CN103709270B - 一种壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于海洋化学化工工程技术领域，具体内容涉及一种壳聚糖接枝小檗红碱衍生物及其制备方法。接枝壳聚糖衍生物为式Ⅰ—A的2-N-烷基取代小檗红碱壳聚糖或式Ⅰ—B的6-O-烷基取代小檗红碱壳聚糖；式Ⅰ—A或式Ⅰ—B中R为9-O-烷基取代小檗红碱；n为聚合度≥2；衍生物的制备为将9-O-烷基取代小檗红碱与壳聚糖或壳聚糖的氨基保护物反应制备而得。本发明所得目标产物引入小檗碱分子特有的生物碱活性氮结构，特别是6-烷基取代小檗红碱壳聚糖在引入小檗碱活性的同时还保留了壳聚糖的活性氨基，使得壳聚糖分子的正电荷数量提高，有助于改善壳聚糖的理化性质和应用范围。

Description

一种壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物及其制备方法

技术领域

本发明属于海洋化学化工工程技术领域，具体内容涉及一种壳聚糖接枝小檗红碱衍生物及其制备方法。

背景技术

随着经济的发展和人民生活水平的不断提高，人民健康意识不断增强，食品安全和环境污染问题已引起公众的高度关注。由于目前农业上大多使用的是化学农药，因农药残留导致的食品安全和环境污染问题日益突出，有害农药残留已严重影响农业的可持续发展和人类健康。因此，研制高效、低毒、低残留生物农药的呼声越来越高。

我国是一个农业大国，同时也是一个海洋大国，利用丰富的海洋生物资源，开发新型海洋生物源农药，是一个新的应用前景广阔的研究领域。甲壳素是来源于虾、蟹、昆虫等节肢动物的外壳或软体动物的外壳以及真菌、低等藻类的细胞壁。甲壳素含量丰富，是含量仅次于纤维素的第二大天然生物多糖。壳聚糖作为甲壳素的脱乙酰产物，具有无毒、生物相容性好、可自然降解等特点。此外，壳聚糖还能抑制植物病原真菌以及诱导植物产生抗病性，以壳聚糖、寡糖为原料研制的海洋生物源农药已有多个产品面市。

壳聚糖和寡糖制品普遍存在抑菌活性低和水溶性差等方面的不足，通过对壳聚糖进行定位修饰、接枝共聚等手段进行化学改性，导入抑菌活性基团，能够获得具有较高抑菌活性的新型壳聚糖衍生物。壳聚糖自身的抑菌活性主要源于其携带有大量的正电荷，因此向壳聚糖分子中引入含有正电荷的活性基团将有望获得高抑菌活性的壳聚糖接枝衍生物。小檗红碱是一种常见的天然异喹啉生物碱，分子中含有质子化的氮，活性测定表明其对植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发有较强的抑制作用。因此，本发明提出以小檗红碱作为活性基团接入壳聚糖分子中，使壳聚糖与抑菌活性基团产生协同作用，同时使合成物能够保持壳聚糖无毒、易降解和生物相容性好的特点，为研制新型海洋生物农药奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物，接枝壳聚糖衍生物为式Ⅰ—A的2-N-烷基取代小檗红碱壳聚糖或式Ⅰ—B的6-O-烷基取代小檗红碱壳聚糖；式Ⅰ—A或式Ⅰ—B中R为9-O-烷基取代小檗红碱；n为聚合度≥ 2；

所述衍生物是在壳聚糖分子的2-N或6-O位接入小檗碱（衍生物）分子活性结构。

一种壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物的制备方法，衍生物为将9-O-烷基取代小檗红碱与壳聚糖或壳聚糖的氨基保护物反应制备而得。

以小檗碱为原料，经常压热裂解获得小檗碱衍生物小檗红碱，小檗红碱与二卤代烷基反应获得9-卤代烷基小檗红碱；壳聚糖或壳聚糖的氨基保护物（苄叉壳聚糖或N-邻苯二甲酰基壳聚糖）分别与9-卤代烷基小檗红碱反应生成2-N-烷基取代小檗红碱壳聚糖和6-O-烷基取代小檗红碱苄叉壳聚糖或6-O-烷基取代小檗红碱-2-N-邻苯二甲酰基壳聚糖；

将所得6-O-烷基取代小檗红碱苄叉壳聚糖在酸性醇溶液中脱去苄其得6-O-烷基取代小檗红碱壳聚糖；6-O-烷基取代小檗红碱-2-N-邻苯二甲酰基壳聚糖在水合肼溶液中脱去邻苯二甲酰基得6-O-烷基取代小檗红碱壳聚糖。

