CN103396462A - 姜黄素类糖苷及其制备方法和在抗帕金森氏病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及姜黄素类糖苷及其制备方法。药理实验证明，本发明的姜黄素类糖苷具有显著的抗帕金森氏病作用，用药剂量低，具有很好的临床应用前景。

Description

姜黄素类糖苷及其制备方法和在抗帕金森氏病中的应用

技术领域：

本发明涉及生物医药领域，具体涉及姜黄素类糖苷及其制备方法和在抗帕金森氏病中的应用。

背景技术：

帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)是一种常见的慢性进行性运动障碍性疾病，以黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性坏死为主要病理特征，临床表现为静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓和姿势反射障碍。老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7％，美国患病人数超过100万，我国的患病人数已超过200万，仅次于糖尿病、冠心病、脑血管病的患病率。PD不仅发病率高，而且在发病2-8年后多出现不同程度的致残现象，严重影响患者的生活质量，加上医疗费用，给社会和家庭带来了精神负担和经济负担。

解剖学研究表明，帕金森氏病与脑基底神经节内的多巴胺能黑质神经元的大面积退化有关。当黑质神经元产生的多巴胺有大约60％-80％受损时，它就不可能再辅助锥体外束系统，从而导致帕金森氏症状。研究证实JNK通路与1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)、1-甲基-4-苯基吡啶离子(Mpp⁺)和6-OHDA诱导的多巴胺能神经元凋亡有关，而且使用特异性抑制剂直接阻断JNK可以有效减慢PD的病程。

姜黄素(curcuminoids)是从中药姜黄的根、茎中提取出来的一种酚类色素，主要包括姜黄素(curcumin)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin)和去双甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin)，以姜黄素为主，是中药姜黄的主要活性成分。现代药理研究表明，姜黄素具有抗癌、抗炎、抗氧化、降血脂及抗动脉粥样硬化、抗抑郁、抗帕金森氏病等多种药理活性，而且无毒，无副作用，应用领域十分广泛。近年来有研究报道，姜黄素通过抑制JNK通路起到保护多巴胺能神经元的作用，为进一步将姜黄素在帕金森氏病等神经退行性疾病治疗中的应用提供可靠的实验依据。

但是姜黄素水溶性和脂溶性均很差，结构不稳定，在体内容易被降解，导致其生物利用度低，这些阻碍了姜黄素作为候选药物的进一步开发。本发明通过微生物转化方法来制备姜黄素类糖苷，增加其水溶性，提高生物利用度，同时保持活性，甚至可以延长作用时间。

微生物转化是利用微生物产生的特异酶对外源性化合物进行结构修饰的特定生化反应。微生物转化具有高度的立体结构选择性，能专一地催化特定的反应、无需繁琐的保护与脱保护操作，具有高效、环保的优点，是天然活性化合物进行结构修饰的一种有效方法。在姜黄素类化合物的酚羟基结构中引入糖基可以在一定程度上解决水溶性差，生物利用度低的问题，同时保持或增强其活性。

发明内容：

本发明的目的在于提供姜黄素类糖苷和其在药学上可接受的溶剂化物，以及提供一种高效、环保的姜黄素类糖苷的制备方法及其在抗帕金森氏病中的应用。

本发明提供的姜黄素类糖苷具有下列结构式：

本发明为了寻找适宜转化姜黄素类物质成其糖苷化产物的菌种，筛选了多个菌种，结果发现，保藏号为NRRL1086菌种对姜黄素类物质具有较强的转化能力(表1)。

筛选所用液体培养基(PDA)：200克新鲜去皮马铃薯加沸水500ml煮15min后过滤，滤液加葡萄糖20g、KH₂P0₄3.0g、MgSO₄0.75g、Vb₁10.0mg，加蒸馏水定容至1.0L，加NaOH或HCl调pH值至6.0，150ml三角烧瓶每瓶分装30ml液体培养基，121℃、0.15MPa灭菌20min。

筛选菌种时，保存菌种所用斜面培养基是在上述液体培养基加入1.5％的琼脂，15ml具塞试管每管5ml，121℃、0.15MPa灭菌20min冷却后制成。

菌种的保存与活化：菌种活化采用两步活化法，参见：Nair,M.S.R.，and Basile，D.V.Bioconversion of artenium B to artmisinn.天然产物杂志(Jounal of Natural Products)1993,56(9)：1559。先将菌种接种于液体培养基，28℃180r/min旋转培养24-48h后，转接于另一液体培养基，接种量1-5％(V/V)，同条件培养24h后加样。

