CN102002081A - 9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱、其制法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物药物领域，具体涉及一种9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(I)及其制备方法，药理试验证明，本发明的四氢小檗红碱(I)具有心血管疾病的功效。

Description

9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱、其制法及其用途

技术领域

本发明涉及生物药物领域，具体涉及9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)及其制备方法，本发明还公开了其抗心血管疾病的用途。

背景技术

心血管疾病是一常见病，随着社会人口的老龄化，发病率日益上升，因此心血管药物一直是国内外研究的活跃领域。四氢异喹啉类生物碱广泛分布于各种植物中，具有广泛的生物活性，特别是在心血管方面具有显著的活性。如四氢小檗碱和四氢巴马汀具有明显的抗心律失常和钙拮抗作用，但水溶性差，影响了其药效的发挥。为了增加水溶性，同时保持其活性，对它们进行了结构修饰，化学合成了大量的衍生物，其中不乏有活性好的化合物发现。但有关四氢小檗碱类化合物的糖基化修饰并未见报道。

微生物转化是利用微生物产生的特异酶对外源性化合物进行结构修饰的特定生化反应。微生物转化具有高度的立体结构选择性，能专一地催化特定的反应、无需繁琐的保护与脱保护操作，具有高效、环保的优点，是天然活性化合物进行结构修饰的一种有效方法。若在含有羟基的四氢小檗碱类化合物中引入糖基可以在一定程度上解决生物利用度差的问题，同时保持其活性。

发明内容

本发明公开了结构式I的化合物：

命名为9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(简称NAD-G)。本发明同时也包括结构式I的化合物的溶剂化物，化合物I的¹³C-NMR数据见表1：

表1四氢小檗红碱(NAD)与9-O-β-D-葡萄糖基四氢小檗红碱(NAD-G)¹³C-NMR数据如下：

药理试验证明，本发明的式I化合物具有优异的抗心血管疾病效果，其溶剂化物具有同样的药理功效。

本发明的式I化合物优选用生物转化方法以四氢小檗红碱为底物进行转化制备，方法如下：

为了寻找适宜转化四氢小檗红碱成9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)的菌种，发明人筛选了多个菌种，结果发现，保藏号为NRRL1086菌种对鲁斯可具有较强的转化能力(见表2)。

筛选所用液体培养基(PDA)：200克新鲜去皮马铃薯加沸水500ml煮15min后过滤，滤液加葡萄糖20g、KH₂PO₄3.0g、MgSO₄0.75g、Vb₁10.0mg，加蒸馏水定容至1.0L，加Na0H或HCl调pH值至6.0，150ml三角烧瓶每瓶分装30ml液体培养基，121℃、0.15MPa灭菌20min。

筛选菌种时，保存菌种所用斜面培养基是在上述液体培养基加入1.5％的琼脂，15ml具塞试管每管5ml，121℃、0.15MPa灭菌20min冷却后制成。

菌种的保存与活化：菌种活化采用两步活化法，参见：Nair，M.S.R.，andBasile，D.V.Bioconversion of artenium B to artmisinn.天然产物杂志(Jounal of NaturalProducts)1993，56(9)：1559。先将菌种接种于液体培养基，28℃180r/min旋转培养24-48h后，转接于另一液体培养基，接种量1-5％(V/V)，同条件培养24h后加样。

样品的制备及加样：四氢小檗红碱溶于乙醇，配成10mg/ml溶液备用；每瓶经两步活化的菌液(30ml)加0.5ml样品溶液，使每瓶菌液含四氢小檗红碱5mg。同条件培养120h后，中止反应，过滤菌体，发酵液用等量的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌体用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，将两种浸膏和并，加少许乙酸乙酯溶解后备薄层鉴定用。

空白对照：空白对照设阳性对照(底物+培养基)、阴性对照(培养基+菌)、溶剂对照(培养基+菌+乙醇)，培养和萃取条件同上。

转化产物的薄层鉴定：

薄层条件：

薄层板：0.7％的CMC-Na制成的硅胶G板。

展开剂：正己烷∶氯仿∶甲醇(5∶3∶1)上行法展开。

显色剂：碘化铋钾。

操作：

转化萃取物和空白对照萃取物分别点于薄层板，充分展开后取出自然晾干，喷以碘化铋钾显色。转化结果见表2。

表2微生物转化四氢小檗红碱筛选结果

从筛选结果看，有3种菌可以转化，NRRL 1086，经测算，转化率可达80％。Absidiacoerulea虽为糖基化转化但转化率较低。而NRRL 5646不是糖基化转化。因此，本发明选用菌株NRRL 1086，以四氢小檗红碱为原料来制备9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)。

