CN101979535A

CN101979535A - 等位基因的敲除方法及其构建的重组gal菌株和用途

Info

Publication number: CN101979535A
Application number: CN 201010284289
Authority: CN
Inventors: 郭钦; 张伟; 何国庆; 阮晖
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-09-16
Filing date: 2010-09-16
Publication date: 2011-02-23
Anticipated expiration: 2030-09-16
Also published as: CN101979535B

Abstract

本发明公开了一种等位基因的敲除方法，根据等位基因的基因序列，设计40～500bp的同源引物，分三步敲除三个等位基因，同时引入长片段的目的基因。本发明还同时公开了利用上述方法构建而得的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏名称为：S.CGQ21-14，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年9月6日，保藏号：CGMCC NO.3263。该酿酒酵母能在发酵过程中提高GAL1启动子控制下的外源蛋白的表达水平，同时使发酵过程中半乳糖的浓度维持不变。

Description

等位基因的敲除方法及其构建的重组GAL菌株和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及到基于同源重组原理的一种多个等位基因的准确敲除技术和运用此技术对工业多倍体酵母染色体的基因改造，并涉及到应用此重组菌株作为表达系统进行外源蛋白表达后的工业酶的表达产量的提高。

背景技术

酿酒酵母表达系统是目前应用最广泛、技术最为成熟的真核蛋白表达系统。酿酒酵母染色体中的GAL系统共包括11个基因，这些基因大部分在转录水平上通过碳源被调控，一般被葡萄糖所抑制，被半乳糖所诱导。

其中GAL1被称为半乳糖激酶，具有半乳糖激酶活性和在有半乳糖存在下诱导酵母GAL基因信号转录的活性。缺失了GAL1基因的酵母不能利用半乳糖。GAL1基因的启动子属于强诱导型启动子，在缺乏葡萄糖的培养基中加入半乳糖可以提高GAL1启动子的表达丰度1000倍左右，因此GAL1启动子被大量用来指导外源蛋白在酿酒酵母中的表达。将所要表达的异源蛋白基因CDS序列置于GAL1启动子下方转入酵母体内，当酵母到达对数生长期后，在培养基中加入半乳糖作为诱导剂启动GAL1启动子的转录，由此可以避免蛋白大量表达对酵母代谢和生长造成的负荷，同时得到高水平的表达蛋白。

尽管利用GAL1启动子的诱导特性可以控制外源蛋白在酵母中的表达，然而使用半乳糖做为GAL1启动子的诱导剂也存在缺陷。GAL1启动子的诱导需要半乳糖，而半乳糖在酵母生长过程中会被酵母同步消耗，造成诱导剂浓度下降，随之影响外源蛋白的表达。此外，一般情况下半乳糖被添加到培养基中的终浓度为2％-4％，与葡萄糖相比半乳糖价格昂贵，使得工业化大规模发酵和蛋白生产过程中半乳糖浓度的维持需要较高的经济成本。

GAL4是GAL基因诱导表达的主要正调控因子，在半乳糖存在的情况下，其编码的蛋白(GAL4p)可以与GAL1启动子序列中的UAS_G序列相结合，从而引发GAL1启动子的转录。由于GAL4基因在单个酵母细胞中的拷贝数一般只有1-2个，其低拷贝数限制了依赖于GAL4蛋白的GAL基因的表达，成了利用GAL1启动子表达外源基因的瓶颈。

为了进一步提高酿酒酵母表达系统表达外源蛋白的能力，可以敲除酵母的GAL1基因或提高转录激活子GAL4基因的表达量，从而降低半乳糖的使用量、延长半乳糖在生产中的利用半衰期并获得外源蛋白的高表达，从而减少生产成本和提高经济效益。

国内外对此进行了大量的研究。Stagoj构建了GAL1、GAL2、GAL3、GAL4、GAL80等28株单个GAL基因敲除菌株，发现与原始菌株相比，GAL1缺失的单倍体菌株获得了最大产量的蛋白产物。Schultz构建了一个染色体上整合了GAL4结构基因与GAL10启动子表达框的酿酒酵母菌株，GAL4蛋白在此重组酵母中得到大量表达，从而使得外源基因的表达是非转化菌株的10倍。