样品的制备及加样：姜黄素溶于乙醇，配成10mg/ml溶液备用；每瓶经两步活化的菌液(30m1)加0.5ml样品溶液，使每瓶菌液含姜黄素5mg。同条件培养120h后，中止反应，过滤菌体，发酵液用等量的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌体用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，将两种浸膏和并，加少许乙酸乙酯溶解后备薄层鉴定用。

空白对照：空白对照设阳性对照(底物+培养基)、阴性对照(培养基+菌)、溶剂对照(培养基+菌+乙醇)，培养和萃取条件同上。

转化产物的薄层鉴定：

薄层条件：

薄层板：0.7％的CMC-Na制成的硅胶G板。

展开剂∶正己烷∶氯仿∶甲醇(5∶3∶1)上行法展开。

操作：

转化萃取物和空白对照萃取物分别点于薄层板，充分展开后取出自然晾干，紫外灯下观察。转化结果见表1。

表1微生物转化姜黄素筛选结果

从筛选结果看，有4种菌可以转化，其中NRRL 1086，经测算，转化率可达60％。Absidiacoerulea虽为糖基化转化但转化率较低。而Streptomyces sp.和NRRL 5646均不是糖基化转化。因此，本发明选用菌株NRRL 1086，以姜黄素为底物来制备姜黄素类糖苷。

本发明提供的姜黄素类糖苷的制备方法，用保藏号为NRRL 1086菌株对姜黄素类底物进行生物转化方法获得。

其中姜黄素类底物包括姜黄素、去甲氧基姜黄素或双去甲氧基姜黄素。

更优选的方法是：以姜黄素为底物，利用保藏号为NRRL 1086的菌株，将底物和该菌株在培养基中共培养3～8天，终止反应，用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，通过硅胶柱层析分离即得。

其中有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、甲酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、正己烷、正丁醇中的一种或几种。更优选乙酸乙酯。

硅胶柱层析分离用氯仿和甲醇进行梯度洗脱。

培养基含10-30％的马铃薯煎煮液、KH₂PO₄、MgSO₄、维生素B1和选自葡萄糖、蔗糖、芽糖、淀粉中一种或几种碳源，培养基pH＝5.0-7.0。为重量百分比。

其中按20％马铃薯煎煮液100毫升计，培养基中各组分优选的含量为KH₂PO₄含0.1-0.5克；MgSO₄含0.05-0.5克；葡萄糖或蔗糖0.5-2.5克。

最为优选的制备方法是：将保藏号为NRRL 1086的菌株由斜面接种到液体培养基中，置28℃，转速为180r/m的摇床中培养24小时成为种子液，种子液转接至发酵液后继续培养24小时，加入转化底物；继续培养144小时后终止催化反应，过滤菌体，发酵液用等量的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯，得到萃取浸膏，浸膏经硅胶拌样后柱层析分离；以氯仿-甲醇为洗脱系统。转化产物经甲醇重结晶，得到纯的转化产物姜黄素类糖苷。

本发明提供的姜黄素类糖苷或其药学上可接受的溶剂化物具有抗帕金森氏病的作用，在制备抗帕金森氏病药物中有很好的临床应用前景。

本发明的姜黄素类糖苷可与药学上可接受的载体混合，用于制备治疗用药物组合物。可制备成药剂学上通用的剂型，如胶囊、片剂、丸剂、口服液、颗粒剂、酊剂、透皮贴剂、缓释剂、注射剂等胃肠道给药剂型及注射剂、外用制剂等胃肠外给药剂型。

附图说明

图1化合物1对MPTP诱导的小鼠行为学旷场实验之水平运动(即爬格数)结果

图2化合物1对MPTP诱导的小鼠行为学旷场实验之垂直运动(即直立数)结果

图3化合物1对MPTP诱导的小鼠行为学牵引实验结果

具体实施方式

实施例1 姜黄素糖苷1的制备：

底物姜黄素200mg溶于20mL乙醇；配制0.5g/ml的蔗糖溶液100ml，灭菌；菌种NRRL1086由4℃的固体斜面接种至液体PD培养基(培养基按100毫升20％马铃薯煎煮液中含KH₂PO₄0.3克；MgSO₄0.75克；葡萄糖10克；维生素B₁0.01克配制，液体培养基分装至150mL的三角瓶，每瓶装液30mL)，至摇床中培养24小时(28℃，180r/m)，即为种子液；将种子液在无菌条件下转移至液体PDA培养基(培养基组成同前)中，在摇床中继续培养24小时。每瓶加1ml姜黄素乙醇溶液及3ml蔗糖溶液，培养144小时后终止反应。发酵液用等量的乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏328mg，称取100-200目硅胶0.8g与残渣均匀拌样，柱层析200～300目20g干法装柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，在氯仿-甲醇＝20∶1的洗脱馏分中，可得目标转化产物姜黄素糖苷1的粉未182mg。其结构式如下所示：

