实施方案中，在所述RNA量比标准对照降低超过50％。

还提供了测定妇女怀孕的试剂盒。该试剂盒包括：(i)对所述妇女生物样品中的RNA类型含量进行定量测定的PCR引物，其中所述RNA类型独立地选自从包含COL6A1、COL6A2、SOD1、ATP5O、ADAMTS1、DSCR5和PLAC4的遗传座位衍生得到的RNA类型，且其中所述生物样品为血液、生殖道的洗涤物、羊水、尿液、唾液或绒毛膜绒毛；及(ii)代表正常非孕妇对应样品中的所述RNA类型含量的标准对照。

附图的简要描述

图1所示为妊娠头三个月21号染色体三体与对照妊娠中胎盘组织RNA转录水平的比较。(A)代表ADAMTS1mRNA。(B)代表APP mRNA。每一个●代表一个受试者。

图2所示为在母体血沉棕黄层中胎盘表达转录物的相对浓度。方框内部的横线代表中位值。所述方框代表25％-75％的区间。所述须线(whisker)代表10％-90％的区间。所述实心圆代表在10％-90％的区间之外的数据。

图3所示为分娩后母体血浆中胎盘mRNA的清除。(A)和(B)分别为分娩前和分娩后24小时母体血浆中COL6A1 mRNA和COL6A2mRNA的浓度。每条线都代表从同一个受试者得到的成对血浆样品。

图4所示为妊娠头三个月21号染色体三体与对照妊娠中胎盘组织RNA转录水平的比较。(A)代表EFEMP1mRNA。(B)代表TFRC mRNA。(C)代表ATP5O mRNA。每一个●代表一个受试者。(D)表示分娩后24小时母体血浆中的ATP5O mRNA的清除。每条线都代表从同一个受试者得到的成对血浆样品。

图5所示为妊娠末三个月先兆子痫(PET)与对照妊娠中胎盘组织RNA转录水平的比较。(A)代表Leptin(瘦素，LEP)mRNA。(B)代表SIGLEC6mRNA。方框内部的横线代表中位值。所述方框代表25％-75％的区间。所述须线代表10％-90％的区间。所述实心圆代表在10％-90％的区间之外的数据。

图6所示为在先兆子痫与对照妊娠的母体血浆中，Leptin(LEP)mRNA和INHBA mRNA浓度的比较，(A)代表Leptin(LEP)mRNA。(B)代表INHBA mRNA。方框内部的横线代表中位值。所述方框代表25％-75％的区间。所述须线代表10％-90％的区间。所述实心圆代表在10％-90％的区间之外的数据。

图7所示为未孕妇、妊娠前三个月和妊娠末三个月妇女血浆中PLAC4mRNA浓度的方框图。方框内部的横线代表中位值。所述方框代表25％-75％的区间。所述须线代表10％-90％的区间。所述实心圆代表在10％-90％的区间之外的数据。

图8所示为分娩后母体血浆中PLAC4mRNA的清除。每条线都代表从同一个受试者得到的成对血浆样品。

图9所示为妊娠末三个月先兆子痫(PET)与对照(正常)妊娠中胎盘组织RNA转录水平的比较。(A)代表LEP mRNA。(B)代表ADAM12mRNA。(C)代表PAPPA mRNA。(D)代表PAPPA2mRNA。(E)代表INHBAmRNA。(F)代表FN1mRNA。方框内部的横线代表中位值。所述方框代表25％-75％的区间。所述须线代表10％-90％的区间。所述实心圆代表在10％-90％的区间之外的数据。

定义

在本说明书中，术语“衍生自遗传座位的RNA类型”是指核糖核苷酸聚合物，所述核糖核苷酸聚合物具有与人类基因组中预先选定位置的至少一部分相对应的序列。在本申请中，“RNA类型”可以编码或不编码蛋白产物，其序列可包含非编码序列或仅包括部分开放阅读框。

在本说明书中，术语“胎儿”，“衍生自胎盘的”或“胎盘表达的”是指可在孕妇的如血液生物样品中检测到的某些RNA类型的来源。换言之，胎儿RNA类型是从胎儿DNA序列转录而来的。而且，衍生自胎盘的或胎盘表达的RNA类型是在所述胎盘中发现的，并且是由胎儿DNA序列转录而来的。

在本说明书中，术语“生殖道的洗涤物”是指对孕妇或检测是否怀孕的妇女的生殖道进行冲洗或清洗后收集的任意液体或溶液。

在本说明书中，术语“先兆子痫”是指在妊娠中发生的疾病状态，其主要症状是通常与蛋白尿和水肿(肿胀)相伴的多种高血压。先兆子痫有时也称为妊娠毒血症，其还涉及称为“惊厥”的更严重的病症，该病症是伴随癫痫发作的先兆子痫。这些状态通常在妊娠的后半段(20周以后)发展，尽管也有可能在出生后短期或妊娠20周前发作显现。

在本说明书中，术语“引物延伸反应”是指在适当条件下，由核苷酸聚合酶，如DNA聚合酶作用介导的对与模板序列至少部分互补的预定多核苷酸序列进行延伸的任何聚合过程。

在本说明书中，术语“染色体非整倍性”是指一种染色体异常状态，其中所述染色体数不是正常单倍体数的整数倍：通常情况是，有额外的一条染色体或其中的一条染色体丢失。染色体非整倍性的最常见情况是三体，其具有一条额外的染色体。例如，18号染色体三体就是在细胞中发现第三条18号染色体的一种染色体异常，而在细胞中存在第三体21号染色体的患者则患有21号染色体三体。

与非整倍性相反，“染色体正常”描述的是染色体数量为单倍体数量整数倍的状态，例如在二倍体中二倍的染色体数量，且每条染色体都具有相同的数量(除非是在例如男性的性染色体中，两条不同的性染色体，X和Y都以单拷贝分别存在)。

在本说明书中，术语“血液”是指来自孕妇或检测是否怀孕妇女的血液样品或制品。该术语还包括全血，或者是具有不同浓度，甚至是不含有造血细胞或任意其它类型细胞或细胞残留物的母体或胎儿来源的任意血液成分，包括血小板。“血液”包括血浆和血清。基本不含有细胞的血液样品也称为“无细胞的”，其中通常没有血小板。

在本说明书中，术语“正常”描述的相对于某些指标，例如在母体血液中检测到的衍生自胎儿/胎盘的RNA水平，是没有先兆子痫，或怀有染色体正常胎儿的孕妇，这些指标是随机选用组群的无先兆子痫，或怀有染色体正常胎儿的妇女的典型值。该选用组群应该包含足够数量的妇女，从而使得从遗传座位(其可编码或不编码特定的胎儿蛋白)转录得到的衍生自胎儿/胎盘的RNA平均水平能够以合理的准确性反映出怀有健康胎儿的健康孕妇的普通人群中的所述RNA水平。此外，所述选用组群的妇女应该与对其血液进行测定的妇女具有相似的妊娠龄，所述测定是为了说明先兆子痫或胎儿染色体非整倍性，如18号染色体三体和21号染色体三体。根据所要筛查的病症的不同，实施本发明的优选妊娠龄也不同。例如，孕妇进行的先兆子痫筛查可优选地在怀孕的中三个月进行，而优选地对胎儿染色体非整倍性进行的筛查和诊断应该尽可能早进行。此外，考虑到某些标记可能会在妊娠的某个阶段比其它阶段更容易进行测定，因此优选地进行测定的妊娠年龄需要根据在检测中所使用的RNA标记而定。

在本说明书中，术语“正常”类似地用于指特定RNA种类的含量，其是健康的未怀孕妇女的随机选用组群血液中测得的典型量。

在本说明书中，IGFBP3、ABP1、FN1、SLC21A2、KIAA0992、TIMP3、LPL、INHBA、LEP、SIGLEC6、RPL17、COL6A1、COL6A2、SOD1、APP、BTG3、ATP5J、ADAMTS1、BACE2、DSCR5、ITSN1、PLAC4、LOC90625、ATP5O、EFEMP1和TFRC是指基因或建议的开放阅读框(包括起变异体和突变体)及其多核苷酸转录物，如表2、表4和表6中提供的GenBank登录号所对应的序列。在本文的某些地方，这些术语还可用来指示由这些基因或开放阅读框编码的多肽。

在本说明书中，术语“标准对照”是指为了测定RNA转录物，如COL6A1，COL6A2，APP，ATP5O或LEP含量，适合用于本发明方法的样品。这些样品含有已知量的衍生自胎儿/胎盘的RNA类型，其能够相当接近地反映在正常孕妇中这些RNA类型的平均水平。类似地，“标准对照”也可来自正常健康的未怀孕妇女。

在本说明书中，术语“所述RNA类型含量比所述标准对照升高或降低”是指相对所述标准对照的量的正变化或负变化。增加优选为至少2倍，更优选为至少5倍，最优选为至少10倍。类似地，降低优选为至少50％，更优选为至少80％，最优选为至少90％。

在本说明书中，术语“多聚核苷酸杂交方法”是指在适当杂交条件下，根据其与已知序列的多聚核苷酸探针形成沃森-克里克碱基配对的能力，测定某种多聚核苷酸的存在和/或量的方法。这些杂交方法的例子包括Southern杂交和Northern杂交。

在本说明书中，术语“PCR引物”是指可用于聚合酶链反应中，对衍生自诸如COL6A1，COL6A2，APP，ATP5O或LEP遗传座位的RNA转录物所产生的核苷酸序列进行扩增的寡核苷酸。至少有一种对衍生自以上名称座位的RNA序列进行扩增的PCR引物对所述座位具有序列特异性。