然而这些研究都存在一些缺陷：1)均以单倍体酵母为表达宿主。单倍体酵母的基因操作较为简单，但由于存在不稳定和退化等问题，因此不太适合在工业生产中长时间、大规模应用；且单倍体酵母外源蛋白的表达量一般低于多倍体酵母。2)基因改造手法单一，使得外源蛋白表达水平提高有限。这些研究仅单纯敲除GAL基因或者提高GAL4蛋白的表达，存在许多不足。3)有的存在半乳糖消耗，造成生产成本昂贵。

为了解决上述问题，有必要过量表达诱导酿酒酵母外源蛋白表达过程中的转录激活子以及突变半乳糖-葡萄糖调控途径中的关键基因。目前敲除单倍体酵母菌株染色体上的任意一个基因已经较为简单，但由于没有足够的选择标记和缺乏合适的营养缺陷性多倍体菌株，多倍体酵母的等位基因敲除仍然存在许多困难。由于等位基因上下游序列的同一性使得已敲除目的基因和未敲除目的基因的位点与敲除引物之间存在竞争性重组，加上已敲除目的基因位点对于再次重组的易感性，使得多倍体酵母等位基因重复敲除的概率很低。若要在敲除的同时插入其他基因序列，则越发困难，基因序列越长，重组机率越小，传统的同源重组方法已经无法达到多倍体酵母基因改造的目的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的等位基因敲除技术，并运用此技术对工业多倍体酿酒酵母染色体上的GAL系统进行多方位改造，即敲除多倍体酵母的全部GAL1等位基因并插入GAL4基因，以获得无法利用半乳糖且外源蛋白表达能力大幅度提高的酿酒酵母表达系统。此等位基因敲除技术也可应用于其他种属酵母的等位基因敲除。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种等位基因的敲除方法，根据等位基因的基因序列，设计40～500bp左右的同源引物，分三步敲除三个等位基因，同时引入长片段的目的基因；具体包括以下步骤：

1)、扩增欲插入到酵母染色体中等位基因位点的目的基因片段和抗性基因片段并按顺序分步克隆到同一个载体中；

2)、设计一对同源引物a，以步骤1)中的重组载体为模板扩增得到等位基因敲除片段A；

3)、将步骤2)中得到的基因片段A转化酵母，用抗性作为筛选，得到抗性转化子；

4)、鉴定转化子：挑取步骤3)中的转化子进行等位基因、插入的目的基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出目的基因准确插入到等位基因位点的正确转化子；

5)、诱导步骤4)得到的正确转化子丢失抗性表达盒，得到第一个等位基因缺失且此等位基因位点处插入目的基因的重组酵母Y1；

6)、根据等位基因编码区中距离终止子400～500bp左右区域的基因序列设计引物，扩增此400～500bp左右的基因片段，同时扩增抗性基因片段，体外连接两个片段；

7)、设计一对同源引物b，以步骤6)中的连接片段为模板扩增得到等位基因敲除片段B；

8)、将步骤7)中得到的基因片段B转化步骤5)中得到的酵母Y1，用抗性作为筛选，得到抗性转化子；

9)、将步骤8)所得抗性转化子进行鉴定：挑取转化子进行等位基因、插入的目的基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出正确转化子；

10)、诱导步骤9)所得的正确转化子丢失抗性表达盒，得到两个等位基因缺失且一个等位基因位点处插入目的基因的重组酵母Y2；

11)、根据等位基因编码区中距离起始密码子300～400bp左右区域的基因序列设计引物，扩增此300～400bp左右的基因片段，同时扩增抗性基因片段，体外连接两个片段；

12)、设计一对同源引物c，以步骤11)中的连接片段为模板扩增得到等位基因敲除片段C；

13)、将步骤12)中得到的基因片段C转化步骤10)中得到的酵母Y2，用抗性作为筛选，得到抗性转化子；

14)、将步骤13)所得抗性转化子进行鉴定：挑取转化子进行等位基因、插入的目的基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出正确转化子；

