CN103739654A - 28-O-β-D-葡萄糖基化熊果酸、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物药物领域，具体涉及28-O-β-D-葡萄糖基化熊果酸（I），本发明公开了其制备方法：用保藏号NRRL1086菌株对熊果酸进行生物转化获得。本发明还公开了其抗炎方面的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物药物领域，具体涉及28-O-β-D-葡萄糖基熊果酸及其制备方法，本发明还公开了其抗炎的用途。
背景技术
炎症是人类疾病中最常见的一种病理过程，与大多数疾病相关。抗炎药物是临床上仅次于抗感染药物的第二大类药物，目前临床上应用较多的抗炎药物主要是非甾体抗炎药和肾上腺皮质激素类药物，但是这些药物作用是多靶点，多途径的，使用的剂量和疗程也各有不同而且各种机制之间也存在复杂的网络关系，长期使用会带来很多不良反应。随着对中药的不断地开发和认识以及多年的临床和实验证实，很多中药具有良好的抗炎作用，且毒副作用小而且资源丰富，因此中药单体的开发和结构改造以及对其药理作用机制的研究已经成为当今世界上新药开发的热点。五环三萜类化合物广泛分布于各种植物中，具有广泛的生物活性，研究显示在抗炎方面具有显著的活性。如熊果酸具有明显的抗炎作用，但水溶性差，可能影响了其药效的发挥。为了增加水溶性，同时保持或者提高其活性，对它进行了结构修饰，化学合成了大量的衍生物，其中不乏有活性好的化合物发现。但有关熊果酸的微生物糖基化修饰少见于报道。
微生物转化是利用微生物产生的特异酶对外源性化合物进行结构修饰的特定生化反应。微生物转化具有高度的立体结构选择性，能专一地催化特定的反应、无需繁琐的保护与脱保护操作，具有高效、环保的优点，是天然活性化合物进行结构修饰的一种有效方法。若在含有羧基的乌苏烷型五环三萜苷元类化合物中引入糖基可以在一定程度上解决生物利用度差的问题，同时保持其活性。
发明内容
本发明公开了结构式I的化合物：
命名为28-O-β-D-葡萄糖基化熊果酸。本发明同时也包括结构式I的化合物的溶剂化物。其13C-NMR数据为: δ (ppm) C(1) 39.2，C(2) 28.2，C(3) 78.2，C(4) 36.8，C(5) 55.9，C(6) 18.8，C(7) 33.6，C(8) 39.2，C(9) 48.1，C(10) 37.3，C(11) 23.8，C(12) 126.2，C(13) 138.5，C(14) 42.5，C(15) 28.7，C(16) 24.7，C(17) 48.4，C(18) 53.4，C(19) 39.4，C(20) 39.4，C(21) 39.4，C(22) 36.8，C(23) 28.8，C(24) 15.8，C(25) 16.6，C(26) 17.4，C(27) 23.7，C(28) 176.2，C(29) 17.7，C(30) 21.3，与熊果酸13C-NMR数据相比较，可以确定其母核为熊果酸，通过化学位移值的变化可确定糖是连在C28位上。另外还有6个葡萄糖碳信号，分别为GLC(1) 95.8，GLC(2) 74.1，GLC(3) 79.0，GLC(4) 71.3，GLC(5) 79.2，GLC(6) 62.4。
药理试验证明，本发明的式I化合物具有明显的的抗炎活性，其溶剂化物具有同样的药理功效。
本发明的式I化合物优选用生物转化方法以熊果酸为底物进行转化制备，方法如下：
为了寻找适宜转化熊果酸成28-O-β-D-葡萄糖基熊果酸的菌种，本发明共筛选了多个菌种，结果发现，保藏号为NRRL1086菌种对熊果酸具有较强的转化能力（见表2）。
筛选所用液体培养基(PDA)：200克新鲜去皮马铃薯加沸水500mL煮15min后过滤，滤液加葡萄糖20g、KH2PO4 3.0g、MgSO4 0.75g、Vb1 10.0mg，加蒸馏水定容至1.0L，加NaOH或HCl调pH值至6.0，150mL三角烧瓶每瓶分装30mL液体培养基，121℃、0.15MPa灭菌20min。
