CN107955816B - 一种双通道蛋白表达的工程酵母的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种双通道蛋白表达的工程酵母的构建方法。构建得到一种基因工程酵母质粒载体，该质粒载体携带两个表达外源基因的启动子GAL10和GAL1，其中一个启动子GAL10能够将外源蛋白定位至酵母表面；另外一个启动子GAL1控制的基因的蛋白表达于酵母的细胞质内。本发明的工程酵母能够将两种不同的蛋白通过不同的蛋白表达通道输送到酵母表面或者定位于细胞质内，酵母表面的蛋白可以用于蛋白功能研究，胞内荧光强度指示酵母数量而达到的高效、简便、经济的目的以及用于胞内蛋白研究。

Description

一种双通道蛋白表达的工程酵母的构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，本发明构建得到一种酵母质粒载体，该载体携带两个表达外源基因的启动子GAL10和GAL1，其中启动子GAL10表达的基因与酵母凝集素小亚基融合，由于凝集素小亚基将与定位在酵母表面的凝集素大亚基共价结合，因此将携带外源蛋白一起定位至酵母表面；另外一个启动子GAL1控制的基因，其蛋白表达于酵母的细胞质内。本发明的工程酵母能够将两种不同的蛋白通过不同的蛋白表达通道输送到酵母表面或者定位于细胞质内。
背景技术
酵母表面展示(简称YSD)是将外源蛋白表达于酵母体内并通过酵母表面凝集素将其携带至细胞表面的一种技术(Boder,et al.,1997.)。a型凝集素大亚基Aga1共价连接于酵母表面β-葡聚糖，而小亚基Aga2又与Aga1之间形成两对二硫键。据此，Boder和Wittup等将Aga1蛋白整合到酵母基因组，并用一个质粒载体以Gal1启动子表达Aga2和外源基因的融合蛋白。因此外源基因便以融合蛋白的形式随Aga2转移到酵母表面。由于融合蛋白被共价地展示于细胞表面，可以方便地用外源蛋白的受体或抗体，或置于外源蛋白前或者后的寡肽的通用抗体来检测蛋白的表达，借助常用的流式细胞仪，可快速定量检测外源蛋白与受体间的亲和力。YSD的这些特点，使其能够非常适用于文库筛选，增强蛋白稳定性和表达量，以及定位蛋白功能结构域等。YSD尤其对于无需构建大容量文库的蛋白定向进化非常有效，如利用该技术使蛋白亲和力提高了二十万倍(Jin,M.et al.,2006)。
酵母表面双杂交系统(YS2H)，是通过分泌途径来分析蛋白互作的一个平台，这种系统是在酵母表面展示系统的基础上发展起来的，优点在于无需蛋白表达纯化，在酵母体内同时表达这两个蛋白并最终展示于酵母表面。在YSD基础上酵母表面展示一个外源蛋白X，另一个蛋白Y则以分泌的形式表达，如果X能结合Y，那么Y则可以与X一起附于酵母表面，利用Y或与Y融合的寡肽的抗体来检测他们的亲和性，并且X和Y之间的亲和性可以通过流式细胞仪定量(Hu,.et al.,2009)。这种技术有几个特点：①将Gall和Gall0启动子的联用。②建立利用酵母蛋白分泌途径的蛋白-蛋白相互作用体系。③本系统无需蛋白纯化即可进行蛋白的定向进化以及文库受体筛选。
炎症相关的蛋白——淋巴功能相关抗原-1蛋白(LFA-1)和细胞间黏连蛋白分子1(ICAM-1)在机体炎症信号中扮演重要角色。在没有炎症时，LFA-1结构为野生型(Wt)，ICAM-1不与其结合。但当炎症发生时，LFA-1的蛋白结构发生构象变化，成为高亲和性结构(HA)，此时与ICAM-1能紧密结合，传导炎症信号(Luo，1997)。LFA-1包含两个结构复杂的α和β亚基蛋白；其中α亚基的插入结构域(I domain)负责与ICAM-1结合，且自身也存在构象变化，即与ICAM-1结合前后从Wt到HA状态。为了方便研究，科学家通过各种途径找到了LFA-1插入结构域的高亲和性(HA)突变体(Jin，2006；Hu，2010)。小鼠是常用试验动物，小鼠LFA-1与人源蛋白之间高度相似，但是彼此间不能简单互换。因此申请人利用已经发表的方法(Hu X,Kang S,Lefort C,et al.Combinatorial libraries against libraries for selectingneoepitope activation-specific antibodies[J].Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2010,107(14):6252-6257；Hu X,Kang S,Chen X,et al.Yeastsurface two-hybrid for quantitative in vivo detection of protein-proteininteractions via the secretory pathway[J].Journal of Biological Chemistry,2009,284(24):16369-16376.)，在YSD基础上设计了酵母表面双杂交(YS2H)系统，是无需蛋白表达纯化的新型蛋白互作系统，使酵母同时表达两个蛋白并最终展示于酵母表面。酵母表面展示一个外源蛋白(X)，另一蛋白(Y)则以分泌形式表达，如果X与Y结合，那么Y则与X一起运输至酵母表面，利用Y或者与Y融合的寡肽的抗体检测其亲和性，进行文库受体筛选得到一种小鼠LFA-1蛋白αL亚基I domain的高亲和性突变体(F292S/T208I、F292S/F277L/F267G)以及相对于野生型(Wt)更不亲合的突变体(F292S/F277L)。同时我们在酵母表面双杂交(YS2H)系统基础上进行改进，把YS2H载体的启动子GAL1后面的分泌信号肽去掉，使其蛋白表达于酵母的细胞质内。