15)、诱导步骤14)所得的正确转化子丢失抗性表达盒，得到三个等位基因被敲除且一个等位基因位点处插入目的基因的重组目的酵母Y3。

作为本发明的等位基因的敲除方法的改进：还包括步骤16)：将带有GAL1启动子的外源基因表达框架的表达载体转入步骤15)中得到的重组酵母Y3，用半乳糖进行诱导，测定半乳糖的消耗量和Y3表达的外源蛋白的表达水平。

作为本发明的等位基因的敲除方法的进一步改进：步骤2)中的同源引物a为45bp左右，由以下两部分组成：和等位基因上下游两端序列同源的部分(25bp左右)以及和目的基因上下游两端序列同源的部分(20bp左右)；

步骤7)中的一对同源引物b的上游引物(45bp左右)由以下两部分组成：和等位基因上游序列同源的部分(25bp左右)以及和抗性基因上游序列同源的部分(20bp左右)；同源引物b的下游引物(20bp左右)为：和步骤6)中的等位基因编码区中距离终止子400～500bp区域的基因序列下游同源；

步骤12)中的一对同源引物c的上游引物(20bp左右)为和步骤11)中的等位基因编码区中距离起始密码子300～400bp区域的基因序列上游同源，且起始密码子由ATG变成ATC；同源引物c的下游引物(45bp左右)由以下两部分组成：和等位基因下游序列同源的部分(25bp左右)以及和抗性基因下游序列同源的部分(20bp左右)。

作为本发明的等位基因的敲除方法的进一步改进：使用同源引物b扩增所得的等位基因敲除片段B和等位基因拥有400～500bp同源区。

作为本发明的等位基因的敲除方法的进一步改进：使用同源引物c扩增所得的等位基因敲除片段C和等位基因拥有300～400bp同源区。

作为本发明的等位基因的敲除方法的进一步改进：所敲除的等位基因是GAL1，插入的目的基因是GAL4，抗性基因是G418抗性。

作为本发明的等位基因的敲除方法的进一步改进：步骤16)中的外源基因为任意基因。

本发明还同时提供了采用本发明的方法于步骤15)所得到的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏名称为：S.C GQ21-14，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年9月6日，保藏号：CGMCC NO.3263。

作为本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的改进：GAL1基因被完全敲除，其中一个GAL1位点被插入了GAL4的基因。

本发明还同时提供了上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的用途：在发酵过程中大幅度提高GAL1启动子控制下的外源蛋白的表达水平，同时发酵过程中半乳糖的浓度维持不变。

本发明采用上述等位基因敲除技术获得了GAL1等位基因全部缺失、且插入一个GAL4基因的重组酵母S.C GQ21-14(酿酒酵母CGMCC NO.3263)，此酵母无法利用半乳糖，且表达外源蛋白的能力大幅度提高。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是一个GAL1等位基因缺失且具备双GAL4基因的酵母转化子Y1的PCR鉴定，250bp Marker。

图2是二个GAL1等位基因缺失且具备双GAL4基因的酵母转化子Y2的PCR鉴定(1：V1/K3；2：V1/K2-2)，250bp Marker。

图3是三个GAL1等位基因缺失且具备双GAL4基因的酵母转化子S.C GQ21-14的PCR鉴定(对照为MS-1，1：V1/K3；2；GAL1-S2/GAL1-AS1；3，4：V1/K4；5；GAL1-S2/GAL1-AS1；6：V1/K4；7：V1/K3)，250bp Marker。

图4是S.C GQ21-14分泌表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶活测定。

图5是HPLC测定S.C GQ21-14和MS-1在YPGL培养基中消耗的半乳糖含量。

具体实施方式

下面通过S.C GQ21-14高效表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的例子，来具体描述本发明的等位基因敲除技术和重组菌株的构建以及用途。