本发明公开了一种制备式I化合物的制备方法，用保藏号为NRRL 1086菌株对四氢小檗红碱进行生物转化获得。

更优选的制备方法包括：以四氢小檗红碱为底物，利用保藏号为NRRL1086的菌株，将底物和该菌株在培养基中共培养4～7天，终止反应，发酵液用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，得浸膏，通过硅胶柱层析分离得到目标化合物。

其中有机溶剂优选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、甲酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、己烷或正丁醇。更优选乙酸乙酯

硅胶柱层析分离用氯仿和甲醇进行梯度洗脱。

培养基含10～30％的马铃薯煎煮液、KH₂PO₄、MgSO₄、维生素B1和选自葡萄糖、蔗糖、芽糖、淀粉中一种或几种碳源，培养基pH＝5.0～7.0。为重量百分比。

其中按20％马铃薯煎煮液100毫升计，培养基中各组分优选的含量为KH₂PO₄含0.1～0.5克；MgSO₄含0.05～0.5克；葡萄糖或蔗糖0.5-2.5克。

最为优选的制备方法是：将保藏号为NRRL 1086的菌株由斜面接种到液体培养基中，置28℃，转速为180r/m的摇床中培养24小时成为种子液，种子液转接至发酵液后继续培养24小时，加入转化底物；继续培养144小时后终止催化反应，过滤菌体，发酵液用等量的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯，得到萃取浸膏，浸膏经硅胶拌样后柱层析分离；以氯仿-甲醇为洗脱系统。转化产物经甲醇重结晶，得到白色粉末状转化产物。

药理试验证明，本发明的结构式I化合物具有显著的抗心血管疾病作用，以下是试验方法及结果：

1、9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)对大鼠冠状动脉结扎性心肌缺血的影响

取60只Wister大鼠，随机分为6组：空白对照组、模型组(等容量生理盐水)、血栓心脉宁(50mg/kg)组及9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)高、中、低剂量(25、12.5、6.25mg/kg)组。每天灌胃给药1次，连续给药7d。于末次给药后10min，以乌拉坦麻醉，稳定5min，皮下插电极，记录II导联心电图。手术部位剪去毛，常规消毒皮肤，于左胸第4、5肋间隙打开胸腔，挤压胸廓，使心脏暴露于胸腔外，在肺动脉圆锥左缘，左心耳根部下缘1～2mm处，用0号无损伤缝合针结扎冠状动脉左前降支，然后立即将心脏放回胸腔，缝合。假手术组除不结扎冠状动脉外，其余操作同手术组。结扎后6h腹动脉取血，分离血清，分别测定血清磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)对大鼠冠状动脉结扎性心肌缺血的影响见表2：

表3NAD-G对大鼠冠状动脉结扎性心肌缺血的影响(x±s，n＝10)

由此可见9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)能显著降低急性心肌缺血大鼠血清CK、LDH、MDA含量，升高急性心肌缺血大鼠血清SOD水平。

2、9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)对大鼠体内血栓形成的影响

取50只大鼠，随机分为5组：模型组(等容量生理盐水)、血栓心脉宁(50mg·kg^-1)组及9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)高、中、低剂量(25、12.50、6.25mg·kg^-1)组。每天灌胃给药1次，连续3d。末次给药后15min，用水合氯醛300mg·kg^-1麻醉大鼠，背位固定，剥离右颈总动脉和左颈总静脉，在-根长约18cm的塑料点滴管内，放置长约6cm的4#丝线，在其内充满215IU·ml^-1的肝素生理盐水，分别从静脉和动脉插管，形成体外动-静脉回路，循环15min，取出丝线，用精密电子天平称重，计算血栓重量。9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)对大鼠体内血栓形成的影响见表4：

表4NAD-G对大鼠体内血栓形成的影响(x±s，n＝10)

说明9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)高剂量组能显著减轻大鼠体内血栓形成的重量，其余各给药组均有血栓重量减轻的趋势。