本发明可应用于生物学、医学、药学、农学、畜牧兽医学、水产学、食品科学等与分子生物学相关的蛋白质功能分析和研究领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，构建一种酵母质粒载体，该载体携带两个表达外源基因的启动子GAL10和GAL1，启动子GAL10将外源蛋白定位在酵母表面，GAL1将外源蛋白定位在酵母细胞内。本发明中工程酵母能够将两种不同的蛋白通过不同的蛋白表达通道输送到酵母表面或者定位于细胞质内，可以应用于蛋白质功能分析和研究。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案
一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，包括以下步骤：
(1)双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体的构建：在启动子GAL10的后面依次连接分泌信号肽SS、α-半乳糖苷酶Aga2基因、小鼠LFA-1αL I domain胞外域和Flag标签，使小鼠LFA-1αL I domain胞外域、Flag标签和的α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域，能够展示于酵母细胞EBY100的表面；在启动子GAL1的后面依次连接GFP荧光蛋白基因和Myc标签，使其能够在酵母细胞的胞内表达GFP绿色荧光蛋白，用于指示酵母数量，得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-muαL I d-wGFP；因小鼠LFA-1αL I domain胞外域基因片段有四个，分别为wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G，所以得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-muαL Id-wGFP有四个，分别为pDV3-intre-muαLIdwt-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/T208I-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L/F267G-wGFP。所述的启动子GAL10的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的分泌信号肽SS的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述的α-半乳糖苷酶Aga2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；小鼠LFA-1αL I domain胞外域为四个，wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；所述的Flag标签的核苷酸序列如SEQ IDNO：16所示；所述的启动子GAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，GFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；所述的双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-muαL I d-wGFP有四个，分别为pDV3-intre-muαL Idwt-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/T208I-wGFP、pDV3-intre-muαL IdF292S/F277L-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L/F267G–wGFP，其分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。
(2)双通道蛋白表达工程酵母载体的验证：将步骤(1)所述的质粒载体pDV3-intre-muαL I d-wGFP以PEG/LiAc方法转入酵母细胞EBY100中，得到重组酵母细胞，培养该重组酵母细胞并诱导所述重组载体的表达，得到所述表面展示有目标蛋白的酵母细胞后，通过流式细胞仪检测小鼠LFA-1αL I domain和GFP荧光蛋白是否表达。
本发明的具体技术方案如下所述：
1、双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体构建，按以下步骤：