实施例1、等位基因敲除技术构建重组菌株S.C GQ21-14：

(一)第一个GAL1等位基因的敲除和GAL4基因的引入

1.基因扩增：分别以工业三倍体酿酒酵母MS-1基因组和质粒pUG6为模板PCR扩增GAL4基因(SGD登陆号：YPL248C，引物GAL4-S3/AS3)片段和KanMX抗性表达盒(引物PUG6-S1/AS1)片段。

GAL4-S3：TGC/AAGCTT/AAGCTACTGTCTTCTATCGA (HindIII)

GAL4-AS3：TCG/GGATCC/TTACTCTTTTTTTGGGTTTGG (BamHI)

PUG6-S1：GTC/GGATCC/CGTACGCTGCAGGTCGAC (BamHI)

PUG6-AS1：GTC/GGTACC/CCACTAGTGGATCTGATATC (KpnI)

高保真酶扩增基因片段的PCR反应体系和条件：

HSTaq 0.5μl

5×PCR Buffer(Mg²⁺Plus) 10μl

dNTP Mixture(各2.5mM) 4μl

模板 1-10ng

引物1 1μl

引物2 1μl

加灭菌超纯水至 50μl

PCR反应条件(根据片段大小不同略有差异)：

2.载体构建：将步骤1中所得的GAL4基因与PMD18-T载体相连，得到质粒PMD18-TG4；用BamHI和KpnI分别双切PMD18-TG4和步骤1中所得的KanMX抗性表达盒，连接并转化大肠杆菌DH5α，最后得到质粒PMD18-TGK，大小为6.9kb左右。具体如下：

(1)DNA的酶切：

根据内切酶使用说明书上的建议，分别配制反应体系：

BamHI 1μl

KpnI 1μl

最适10×Buffer 2μl

DNA(PMD18-TG4或KanMX) 1μg

去离子水

加灭菌双蒸水至 20μl

最适反应温度酶切3-4小时，凝胶回收。

(2)DNA的连接

将(1)中凝胶回收后的载体∶片断＝1∶8的比例(体积比，也即PMD18-TG4：KanMX)配制反应体系，加2μl 10×T4ligase buffer、1μl T4DNA ligase，加灭菌超纯水至体积为20μl。4℃连接过夜。

(3)大肠杆菌感受态细胞制备和转化

a.感受态细胞的制备：

(i)将-20℃甘油保存的E.coli DH5α划线接种于无抗LB固体培养基上，37℃培养过夜。

(ii)挑单菌落接种于5ml LB液体培养基，37℃振荡培养过夜；

(iii)取50μl步骤(ii)得到的发酵液(1％的接种量)接种于5ml LB液体培养基，37℃振荡培养2-3h至OD600为0.35-0.40；

(iv)将步骤(iii)中的菌液分装于1.5ml灭菌离心管中，置冰上20min后，4℃3200rpm离心10min；

(v)弃上清，加预冷的500μl TSS悬浮细胞，6500rpm离心5min；

(vi)弃上清，加预冷的100μl TSS悬浮细胞，即为感受态细胞；

b.转化：

(i)100μl感受态细胞中加入上述步骤(2)的DNA连接产物(5-10μl)，轻轻混匀，置冰上30min；

(ii)在离心管中加入无抗生素的LB液体培养基1ml，混匀后37℃振荡培养1h；

(iii)离心，弃上清，用200μl灭菌水重悬菌体后涂布于含100μg/ml氨卞青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12-16h后挑斑鉴定。

(4)质粒的提取

①取1-2ml步骤(iii)中挑出的单斑接种后过夜培养的LB培养液，12000g离心1min，弃尽上清，得到菌体沉淀。

②用250μl已加入RNAaseA的BufferS1悬浮步骤①中的细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小菌块。

③加入250μl BufferS2，温和并充分地上下翻转混合4-6次均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮溶液。此步骤不宜超过5min。

④加入350μl BufferS3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000g离心10min。

⑤吸取以上步骤的离心上清液并转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，12000g离心1min，弃滤液。