发明的详细描述

I概述

本发明首次提供了诊断、监测或预测孕妇先兆子痫、胎儿的18号染色体三体和21号染色体三体，以及妇女妊娠的方法与试剂盒，该方法与试剂盒是通过分析所述妇女血液中的一种或多种衍生自胎儿/胎盘的RNA类型、即具有表1至表6中所述序列的水平实现的。

如本发明所述，这些母体血液样品中的胎儿/胎盘来源的RNA转录物量是可以优选地在完成扩增过程，例如反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)之后进行定量测定的。然后将一种或多种这些RNA类型含量与具有相同类型RNA水平的标准对照相比，所述该RNA水平是指处于类似妊娠龄但没有这些妊娠相关病症的正常孕妇典型值。所述RNA水平的升高或降低说明了所述病症的存在或发展成所述病症的高易感性。因此，本发明提供了诊断先兆子痫、以及诸如胎儿的18号染色体三体和21号染色体三体的胎儿染色体非整倍性的新的途径，该途径是非侵入性的，并且不依赖于性别和多态性。

根据相同的方法，通过将妇女血液中从这些遗传座位转录得到的一种或多种所述RNA类型的水平与从正常未妊娠妇女获得的已确定的对照值进行比较，本发明还可用来测定妊娠。

尽管胎儿/胎盘表达的RNA已经用作产前诊断和监测，参见，例如美国专利申请第09/876,005号和第10/759,783号，但是却发现对适于该目的特定RNA类型的标记的鉴定具有不可预测性。因为并不是所有在胎盘中表达的RNA类型都能够在母体血液中检测到。例如，本发明人未能在母体血液中检测到某些衍生自胎儿/胎盘的RNA类型。一些示例性的未检测到的类型包括：NADH脱氢酶(泛醌)黄素蛋白3，10kDa(NDUFV3)；α-胎蛋白(AFP)；∈1-血红蛋白(HBE1)以及IIA型磷脂酶A2(血小板，滑液)(PLA2G2A)。

II血液样品的制备

A.血液样品的获得

实施本发明的第一步就是从适合接受本发明方法检测的妊娠龄的孕妇，或检测是否妊娠的妇女中获取生物样品，例如血液样品。如上所述，根据所检测的病症不同和有时所使用的RNA标记不同，适合的妊娠龄也会有所变化。对妇女进行的血液采集是按照医院或诊所的标准操作程序进行的。采集适量的外周血液，例如3-20ml，并且在进行后续处理之前按照标准程序进行保存。

B.血浆或血清样品的制备

妇女血液的血清和血浆适于本发明，并可通过公知的方法获得。例如，可将妇女的血液放置于含有EDTA或具体的商业化制品，如Vacutainer SST(Becton Dickinson，Franklin Lakes，新泽西，美国)中以防止血液凝结，可通过离心从全血得到血浆。在另一方面，可在凝结后通过离心血液得到血清。离心通常在适合的速度，如1,500-3,000×g，在冷藏的环境，如4-10℃的条件下进行。在将血浆或血清转移至新管进行RNA提取之前，还可以对其进行额外的离心处理步骤。在本发明的某些应用中，血浆或血清可能是优选的样品类型。而在本发明的其它应用中，全血可能是优选地。而在另一些应用中，优选地则是血液的其它组分。

III妇女血液中RNA量的定量测定

A.RNA提取

从生物样品中提取RNA有多种方法。可以采用普通的RNA制备方法(例如Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual3d ed.，《分子克隆：实验手册》第3版，2001)；多种可商业获得的试剂或试剂盒，如Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，加利福尼亚，美国)，OligoteX Direct mRNA Kits试剂盒(Qiagen，Valencia，加利福尼亚，美国)，RNeasy Mini Kits试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)以及

Series9600^TM(Promega，Madison，WI，美国)来从妇女的血液样品中获取RNA。也可以将这些方法组合来提取RNA。

[0061]在某些应用中，优选地要去从RNA制品中去除所有或大部分污染性的DNA。因此，在扩增和定量步骤中，应该对样品小心操作，彻底进行DNA酶处理并且设定适当的阴性对照。

B.对RNA水平基于PCR的定量测定

一旦从妇女血液样品中提取到了RNA，就可以对衍生自感兴趣的遗传座位，如COL6A1，COL6A2，APP，ATP5O或LEP的RNA量进行定量测定。测定所述RNA水平的优选方法是基于扩增的方法，如PCR。

在进行扩增步骤之前，必须合成所述感兴趣RNA的DNA拷贝(cDNA)。这可以通过反转录来完成，其可作为分别的步骤进行，或者以对扩增RNA的聚合酶链反应进行改进的均一反转录-聚合酶链反应进行。对核糖核酸进行PCR扩增的适合方法可参见Romero和Rotbart 所著的《诊断分子生物学：原理和应用》(Diagnostic Molecular Biology：Principles and Applications)401-406页；Persing等人编辑，Mayo Foundation，Rochester，MN，1993；Egger et al.，J.Clin.Microbiol.33：1442-1447，1995；以及美国专利第5,075,212号。

PCR方法在本领域内是公知的，因此无需在此进行描述。关于PCR方法的综述，实验方法和引物设计原理可参考例如Innis等人的《PCR实验方法：方法和应用指南》(PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications)，Academic Press，Inc.N.Y.，1990。也可从零售商，如RocheMolecular Systems获得PCR试剂和操作方法。

在大多数情况下，都采用热稳定酶以自动化的过程实施PCR。在该过程中，反应混合物的温度通常是在变性区，引物退火区，和延伸反应区之间自动循环。在有些实验方法中，可以将退火区与延伸反应区合并。适合这一目的的机器是商业可获得的。

尽管在实施本发明时通常采用的RNA扩增方法是PCR。但本领域所述技术人员应意识到，对母体血液中这些RNA类型的扩增也可以通过其它公知的方法来实现，例如连接酶链反应(LCR)，转录介导的扩增，以及自主序列复制或基于核酸序列的扩增(NASBA)，其中的每一种都能提供足量的扩增。还可以使用最近开发的分支DNA技术对母体血液中的RNA标记量进行定量测定。关于对临床样品中的核酸序列进行直接定量的分支RNA信号扩增的综述，可参见Nolte，Adv.Clin.Chem.33：201-235，1998。

C.其它定量方法

也可以使用本领域所属技术人员公知的其它标准技术测定所感兴趣的RNA类型。尽管扩增步骤通常先于所述测定步骤，但在本发明的所述方法中扩增可不需要。例如，无论是在扩增步骤之前或之后进行，都可以通过大小分离(如凝胶电泳)鉴定所感兴趣的RNA类型。在经过公知的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，并进行溴化乙锭标记之后(参见，例如上述的Sambrook and Russell)，与标准对照相同的条带的存在可以说明靶RNA的存在，可根据所述条带的强度，对所述条带的量与所述标准进行比较。可选择地，基于所述探针所产生信号的强度，可以采用与从如COL6A1，COL6A2，APP，ATP5O或LEP的遗传座位转录而来的RNA特异的寡核苷酸探针来检测这些RNA类型的存在，并且与所述标准比较说明了所述RNA的量。

序列特异性的探针杂交是在含有其它核酸类型的环景下检测特异性核酸的公知方法。在足够严苛的杂交条件下，所述探针特异性地仅与基本上互补的序列杂交。可将所述杂交条件的严苛程度放宽从而允许不同量的序列错配。

在本领域中有多种杂交方式，包括液相，固相或混合相杂交分析方法。下述文章提供了对多种杂交分析方式的综述：Singer et al.，Biotechniques(生物技术)4：230，1986；Haase et al.，Methods in Virology(病毒学方法)，pp.189-226，1984；Wilkinson，In situ Hybridization(原位杂交)，Wilkinson ed.，IRL Press，Oxford University Press，Oxford；以及Hames andHiggins eds.，Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(核酸杂交：操作方法)，IRL Press，1987。

根据公知的方法可对杂交复合物进行测定，所述测定并不是本发明的重点。可以采用任何常用于测定杂交核酸存在的方法标记能特异性与靶核酸，即所感兴趣的RNA类型或所述扩增的DNA，杂交的核酸探针。常见的测定方法是采用由³H，¹²⁵I，³⁵S，¹⁴C或³²P等等标记的探针进行放射自显影。放射性同位素的选择是根据研究偏好，考虑因素包括同位素的合成容易程度、稳定性和半衰期。其它标记包括化合物(例生物素和地高辛)标记，所述化合物能与荧光基团、化学发光剂和酶标记的抗配体(antiligands)或抗体相结合。可选择地，探针可以与诸如荧光基团、化学发光剂或酶的标记直接轭合。所述标记的选择依赖于所需要的敏感性、与所述探针轭合的难易程度、稳定性要求以及可利用的设备。

可以使用公知的技术合成和标记实施本发明所必需的探针和引物。可以根据首先由Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letts.，22：1859-1862，1981所述的固相亚磷酰胺三酯法，如Needham-VanDevanter et al.，Nucleic Acids Res.12：6159-6168，1984所述，使用自动合成仪，对用作探针和引物的寡核苷酸进行化学合成。如 Pearson and Regnier，J.Chrom.，255：137-149，1983所述，可采用天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换高效液相色谱(HPLC)对寡核苷酸进行纯化。

IV.标准对照的建立

为了建立标准对照，首先要选取一组怀有健康胎儿的健康孕妇。这些妇女应具有类似的妊娠龄，所述妊娠龄应该处于使用本发明方法对诸如先兆子痫和胎儿染色体非整倍性(包括18号染色体三体和21号染色体三体)的病症进行检测的适当的怀孕阶段之内。类似地，可使用来自健康未怀孕妇女组别的样品建立标准对照。