所述壳聚糖的氨基保护是将壳聚糖与苯甲醛反应生成苄叉壳聚糖，或将壳聚糖与邻苯二甲酸酐生成N-邻苯二甲酰基壳聚糖；其中壳聚糖分子聚合度不小于2，脱乙酰度＞80%。

所述9-O-卤代烷基小檗红碱的制备是以小檗碱为原料，经高温热裂解制备成小檗红碱，在与小檗红碱3～10倍当量的二卤代烷烃反应，获得。

所述二卤代烷烃为直链烷烃、支链烷烃或不饱和烷烃，通式为C_nH_2n-mX₂（n为2～12，m为0～4的整数），X为F、Br、Cl或I。

将小檗红碱的3～10倍当量的二卤代烷烃与小檗红碱在无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中反应，于40℃～80℃回流反应，通过薄层层析监测反应进程，反应产物用乙醚沉淀，经过滤、洗涤得到9-O-卤代烷基小檗红碱。

将壳聚糖与9-O-卤代烷基小檗红碱按1:3～1:10的摩尔比，在含2.5～5mol/L NaOH的异丙醇溶液中于40～60℃条件下反应2～4h，反应后用6mol/L盐酸水溶液调节pH至中性，沉淀、离心后以甲醇洗涤至洗出液无色，即得到2-N-烷基取代小檗红碱壳聚糖；NaOH的异丙醇溶液体积约为壳聚糖质量的50倍；

氨基保护壳聚糖与9-O-卤代烷基小檗红碱按1:1～1:10摩尔比投入异丙醇溶液中，滴加催化量的吡啶作为催化剂，在80℃反应24h，产物经过滤及甲醇洗涤，得6-O-烷基取代小檗红碱苄叉壳聚糖，产物在0.2M盐酸与乙醇的混合溶液（1:4，V/V）中室温搅拌24h，得目标产物6-O-烷基取代 小檗红碱壳聚糖；异丙醇溶液体积约为氨基保护壳聚糖质量的50倍。

作用原理：对壳聚糖进行接枝是改善其理化性质和生物活性的主要手段，向壳聚糖中引入含有活性氮原子的生物碱——小檗红碱，有助于提高壳聚糖衍生物与病菌的作用能力，提高衍生物的生物活性。

具体，本发明分别在制备小檗碱衍生物的基础上，分别在壳聚糖2位和6位上引入小檗碱衍生物，通过在壳聚糖上引入活性植物源生物碱结构，以期改善壳聚糖理化性质和生物活性。具体反应过程如下：以小檗碱为原料，采用热裂解法制备成小檗红碱，通过与二卤代烷烃反应制备成9-卤代烷基小檗红碱；壳聚糖与9-卤代烷基小檗红碱直接反应生成2-N-烷基取代小檗红碱壳聚糖；壳聚糖的氨基保护产物——苄叉壳聚糖或N-邻苯二甲酰基壳聚糖，其与9-卤代烷基小檗红碱在碱性条件下发生双分子亲核取代，反应生成6-O-烷基取代小檗红碱苄叉壳聚糖，产物在酸性醇溶液或水合肼溶液中脱氨基保护制备得6-O-烷基取代小檗红碱壳聚糖。所得目标产物引入小檗碱分子特有的生物碱活性氮结构，特别是6-烷基取代小檗红碱壳聚糖在引入小檗碱活性的同时还保留了壳聚糖的活性氨基，使得壳聚糖分子的正电荷数量提高，有助于改善壳聚糖的理化性质和应用范围。

本发明所具有的特点：

1.本发明在壳聚糖结构中引入小檗红碱活性结构后，可提高壳聚糖的水溶解性能及对微生物的生物活性。

2.本发明制备的壳聚糖接枝小檗红碱衍生物具有良好的水溶性和抗菌活性，克服了壳聚糖自身水溶解性差的缺点，拓展了其应用领域，在农用杀菌剂、兽药、医药、化妆品等领域有着潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施所使用的低分子量壳聚糖红外光谱图，其中其红外特征吸收（cm^-1）：3415.98（νO-H，νN-H），2877.82（νC-H），1659.76（νC=O），1596.89（νC-N），1380.83（δC-H），1078.42（νC-O），1250－1000（pyranose）。

图2为本发明实施例所得产物2-N-丙烷基取代小檗红碱壳聚糖的红外光谱，其中其红外特征吸收（cm^-1）：3432.90（νO-H，νN-H），2909.03（νC-H），1637.49（νC=O），1323.43（δC-H），1078.47（νC-O），1250－1000（pyranose）。