⑥将制备管置回离心管，加500μl BufferW1，12000g离心1min，弃滤液。

⑦将制备管置回离心管，加700μl BufferW2，12000g离心1min，弃滤液。重复此步骤。

⑧将带有制备管的离心管在离心机中12000g空转1分钟；

⑨取出制备管，置于新的1.5ml离心管中，室温下晾干数分钟直至酒精完全挥发；

⑩在DNA制备膜正中央加50μl洗脱液，室温静置1min，12000g离心1min。所得质粒PMD18-TGK(此质粒为步骤2一系列构建所得)，大小为6.9kb左右，-20℃保存。

3.以步骤2所得的质粒PMD18-TGK为模板，设计引物GAL4-S2/KanMX-AS1扩增GAL4+KanMX框架，所得PCR产物两端分别带有与GAL1基因同源序列47bp，产物大小为4357bp(片段A)，引物序列如下：

上游引物GAL4-S2：

GTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGAAGCTACTGTCTTCTATCGA SEQ ID NO：1

下游引物KanMX-AS1：

GAAAAAAATGAGAAGTTGTTCTGAACAAAGTAAAAAAAAGAAGTATACCCACTAGTGGATCTGATATC SEQ ID NO：2

高保真酶扩增基因片段的PCR反应体系和条件如下：

HSTaq 0.5μl

5×PCR Buffer(Mg²⁺Plus) 10μl

dNTP Mixture(各2.5mM) 4μl

模板 1-10ng

引物1 1μl

引物2 1μl

加灭菌超纯水至 50μl

PCR反应条件：

乙醇沉淀PCR产物，溶于5μl无菌水中。该PCR产物大小为4357bp的片段A。

4.将步骤3中的片段A电击入MS-1酵母感受态细胞内，在含200μg/ml G418的YPD平板上筛选转化子。

酵母感受态细胞制备：

a)从冰箱保存的酵母斜面培养物中划线接种于YPD平板上，活化培养1天，挑取单个酵母菌落，接种于5mlYEPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养过夜。

b)取100μl菌液接种于含10ml YEPD培养基的三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养8-10h至OD₆₀₀1.3-1.5。

c)分装菌液到灭菌的2ml离心管中，冰上放置15min。

d)5500rpm 4℃离心5min收集细胞。去离子水洗涤1-2次。

e)弃上清，每管用320μl灭菌超纯水重悬，加40μl 10×TE以及40μl 10×LiAc，混匀，30℃85rpm振荡45min；加20μl DTT至终浓度为25mM，30℃85rpm振荡15min。5500rpm 4℃离心5min收集细胞。

f)用1ml预冷过的灭菌超纯水重悬细胞沉淀，5500rpm 4℃离心5min收集细胞。

g)重复步骤f两次。

h)1ml预冷过的1M D-山梨醇重悬细胞沉淀，5500rpm 4℃离心5min。

i)100μl预冷过的1M D-山梨醇重悬细胞沉淀，轻轻旋转混匀，置于冰上。

酵母电转化

a)取40μl酵母感受态菌，与5μl步骤3中的片段A混合，移入0.2cm电转化杯，冰浴5min。

b)擦干水滴，置电转仪上，电击转化。条件为：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；时间5msec。

c)立即加入1ml冰浴的YEPD培养基，将混合物转到1.5ml EP管中。

d)30℃振荡2h，其间每隔30min轻轻颠倒混匀一次。

e)5500rpm室温离心5min，弃上清，用灭菌超纯水洗涤一次；

f)5500rpm室温离心5min，用200μl灭菌超纯水悬浮细胞；

g)菌液涂布于含G418(200μg/ml)或Zeocin(150μg/ml)的YPD培养板，30℃倒置培养培养2-3天左右。

5.鉴定转化子。

将YPD平板上长出的大菌落复点于YPD/G418平板上，30℃培养3天后使用引物V1/K3对长出的200个单菌落进行PCR鉴定。V1位于GAL1基因上游346bp处，K3位于GAL4基因内部608bp处，V1/K3引物可以鉴定GAL4基因是否已经被正确重组到酵母染色体GAL1基因位点上。V1/K3扩增得到的PCR产物大小为954bp(图1)。引物序列如下：