应该使用已建立的、常规使用的方法对所选择的孕妇以及她们所怀的胎儿的健康状态进行确认，这些方法包括监测所述妇女的血压，记录产程开始，使用CVS以及羊水诊断进行胎儿遗传分析。

此外，因该以适当的组别规模选择怀有健康胎儿的健康孕妇或健康未孕妇女，从而使得从所述组别中计算得到的本申请指明的遗传座位衍生出的RNA平均量能够比较合理的代表怀有健康胎儿的健康孕妇或健康未孕妇女普通人群中的正常或平均量。优选地，所选择的组别包含至少10例妇女。

一旦根据所选择组别的每个妇女测定的个体值建立了所述胎儿/胎盘衍生RNA量的平均值，则就可认为该值是所述RNA类型的标准。因此，含有所述相同类型类似量RNA的血液样品都可用作标准对照。也可以人工配制含有所述相同类型的已建立平均浓度的感兴趣的RNA类型的溶液并将其作为标准对照。

仅以说明性目的而非限制性目的提供以下实施例。本领域所属技术人员应很容易理解，对多种非关键性参数进行改变和修改也能得到基本类似的结果。

实施例

仅以说明性目的而非限制性目的提供以下实施例。本领域所属技术人员应很容易理解，对多种非关键性参数进行改变和修改也能得到基本相同或类似的结果。

实施例1在胎盘组织中表达的21号或18号染色体的遗传座位

方法

受试者

胎盘组织和血液样品采集自知情同意的处于头三个月的孕妇，这些妇女是到香港威尔斯亲王医院的妇产科就诊的。所述研究已获得了临床研究伦理委员会的批准。

微阵列分析的样品制备

在治疗结束前，采用绒膜绒毛取样(CVS)从孕妇获得了5份头三个月的胎盘组织样品。所有病例中的胎儿核型分析随后都被确认为正常。在采集时立即将胎盘组织样本储存于RNAlater^TM(

奥斯丁，德克萨斯，美国)并保存于-80℃直至进行RNA提取。在进行组织采集的同时收集6毫升孕妇的外周血，并储存于PAXgene^TM血液RNA试管(PreAnalytiX，Hombrechtikon，瑞士)中。根据制造商的实验指南，采用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，加利福尼亚，美国)从胎盘组织中提取总RNA，并用RNeasy mini-试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)进行纯化。按照制造商的指南，使用PAXgene^TM血液RNA试剂盒(PreAnalytiX，Hombrechtikon，瑞士)从外周血中提取总RNA，还包括进行DNA酶处理(RNase-Free DNase Set，Qiagen，Hilden，德国)。

通过高密度寡核苷酸微阵列进行基因表达分析

按照制造商的指南，对每个样品而言，将所提取的10微克RNA用于标记并与人类基因组U133A和U133B阵列(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)杂交。杂交之后，洗涤每个阵列并在

Fluidics Station 400(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)中进行染色。用GeneArray Scanner(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)对所述芯片进行扫描，用

Microarray Suite 5.0(Affymetrix)进行分析。

实时定量RT-PCR

采用一步实时定量RT-PCR(QRT-PCR)对胎盘组织和母体血液样品中的RNA转录物进行定量测定。对持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)检测的QRT-PCR分析在之前已有描述(Ng et al.2002)。其它待测基因的引物(Proligo，Singapore)和荧光探针(Applied Biosystems，FosterCity，加利福尼亚，美国)序列如表1A所示。为了对胎盘组织和母体血沉棕黄层进行分析，进行了相对定量，其中将所研究的转录物水平标准化至相应的GAPDHmRNA水平。

根据制造商的指南(EZ rTth RNA PCR reagent set，AppliedBiosystems)，在25μl反应体积中建立所述QRT-PCR反应。在组合的热循环仪和荧光检测器(ABI Prism 7900HT，Applied Biosystems)上进行所述QRT-PCR分析。对所有转录物而言，所述PCR引物和荧光探针的浓度分别为300nM和100nM。在进行QRT-PCR之前，根据制造商的推荐，使用DNase I消化(Invitrogen，Carlsbad，加利福尼亚，美国)去除所述胎盘组织RNA提取物中的污染DNA。使用17ng提取的胎盘RNA进行扩增。在每次分析中都包含有多个阴性水空白对照。

所述热处理过程如下：所述反应在50℃，2分钟启动，使得所包含的尿嘧啶N-糖基化酶起作用，然后在60℃反转录30分钟。经过在95℃变性5分钟之后，在92℃变性15秒和在58℃退火/延伸1分钟进行40个PCR循环。

对母体血液中胎盘表达转录物的定量分析

将正常孕妇的母体全血样品采集到EDTA管中。将所述血液样品在1,600g，在4℃离心10分钟后，将所述血沉棕黄层和血浆部分小心地转移至分别的聚丙烯管中。将所述血浆样品在16,000g，在4℃再离心10分钟。将上清液收集至新的聚丙烯管中。如前所述，从所收集的母体血浆中提取RNA(Ng et al.，2002)。类似地，从0.3mL所述血沉棕黄层部分中提取RNA。

采用与上述相同的条件对所研究的转录物进行QRT-PCR分析。每个QRT-PCR反应需要使用5微升所提取的血浆RNA或10ng所述血沉棕黄层的RNA。采用绝对定量来测定血浆样品中的所述转录物浓度。以浓度从1x10⁷拷贝到1x10¹拷贝，通过对具有所述扩增子全长的经过高效液相色谱纯化的单链合成DNA寡核苷酸(Proligo，Singapore)进行连续稀释制备了校准曲线。血浆中所述转录物的绝对浓度以拷贝/毫升血浆进行描述。所合成DNA寡核苷酸的序列如表1B所示。所述血沉棕黄层部分的结果以基于对GAPDH的标准化进行相对定量表述。

统计分析

使用Sigma Stat 2.03软件(SPSS)进行统计分析。

结果

通过高密度寡核苷酸微阵列对胎盘表达基因的鉴定

通过对每个独立样品进行独立的微阵列分析得到了5份头三个月CVS样品的基因表达谱。在人类基因组U133A和U133B芯片(Affymetrix)中大约22,000个可检测的转录物中，在所述CVS样品中总共有7226个基因转录物具有表达。我们之前已报到过在正常人血浆中的循环DNA主要衍生自造血细胞(Lui et al.，2002)。因此，我们认为在母体血液中多数背景母体核酸也具有源自所述造血部分。考虑到我们的目的是对母体血浆的所述循环RNA分子中胎盘表达转录物进行鉴定，所以我们进一步获得了母体全血的基因表达谱，并使用了

Microarray Suite 5.0软件(Affymetrix)将所述表达谱与对应的胎盘组织表达谱进行了比较。在总共五组的与对应全血样品的比较中，通过对所述CVS组织中表达水平升高的转录物进行选择，鉴定了早期妊娠的胎盘表达转录物。完成该步骤之后，去除在母体血细胞中表达高于所述胎盘组织或与之类似的转录物。由此，该分析确定了在妊娠头三个月中具有胎盘特异性的1245个转录物组。

选择具有胎盘组织表达及在21号或18号染色体上的遗传座位

在通过上述方法鉴定的具有胎盘特异性转录物的组中，我们对位于21号染色体上基因的转录物进行了进一步的搜索。鉴定了13个位于21号染色体上的基因，如表2A所示。该基因选择策略是基于这样的原因：具有21号染色体三体的胎儿的基因组中存在有额外21号染色体产生的基因剂量的改变，可导致位于21号染色体上的基因异常表达。正如我们之前所证明的，胎盘是母体血浆中循环胎儿RNA的重要来源(Ng et al.，2003)，由21号染色体三体引起的该靶基因的异常胎盘组织表达，可通过母体血液中所述转录物的异常浓度得以反映。因此，通过源自胎儿/胎盘的循环RNA分析用作胎儿21号染色体三体的非侵入性产前检测的方法，是根据将怀有21号染色体三体的胎儿的孕妇的那些所选择的转录物的异常血浓度与怀有正常胎儿的妇女的血液浓度相比较的检测。

采用了类似的策略以非入侵性的产前分析方式对18号染色体的三体的基因标记进行鉴定。采用人类基因组U133B阵列(Affymetrix)对CVS和母体全血样品的表达谱进行了分析。针对母体血液的情况，采用与如上相同的筛选标准确定了在CVS中具有优先表达的转录物组。根据相对胎盘特异性从所述转录物组中选择了位于18号染色体上的胎盘表达基因。在此组中，选择了在CVS中表达水平最高的转录物，如表2B所示。

通过实时QRT-PCR对微阵列进行验证

采用一步实时QRT-PCR对上述基于微阵列的策略鉴定的标记的胎盘组织表达进行了验证。对10个正常妊娠和3个21号染色体三体妊娠的头三个月CVS组织进行了GAPDH mRNA、列示于表2A和2B的所选择的转录物的测定。采用以下等式，将所测基因的相对mRNA水平对相应的GAPDH水平进行了标准化：

ΔCt_X＝Ct_GAPDH-Ct_X

其中Ct代表了阈循环数，即将样品的QRT-PCR反应累积的荧光达到预定阈强度所需要的PCR循环数。ΔCt_X是所测转录物X的标准化mRNA水平；Ct_GAPDH是GAPDHmRNA的Ct值；Ct_X是所述转录物X的Ct值。由于Ct值与所述模板mRNA的量的对数呈反比，所以ΔCt_X值越高则 mRNA水平越高。由此确认了所测转录物在采集自正常和涉及21号染色体三体胎儿妊娠的CVS组织中都有表达并具有可检测性。