筛选菌种时，保存菌种所用斜面培养基是在上述液体培养基加入1.5%的琼脂，15mL具塞试管每管5mL，121℃、0.15MPa灭菌20min冷却后制成。
菌种的保存与活化：菌种活化采用两步活化法，参见：Nair,M.S.R.,and Basile,D.V.Bioconversion of artenium B to artmisinn.天然产物杂志（Jounal of Natural Products）1993,56(9):1559。先将菌种接种于液体培养基，28℃180r/min旋转培养24-48h后，转接于另一液体培养基，接种量1-5%（V/V），同条件培养24h后加样。
样品的制备及加样：熊果酸溶于乙醇，配成10mg/mL溶液备用；每瓶经两步活化的菌液（30mL）加0.5mL样品溶液，使每瓶菌液含熊果酸5mg。同条件培养120h后，中止反应，过滤菌体，发酵液用等量的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌体用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，将两种浸膏合并，加少许乙酸乙酯溶解后备薄层鉴定用。
空白对照：空白对照设阳性对照（底物+培养基）、阴性对照（培养基+菌）、溶剂对照（培养基+菌+乙醇），培养和萃取条件同上。
转化产物的薄层鉴定：
薄层条件：
薄层板：0.7%的CMC-Na制成的硅胶G板。
展开剂：甲苯：丙酮（5 : 1）。
显色剂：10%硫酸乙醇。
操作：
转化萃取物和空白对照萃取物分别点于薄层板，上行法充分展开后取出自然晾干，喷以10%硫酸乙醇，在105℃加热显色。转化结果见表2。
表2 微生物转化熊果酸筛选结果
| 菌种 | 筛选结果 |
| Mucor sp. | — |
| Streptomyces sp. | — |
| Beauveria sp. | — |
| Rhizopus sp. | — |
| Gibberella sp. | — |
| NRRL-5646 | +++ |
| SC-2831 | — |
| SC-2831-DD | — |
| U1315-BN | — |
| Alternaria sp. | — |
| Alternaria sp. | — |
| Fusarium sp. | — |
| Phomopsis sp. | — |
| Phomopsis sp. | — |
| G.deliquescens. NRRL-1086 | +++ |
从筛选结果看，有2种菌可以转化，NRRL 1086，经测算，转化率可达50%。而NRRL 5646不是糖基化转化。因此，本发明选用菌株NRRL 1086，以熊果酸为原料来制备28-O-β-D-葡萄糖基熊果酸。
本发明公开了一种制备式I化合物的制备方法，用保藏号为NRRL 1086菌株对熊果酸进行生物转化获得。
更优选的方法是：以熊果酸为底物，利用保藏号为NRRL 1086的菌株，将底物和该菌株在培养基中共培养3～8天，终止反应，用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，通过硅胶柱层析分离即得。
其中有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、甲酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、正己烷、正丁醇中的一种或几种。更优选乙酸乙酯。
硅胶柱层析分离用氯仿和甲醇进行梯度洗脱。
培养基含10~30%的马铃薯煎煮液、KH2PO4、MgSO4、维生素B1和选自葡
萄糖、蔗糖、芽糖、淀粉中一种或几种碳源，培养基pH=5.0~7.0。为重量百分比。
其中按20%马铃薯煎煮液100毫升计，培养基中各组分优选的含量为KH2PO4 含0.1~0.5克；MgSO4含0.05~0.5克；葡萄糖或蔗糖0.5-2.5克。
