CN114891823A - 一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法 - Google Patents

一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因敲除技术领域，并提供一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，先进行酵母基因序列的构建，构建好的酵母基因序列扩增为用于酵母转化的基因组件，在扩增过程中进行酵母的转化，酵母转化，在扩增的基因组件上实现对A基因的敲除，酵母筛选标记基因敲除完成。该用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法以构建到pBridge载体上的X(MCSII位点)、Y(MCSI位点)基因为诱饵，筛选酵母三杂交某物种文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7‑X‑Y相互作用的蛋白，该实验方法能够快速高效的确定所需的蛋白，且实验过程清楚易操作，从而大大推进了筛选与pBridge‑X‑Y相互作用蛋白技术领域的发展。

Description

一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法
技术领域
本发明涉及基因敲除领域，具体为一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法。
背景技术
基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术，它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能为此现提出一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术，它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法，这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命，尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值，基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，由以下具体技术手段所达成：
本发明为实现技术目的采用如下技术方案：一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，其特征在于：具体步骤为：
S100、选定酵母基因组序列；
S101、构建用于酵母转化的基因组件；
S102、实现对A基因的敲除；
所述酵母基因序列包含有ATG原始密码子与TGA终止密码子。
优选的，所述用于酵母转化的基因组件先扩增为三个片段，然后三个片段进行重组成BO等初始载体，重组后的BO等初始载体再次转化阳性菌，其中提质粒为PCR模板，重组扩增重组组件用于酵母转化。
优选的，所述酵母转化具体包含以下步骤：
S200、从接种在YPD斜面上的S.s挑取单菌落；
S201、接种单菌落至50mLYPD培养基的500mL三角瓶中，25℃，200rpm，培养过夜至OD600值在1.0-1.5之间；
S202、吸取培养液按5％接种量接种至50mLYPD培养基的500mL三角瓶中，25℃，200rpm，培养至OD600值在0.8-1.0之间；4500rpm，离心5min，收集菌体；
S203、将菌体与新鲜配制的8mL酵母细胞感受态母液轻轻混匀后，室温放置30min，每10min轻轻摇匀一次；
S204、4500rpm，离心5min，收集菌体；
S205、用2mL的预冷的1M山梨醇重悬，然后于4℃条件下，4000rpm，离心5min，收集菌体，重复三次；
S206、然后用200-250μL预冷的1M山梨醇重悬，分装至1.5mL离心管中，每管60-80μL；
S207、冰上预冷0.2cm电击杯，打开电击仪，调整参数：电压1.5KV/mm，时间5ms；
S208、向感受态细胞中加入10ug DNA片段，轻柔吸打混匀后转移至电击杯中，电击结束后立即加入1mL预冷的1M山梨醇，吸打混匀后转移至离心管中，25℃孵育1h；
S209、室温下800g离心3min，用200μL 1M山梨醇重悬，涂布于含NTC的YPD平板，25℃倒置培养3-7天。
优选的，所述基因敲除方法的具体步骤如下：
S300、先进行酵母基因序列的构建；
S301、构建好的酵母基因序列扩增为用于酵母转化的基因组件；
S302、在扩增过程中进行酵母的转化，酵母转化；
S303、在扩增的基因组件上实现对A基因的敲除；
S304、酵母筛选标记基因敲除完成。
有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，具备以下有益效果：
1、该用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，先将质粒转化受体菌Y2HGold中及其自激活检测，然后进行文库筛选与酵母阳性克隆鉴定及测序比对，之后测序比对结果，最后进行酵母阳性克隆回转验证，得到回转验证结果，该用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法以构建到pBridge载体上的X(MCSII位点)、Y(MCSI位点)基因为诱饵，筛选酵母三杂交某物种文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7-X-Y相互作用的蛋白，该实验方法能够快速高效的确定所需的蛋白，且实验过程清楚易操作，从而大大推进了筛选与pBridge-X-Y相互作用蛋白技术领域的发展。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，包含有材料的准备，所述材料的准备包含有诱惑克隆、诱惑载体、文库酵母质粒、Clontech酵母三杂交系统、培养基；具体实验筛选步骤如下：
S100、将质粒转化受体菌Y2H Gold中及其自激活检测；
S101、文库筛选；
S102、酵母阳性克隆鉴定及测序比对；
S103、测序比对结果；
S104、酵母阳性克隆回转验证；
S105、回转验证结果。
具体的，所述诱饵克隆为pBridge-X-Y，所述诱饵载体为pBridge，所述文库酵母质粒为pGADT7-某物种cDNA；所述培养基为酵母完全培养基与酵母缺陷型筛选培养基。
具体的，所述将质粒转化受体菌Y2H Gold中及其自激活检测包含有酵母转化、酵母转化方法于自激活验证，所述酵母转化是将表1的质粒分别转入Y2HGold酵母中。
具体的，根据上述的一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，所述酵母转化方法包含以下步骤：
S200、从YPDA平板挑取Y2H Gold单菌落接种于YPDA液体培养基4ml，30℃，225rpm，振荡培养18-20h(过夜)，至OD600>1.5；
S201、转接YPDA液体培养基，培养体积为50ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4-5h，至OD600＝0.6-0.8；
S202、离心收菌，室温，4000rpm，5min，用20ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
S203、用5ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用500ul 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul(每个转化)，备用；
S204、用500ul 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul(每个转化)，备用；