在与从正常妊娠采集的样品进行比较时，在采集自21号染色体三体妊娠的CVS组织中发现了ADAMTS1 mRNA(图1A)(Mann-Whitney检验，P＝0.036)和APP mRNA(图1B)(Mann-Whitney检验，P＝0.036)在胎盘组织表达的统计显著性上调。这些数据证实了我们的假设，说明位于所述三体染色体上的基因与胎盘组织表达的定量异常有关，因此，这些基因是21号染色体三体产前评价非常有用的标记。

母体血液中所述胎盘表达转录物的可检测性

我们对从妊娠末三个月妇女采集到的血沉棕黄层和血浆样品中某些转录物的可检测性进行了研究。研究的所有12个转录物在血沉棕黄层(图2)和血浆样品中(数据未显示)都具有可检测性。为了对所述转录物的妊娠特异性进行检测，还采集了10位孕妇生产前和产后24小时的血浆样品。图3A和3B说明COL6A1和COL6A2 mRNA在产后的母体血浆中被迅速清除(Wilcoxon检验，二者均为P＜0.05)，而对应的GAPDH mRNA水平则保持不变(数据未显示，Wilcoxon检验，P＝1.000)。产后母体血浆中COL6A1和COL6A2 mRNA的清除说明胎盘是这些转录物的最主要组织来源。

结论

本发明使用基于微阵列的方法，鉴定了在妊娠头三个月的胎盘组织中表达的转录物。根据对位于21号染色体上胎盘表达的基因的选择，确定了13个用于21号染色体三体的产前检测的转录本。类似地，也通过对在18号染色体上编码的胎盘转录物的选择，确定了用于18号染色体三体的产前检测的RNA标记。

本发明通过实时QRT-PCR方法验证了在正常和非整倍型胎盘组织中所测转录物的可检测性。例如，在21号染色体三体妊娠的胎盘组织中，ADAMTS1与APP mRNA具有异常表达。此外，在母体血沉棕黄层和血浆中所有所述靶基因的mRNA都具有可检测性。这些数据证实了我们的标记选择策略能够鉴定在21号染色体三体中异常表达的RNA类型，并且在母体循环中具有可检测性，其可促进对胎儿21号染色体三体的非侵入性产前诊断策略的发展。例如，对21号染色体三体的非侵入性产前检测可以根据对21号染色体三体妊娠的所述RNA标记的异常浓度的测定和正常妊娠中的对应浓度的比较来实现。可选择地，可以根据母体血浆中一或多种所述转录物的不同分子形式的相对定量比较实施非侵入性的产前诊断。还可以通过对母体血浆中RPL17mRNA的测定来诊断18号染色体三体。

实施例2在21号染色体三体妊娠胎盘中表达升高的基因与正常妊娠的基因的比较

方法

受试者

所有胎盘组织和血液样品均采集自知情同意的处于妊娠头三个月的孕妇，这些妇女是到香港威尔斯亲王医院的妇产科就诊的。所述研究已获得了临床研究伦理委员会的批准。

在本研究的第一部分，采用寡核苷酸微阵列对正常和21号染色体三体妊娠的胎盘组织基因表达谱进行了鉴定。采用绒膜绒毛取样(CVS)从孕妇获得了头三个月的胎盘组织样品。招募了5名正常妊娠的妇女(妊娠龄10-12周)和3名怀有21号染色体三体胎儿的妇女(妊娠龄12-13周)，随后分别对其进行了胎儿核型分析并确诊。在本研究的第二部分，使用QRT-PCR对通过所述寡核苷酸微阵列实验产生的基因表达谱进行验证。为进行所述研究，采用了来自于3名怀有21号染色体三体胎儿的妇女(妊娠龄13-14周)和5名正常妊娠妇女(妊娠龄9-13周)的CVS。

微阵列分析的样品制备

采集后立即将CVS样本储存于RNAlater^TM(

奥斯丁，德克萨斯，美国)并保存于-80℃直至进行RNA提取。在进行组织采集的同时对五名正常妊娠的孕妇，收集6毫升外周血，并储存于 PAXgene^TM血液RNA试管(PreAnalytiX，Hombrechtikon，瑞士)中。根据制造商的实验指南，采用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，加利福尼亚，美国)从胎盘组织中提取总RNA，并用RNeasy mini-试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)进行纯化。按照制造商的指南，使用PAXgene^TM血液RNA试剂盒(PreAnalytiX，Hombrechtikon，瑞士)从外周血中提取总RNA，还包括进行DNA酶处理(RNase-Free DNase Set，Qiagen，Hilden，德国)。

通过高密度寡核苷酸微阵列进行基因表达分析

按照制造商的指南，对每个样品而言，标记所提取的10微克RNA并与

人类基因组U133A和U133B阵列(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)杂交。杂交之后，洗涤每个阵列并在 FluidicsStation 400(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)中进行染色。用GeneArray Scanner(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)对所述芯片进行扫描，用

Microarray Suite 5.0(Affymetrix)进行分析。

实时定量RT-PCR

采用一步实时定量RT-PCR(QRT-PCR)对胎盘组织和母体血液样品中的RNA转录物进行定量测定。对持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)检测的QRT-PCR分析在之前已有描述(Ng et al.2002)。其它检测基因的引物(Proligo，Singapore)和TaqMan小沟结合(MGB)荧光探针(Applied Biosystems，Foster City，加利福尼亚，美国)序列如表3所示。采用相对定量来描述所表达的RNA量，其中根据相应的GAPDH mRNA水平对所研究的转录物水平进行标准化。

根据制造商的指南(EZ rTth RNA PCR reagent set，AppliedBiosystems)，在25μl反应体积中建立所述QRT-PCR反应。在合并的热循环仪和荧光检测器(ABI Prism 7900HT，Applied Biosystems)上进行所述QRT-PCR分析。对所有转录物而言，所述PCR引物和荧光探针的浓度分别为300nM和100nM。在进行QRT-PCR之前，根据制造商的推荐，使用DNase I消化(Invitrogen，Carlsbad，加利福尼亚，美国)去除所述胎盘组织RNA提取物中的污染DNA。使用17ng胎盘RNA提取物进行扩增。在每次分析中都包含有多个阴性水空白对照。

所述热处理过程如下：所述反应在50℃、2分钟启动，使得所包含的尿嘧啶N-糖基化酶起作用，然后在60℃反转录30分钟。经过在95℃变性5分钟之后，在92℃变性15秒和在58℃退火/延伸1分钟进行40个PCR循环。

对母体血液中与胎盘转录物相关的21号染色体三体的定量分析

将从正常怀孕妇女中的母体全血样品采集到EDTA管中。将所述血液样品在1,600g，在4℃离心10分钟后，将血浆部分小心地转移至空的聚丙烯管中。将该血浆样品在16,000g，在4℃再离心10分钟。将上清液收集至新的聚丙烯管中。如前所述，从所收集的母体血浆中提取RNA(Ng et al.，2002)。采用与上述相同的条件对所述研究转录物进行QRT-PCR分析。每个QRT-PCR反应需要使用5微升所提取的血浆RNA。

统计分析

使用Sigma Stat 2.03软件(SPSS)进行统计分析。

结果

非整倍体妊娠中异常胎盘组织表达基因基于微阵列的鉴定

通过对每个单独样品进行独立的微阵列分析得到了5份头三个月CVS样品的基因表达谱。我们之前已报到过在正常人血浆中的循环DNA主要衍生自造血细胞(Lui et al.，2002)。因此，我们假设在母体血液中背景母体核酸的多数也源自所述造血部分。考虑到本研究的最终目的是鉴定胎盘表达转录物，其在母体血浆中的循环RNA分子中是胎儿特异性的，所以我们进一步获取了成对母体全血的基因表达谱，并将这些表达谱与那些对应的5个正常妊娠样品中的表达谱进行了比较。使用的是

Microarray Suite 5.0软件(Affymetrix)。当与全部5组比较中的对应的全血样品进行比较时，通过对所述CVS组织中表达水平升高的转录物的选择，鉴定了具有相对胎盘特异性的转录物。完成该步骤之后，去除在母体血细胞中表达高于所述CVS组织或与之类似的转录物。由此，该分析确定了在妊娠头三个月中具有胎盘特异性的转录物组。

在下一步中，鉴定了在非整倍性妊娠的胎盘组织中异常表达的转录物。使用 Microarray Suite 5.0软件(Affymetrix)，将3份21号染色体三体的CVS组织的表达谱与上述5份妊娠龄匹配的正常妊娠中的胎盘特异性基因组进行了比较。以正常的胎盘组织表达谱作为基线，将所述3份非整倍性的CVS样品的每一份基因表达信号都单独地与5份正常CVS样品中的每一份进行比较。总共进行了15种比较，对于每个询问的基因，计数(I-计数)在所述非整倍体胎盘中表达上调的比较的数目。计算表达水平的成倍变化，并将其转化成log₂值(信号Log比值，SLR)。然后对转录物进行选择，条件为如果(i)当与正常胎盘进行比较时，所述信号Log比值至少为0.4的条件下，非整倍性胎盘中的所述转录物有所上调；以及(ii)所述上调与超过半数的比较给出的上调一致(I-计数≥8)。表4总结了所述3种转录物的微阵列结果，即含有EGF的fibulin-样细胞外基质蛋白1(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein1)(EFEMP1)，转铁蛋白受体p90 CD71(TFRC)和ATP5O，它们是在21号染色体三体妊娠的基因小组中最大程度上调的优选在胎盘表达的基因。通过实时QRT-PCR对微阵列进行验证

采用一步实时QRT-PCR验证了上述微阵列实验鉴定的21号染色体三体妊娠3种异常胎盘组织表达的转录物。对从3个21号染色体三体妊娠和5个具有相匹配妊娠龄的正常妊娠采集到的CVS组织中的所述3种转录物和GAPDH的mRNA水平进行了定量。采用以下等式，将所测基因的相对mRNA水平对相应的GAPDH水平进行了标准化：