V1：GCACTGCTCCGAACAATAAA SEQ ID NO：3

K3：AAGAGAGAACCGTCGCCAAA SEQ ID NO：4

6.半乳糖诱导丢失KanMX抗性表达盒

将质粒pSH/ZEO电转化重组双GAL4酿酒酵母，涂于含150μg/ml Zeocin的YPD平板上，30℃培养3天。随机挑取100多个转化子于YPG液体培养基中180rpm/min震荡培养2-3小时诱导Cre重组酶的表达，然后将菌液稀释涂布于无抗生素的YPD平板培养2-3天，随机挑取生长出的100个单菌落分别对应点于含G418(200μg/ml)和无抗YPD平板，并做好标记。在G418平板上不能生长而正常平板上能生长的初步认定为Kan^r丢失的菌株，基因型为GAL1/gal1::GAL4。通过传代培养去除质粒pSH/ZEO，得到重组酵母Y1。

(二)第二个GAL1等位基因的敲除

7.分别以工业酿酒酵母MS-1基因组和质粒pUG6为模板扩增含有部分GAL1基因序列的GAL1_S片段(引物为GAL1-S1/AS1)和KanMX抗性表达盒(引物同步骤1)，并进行体外连接，得到连接片段。具体实施同步骤2，但酶切位点改为KpnI。

GAL1-S1：GCC/GGTACC/TCCAGTGAGATTTCAAGTC (KpnI)

GAL1-AS1：GGC/GAATTC/GCTGGTTTAGAGACGATGA (EcoRI)

8.设计第二轮同源引物，以步骤7中的连接片段为模板扩增，得到片段B，引物如下，扩增条件具体同步骤3。

pug6KanMX-S1：

GTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGCGTACGCTGCAGGTCGAC

GAL1-AS1：GGC/GAATTC/GCTGGTTTAGAGACGATGA

9.将步骤8中的片段B电击入步骤6中得到的重组酵母Y1的感受态细胞内，在含200μg/ml G418的YPD平板上筛选转化子。具体实施同步骤4。

10.鉴定转化子。

将YPD平板上长出的大菌落复点于YPD/G418平板上，30℃培养3天后使用引物V1/K3、V1/K2-2对长出的单菌落进行PCR鉴定，以保证双GAL4基因的存在以及KanMX表达盒对第二个GAL1基因的正确取代(图2)。引物序列如下：

V1：GCACTGCTCCGAACAATAAA SEQ ID NO：5

K3：AAGAGAGAACCGTCGCCAAA SEQ ID NO：6

K2-2：ATCATTGGCAACGCTACCTT SEQ ID NO：7

11.半乳糖诱导丢失KanMX抗性表达盒。具体实施同步骤6，最后得到一株具有双GAL4基因型、染色体中仅剩一个GAL1等位基因拷贝的重组酵母Y2。

(三)第三个GAL1等位基因的敲除

12.分别以工业酿酒酵母MS-1基因组和质粒pUG6为模板扩增含有部分GAL1基因序列的GAL1t片段(引物为GAL1-S2/AS2)和KanMX抗性表达盒(引物同步骤1)，并进行体外连接，得到连接片段。具体实施同步骤2，但酶切位点改为KpnI。

GAL1-S2：TGC/AAGCTT/ATCACTAAATCTCATTCAG (HindIII)

GAL1-AS2：GTC/GGATCC/ACATAAGAACCGTCCAAC (BamHI)

13.设计第三轮同源引物，以步骤12中的连接片段为模板扩增，得到片段C，引物如下，扩增条件具体同步骤3。

GAL1-S2：TGC/AAGCTT/ATCACTAAATCTCATTCAG

KanMX-AS1：

GAAAAAAATGAGAAGTTGTTCTGAACAAAGTAAAAAAAAGAAGTATACCCACTAGTGGATCTGATATC

14.将步骤13中的片段C电击入步骤11中得到的重组酵母Y2的感受态细胞内，在含200μg/ml G418的YPD平板上筛选转化子。具体实施同步骤4。

15.鉴定转化子。

将步骤14中YPD平板上长出的大菌落复点于YPD/G418平板上，30℃培养3天后使用引物V1/K3、V1/K4和GAL1-S2/GAL1-AS1对长出的单菌落进行PCR鉴定，以保证双GAL4基因的存在以及GAL1基因的全部缺失(图3)。引物序列如下：