S205、每个1.5ml离心管中依次加入表格2的试剂中，用枪头吹打混匀，剧烈振荡1min左右，至完全混匀；
S206、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏，30min；
S207、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
S208、每个转化用200ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板；
S209、30℃恒温培养4天。
具体的，所述自激活验证是随机挑取8个点用pBridge的载体引物进行PCR验证，全部为正确克隆，随机抽取了三个克隆点板至SD-T、SD-TH、SD-THA、SD-THA+X-α-gal板上，30℃培养3-5d。其中pBridge-Y为阴性对照。
具体的，根据上述的一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，所述文库筛选是用含有pBridge-X-Y诱饵质粒的Y2H Gold酵母菌株作为受体菌制备感受态，将文库质粒pGADT7-某物种cDNA转入其中，涂SD-TLH，SD-TLH+10mM3AT，SD-TLHM，SD-TLHM+10mM 3AT筛选平板；所述文库筛选包含有文库DNA转化方法与文库筛库结果。
具体的，所述文库DNA转化方法具体步骤如下：
S300、从SD-T平板挑取单菌种接于液体SD-T培养基50ml，30℃，225rpm，振荡培养24h；
S301、转接于YPDA液体500ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4-5h，至OD600＝0.6；
S302、转接于YPDA液体500ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4-5h，至OD600＝0.6；
S303、离心收菌，室温，4000rpm，5min，用30ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用20ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用10ml 0.1MLiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；
S304、向离心管中依次加入表3中试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀；
S305、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏1h；
S306、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用6ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20ul培养物稀释后涂SD-TL平板，用于检测文库转化效率。其余涂SD-TLH，SD-TLH+10mM 3AT，SD-TLHM，SD-TLHM+10mM3AT平板各5块；
S307、30℃恒温培养3-7天，观察菌落生长；
S308、挑取长出的克隆单菌落，转接到SD-TLH+10mM 3AT和SD-TLHM+10mM3AT筛选平板中继续培养3-5天。
具体的，所述酵母阳性克隆鉴定及测序比对是为了鉴定SD-TLH+10mM3AT和SD-TLHM+10mM 3AT平板中筛选到的阳性克隆分别是什么基因，需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行DNA测序，并与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析。
具体的，所述酵母阳性克隆回转验证的回转验证结构筛选得到的30个酵母阳性克隆，都能在SD-TL缺陷型平板上正常生长；其中部分克隆在SD-TLH+10mM 3AT平板上不能生长，而在SD-TLHM+10mM 3AT平板上能正常生长，表明X促进互作用。
文中提及表格如下：
Figure BDA0003573349820000071
表1
Figure BDA0003573349820000072
表2
Figure BDA0003573349820000073
表3
该用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，先将质粒转化受体菌Y2HGold中及其自激活检测，然后进行文库筛选与酵母阳性克隆鉴定及测序比对，之后测序比对结果，最后进行酵母阳性克隆回转验证，得到回转验证结果，该用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法以构建到pBridge载体上的X(MCSII位点)、Y(MCSI位点)基因为诱饵，筛选酵母三杂交某物种文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7-X-Y相互作用的蛋白，该实验方法能够快速高效的确定所需的蛋白，且实验过程清楚易操作，从而大大推进了筛选与pBridge-X-Y相互作用蛋白技术领域的发展。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，其特征在于：具体步骤为：
S100、选定酵母基因组序列；
S101、构建用于酵母转化的基因组件；
S102、实现对A基因的敲除；
所述酵母基因序列包含有ATG原始密码子与TGA终止密码子。
2.根据权利要求1所述的一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，其特征在于：所述用于酵母转化的基因组件先扩增为三个片段，然后三个片段进行重组成BO等初始载体，重组后的BO等初始载体再次转化阳性菌，其中提质粒为PCR模板，重组扩增重组组件用于酵母转化。
3.根据权利要求1所述的一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，其特征在于：所述酵母转化具体包含以下步骤：
S200、从接种在YPD斜面上的S.s挑取单菌落；
S201、接种单菌落至50mLYPD培养基的500mL三角瓶中，25℃，200rpm，培养过夜至OD600值在1.0-1.5之间；
S202、吸取培养液按5％接种量接种至50mLYPD培养基的500mL三角瓶中，25℃，200rpm，培养至OD600值在0.8-1.0之间；4500rpm，离心5min，收集菌体；
S203、将菌体与新鲜配制的8mL酵母细胞感受态母液轻轻混匀后，室温放置30min，每10min轻轻摇匀一次；
S204、4500rpm，离心5min，收集菌体；
S205、用2mL的预冷的1M山梨醇重悬，然后于4℃条件下，4000rpm，离心5min，收集菌体，重复三次；
S206、然后用200-250μL预冷的1M山梨醇重悬，分装至1.5mL离心管中，每管60-80μL；
S207、冰上预冷0.2cm电击杯，打开电击仪，调整参数：电压1.5KV/mm，时间5ms；
S208、向感受态细胞中加入10ug DNA片段，轻柔吸打混匀后转移至电击杯中，电击结束后立即加入1mL预冷的1M山梨醇，吸打混匀后转移至离心管中，25℃孵育1h；
S209、室温下800g离心3min，用200μL 1M山梨醇重悬，涂布于含NTC的YPD平板，25℃倒置培养3-7天。
4.根据权利要求1-3所述的一种用于发酵酵母的筛选标记基因敲除方法，其特征在于：所述基因敲除方法的具体步骤如下：
S300、先进行酵母基因序列的构建；
S301、构建好的酵母基因序列扩增为用于酵母转化的基因组件；
S302、在扩增过程中进行酵母的转化，酵母转化；
S303、在扩增的基因组件上实现对A基因的敲除；
S304、酵母筛选标记基因敲除完成。
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