ΔCt_X＝Ct_GAPDH-Ct_X

其中Ct代表了阈循环数，即将样品的QRT-PCR反应累积的荧光达到预定阈强度所需要的PCR循环数。ΔCt_X是所测转录物X的标准化mRNA水平；Ct_GAPDH是GAPDHmRNA的Ct值；Ct_X是所述转录物X的Ct值。由于Ct值与所述模板mRNA的量的对数呈反比，所以ΔCt_X值越高则mRNA水平越高。

在与从正常妊娠采集的CVS样品进行比较时，QRT-PCR显示该21号染色体三体妊娠的CVS组织中EFEMP1 mRNA(图4A)，TFRC mRNA(图4B)和ATP5O mRNA(图4C)确实有所上调。在非整倍性妊娠中所述三种转录物的异常胎盘组织表达，证明了其作为RNA标记对21号染色体三体的产前检测中的作用。

母体血液中所述RNA标记的可检测性

测定正常孕妇的血浆样品的ATP5O mRNA。在产后24小时，ATP5OmRNA的浓度具有统计显著性的下降(图4D；Wilcoxon，P＜0.05)，其在母体血浆中是可检测的(图4D)。这些数据说明胎盘是母体血浆中ATP5OmRNA的重要组织来源。

结论

本发明使用基于微阵列的方法，对21号染色体三体的胎盘组织中具有异常表达的转录物进行了鉴定。通过微阵列技术对所述三种转录物，EFEMP1、TFRC和ATP5O进行了鉴定，并通过QRT-PCR进一步验证了其在21号染色体三体妊娠的胎盘组织中表达的异常特性。这些数据从而说明这3个转录物可用作21号染色体三体产前检测的RNA标记。ATP5OmRNA在母体血浆中的可检测性说明该转录物对胎儿21号染色体三体的非侵入性产前检测具有适用性。例如，对21号染色体三体的非侵入性产前检测可以根据对21号染色体三体妊娠中测定的所述RNA标记和正常妊娠中的对应浓度的比较的异常浓度来实现。

实施例3受先兆子痫影响的妊娠胎盘中异常表达的基因与正常妊娠的对应基因的比较

方法

受试者

所有胎盘组织和血液样品均采集自知情同意的处于妊娠末三个月的怀孕妇女，这些妇女是到香港威尔斯亲王医院的妇产科就诊的。所述研究已获得了临床研究伦理委员会的批准。

在本研究的第一部分，采用寡核苷酸微阵列对正常和先兆子痫(PET)妊娠的胎盘组织基因表达谱进行了鉴定。在剖腹产后，立即采集了5名PET妊娠的妇女(妊娠龄37-40周)和5名正常妊娠的妇女(妊娠龄38-40周)的胎盘组织。同时在产前采集外周血。在本研究的第二部分，使用QRT-PCR对通过所述寡核苷酸微阵列实验产生的基因表达谱进行验证。在剖腹产后，立即采集了10名PET妊娠的妇女(妊娠龄25-40周)和10名正常妊娠的妇女(妊娠龄37-39周)的胎盘组织。对没有高血压病史的妇女而言，如果舒张血压持续增加，一次＞110mm Hg、或者两次或更多次在至少4小时间隔的的情况下＞90mm，并且存在明显的蛋白尿情况，则认为该妇女患有先兆子痫。明显的蛋白尿定义为蛋白尿＞0.3g/天或在至少4小时间隔采集的两次干净收集的中段尿样的浸渍条检查法中≥2+。

微阵列分析的样品制备

采集后立即将胎盘组织样本储存于RNAlater^TM(

奥斯丁，德克萨斯，美国)并保存于-80℃直至进行RNA提取。在进行组织采集的同时收集6毫升外周血，并储存于PAXgene^TM血液RNA试管(PreAnalytiX，Hombrechtikon，瑞士)中。根据制造商的实验指南，采用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，加利福尼亚，美国)从胎盘组织中提取总RNA，并用RNeasy mini-试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)进行纯化。按照制造商的指南，使用PAXgene^TM血液RNA试剂盒(PreAnalytiX，Hombrechtikon，瑞士)从外周血中提取总RNA，还包括进行DNA酶处理(RNase-Free DNase Set，Qiagen，Hilden，德国)。

通过高密度寡核苷酸微阵列进行基因表达分析

人类基因组U133A和U133B阵列(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)杂交。杂交之后，洗涤每个阵列并在 Fluidics Station 400(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)中进行染色。用GeneArray Scanner(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)对所述芯片进行扫描，用

Microarray Suite 5.0(Affymetrix)进行分析。

实时定量RT-PCR

采用一步实时定量RT-PCR(QRT-PCR)对胎盘组织和母体血浆样品中的RNA转录物进行定量测定。对持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)检测的QRT-PCR分析在之前已有描述(Ng et al.2002)。其它检测基因的引物(Proligo，Singapore)和TaqMan小沟结合(MGB)荧光探针(Applied Biosystems，Foster City，加利福尼亚，美国)序列如表5所示。采用相对定量来描述所表达的RNA量，其中根据相应的GAPDH mRNA水平对所研究的转录物水平进行标准化。

根据制造商的指南(EZ rTth RNA PCR reagent set，AppliedBiosystems)，在25μl反应体积中建立所述QRT-PCR反应。在组合的热循环仪和荧光检测器(ABI Prism 7900HT，Applied Biosystems)上进行所述QRT-PCR分析。对所有转录物而言，该PCR引物和荧光探针的浓度分别为300nM和100nM。在进行QRT-PCR之前，根据制造商的推荐，使用DNase I消化(Invitrogen，Carlsbad，加利福尼亚，美国)去除所述胎盘组织RNA提取物中的污染DNA。使用17ng胎盘RNA提取物进行扩增。在每次分析中都包含有多个阴性水空白对照。

所述热处理过程如下：所述反应在50℃，2分钟启动，使得所包含的尿嘧啶N-糖基化酶起作用，然后在60℃反转录30分钟。经过在95℃变性5分钟之后，在92℃变性15秒和在56℃退火/延伸1分钟进行40个PCR循环。

对母体血液中与先兆子痫相关的胎盘转录物的定量分析

将孕妇母体全血样品采集到EDTA管中。将所述血液样品在1,600g，4℃离心10分钟后，将血浆部分小心地转移至空的聚丙烯管中。将该血浆样品在16,000g，4℃再离心10分钟。将上清液收集至新的聚丙烯管中。如前所述，从所收集的母体血浆中提取RNA(Ng et al.，2002)。采用与上述相同的条件对所研究的转录物进行QRT-PCR分析。每个QRT-PCR反应需要使用5微升所提取的血浆RNA。

统计分析

使用Sigma Stat 2.03软件(SPSS)进行统计分析。

结果

通过基于微阵列的方法对先兆子痫妊娠中具有异常胎盘组织表达基因的鉴定

我们的最终目的是通过对母体血浆中的PET-相关转录物的测定开发诊断PET的方法。因此对基因的选择首先要鉴定在所述PET胎盘而不是在母体外周血细胞中优先表达的转录物。该策略的设计是基于我们之前的发现，即在正常个体中，胎盘是母体血液中循环胎儿RNA的重要来源以及造血系统是血浆DNA的主要来源(Lui et al.，2002)。通过寡核苷酸微阵列，测定了5个PET胎盘组织及其对应外周血样品的基因表达谱。为了鉴定胎盘表达的基因，选择的是在所述5个被分析胎盘组织样品中至少在4个样品中具有表达的转录物。然后将在母体血细胞中具有表达的基因通过转录物的阳性选择进行去除，所述转录物的表达水平当与全部5组成对的胎盘和母体血液样品中所对应的全血样品进行比较时，或者在全部5个外周血样品中都“不存在”，或者在胎盘中“升高”。因此，将在母体血细胞中具有与胎盘组织中表达类似或更高程度的转录物去除。通过这些程序得到了所选择的转录物组，所述转录物优选地在胎盘组织中表达。

在下一步中，鉴定了在PET胎盘中具有异常表达的转录物。使用

Microarray Suite 5.0软件(Affymetrix)，将5份PET中的每一份胎盘的表达谱与妊娠龄匹配的正常妊娠的胎盘表达谱进行了比较。以正常的胎盘组织表达谱作为基线，将从所述5份上述PET妊娠样品中鉴定出的胎盘特异性基因的表达信号都单独地与5份正常胎盘样品中的每一份进行比较。总共进行了25种比较，对于所询问的每个基因，计数(I-计数)在所述PET胎盘中表现出表达上调的比较的数目。计算表达水平的成倍变化，并将其转化成log₂值(信号Log比值，SLR)。然后对转录物进行选择，条件为如果(i)当与正常胎盘进行比较时，所述信号Log比值至少为0.4(表达改变1.3倍)的程度下，PET胎盘中的所述转录物有所上调；以及(ii)所述上调与超过半数的比较给出的上调一致(I-计数≥13)。表6总结了在PET妊娠的胎盘中具有上调的优先表达的10个已鉴定的转录物的结果。

通过实时QRT-PCR对微阵列进行验证

采用一步实时QRT-PCR验证了从所述微阵列实验中选中的PET相关转录物。对从10个PET和具有相匹配妊娠龄的正常妊娠中采集到的每一个胎盘组织中的GAPDH mRNA浓度进行了测定。将该GAPDH mRNA浓度用于对不同样品之间的所述转录物水平进行标准化。然后将通过微阵列分析鉴定的两组妊娠胎盘组织样品中的所述10个转录物的表达水平进行比较。采用以下等式，将所测基因的相对mRNA水平对相应的GAPDH水平进行标准化：