图3为本发明实施所使用的苄叉壳聚糖红外光谱图，其中其红外特征吸收（cm^-1）：3421.19（νO-H），2878.21（νC-H），1642.57（νC=N；νC=O），1451.06（Ar），1250－1000（pyranose）。

图4为本发明实施所得产物6-O-丙烷基取代小檗红碱壳聚糖的红外光谱，其中其红外特征吸收（cm^-1）：3432.53（νO-H，νN-H），2879.32（νC-H），1636.02（νC=O），1375.43（δC-H），1066.76（νC-O），1250－1000（pyranose）。

具体实施方式

实施例1

2g小檗碱，在190～220℃常压热裂解5min，用氯仿溶解后过滤，浓缩滤液得小檗红碱。然后与二卤代烷烃反应，制备得到9-O-卤代烷基小檗红碱。

具体小檗红碱与二卤代烷烃反应为：

1.0g小檗红碱溶解于7.5ml二甲基甲酰胺溶剂中，加入4.0g1,3-二溴丙烷，60℃回流反应6h。反应完毕后，加入10ml乙醚沉淀、过滤得黄色9-O-溴丙烷基小檗红碱粗品1.17g。

0.08g壳聚糖（3.47×10⁵Da，脱乙酰度83.5%）与0.62g9-O-溴丙烷基小檗红碱于5ml含2.0mol/L氢氧化钠的异丙醇溶液中于50℃反应5h。反应完毕后以6mol/L盐酸溶液调节pH为7，沉淀、离心，用甲醇充分洗涤沉淀至洗出液无色。产物为2-N-丙烷基取代小檗红碱壳聚糖0.3160g（参见图2）。

实施例2

壳聚糖1.00g（3.47×10⁵Da，脱乙酰度83.5%）溶于300mL2%的醋酸溶液中，加入20ml甲醇，搅拌1h使壳聚糖充分溶胀。将苯甲醛6.57g溶于20ml甲醇中，加入到反应物中，室温搅拌24h。反应终止后得到白色胶状混合物，用100mL丙酮洗涤并过滤，固体再以50mL丙酮充分搅拌洗涤过滤，200mL5%的氢氧化钠水溶液在室温下处理10min，过滤并用去离子水洗至中性。150ml甲醇浸泡过夜，得壳聚糖西弗碱——苄叉壳聚糖1.10g（参见图3）。

0.11g苄叉壳聚糖与0.5g9-O-溴丙烷基小檗红碱在含有0.5mL吡啶的异丙醇溶液（5mL）中于80℃反应24h，过滤后用甲醇充分洗涤沉淀至洗出液无色，得棕色固体粉末，冻干得6-O-丙烷基取代小檗红碱苄叉壳聚糖0.11g。将以上产物0.10g置于0.25M HCl与乙醇的混合溶液中（1:4，V/V），室温搅拌24h后过滤，用甲醇充分洗涤沉淀得目标产物6-O-丙烷基取代小檗红碱壳聚糖0.08g（参见图4）。

实施例3

向三口烧瓶中加入6.6g壳聚糖（分子量134万，脱乙酰度84%），120mL二甲基甲酰胺（含有5%（v/v）的水），室温下搅拌使壳聚糖均匀溶胀分散在溶剂中后，加入16.0g邻苯二甲酸酐（108mmol），120℃搅拌回流8h后冷却至室温，将反应物倾倒入冰水中，减压过滤并用蒸馏水洗涤，过滤后将产物分散于乙醇中，用乙醇完全洗涤，过滤、烘干得到棕色粉末状N-邻苯二甲酰基壳聚糖10.6g。

取0.10g N-邻苯二甲酰基壳聚糖与0.5g9-O-溴丙烷基小檗红碱在含有0.5mL吡啶的异丙醇溶液（5mL）中于80℃反应24h，过滤后用甲醇充分洗涤沉淀至洗出液无色，得9-O-溴丙烷基小檗红碱-2-N-邻苯二甲酰基 壳聚糖。将以上产物0.10g置于5ml N-甲基-2-吡咯烷酮和5ml的水合肼（80%）的混合溶液中，加热至100℃回流反应5h，反应结束后将反应液倒入50ml乙醇中沉淀、离心，用40ml乙醇洗涤沉淀3次，冻干得产物6-O-丙烷基小檗红碱壳聚糖。