(1)在YS2H载体启动子GAL1之后的ECORI和BamHI酶切位点间插入wGFP基因，构建得到载体pDV3-intre-wGFP；在上述载体基础上，在NcoI和SalI酶切位点间插入小鼠LFA-1αL I domain胞外域基因(wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G)，得到四个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-muαL I d-wGFP，分别为pDV3-intre-muαLIdwt-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/T208I-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L/F267G-wGFP；wt从自有载体扩增；F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G以PCR引物定点突变构建，将所得载体进行测序验证；。
2、所述的双通道蛋白表达工程酵母的载体的验证，按以下步骤：
将构建得到的编码wGFP和小鼠LFA-1αL I domain基因的重组表达载体质粒(pDV3-intre-muαL I domain-wGFP)通过PEG/LiAc方法转入酵母细胞EBY100中，得到重组酵母细胞；将重组酵母细胞涂在SDCAA固体培养板上，于30℃培养48h-60h后长出单克隆酵母，挑取单克隆酵母细胞先用2ml SDCAA液体培养基在30℃摇床中培养24h后，然后离心，再用2ml的SGCAA培养基在30℃摇床中培养24h诱导蛋白的表达，得到表达目标蛋白的酵母细胞；取3uμl酵母细胞用100ul缓冲液A(配方：PH＝7.4PBS+0.5％BSA+1mM MgCl2)洗涤一遍,然后用20μl冰浴冷却的含有小鼠抗flag抗体的缓冲液A标记，并在30℃温育30min，用100μl缓冲液ApH 7.4洗涤一遍，用20μll冰浴冷却的含有藻红蛋白标记的山羊抗小鼠IgG抗体的缓冲液A标记一抗，在4℃孵育10min，用100μl缓冲液A洗涤一遍；洗涤后，将酵母细胞重悬在200μl的缓冲液A(pH 7.4)中并用流式细胞仪检测小鼠LFA-1αL I domain和GFP荧光蛋白是否表达。；
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明涉及的wGFP序列。序列长度为699bp。
序列表SEQ ID NO：2是本发明涉及的小鼠LFA-1aL I domain WT序列。序列长度为573bp。
序列表SEQ ID NO：3是本发明涉及的小鼠LFA-1aL I domain F292S/T208I序列。序列长度为561bp。
序列表SEQ ID NO：4是本发明涉及的小鼠LFA-1aL I domain F292S/F277L序列。序列长度为573bp。
序列表SEQ ID NO：5是本发明涉及的小鼠LFA-1aL I domain F292S/F277L/F267G序列。序列长度为573bp。
序列表SEQ ID NO：6是本发明涉及的启动子Gal10序列。序列长度为9bp。
序列表SEQ ID NO：7是本发明涉及的启动子Gal1序列。序列长度为9bp。
序列表SEQ ID NO：8是本发明涉及的分泌信号肽序列。序列长度为54bp。
序列表SEQ ID NO：9是本发明涉及的α半乳糖苷酶Aga2基因序列。序列长度为207bp。
序列表SEQ ID NO：10是本发明涉及的信号肽序列。序列长度为267bp。
序列表SEQ ID NO：11是本发明涉及的载体pDV3-intre-wGFP序列。序列长度为7143bp。
序列表SEQ ID NO：12是本发明涉及的载体pDV3-intra-muαL Id WT-wGFP序列。序列长度为7716bp。
序列表SEQ ID NO：13是本发明涉及的载体pDV3-intra-muαL Id F292S/T208I-wGFP序列。序列长度为7704bp。
序列表SEQ ID NO：14是本发明涉及的载体pDV3-intra-muαL Id F292S/F277L-wGFP序列。序列长度为7716bp。
序列表SEQ ID NO：15是本发明涉及的载体pDV3-intra-muαL Id F292S/F277L/F267G
-wGFP的序列。序列长度为7716bp。
序列表SEQ ID NO：16是本发明涉及的Flag标签序列序列。序列长度为24bp。
序列表SEQ ID NO：17是本发明涉及的Myc标签标签序列。序列长度为30bp。
图1：本发明的技术路线图。
图2：本发明的双通道蛋白表达工程酵母构建示意图。附图标记说明：
图2中的A图是本发明的工程酵母的载体pDV3-intra-muαL Id-wGFP构建图；图2中的B图是工程酵母双向启动子蛋白表达结构图(图2中的B图的上图)与I doma i通过胞外分泌途径而转运至细胞表面以及GFP细胞质表达的示意图(图2中的B图的下图)。