ΔCt_X＝Ct_GAPDH-Ct_X

当通过QRT-PCR分析对正常妊娠进行比较时，在PET胎盘中证实了显著的Leptin(LEP)和唾液酸结合Ig-样凝集素6(sialic acid bindingIg-like lectin 6)(SIGLEC6)mRNA的上调(图5A和图5B分别为Leptin和SIGLEC6mRNA)(Mann-Whitney检验，对两种情况都为P＜0.05)。这些数据证实了我们的转录物选择策略能够鉴定出在PET胎盘组织中异常表达的标记。

母体血液中所述PET相关RNA标记的可检测性

通过QRT-PCR对25个健康和26个受PET影响妊娠末三个月的血浆样品进行了LEP和INHBA mRNA的测定。当与正常妊娠相比较时，受PET影响的妊娠中母体血浆的LEP和INHBA浓度显著升高(LEP：图6A，Mann-Whitney，P＝0.017；INHBA：图6B，Mann Whitney，P＝0.006)。

结论

本发明使用基于微阵列的方法，鉴定出了在PET胎盘中具有不同表达的转录物，并考虑将其作为诊断PET的重要标记。在通过微阵列分析鉴定出的PET-相关转录物清单中，选择了10个与正常妊娠相比在PET胎盘中最异常表达的转录物。实时QRT-PCR也证实了在与正常胎盘相比较时在PET胎盘中LEP和SIGLEC6的表达都显著上调。与正常妊娠相比，PET妊娠中母体血浆的INHBA和LEP水平也显著增高，由此说明使用这些标记进行PET非侵入性产前评估的可能性。

实施例421号染色体三体和正常妊娠母体血浆中胎盘特异的PLAC4mRNA

PLAC4mRNA的可检测性与妊娠特异性的测定

使用实时QRT-PCR分析测定母体血浆中的PLAC4mRNA。除此之外，在婴儿诞生之后PLAC4mRNA会从该母体的血浆中清除出去。所以，母体血浆中的PLAC4mRNA是源于胎儿的，并且是妊娠特异性的。

样品采集和处理

从5名非妊娠妇女，5名妊娠头三个月和8名妊娠末三个月妇女采集外周血液样品。同样还在产前和产后24小时从6名妊娠末三个月的妇女采集了外周血。将该血液样品收集于EDTA管中。如实施例1所述收集血浆样品。根据实施例1所述的步骤，从母体血浆中提取RNA。

实时QRT-PCR分析的开发

如实施例1所述开发了对PLAC4 mRNA的QRT-PCR分析。所述引物(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA，美国)和TaqMan小沟结合(MGB)荧光探针(Applied Biosystems，Foster City，加利福尼亚，美国)和校准物(Proligo，Singapore)的序列如表7所示。

根据制造商的指南(EZ rTth RNA PCR reagent set，AppliedBiosystems)，在25μl反应体积中建立所述QRT-PCR反应。在ABI

7900HT(Applied Biosystems)上进行所述QRT-PCR分析。所述PCR引物和荧光探针的浓度分别为400nM和100nM。5μl所提取的RNA用于扩增。所述热处理过程为：所述反应在50℃、2分钟启动，然后在60℃反转录30分钟。经过在95℃变性5分钟之后，在95℃变性15秒和在60℃、1分钟进行45个PCR循环。

PLAC4mRNA能在母体血浆中检测并且是妊娠特异性的

在所有头三个月和末三个月怀孕妇女而不是非妊娠个体中检测到PLAC4mRNA(图7)。在头三个月和末三个月妊娠的血浆中的PLAC4mRNA的中位浓度分别为299.6拷贝/ml和529.3拷贝/ml。测定了所述循环PLAC4mRNA的妊娠特异性。在产前血浆样品中，PLAC4mRNA的中位浓度为500.0拷贝/ml。在所有的产后血浆样品中都检测不到所述转录物(图8)。

在整倍体和21号染色体三体妊娠中循环PLAC4 mRNA的比较

在核型分析正常和21号染色体三体的妊娠之间对循环PLAC4mRNA的浓度进行比较。从29名怀有整倍体胎儿的孕妇以及处于头三个月和中三个月妊娠的5名怀有21号染色体三体胎儿的孕妇中收集血浆样品。然后通过实时一步RT-PCR测定所述血浆样品中的PLAC4 mRNA浓度。测定所有三体血浆样品的PLAC4 mRNA浓度。21号染色体三体和正常妊娠中的中位值分别为5581拷贝/ml和4836拷贝/ml。由于样本数较少，因此没有在正常和21号染色体三体妊娠之间没有建立统计显著性差异。

实施例5受先兆子痫影响的妊娠胎盘中异常表达的基因与正常妊娠中对应基因的比较

方法

受试者

在本研究的第一部分，采用寡核苷酸微阵列对正常和先兆子痫(PET)妊娠的胎盘组织基因表达谱进行了鉴定。在剖腹产后，立即采集了5名PET妊娠的妇女(妊娠龄37-40周)和5名正常妊娠的妇女(妊娠龄38-40周)的胎盘组织。同时在产前采集外周血。在本研究的第二部分，使用QRT-PCR对通过所述寡核苷酸微阵列实验产生的基因表达谱进行验证。在剖腹产后，立即采集了6名PET妊娠的妇女(妊娠龄30-39周)和6名正常妊娠的妇女(妊娠龄37-39周)的胎盘组织。对没有高血压病史的妇女而言，如果舒张血压持续增加，一次＞110mm Hg、或者两次或更多次在至少4小时间隔的的情况下＞90mm，并且存在明显的蛋白尿情况，则认为该妇女患有先兆子痫。明显的蛋白尿定义为蛋白尿＞0.3g/天或在至少4小时间隔采集的两次干净收集的中段尿样的浸渍条检查法中≥2+。

微阵列分析的样品制备

采集后立即将胎盘组织样本储存于RNAlater^TM(

通过高密度寡核苷酸微阵列进行基因表达分析

人类基因组U133A和U133B阵列(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)杂交。杂交之后，洗涤每个阵列并在

FluidicsStation 400(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)中进行染色。用GeneArray Scanner(Affymetrix，Santa Clara，加利福尼亚，美国)对所述芯片进行扫描，用GeneSpring v 7.2(Agilent Technologies，Palo Alto，加利福尼亚，美国)进行分析。

微阵列基因表达数据的挖掘/分析

将所述微阵列数据以CEL格式导入GeneSpring v 7.2(AgilentTechnologies)。对正常和PET妊娠的样品(胎盘组织和母体血细胞)独立地进行数据挖掘。在每一组妊娠中，首先确定在胎盘组织样品中的表达相对高于母体血细胞的基因。依次采用以下步骤对5份胎盘和配对的母体血细胞的微阵列原始数据进行标准化：(1)以GC含量背景校正(GC-RMA)，使用Robust Multi-chip Average对原始数据进行处理；(2)进行数据转化，由此低于0.001的微阵列数值都被设置成0.001；及(3)用每个基因的信号强度除以全部样品中测定的中位值。然后确定在胎盘组织或母体血细胞中具有统计显著性(P＜0.05)表达的基因。根据确定具有较高倍数差异转录物的目的，将这些基因以在胎盘组织表达和母体血细胞表达的倍数差异的顺序进行储存。这样的数据挖掘处理可以鉴定出在胎盘组织中比母体血细胞中相对较高表达的的基因。

在另一方面，数据挖掘也可用来鉴定在胎盘组织中具有较高绝对表达水平的基因。通过GC-RMA处理然后将低于0.001的微阵列数值设置成0.001进行数据转化对所述胎盘组织的原始微阵列数据进行标准化。根据标准化后的表达水平对基因进行排序。同样也对从正常和先兆子痫妊娠采集的胎盘组织进行独立地数据挖掘。

如果基因在所述PET胎盘相对配对母体血液的倍数差异高于正常妊娠的倍数差异，或者那些基因在PET中比正常胎盘中高得多的绝对表达水平，而在胎盘组织和母体血液中的表达至少有200倍的差异，则对这些选中的基因进行深入研究。

实时定量RT-PCR

采用一步实时定量RT-PCR对胎盘组织中的RNA转录物进行定量测定。以浓度从2.5x10⁶拷贝到2.5拷贝，通过对经过高效液相色谱纯化的单链合成DNA寡核苷酸进行连续稀释制备了校准曲线。所述引物(Proligo)，荧光探针(Applied Biosystems)和所研究基因的寡核苷酸校准物的序列如表8所示。

根据制造商的指南(EZ rTth RNA PCR reagent set，AppliedBiosystems)，在50μl反应体积中建立所述QRT-PCR反应。在联合的热循环仪和荧光检测器(ABI Prism 7900HT，Applied Biosystems)上进行所述QRT-PCR分析。对所有研究转录物而言，所述荧光探针的浓度是100nM。对妊娠相关血浆蛋白A(pregnancy-associated plasma proteinA)，pappalysin1(PAPPA)，INHBA和FN1进行分析的每个反应中分别使用300nM的正向和反向引物。对LEP，ADAM金属肽酶结构域12(meltrin alpha)(ADAM12)和pappalysin 2(PAPPA2)进行分析的每个反应中则分别使用400nM的正向和反向引物。在进行QRT-PCR之前，根据制造商的推荐，使用DNase I消化(Invitrogen)去除所述胎盘组织RNA提取物中的污染DNA。使用1ng提取的胎盘RNA进行扩增。在每次分析中都包含有多个阴性水空白对照。依胎盘总RNA的拷贝数/ng对胎盘组织RNA浓度进行表述。