最为优选的制备方法是：将保藏号为NRRL 1086的菌株由斜面接种到液体培养基中，置28℃，转速为180r/m的摇床中培养24小时成为种子液，种子液转接至发酵液后继续培养24小时，加入转化底物；继续培养144小时后终止催化反应，过滤菌体，发酵液用等量的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯，得到萃取浸膏，浸膏经硅胶拌样后柱层析分离；以氯仿-甲醇为洗脱系统。转化产物经甲醇重结晶，得到白色粉末状转化产物。
药理试验证明，本发明的结构式I化合物具有显著的抗炎活性，以下是试验方法及结果：
28-O-β-D-葡萄糖基化熊果酸抗炎活性研究
1、28-O-β-D-葡萄糖基化熊果酸对二甲苯所致小鼠耳肿胀模型的影响
取正常小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，分别为对照组、用药（25、50、100mg/kg）组、阳性药组（萘普生45mg/kg）。各组连续灌胃给药三天，每天一次，对照组则给予相应体积的CMC-Na。末次给药 40 分钟后于左耳廓正、反两面均匀涂抹二甲苯 20μL/只，20分钟后拉颈处死，沿耳廓基线剪下双耳，用 YLS-Q4 耳肿打耳器在左右耳同一部位冲下耳片，分别称重，以自身左右耳片质量之差表示肿胀度。
抑制率=[（对照组肿胀度平均值－给药组肿胀平均值）/对照组肿胀平均值]×
100%
结果如下：
| 组别 | 剂量mg/kg | 抑制率 | 统计学意义 |
| 对照组 | - | - | - |
| 阳性药组 | 45 | 45.7% | P＜0.01 |
| 高剂量组 | 100 | 80.4% | P＜0.01 |
| 中剂量组 | 50 | 72.1% | P＜0.05 |
| 低剂量组 | 25 | 25.5% | P＜0.05 |
由此可见，28-O-β-D-葡萄糖基化熊果酸能抑制二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症，而中、高剂量组效果尤为明显。
2、28-O-β-D-葡萄糖基化熊果酸对角叉菜胶致大鼠足肿胀模型的影响
取正常雄性大鼠50只，随机分为5组，分别为对照组、用药（25、50、100mg/kg）组、阳性药组（萘普生30mg/kg）。各组连续灌胃给药三天，每天一次，对照组则给予相应体积的CMC-Na。末次给药前用 YLS-7B足趾容积测定仪测量右后足体积，作为给药前体积V0，给药40分钟后，于大鼠右后足足跖腱鞘间注射 1% λ-角叉菜胶 0.1mL/只致炎，分别在致炎后1h、3h、5h、7h 测量右后足体积 VS，以致炎前后体积差(VS－V0)为肿胀度。
结果如下：
与对照组相比 *P＜0.05, **P＜0.01
由此可以看出，用药后对角叉菜胶致大鼠足肿胀有抑制作用，且具有一定的浓度依赖性。
3、28-O-β-D-葡萄糖基化熊果酸对大鼠AA模型的影响
大鼠分组、用药同上，将同一批号的的卡介苗80℃水浴1h灭活，用灭菌液体石蜡配成10g/L的乳剂，充分研磨混匀即成佛氏完全佐剂(FCA)。放置4℃冰箱保存备用，使用前摇匀。用足趾容积测量仪测定致炎前大鼠左、右后踩关节以下容积(mL)，然后于每鼠左后足趾皮内注射0.1mL FCA致炎，正常对照组注射0.1mL PBS。致炎前3天灌胃给药。分别于致炎前及致炎后6、12、18和24h，用足趾容积测量仪检测致炎前、后大鼠致炎侧足肿胀，以观察AA大鼠原发性病变。
结果如下：
| 组别 | 剂量mg/kg | 6h肿胀度/mL | 12h肿胀度/mL | 18h肿胀度/mL | 24h肿胀度/mL |
| 对照组 | - | 0.49±0.06 | 0.54±0.07 | 0.64±0.07 | 0.50±0.06 |
| 阳性药组 | 30 | 0.16±0.09** | 0.22±0.07* | 0.29±0.08** | 0.28±0.06** |
| 高剂量组 | 100 | 0.14±0.06** | 0.24±0.08* | 0.27±0.07** | 0.25±0.06* |
| 中剂量组 | 50 | 0.25±0.05** | 0.29±0.08** | 0.33±0.06* | 0.30±0.07** |
| 低剂量组 | 25 | 0.44±0.05** | 0.53±0.16** | 0.59±0.13** | 0.49±0.15* |