图3：本发明所用的载体和所构建载体示意图。附图标记说明：图3中的A图是载体pCTCON-wGFP结构示意图；图3中的B图是载体YS2H结构示意图；图3中的C图是载体pCTCON-muαL Id WT结构示意图；图3中的D图是载体pCTCON-muαL Id F292S/T208I结构示意图；图3中的E图是载体pCTCON-muαL Id F292S结构示意图；图3中的F图是载体pDV3-intre-wGFP结构示意图；图3中的G图是载体pDV3-intra-muαL Id WT-wGFP结构示意图；图3中的H图是载体pDV3-intra-muαL Id F292S/T208I-wGFP结构示意图；图3中的L图是载体pDV3-intra-muαL Id F292S/F277L-wGFP结构示意图；图3中的J图是载体pDV3-intra-muαL Id F292S/F277L/F267G-wGFP结构示意图。
图4：双通道蛋白表达酵母GFP与I domain蛋白表达量的流式细胞检测结果图谱。附图标记说明：
图4中的A图是pDV3-intra-muαL Id wt–wGFP载体酵母的GFP蛋白表达；图4中的B图是pDV3-intra-muαL Id F292S/T208I–wGFP载体酵母的GFP蛋白表达；图4中的C图是pDV3-intra-muαL Id F292S/F277L–wGFP载体酵母的GFP蛋白表达；图4中的D图是pDV3-intra-muαL Id F292S/F277L/F267G–wGFP载体酵母的GFP蛋白表达；图4中的E图是pDV3-intra-muαL Id wt–wGFP载体酵母的I domain蛋白表达；图4中的F图是pDV3-intra-muαLId F292S/T208I–wGFP载体酵母的I domain蛋白表达；图4中的G图是pDV3-intra-muαL IdF292S/F277L–wGFP载体酵母的I domain蛋白表达；图4中的H图是pDV3-intra-muαL IdF292S/F277L/F267G–wGFP载体酵母的I domain蛋白表达。
将构建好的各载体转入酵母后，经诱导蛋白表达后，用流式细胞仪分析，携带GFP的各个酵母菌株的荧光强度(图4中灰色阴影部分表示)以及以免疫标记Flag标签指示的各酵母I domain表达量(图4中灰色阴影部分表示)，图中黑线表示对照细胞，数值为高于对照细胞的百分比。
具体实施方式
通过下述实施例有助于进一步理解本发明，并描述了本发明在双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体构建，以及验证双通道蛋白是否表达的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，使其适应不同的用途和条件。
实施例1：双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体构建
参见图2：以自有的质粒pCTCON-wGFP为模板，用带酶切位点接头的引物wGFP(5，－ATCGAATTCTACTTCATACATTTTCAAATTAAGATGGCTAGCGTGAGCAAGGGCGAGGAG－3，，序列特异引物外加ECORI位点)和wGFP(5，－GTTCGGATCCAGTGATCCCGGCGGCGTTC－3，，序列特异引物外加BamHI位点)扩增出wGFP片段(720bp)。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，54℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。将所扩增的wGFP基因PCR产物插入YS2H载体启动子GAL1之后的ECORI和BamHI酶切位点之间，筛选阳性克隆并测序，获得基因wGFP，我们将这个质粒命名为pDV3-intra-wGFP。
在上述pDV3-intra-wGFP载体构建的基础上，申请人在NcoI和SalI酶切位点间插入小鼠LFA-1αL I domain基因。。WT和F292S/T208I都是通过用带酶切位点接头的引物WT(5，－AGTCCCATGGTGTCAGGTCCTGTCTGTTTG－3，，序列特异引物外加NcoI位点)和WT(5，－GGGTGTCGACAAAGTCGATCTGGTGTTTCTGTTC－3，，序列特异引物外加SalI位点)从自有的质粒pCTCON-muαL Id wt和pCTCON-muαL Id F292S/T208I分别扩增出WT片段(573bp，见序列表SEQ ID NO：2)和F292S/T208I片段(561bp，序列表SEQ ID NO：3))。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，54℃30sec，72℃45sec，35个循环；72℃延伸10min。将扩增的获得的PCR产物分别连接pDV3-intra-wGFP载体，通过常规的筛选阳性克隆并测序，分别获得基因WT(序列表SEQ ID NO：2)和F292S/T208I(序列表SEQ ID NO：3)，该质粒分别命名为pDV3-intra-muαL Id WT-wGFP(见序列表SEQ ID NO：12)、pDV3-intra-muαL Id F292S/T208I-wGFP(见序列表SEQ ID NO：13)。