所述热处理过程如下：所述反应在50℃、2分钟启动，使得所包含的尿嘧啶N-糖基化酶起作用，然后在60℃反转录30分钟。经过在95℃变性5分钟之后，在92℃变性15秒，以及对于LEP、ADAM12、PAPPA和INHBA在56℃，对于PAPPA2和FN1在57℃退火/延伸1分钟进行40个PCR循环。

统计分析

使用Sigma Stat 3.0软件(SPSS)进行统计分析。

结果

从所述微阵列分析中鉴定出的基因包括LEP、ADAM12(GenBank登录号：NM_003474，NM_021641)、PAPPA(GenBank登录号：NM_002581)、PAPPA2(GenBank登录号：NM_020318，NM_021936)、INHBA和FN1。采用一步实时QRT-PCR对PET和正常妊娠中选中的转录物的胎盘组织表达水平进行测定。结果如图9所示。收集自PET妊娠的胎盘中，LEP、ADAM12、PAPPA2、INHBA和FN1的浓度高于正常妊娠胎盘中的浓度，而PAPPA mRNA在收集自PET妊娠的胎盘中的浓度则低于正常妊娠胎盘中的浓度。

结论

本发明使用基于微阵列的方法，鉴定出了在PET胎盘中具有异常表达的转录物，并考虑将其作为诊断PET的重要标记。从所述微阵列分析中选出了6种转录物，并通过实时QRT-PCR验证了其在PET胎盘中异常表达谱的特性。

参考文献

Lui，YYN，Chik，KW，Chiu，RWK，Ho，CY，Lam，CW and Lo，YMD(2002).《性别错配骨髓移植后血浆和血清中无细胞DNA的主要造血来源》(Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serumafter sex-mismatched bone marrow transplantation.)Clin Chem 48，421-427.Ng，EKO，Tsui，NBY，Lam，NY，Chiu，RWK，Yu，SC，Wong，SC，Lo，ES，Rainer，TH，Johnson，PJ and Lo，YMD(2002).《在癌症患者和健康个体中可过滤和不可过滤mRNA的存在》(Presence of filterable and nonfilterablemRNA in the plasma of cancer patients and healthy individuals.)Clin Chem48，1212-1217.

Ng，EKO，Tsui，NBY，Lau，TK，Leung，TN，Chiu，RWK，Panesar，NS，Lit，LCW，Chan，KW and Lo，YMD(2003).《胎盘来源的mRNA在母体血浆中的易检测性》(mRNA of placental origin is readily detectable in maternalplasma.)Proc Natl Acad Sci U.S.A.100，4748-4753.

为所有目的，将本申请所引用的所有专利、专利申请以及其它出版物，包括公开的氨基酸或多核苷酸序列全部引用作为参考。

表1A对21号染色体上及具有胎盘表达的转录物进行实时QRT-PCR检测的引物和探针的序列

MGBNFQ：小沟结合非荧光猝灭剂；FAM：荧光报道物；TAMRA：荧光猝灭剂

表1B用于对21号染色体上及具有胎盘表达的转录物进行绝对定量的寡核苷酸校准物序列

表2A对位于21号染色体上胎盘表达基因的微阵列检测

表2B在位于18号染色体上的胎盘表达基因中，在头三个月胎盘中具有最高表达水平的转录物。所述基因由人类基因组U133B阵列(Affymetrix)测定。

表3对21号染色体三体中异常表达的胎盘表达转录物进行实时QRT-PCR测定的引物和探针的序列。

MGBNFQ：小沟结合非荧光猝灭剂

表4在21号染色体三体和正常CVS组织中具有表达差异的胎盘表达基因的微阵列检测。所述基因是通过人类染色体U133A阵列(Affymetrix)检测的。

表5对先兆子痫相关胎盘表达转录物进行实时QRT-PCR检测的引物和探针的序列

表6在先兆子痫和正常胎盘组织中具有表达差异的胎盘表达基因的微阵列检测。所述基因是通过人类基因组U133A和U133B阵列(Affymetrix)检测的。

表7对PLAC4 mRNA进行实时QRT-PCR检测的引物、校准物和探针的序列

MGBNFQ：小沟结合非荧光猝灭剂

表8对先兆子痫相关胎盘表达转录物进行实时QRT-PCR检测的引物、探针和校准物的序列

序列编号列表

序列表

<110>香港中文大学

<120>产前诊断和监测的标记

<130>10C11284CN

<150>US 60/663,293

<151>2005-03-18

<160>113

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>COL6A1正向引物

<400>1

gacaaagtca agtccttcac caa 23

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>COL6A1反向引物

<400>2

gcgttccaca ccaggttt 18

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>COL6A1探针

<400>3

cgcttcatcg acaacc 16

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>COL6A2正向引物

<400>4

gatcaaccag gacaccatca a 21

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>COL6A2反向引物

<400>5

ccgtaggctt cgtgtttca 19

<210>6

<211>15

<212>DNA

<213>COL6A2探针

<400>6

cgcatcatca aggtc 15

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>SOD1正向引物

<400>7

cagggcatca tcaatttcg 19

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>SOD1反向引物

<400>8

tgcttcccca caccttca 18

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>SOD1探针

<400>9

cagaaggaaa gtaatggacc a 21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>ATP50正向引物

<400>10

ccctcactac caacctgatc a 21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>ATP50反向引物