本实施例中的姜黄素还可以是去甲氧基姜黄素或二去甲氧基姜黄素，其相应的目标产物2和3制备方法同上，只是所加入的底物不同。

为了验证所述化合物对帕金森氏病的治疗功效，用MPTP小鼠模型作为动物模型进行试验，取得了令人满意的结果。

实施例2 姜黄素糖苷对MPTP诱导的小鼠行为学实验

1、PD小鼠模型的建立和实验分组

8周龄C57BL/6雄鼠60只，体重约25g，随机分六组，正常对照组、模型组、阳性药组(L-左旋多巴，75mg/kg)、姜黄素糖苷低剂量治疗组(15mg/kg)、中剂量治疗组(30mg/kg)和高剂量治疗组(60mg/kg)，每组10只小鼠。模型组小鼠连续5d腹腔注射MPTP(30mg/kg)，间隔24h，随后连续7天腹腔注射DMSO；治疗组小鼠连续5d腹腔注射MPTP(30mg/kg)，随后连续7天腹腔注射姜黄素糖苷低、中、高剂量(15、30、60mg/kg，用DMSO溶解)。

2、行为学检测

2.1旷场实验

自制旷场实验木箱100cmx100cmx50cm，底面用墨线分成16个方格(25X25cm)，上面敞开。行为学观察：实验在暗室、安静的环境中进行，旷场实验箱上方约60cm高处用一个60w的灯泡照明。观察指标有(1)水平运动(locomotion)：即爬格数，观察期内小鼠四肢所爬过的格子数；(2)直立数(rearing)：观察期内后肢站立，前肢离地1cm以上，不包括站立理毛现象的次数。每只动物观察时间为10min。

2.2牵引实验

将小鼠的前爪悬挂在一条水平电线上。小鼠若两只后肢都能抓住电线记为3分，一只后肢能抓住电线记为2分，两只后肢都不能抓住电线记为1分，以总分表示结果。

如图1，图2所示，旷场实验结果表明，与正常对照组小鼠相比，MPTP模型组小鼠的爬格数和直立数显著降低(p＜0.01)。而经姜黄素糖苷给药七天后，与模型组小鼠比较，其治疗组小鼠的爬格数和直立数显著增加(p＜0.01，p＜0.05，图1和图2)，阳性药也有明显的改善作用。牵引实验结果显示，正常对照组小鼠四肢都能抓住电线；第12天时模型组小鼠仅能用前爪抓住电线；而姜黄素糖苷治疗组不管是低剂量、中剂量还是高剂量小鼠都能用一只或两只后爪抓住电线，与模型组相比，姜黄素糖苷治疗组小鼠的牵引评分显著增高(p＜0.01，p＜0.05，图3)，阳性药组小鼠的牵引评分也是显著增高(p＜0.01，图3)。

实验结果表明姜黄素糖苷及本发明的其它两个化合物都能够明显改善MPTP诱导的PD行为学变化。而且姜黄素类糖苷的治疗效果与阳性对照药左旋多巴接近甚至更好，但用药剂量却明显减少，具有很好的临床应用前景。

实施例3 片剂

取实施例1制得的姜黄素糖苷100g与淀粉50g，糊精50g混合，用适量30％乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入适量硬脂酸镁混合，制成片剂。

Claims (8)

1.一种姜黄素类糖苷，其特征在于具有下列结构及其在药学上可接受的溶剂化物： 

。

2.权利要求1所述的姜黄素类糖苷的制备方法，包括：用保藏号为NRRL1086菌株对姜黄素类化合物进行生物转化获得。 

3.权利要求2所述的姜黄素类化合物包括：姜黄素、去甲氧基姜黄素或双去甲氧基姜黄素等。 

4.权利要求2的制备方法，其中生物转化方法如下：以姜黄素类化合物为底物，利用保藏号为NRRL1086的菌株，将底物和该菌株在培养基中共培养4～7天，终止反应，发酵液用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，得浸膏，通过硅胶柱层析分离得到目标化合物。 

5.权利要求4的制备方法，其中有机溶剂包括：乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、甲酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、己烷或正丁醇。 

6.权利要求4的制备方法，其中培养基按20％的马铃薯煎煮液100毫升计，含KH₂PO₄0.1-0.5克、MgSO₄0.05-0.5克和葡萄糖0.5-2.5克。 

7.一种药物组合物，其中含有权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物及药学上可接受的载体。 

8.权利要求1所述的姜黄素类糖苷化合物或其药学上可接受的溶剂化物用于制备抗帕金森氏病的药物的用途。 

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