F292S/F277L基因，以PCR引物(F292S/F277L①、F292S/F277L②、F292S/F277L③、F292S/F277L④)定点突变构建，以质粒pCTCON-muαL Id F292S为模板，通过引物F292S/F277L①(5，－AGTCCCATGGTGTCAGGTCCTGTCTGTTTG－3，，序列特异引物外加NcoI位点)和F292S/F277L②(5，－ACGCTCCACATACTTGCCTCAGAACCTGTAG－3，)、F292S/F277L③(5，－GAGGCAAGTATGTGGAGCGTCTTTTG－3，)和F292S/F277L④(5，－GGGTGTCGACAAAGTCGATCTGGTGTTTCTGTTC－3，，序列特异引物外加SalI位点)分别扩增出目的片段F292S/F277L PCR①和F292S/F277L PCR②。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃延伸10min。然后以F292S/F277L PCR①和F292S/F277L PCR②为模板，通过引物F292S/F277L①(5，－AGTCCCATGGTGTCAGGTCCTGTCTGTTTG－3，，序列特异引物外加NcoI位点)和F292S/F277L④(5，－GGGTGTCGACAAAGTCGATCTGGTGTTTCTGTTC－3，，序列特异引物外加SalI位点)扩增出F292S/F277L目的片段序列(见序列表SEQ ID NO：4，长度为573bp)。
PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，35个循环；72℃延伸10min。将扩增的获得的PCR产物连接pDV3-intra-wGFP载体，筛选阳性克隆并测序，分别获得F292S/F277L基因(序列表SEQ ID NO：4)。申请人将该该质粒命名为pDV3-intra-muαL Id F292S/F277L-wGFP。
F292S/F277L/F267G基因：以PCR引物(F292S/F277L/F267G①、F292S/F277L/F267G②、F292S/F277L/F267G③、F292S/F277L/F267G④)定点突变构建：具体步骤为，以pDV3-intra-muαL Id F292S/F277L-wGFP质粒为模板，通过引物F292S/F277L/F267G①(5，－AGTCCCATGGTGTCAGGTCCTGTCTGTTTG－3，，序列特异引物外加NcoI位点)和F292S/F277L/F267G②(5，－GCATTTTGTGGGCGTACAAAAGCAAAAGACG－3，)、F292S/F277L/F267G③(5，－TTTGTACGCCCACAAAATGCTTGCCAATC－3，)和F292S/F277L/F267G④(5，－GGGTGTCGACAAAGTCGATCTGGTGTTTCTGTTC－3，，序列特异引物外加SalI位点)分别扩增出目的片段F292S/F277L/F267G PCR①和F292S/F277L/F267G PCR②。
PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃延伸10min。然后以F292S/F277L/F267G PCR①和F292S/F277L/F267G PCR②为模板，通过引物F292S/F277L/F267G①(5，－AGTCCCATGGTGTCAGGTCCTGTCTGTTTG－3，，序列特异引物外加NcoI位点)和F292S/F277L/F267G④(5，－GGGTGTCGACAAAGTCGATCTGGTGTTTCTGTTC－3，，序列特异引物外加SalI位点)扩增出F292S/F277L/F267G目的片段(573bp)。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，35个循环；72℃延伸10min。将扩增的获得的PCR产物连接pDV3-intra-wGFP载体，筛选阳性克隆并测序，分别获得小鼠F292S/F277L/F267G基因(序列表见SEQ ID NO：5)，申请人将该质粒名为pDV3-intra-muαL IdF292S/F277L/F267G-wGFP(序列表见SEQ ID NO：15)。
实施例2：双通道蛋白表达工程酵母载体的导入酵母及诱导蛋白的表达
将上述编码wGFP和LFA-1αL I domain基因(序列见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、3、4、5)的重组表达载体载体质粒以经典PEG/LiAc方法(Ito H,Fukuda Y,Murata K,etal.Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations[J].Journal of bacteriology,1983,153(1):163-168.)转入酵母细胞EBY100中，得到重组酵母细胞，培养该重组酵母细胞并诱导所述重组载体的表达(具体步骤按照：Hu X,Kang S,Chen X,et al.Yeast surface two-hybrid for quantitative in vivo detection ofprotein-protein interactions via the secretory pathway[J].Journal ofBiological Chemistry,2009,284(24):16369-16376报道的方法)，得到所述表达有目标蛋白的酵母细胞。