应用例

采用生长速率法测定供试样品的抑菌活性。将供试样品用灭菌水配制成2mg/ml的浓度，壳聚糖采用0.07%（V/V）醋酸溶液配制。量取1ml样品溶剂于刻度试管中，倒入融化的PDA培养基定容至10ml，待培养基冷却凝固后得混药平板。用打孔器（直径4mm）将预先培养的供试菌打制成菌饼，将供试菌饼倒置放于培养基表面中央，每一处理做3次重复，设置相应的溶剂对照。25℃恒温培养72h后用十字交叉法开始测量菌落扩展直径，按下式计算菌丝生长抑制率（参见表1）。

表1壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物的抑菌活性

供试浓度为0.2mg/ml，表中数据为mean±S.D.，同列数据后不同字母表示差异显著（α=0.05，Duncan检验法检验） 。

Claims (8)

1.一种壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物，其特征在于：接枝壳聚糖衍生物为式Ⅰ—A的2-N-烷基取代小檗红碱壳聚糖或式Ⅰ—B的6-O-烷基取代小檗红碱壳聚糖；式Ⅰ—A或式Ⅰ—B中R为9-O-烷基取代小檗红碱；n为聚合度≥2；

衍生物为将9-O-卤代烷基取代小檗红碱与壳聚糖或壳聚糖的氨基保护物反应制备而得。

2.按权利要求1所述的壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物，其特征在于：所述衍生物是在壳聚糖分子的2-N或6-O位接入小檗红碱衍生物分子活性结构。

3.按权利要求1所述的壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物的制备方法，其特征在于：

以小檗碱为原料，经常压热裂解获得小檗红碱，小檗红碱与二卤代烷基反应获得9-O-卤代烷基小檗红碱；壳聚糖或壳聚糖的氨基保护物苄叉壳聚糖或N-邻苯二甲酰基壳聚糖分别与9-O-卤代烷基小檗红碱反应生成2-N-烷基取代小檗红碱壳聚糖和6-O-烷基取代小檗红碱苄叉壳聚糖或6-O-烷基取代小檗红碱-2-N-邻苯二甲酰基壳聚糖；

将所得6-O-烷基取代小檗红碱苄叉壳聚糖在酸性醇溶液中脱去苄基得6-O-烷基取代小檗红碱壳聚糖；6-O-烷基取代小檗红碱-2-N-邻苯二甲酰基壳聚糖在水合肼溶液中脱去邻苯二甲酰基得6-O-烷基取代小檗红碱壳聚糖。

4.按权利要求3所述的壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖的氨基保护物是将壳聚糖与苯甲醛反应生成苄叉壳聚糖，或将壳聚糖与邻苯二甲酸酐生成N-邻苯二甲酰基壳聚糖；其中壳聚糖分子聚合度不小于2，脱乙酰度＞80％。

5.按权利要求1所述的壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物的制备方法，其特征在于：所述9-O-卤代烷基小檗红碱的制备是以小檗碱为原料，经高温热裂解制备成小檗红碱，再与小檗红碱3～10倍当量的二卤代烷烃反应，获得。

6.按权利要求5所述的壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物的制备方法，其特征在于：所述二卤代烷烃为直链烷烃、支链烷烃或不饱和烷烃，通式为C_nH_2n-mX₂，n为2～12，m为0～4的整数，X为F、Br、Cl或I。

7.按权利要求5所述的壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物的制备方法，其特征在于：将小檗红碱的3～10倍当量的二卤代烷烃与小檗红碱在无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中反应，于40℃～80℃回流反应，通过薄层层析监测反应进程，反应产物用乙醚沉淀，经过滤、洗涤得到9-O-卤代烷基小檗红碱。

8.按权利要求7所述的壳聚糖接枝烷基取代小檗红碱衍生物的制备方法，其特征在于：

将壳聚糖与9-O-卤代烷基小檗红碱按1:3～1:10的摩尔比，在含2.5～5mol/L NaOH的异丙醇溶液中于40～60℃条件下反应2～4h，反应后用6mol/L盐酸水溶液调节pH至中性，沉淀、离心后以甲醇洗涤至洗出液无色，即得到2-N-烷基取代小檗红碱壳聚糖；

氨基保护壳聚糖与9-O-卤代烷基小檗红碱按1:1～1:10摩尔比投入异丙醇溶液中，在催化量吡啶的存在下于80℃反应24h，产物经过滤及甲醇洗涤，得6-O-烷基取代小檗红碱苄叉壳聚糖，产物在0.2M盐酸与乙醇的混合溶液中室温搅拌24h，得目标产物6-O-烷基取代小檗红碱壳聚糖。