V1：GCACTGCTCCGAACAATAAA SEQ ID NO：8

K3：AAGAGAGAACCGTCGCCAAA SEQ ID NO：9

K4：CATCTCGTCAGTTGGCA SEQ ID NO：10

16.半乳糖诱导丢失KanMX抗性表达盒。具体实施同步骤6，最后得到一株具有双GAL4基因型且GAL1等位基因全部被敲除的重组酵母S.C GQ21-14。

该重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S.C GQ21-14，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年9月6日，保藏号：CGMCC NO.3263。

实施例2、重组菌株S.C GQ21-14表达外源蛋白β-1，3-1，4-葡聚糖酶：

1.将带有GAL1启动子指导下的β-1，3-1，4-葡聚糖酶表达框架的载体(可购自浙江大学)转入S.C GQ21-14，转化步骤同上述实施例1的步骤4，筛选转化子。

双层平板法：a，下层：YPG(甘油)平板；b，上层：诱导培养基，含0.1％地衣多糖和2％半乳糖以及0.5％琼脂。

将步骤1中筛选出的酵母菌落编号保存后转接于到YP+甘油平板，30℃培养24h，然后在生长平板上缓慢倒入5ml半乳糖诱导培养基，30℃放置12h-20h后，用0.1％的刚果红溶液染色。30min后出现透明圈的即为β-1，3-1，4-葡聚糖酶已经表达的阳性转化子。

2.测定S.C GQ21-14的β-1，3-1，4-葡聚糖酶表达量：

(1)将在平板上产生较大透明圈的酵母菌株编号保存，同时转接于YPD培养基中活化培养24h，然后按1％接种量转接于30ml YPGL培养基中培养24h，加入3ml过滤除菌的20％半乳糖溶液至终浓度为2％，定时取样测培养基上清液酶活。

(2)β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活测定，以GAL系统没有改造的酵母(MS-1)作为对照；具体如下：

①溶剂配制：

0.5％β-葡聚糖母液配制：准确称取0.05gβ-葡聚糖加热溶解于10ml灭菌超纯水，定容，保存于4℃。

100μg/ml β-葡聚糖溶液：准确吸取2ml 0.5％β-葡聚糖溶液定容于100ml灭菌超纯水。

100μg/ml刚果红溶液：称取0.1g刚果红溶于1L 0.05M醋酸钠缓冲液。

②β-葡聚糖标准曲线制作：

取5组试管，分别加入l00μg/mlβ-葡聚糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，每支试管用蒸馏水稀释到1.0ml，并做3次平行。各试管中分别加入100μg/ml的刚果红溶液1.0ml，旋涡振荡摇匀。20℃下准确作用10min，用1.0cm的比色杯于OD₅₄₀波长下测定吸光值。空白对照为1ml蒸馏水加1ml刚果红溶液，以空白对照调零。

③酶活测定：

0.6ml大麦β-葡聚糖溶液(100μg/ml)50℃预热10min，加入适当稀释的酶液，醋酸钠缓冲液补足到1ml，50℃反应10min。将反应体系煮沸灭活10min，冷却至室温。加1ml刚果红溶液(100μg/ml)，旋涡振荡混匀后20℃反应10min，测OD₅₄₀(Wood et al.1988；Rensburg et al.1997)。

酶单位定义为：在50℃，pH 6.0条件下，每分钟水解lμgβ-葡聚糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。