具体步骤如下：
(1)将5μl酵母EBY100感受态细胞中加入20-100g pDV3-intra-muαL Id-wGFP质粒，然后加入50μl E23Solution溶液(购自美国Zymo Research公司)彻底混均；
(2)在30℃培养箱中孵育45min，在孵育期间，震荡混均2-3次；
(3)将上述所述的混合物涂在SDCAA固体培养板上，在30℃培养箱中培养48-60h。
(4)试管中加入2ml SDCAA培养基，接种在SDCAA培养板上长出来的单克隆酵母细胞，于30℃摇床中震荡培养24h后，离心，弃上清，加入2ml SGCAA培养基在30℃摇床中震荡培养24h诱导蛋白表达。
实施例3：双通道蛋白表达工程酵母蛋白表达验证
重组酵母经诱导后可通过流式细胞仪分别检查I domain以及GFP的表达。Idomain表达量以Flag标签蛋白为对象，用流式细胞仪进行检测。具体步骤如下：
(1)吸3ul表达有wGFP和LFA-1αL I domain蛋白的酵母细胞加入96孔V型板中，取未表达蛋白的酵母做阴性对照，向每个孔中加100μl标记缓冲液A PH＝7.4(配方：PBS+0.5％BSA+10mM MgCl2)，混匀后离心(4℃,3min，3000rpm)使细胞沉淀，去上清。吸净缓冲液A，每孔加20μl含10μg/ml的一抗即小鼠抗flag抗体(美国santa cruz biotechnology，圣克鲁斯生物技术公司)缓冲液A，30℃振荡孵育30min。
(2)加入100μl缓冲液A洗涤酵母细胞，离心(4℃,3min，3000rpm)吸弃上清，然后加入20μl含二抗即山羊藻红蛋白共轭抗鼠抗体(美国santa cruz biotechnology，圣克鲁斯生物技术公司))的缓冲液A于4℃孵育15min。
(3)加入100μl标记缓冲液A洗涤酵母细胞，离心(4℃,3min，3000rpm)吸弃上清，然后将酵母细胞用200μl缓冲液A重悬后即可用流式细胞仪检测(图4)。
本发明所用试剂的英文缩写如下：
LFA-1(Lymphocyte function-associated molecule，淋巴细胞功能相关分子-1)PBS(phosphate buffer，磷酸盐缓冲液)；
BSA(Bovine serum albumin，牛血清白蛋白)；
wt为小鼠LFA-1αL I domain基因的野生型；
F292S/T208I为小鼠LFA-1αL I domain基因的高亲和突变体F292S/T208I；
F292S/F277L为小鼠LFA-1αL I domain基因的不亲和突变体F292S/F277L；
F292S/F277L/F267G为小鼠LFA-1αL I domain基因的不亲和突变体F292S/F277L/F267G。
本发明主要溶液配方及其配制方法：
1)缓冲液A的配制：磷酸盐缓冲液PBS+0.5％牛血清白蛋白+1mM MgCl2；
2)pH＝7.4磷酸盐缓冲液(1X1L)配制：
Figure BDA0001131577340000071
将以上成分逐一溶解，加dd H2O至1L。
3)SDCAA固体培养基(1X1L)的配制：
A液：
Figure BDA0001131577340000072
将以上成分逐一溶解，加dd H2O至500ml，然后在121℃(100kPa)下高压湿热灭菌30min；
B液
葡萄糖 20g；
difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate(美国BD公司，Becton,Dickinson and Company) 6.7g；
bacto casamino acids(美国BD公司(Becton,Dickinson and Company)) 5g；
将以上试剂逐一溶解，加dd H2O至500ml，然后用孔径为0.22um的水系滤膜过滤灭菌；将A液和B液加在一起混均。
3)SDCAA液体培养基(1X1L)配制：
A液：
十二水合磷酸氢二钠 13.6g；
二水合磷酸二氢钠 9.68g；
将以上成分逐一溶解，加dd H2O至500ml，然后在121℃(100kPa)下高压湿热灭菌30min。
葡萄糖 20g
difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate(美国BD公司，Becton,Dickinson and Company) 6.7g；
bacto casamino acids(美国BD公司，Becton,Dickinson and Company)， 5g；
将以上试剂逐一溶解，加dd H2O至500ml，然后用孔径为0.22um的水系滤膜过滤灭菌；将A液和B液加在一起混均。
4)SGCAA液体培养基(1X1L)配制：
十二水合磷酸氢二钠 13.6g；
二水合磷酸二氢钠 9.68g；
以上成分逐一溶解，加dd H2O至500ml，然后121℃(100kPa)高压湿热灭菌30min。
半乳糖 20g；
difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate(美国BD公司，Becton,Dickinson and Company)， 6.7g；
bacto casamino acids(美国BD公司，Becton,Dickinson and Company)， 5g；
将以上成分逐一溶解，加dd H2O至500ml，然后用孔径为0.22um的水系滤膜过滤灭菌；将A液和B液加在一起混均。
主要参考文献：
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Figure IDA0001131577410000011
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Figure IDA0001131577410000201

Claims (1)

1.一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体的构建：在启动子GAL10的后面依次连接分泌信号肽SS、α-半乳糖苷酶Aga2基因、小鼠LFA-1 αL I domain胞外域和Flag标签，使小鼠LFA-1 αL I domain 胞外域、Flag标签和的α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域，能够展示于酵母细胞EBY100的表面；在启动子GAL1的后面依次连接wGFP荧光蛋白基因和Myc标签，使其能够在酵母细胞的胞内表达wGFP绿色荧光蛋白，用于指示酵母数量，得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-mu αL I d-wGFP；分离小鼠LFA-1 αL I domain胞外域基因片段四个，分别为wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G，得到四个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-muαL Id-wGFP，分别为pDV3-intre-muαLIdwt-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/T208I -wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L/F267G –wGFP；所述的启动子GAL10的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的分泌信号肽SS的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述的α-半乳糖苷酶Aga2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；小鼠LFA-1 αL I domain胞外域为四个，所述的wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G的核苷酸序列分别如SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；所述的Flag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；所述的启动子GAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，wGFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；所述的双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-mu αL I d-wGFP为四个，分别为pDV3-intre-muαL Idwt-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/T208I -wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L -wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L/F267G –wGFP，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：12、 SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：14 和SEQ ID NO：15所示；
（2）双通道蛋白表达工程酵母载体的验证：将步骤（1）所述的质粒载体pDV3-intre-muαL I d-wGFP以PEG/LiAc 方法转入酵母细胞EBY100中，得到重组酵母细胞，培养该重组酵母细胞并诱导所述重组载体的表达，得到表面展示有目标蛋白的酵母细胞后，通过流式细胞仪检测小鼠LFA-1 αL I domain和wGFP荧光蛋白是否表达。
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