<400>11

ccttgggtat tgcttaatcg a 21

<210>12

<211>15

<212>DNA

<213>ATP50探针

<400>12

tgcttgctga aaatg 15

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>BTG3正向引物

<400>13

gatgtcctga aagcctgtga a 21

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>BTG3反向引物

<400>14

ggcaagccca ggtcacta 18

<210>15

<211>15

<212>DNA

<213>BTG3探针

<400>15

acagctgcat cttgt 15

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>APP正向引物

<400>16

aaggaaggca tcctgcagta 20

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>APP反向引物

<400>17

acattggtga tctgcagttc a 21

<210>18

<211>16

<212>DNA

<213>APP探针

<400>18

tgccaagaag tctacc 16

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>ATP5J正向引物

<400>19

cctgtccgaa tcagcatgat 20

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>ATP5J反向引物

<400>20

tgaccgaatg acagaggaga a 21

<210>21

<211>16

<212>DNA

<213>ATP5J探针

<400>21

cttcagaggc tcttca 16

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>ADAMTS1正向引物

<400>22

ccacaggaac tggaagcata a 21

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>ADAMTS1反向引物

<400>23

caagcatggt ttccacatag c 21

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>ADAMTS1探针

<400>24

aaagaagcga tttgtgtcca 20

<210>25

<211>23

<212>DNA

<213>BACE2正向引物

<400>25

ggaatggaat acttggccta gct 23

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>BACE2反向引物

<400>26

caccagggag tcgaagaagg t 21

<210>27

<211>27

<212>DNA

<213>BACE2探针

<400>27

atgccacact tgccaagcca tcaagtt 27

<210>28

<211>26

<212>DNA

<213>DSCR5正向引物

<400>28

gaatcttggc taaactcttt aggttt 26

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>DSCR5反向引物

<400>29

aggtaatgca actgcccaat 20

<210>30

<211>18

<212>DNA

<213>DSCR5探针

<400>30

acctattggc ctcaaaaa 18

<210>31

<211>17

<212>DNA

<213>ITSN1正向引物

<400>31

tggtggcagc ctggata 17

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>ITSN1反向引物

<400>32

atcatgcttc gctctttcct 20

<210>33

<211>14

<212>DNA

<213>ITSN1探针

<400>33

ctgggccata actg 14

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>PLAC4正向引物

<400>34

cctttccccc ttatccaact 20

<210>35

<211>22

<212>DNA

<213>PLAC4反向引物

<400>35

gtactggttg ggctcatttt ct 22

<210>36

<211>15

<212>DNA

<213>PLAC4探针

<400>36

ccctagccta taccc 15

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>LOC90625正向引物

<400>37

tgcacatcgg tcactgatct 20

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>LOC90625反向引物

<400>38

ggtcagtttg gccgataaac 20

<210>39

<211>16

<212>DNA

<213>LOC90625探针

<400>39

cctactggca cagacg 16

<210>40

<211>20

<212>DNA

<213>RPL17正向引物

<400>40

tgagggttga ctggattggt 20

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>RPL17反向引物

<400>41

tacagcactg cttccacaga a 21

<210>42

<211>14

<212>DNA

<213>RPL17探针

<400>42

aggcccgtgt ggct 14

<210>43

<211>90

<212>DNA

<213>COL6A1校准物序列

<400>43

tggacaaagt caagtccttc accaagcgct tcatcgacaa cctgagggac aggtactacc 60

gctgtgaccg aaacctggtg tggaacgcag 90

<210>44

<211>61

<212>DNA

<213>COL6A2校准物序列

<400>44

gagatcaacc aggacaccat caaccgcatc atcaaggtca tgaaacacga agcctacgga 60

g 61

<210>45

<211>65

<212>DNA

<213>ATP50校准物序列

<400>45

tcccctcact accaacctga tcaatttgct tgctgaaaat ggtcgattaa gcaataccca 60

aggag 65

<210>46

<211>65

<212>DNA

<213>SOD1校准物序列

<400>46

tgcagggcat catcaatttc gagcagaagg aaagtaatgg accagtgaag gtgtggggaa 60

gcatt 65

<210>47

<211>18

<212>DNA

<213>TFRC正向引物

<400>47

cggctgcagg ttcttctg 18

<210>48

<211>25

<212>DNA

<213>TFRC反向引物

<400>48

gttagagaat gctgatctag cttga 25

<210>49

<211>16

<212>DNA

<213>TFRC探针

<400>49

tggcagttca gaatga 16

<210>50

<211>20

<212>DNA

<213>EFEMP1正向引物

<400>50

cacaacgtgt gccaagacat 20

<210>51

<211>22

<212>DNA

<213>EFEMP1反向引物

<400>51

cgtaaattga tgcacacttg gt 22

<210>52

<211>18

<212>DNA

<213>EFEMP1探针

<400>52

acgcacaact gtagagca 18

<210>53

<211>21

<212>DNA

<213>ATP50正向引物

<400>53

ccctcactac caacctgatc a 21

<210>54

<211>21

<212>DNA

<213>ATP50反向引物

<400>54

ccttgggtat tgcttaatcg a 21

<210>55

<211>15

<212>DNA

<213>ATP50探针

<400>55

tgcttgctga aaatg 15

<210>56

<211>18

<212>DNA

<213>IGFBP3正向引物

<400>56

agtccaagcg ggagacag 18

<210>57

<211>22

<212>DNA

<213>IGFBP3反向引物

<400>57

caggtgattc agtgtgtctt cc 22

<210>58

<211>16

<212>DNA

<213>IGFBP3探针

<400>58

aatatggtcc ctgccg 16

<210>59

<211>18

<212>DNA

<213>ABP1正向引物

<400>59

tggaagcaga gcgaactg 18

<210>60

<211>17

<212>DNA

<213>ABP1反向引物

<400>60

catcaggatg gcagcca 17

<210>61

<211>13

<212>DNA

<213>ABP1探针

<400>61

agcgagagat gcc 13

<210>62

<211>18

<212>DNA

<213>FN1正向引物

<400>62

aagcaagccc ggttgtta 18

<210>63

<211>19

<212>DNA

<213>FN1反向引物

<400>63

ccaacgcatt gcctaggta 19

<210>64

<211>20

<212>DNA

<213>FN1探针

<400>64

acactatcag ataaatcaac 20

<210>65

<211>16

<212>DNA

<213>INHBA正向引物

<400>65

cgccctccca aaggat 16

<210>66

<211>23

<212>DNA

<213>INHBA反向引物

<400>66

gcatgtttaa aatgtgcttc ttg 23

<210>67

<211>26

<212>DNA

<213>INHBA探针

<400>67

tacccaactc tcagccagag atggtg 26

<210>68

<211>19

<212>DNA

<213>SLC21A2正向引物

<400>68

gctttgggct ctccagttc 19

<210>69

<211>24

<212>DNA

<213>SLC21A2反向引物

<400>69

gtagctgaca aagatgatga ggat 24

<210>70

<211>18

<212>DNA

<213>SLC21A2探针

<400>70

tttccagctt gaatgaga 18

<210>71

<211>17

<212>DNA

<213>SIGLEC6正向引物

<400>71

caagctctct gtgcgtg 17

<210>72

<211>19

<212>DNA

<213>SIGLEC6反向引物

<400>72

gtccctggga tggagatgt 19

<210>73

<211>14

<212>DNA

<213>SIGLEC6探针

<400>73

atggccctga ccca 14

<210>74

<211>20

<212>DNA

<213>KIAA0992正向引物

<400>74

acctgtttgg ctacgaatcc 20

<210>75

<211>22

<212>DNA

<213>KIAA0992反向引物

<400>75

gaatctgttg aactggcacc tt 22

<210>76

<211>17

<212>DNA

<213>KIAA0992探针

<400>76

acatctgctg aggtgtt 17

<210>77

<211>19

<212>DNA

<213>TIMP3正向引物

<400>77

ccttctgcaa ctccgacat 19

<210>78

<211>18

<212>DNA

<213>TIMP3反向引物

<400>78

agcttcttcc ccaccacc 18

<210>79

<211>14

<212>DNA

<213>TIMP3探针

<400>79

cgtgatccgg gcca 14

<210>80

<211>20

<212>DNA

<213>LEP正向引物

<400>80

ggtgagagct gctctggaaa 20

<210>81

<211>21

<212>DNA

<213>LEP反向引物

<400>81

cctcagcctg attaggtggt t 21

<210>82

<211>14

<212>DNA

<213>LEP探针

<400>82

tgacccagat cctc 14

<210>83

<211>21

<212>DNA

<213>LPL正向引物

<400>83

agcaaaacct tcatggtgat c 21

<210>84

<211>22

<212>DNA

<213>LPL反向引物

<400>84

gcacccaact ctcatacatt cc 22

<210>85

<211>15

<212>DNA

<213>LPL探针

<400>85

tggctggacg gtaac 15

<210>86

<211>20

<212>DNA

<213>PLAC4正向引物

<400>86

cctttccccc ttatccaact 20

<210>87

<211>22

<212>DNA

<213>PLAC4反向引物

<400>87

gtactggttg ggctcatttt ct 22

<210>88

<211>15

<212>DNA

<213>PLAC4探针

<400>88

ccctagccta taccc 15

<210>89

<211>74

<212>DNA

<213>PLAC4校准物

<400>89

cacctttccc ccttatccaa ctagccctag cctataccct ctgctgccca agaaaatgag 60

cccaaccagt acac 74

<210>90

<211>18

<212>DNA

<213>FN1正向引物

<400>90

aagcaagccc ggttgtta 18

<210>91

<211>19

<212>DNA

<213>FN1反向引物

<400>91

ccaacgcatt gcctaggta 19

<210>92

<211>20

<212>DNA

<213>FN1探针

<400>92

acactatcag ataaatcaac 20

<210>93

<211>85

<212>DNA

<213>FN1校准物

<400>93

aaagcaagcc cggttgttat gacaatggaa aacactatca gataaatcaa cagtgggagc 60

ggacctacct aggcaatgcg ttggt 85

<210>94

<211>16

<212>DNA

<213>INHBA正向引物

<400>94

cgccctccca aaggat 16

<210>95

<211>23

<212>DNA

<213>INHBA反向引物

<400>95

gcatgtttaa aatgtgcttc ttg 23

<210>96

<211>26

<212>DNA

<213>INHBA探针

<400>96

tacccaactc tcagccagag atggtg 26

<210>97

<211>76

<212>DNA

<213>INHBA校准物

<400>97

ccgccctccc aaaggatgta cccaactctc agccagagat ggtggaggcc gtcaagaagc 60

acattttaaa catgct 76

<210>98

<211>20

<212>DNA

<213>LEP正向引物

<400>98

ggtgagagct gctctggaaa 20

<210>99

<211>21

<212>DNA

<213>LEP反向引物

<400>99

cctcagcctg attaggtggt t 21

<210>100

<211>14

<212>DNA

<213>LEP探针

<400>100

tgacccagat cctc 14

<210>101

<211>62

<212>DNA

<213>LEP校准物

<400>101

gggtgagagc tgctctggaa aatgtgaccc agatcctcac aaccacctaa tcaggctgag 60

gt 62

<210>102

<211>24

<212>DNA

<213>ADAM12正向引物

<400>102

tggaaagaaa tgaaggtctc attg 24

<210>103

<211>19

<212>DNA

<213>ADAM12反向引物

<400>103

tcgagcgagg gagacatca 19

<210>104

<211>29

<212>DNA

<213>ADAM12探针

<400>104

cacggaaacc cactatctgc aagacggta 29

<210>105

<211>84

<212>DNA

<213>ADAM12校准物

<400>105

tggaaagaaa tgaaggtctc attgccagca gtttcacgga aacccactat ctgcaagacg 60

gtactgatgt ctccctcgct cgaa 84

<210>106

<211>21

<212>DNA

<213>PAPPA2正向引物

<400>106

cacagtggaa gcctgggtta a 21

<210>107

<211>22

<212>DNA

<213>PAPPA2反向引物

<400>107

atcaaacaca cctgcgatga tg 22

<210>108

<211>24

<212>DNA

<213>PAPPA2探针

<400>108

ccggagggag gacagaacaa ccca 24

<210>109

<211>72

<212>DNA

<213>PAPPA2校准物

<400>109

tcacagtgga agcctgggtt aaaccggagg gaggacagaa caacccagcc atcatcgcag 60

gtgtgtttga ta 72

<210>110

<211>19

<212>DNA

<213>PAPPA正向引物

<400>110

gggcattcac accatcagt 19

<210>111

<211>21

<212>DNA

<213>PAPPA反向引物

<400>111

tcggtctgtc ttcaaggaga a 21

<210>112

<211>27

<212>DNA

<213>PAPPA探针

<400>112

ccaagacaac aaagacccac gctactt 27

<210>113

<211>72

<212>DNA

<213>PAPPA校准物

<400>113

tgggcattca caccatcagt gaccaagaca acaaagaccc acgctacttt ttctccttga 60

agacagaccg ag 72

Claims

1.测定孕妇中存在21号染色体三体的胎儿的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)对所述孕妇生物样品中的mRNA含量进行定量测定的PCR引物，其中所述mRNA是从PLAC4遗传座位衍生得到的mRNA，其中所述生物样品为血液、生殖道的洗涤物、羊水、尿液、唾液或绒毛膜绒毛；及

(ii)代表怀有正常染色体胎儿的孕妇对应样品中所述RNA类型含量的标准对照。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述mRNA含量比所述标准对照升高说明所怀胎儿具有21号染色体三体的高易感性。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述PCR包括反转录聚合酶链反应。

4.如权利要求1所述的试剂盒，还包含用于质谱分析的试剂。

5.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其中所述孕妇处于妊娠的头三个月、中三个月或末三个月。

6.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其中所述血液是血浆或血清。

7.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其中所述mRNA含量比标准对照升高超过2倍。

8.如权利要求5所述的试剂盒，其中所述孕妇处于妊娠的头三个月、中三个月或末三个月。

9.如权利要求5所述的试剂盒，其中所述mRNA含量比标准对照升高超过2倍。

10.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述mRNA含量比标准对照升高超过2倍。