酶活测定结果如图4所示，MS-1的最高酶活为846.37U/ml，S.C GQ21-14的最高酶活为3991.00U/ml，是MS-1的4.72倍。

实施例3、重组菌株S.C GQ21-14对半乳糖的利用：

采用高效液相色谱法制作半乳糖标准曲线和测定YPGL培养基中半乳糖的含量。

色谱条件为：Waters Sugar PAK-I column(6.5mm×300mm)HPLC柱，流动相：0.1mMCa-EDTA的高纯水溶液，柱温：90℃，流速：0.25ml/min，样品的进样量：10ul，Waters2410RI监测器。测定结果如图5所示。半乳糖加入20h后MS-1已经将其消耗完毕，而S.C GQ21-14的YPGL培养基中的半乳糖浓度则一直维持不变。

以上试验说明：本发明的等位基因敲除技术确实可以精确定位敲除多倍体酵母染色体中的多个等位基因，且准确的将其他基因插入所需位点，待敲除的等位基因的序列可达2kb，插入的基因长度可达2.5kb。此等位基因敲除技术也可应用于其他种属酵母的等位基因敲除。

以上试验还说明，本发明的构建的重组酵母S.C GQ21-14具有如下特性：该酵母在发酵过程中，可以大幅度提高GAL1启动子控制下的外源蛋白的表达水平，同时发酵过程中半乳糖的浓度维持不变，从而在提高外源蛋白生产能力的同时大幅度降低生产成本、提高经济效益。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种等位基因的敲除方法，其特征在于：根据等位基因的基因序列，设计40～500bp的同源引物，分三步敲除三个等位基因，同时引入长片段的目的基因；具体包括以下步骤：

6)、根据等位基因编码区中距离终止子400～500bp区域的基因序列设计引物，扩增此400～500bp的基因片段，同时扩增抗性基因片段，体外连接两个片段；

11)、根据等位基因编码区中距离起始密码子300～400bp区域的基因序列设计引物，扩增此300～400bp的基因片段，同时扩增抗性基因片段，体外连接两个片段；

2.根据权利要求1所述的一种等位基因的敲除方法，其特征在于还包括步骤16)：将带有GAL1启动子的外源基因表达框架的表达载体转入步骤15)中得到的重组酵母Y3，用半乳糖进行诱导，测定半乳糖的消耗量和Y3表达的外源蛋白的表达水平。

3.根据权利要求1或2所述的一种等位基因的敲除方法，其特征在于：

步骤2)中的同源引物a为45bp，由以下两部分组成：和等位基因上下游两端序列同源的部分(25bp)以及和目的基因上下游两端序列同源的部分(20bp)；

步骤7)中的一对同源引物b的上游引物(45bp)由以下两部分组成：和等位基因上游序列同源的部分(25bp)以及利抗性基因上游序列同源的部分(20bp)；同源引物b的下游引物(20bp)为：和步骤6)中的等位基因编码区中距离终止子400～500bp区域的基因序列下游同源；

步骤12)中的一对同源引物c的上游引物(20bp)为和步骤11)中的等位基因编码区中距离起始密码子300～400bp区域的基因序列上游同源，且起始密码子由ATG变成ATC；同源引物c的下游引物(45bp)由以下两部分组成：和等位基因下游序列同源的部分(25bp)以及和抗性基因下游序列同源的部分(20bp)。

4.根据权利要求3所述的一种等位基因的敲除方法，其特征在于：使用同源引物b扩增所得的等位基因敲除片段B和等位基因拥有400～500bp同源区。

5.根据权利要求4所述的一种等位基因的敲除方法，其特征在于：使用同源引物c扩增所得的等位基因敲除片段C和等位基因拥有300～400bp同源区。

6.根据权利要求5所述的一种等位基因的敲除方法，其特征在于：所敲除的等位基因是GAL1，插入的目的基因是GAL4，抗性基因是G418抗性。

7.根据权利要求6所述的一种等位基因的敲除方法，其特征是：步骤16)中的外源基因为任意基因。

8.一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于：保藏名称为：S.C GQ21-14，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年9月6日，保藏号：CGMCC NO.3263。

9.根据权利要求8所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于：GAL1基因被完全敲除，其中一个GAL1位点被插入了GAL4的基因。

10.如权利要求8或9所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的用途，其特征是：在发酵过程中提高GAL1启动子控制下的外源蛋白的表达水平，同时发酵过程中半乳糖的浓度维持不变。