3、9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)对血淤大鼠血液流变性的影响

取60只Wister大鼠，随机分为6组：空白对照组、模型组(等容量生理盐水)、血栓心脉宁(50mg·k^-1)及9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)高、中、低剂量(25、12.5、6.25mg/kg)组。每天灌胃给药1次，连续3d。末次给药后15min，除空白对照组外，其余大鼠均皮下注射0.1％盐酸肾上腺素0.08mL/kg，间隔4h后再次皮下注射0.1％盐酸肾上腺素0.108mL/kg，注射盐酸肾上腺素前后各间隔2h将大鼠置于115℃冰水中游泳5min。将大鼠麻醉，于腹静脉采血，置全自动血流变快测仪上测定全血比较黏度(高、中、低切值)。9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)对血淤大鼠血液流变性的影响见表5。

表5NAD-G对血淤大鼠血液流变性的影响(x±s)

大鼠造模后，模型组与空白对照组比较血液流变性各指标均显著增高。血栓心脉宁和给药组与模型组比较可降低全血黏度。

4、9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)抗心律失常作用

将家兔用25％乌拉坦4ml/kg腹腔麻醉，沿耳缘静脉快速静脉注射0.1％肾上腺素75μg/kg(5s内注射完)复制心律失常模型。待室性心律失常发作后由耳缘静脉分别按照动物体质量注入药物，生理盐水组注入与药物相等的毫升数。动物随机分为利多卡因组及生理盐水对照组、模型对照组共六个组别，其中3个9-O-β-D-葡萄糖基四氢小檗红碱(NAD-G)组剂量分别为高、中、低剂量(25、12.5、6.25mg/kg)组。以上各组实验动物数量均为6只，雌雄各半。观察指标以标准II导联为心电图(ECG)指标，记录模型组以及注射9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)、利多卡因后实验组的心电图变化，观察室早(V分配P)出现时间、室速(VT)持续时间和心律失常持续时间。结果见表6

表6各组兔心律失常时间的变化

9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)可显著延长室早(VP)出现时间，缩短室速(VT)持续时间及心律失常持续时间，其作用效果优于利多卡因(P＜0101)。

本发明的9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)可与药学上可接受的载体混合，用于制备治疗用药物组合物。可制备成药剂学上通用的剂型，如胶囊、片剂、丸剂、口服液、颗粒剂、酊剂、透皮贴剂、缓释剂、注射剂等胃肠道给药剂型及注射剂、外用制剂等胃肠外给药剂型。

具体实施方式

实施例1

9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)的制备：

底物四氢小檗红碱200mg溶于20mL乙醇；配制0.5g/ml的葡萄糖溶液100ml，灭菌(条件同PDA)；菌种NRRL1086由4℃的固体斜面接种至液体PDA培养基(培养基按100毫升20％马铃薯煎煮液中含KH₂PO₄0.3克；MgSO₄0.75克；葡萄糖10克；微生物B₁0.01克配制，液体培养基分装至150mL的三角瓶，每瓶装液30mL)，至摇床中培养24小时(28℃，180r/m)，即为种子液；将种子液在无菌条件下转移至液体PDA培养基(培养基组成同前)中，在摇床中继续培养24小时。每瓶加1ml四氢小紫红碱乙醇溶液及3ml蔗糖溶液，培养144小时后终止反应。发酵液用等量的乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏309mg，称取100-200目硅胶0.8g与残渣均匀拌样，柱层析200～300目20g干法装柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，在氯仿-甲醇＝10∶1的洗脱馏分中，可得目标转化产物9-0-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)，经甲醇重结晶，得到白色粉末160mg。

其碳谱见表1。

实施例2

片剂

取实施例1制得的9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)100g与淀粉50g，糊精50g混合，用适量30％乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入适量硬脂酸镁混合，制成片剂。

Claims (7)

1.结构式I的化合物或其药学上可接受的溶剂化物：

2.权利要求1的化合物的制备方法，包括：用保藏号为NRRL1086菌株对四氢小檗红碱进行生物转化获得。

3.权利要求2的制备方法，包括：以四氢小檗红碱为底物，利用保藏号为NRRL1086的菌株，将底物和该菌株在培养基中共培养4～7天，终止反应，发酵液用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，得浸膏，通过硅胶柱层析分离得到目标化合物。

4.权利要求3的制备方法，其中有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、甲酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、己烷或正丁醇。

5.权利要求3的制备方法，其中培养基按20％马铃薯煎煮液100毫升计，含KH₂PO₄0.1～0.5克、MgSO₄0.05～0.5克和葡萄糖0.5-2.5克。

6.一种药物组合物，其中含有权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物及药学上可接受的载体。

7.权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物用于制备抗心血管疾病的药物的用途。