与对照组相比 *P＜0.05, **P＜0.01
各组大鼠左侧足在致炎后6h开始肿胀，18h达到高峰。用药后对FCA诱导的AA大鼠原发性炎症有明显的抑制作用，且具有一定的浓度依赖性。
本发明的28-O-β-D-葡萄糖基熊果酸可与药学上可接受的载体混合，用于制备治疗用药物组合物。可制备成药剂学上通用的剂型，如胶囊、片剂、丸剂、口服液、颗粒剂、酊剂、缓释剂等胃肠道给药剂型及注射剂、透皮贴剂、外用制剂等胃肠外给药剂型。
具体实施方式
实施例1
28-O-β-D-葡萄糖基熊果酸的制备：
底物熊果酸200mg溶于20mL乙醇；配制0.5g/mL的葡萄糖溶液100mL,灭菌（条件同PDA）；菌种NRRL1086由4℃的固体斜面接种至液体PDA培养基（培养基按100毫升20%马铃薯煎煮液中含KH2PO4 0.3克；MgSO4 0.75克；葡萄糖10克；维生素B1 0.01克配制，液体培养基分装至150mL的三角瓶，每瓶装液30mL），至摇床中培养24小时（28℃，180r/m），即为种子液；将种子液在无菌条件下转移至液体PDA培养基（培养基组成同前）中，在摇床中继续培养24小时。每瓶加1mL熊果酸乙醇溶液及3mL蔗糖溶液，培养144小时后终止反应。发酵液用等量的乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏305mg，称取100-200目硅胶0.8g与残渣均匀拌样，柱层析200～300目20g干法装柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，在氯仿-甲醇=95 : 5的洗脱馏分中，可得目标转化产物28-O-β-D-葡萄糖基熊果酸，经甲醇重结晶，得到白色粉末135mg。
其碳谱见表1
实施例2
片剂
取实施例1制得的28-O-β-D-葡萄糖基熊果酸 100g与淀粉50g，糊精50g混合，用适量30%乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入适量硬脂酸镁混合，制成片剂。
Claims (9)
1.结构式I的化合物或其药学上可接受的溶剂化物：
。
2.权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物的制备方法，其特征是：用保藏号为NRRL1086菌株对熊果酸进行生物转化获得。
3.权利要求2的制备方法，其中生物转化方法如下：以熊果酸为底物，利用保藏号为NRRL1086的菌株，将底物和该菌株在培养基中共培养4~7天，终止反应，发酵液用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，得浸膏，通过硅胶柱层析分离得到目标化合物。
4.权利要求3的制备方法，其中有机溶剂包括：乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、甲酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、己烷、正丁醇等。
5.权利要求3的制备方法，培养基含10~30%的马铃薯煎煮液、KH2PO4、MgSO4、维生素B1和选自葡萄糖、蔗糖、芽糖、淀粉中一种或几种的碳源，培养基pH=5.0~7.0。
6.权利要求3的制备方法，其中按20%马铃薯煎煮液100毫升计，KH2PO4 0.1~0.5克；MgSO4 0.05~0.5克；葡萄糖0.5-2.5克（或蔗糖0.5-2.5克）。
7.权利要求2的制备方法，其中菌种在培养前先进行活化，活化时间20～30h。
8.一种药物组合物，其中含有权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物及药学上可接受的载体。
9.权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物用于制备抗炎药物的用途。
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