JP2024050720A - 受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法及びキット - Google Patents
受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法及びキット Download PDFInfo
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Abstract
【課題】受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法を提供する。【解決手段】方法は、特異的遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団を提供し、十分な時間、組換え毒素融合体と細胞の集団を接触させ、細胞の選択プールに含まれる核酸分子のうちの1以上の配列を決定することにより、細胞の選択プール内のタンパク質を同定し、それにより標的遺伝子を同定することを含む。毒素耐性細胞株、毒素生成細胞株、組換え毒素融合体、それらを生成するプローブ及び方法、並びにそれらのキットも提供される。【選択図】図1
Description
関連出願
本出願は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2018年5月30日出願の米国仮特許出願第62/677,875号の優先権を主張するものである。
本出願は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2018年5月30日出願の米国仮特許出願第62/677,875号の優先権を主張するものである。
分野
本開示は、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法、プローブ、組換え細胞株、組換え毒素融合体、及びキットに関する。
本開示は、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法、プローブ、組換え細胞株、組換え毒素融合体、及びキットに関する。
背景
細胞は、セクレトームとして集合的に知られている数千のタンパク質を分泌する。ホルモン、成長因子、及び他の自己分泌/パラ分泌シグナル伝達因子を含むこれらのタンパク質は、発達、成長制御、及び組織恒常性に重要な役割を果たす。細胞間シグナル伝達の破壊は、発達障害、癌、及び免疫障害に因果的に関与している。分泌された又別の方法で放出されたシグナル伝達因子は、標的細胞の表面でそれらの特異的(同族)受容体に結合するとすぐに、特異的シグナル伝達カスケードを開始する。そのため、リガンド/受容体相互作用の同定は、基本的な生物医学研究と治療の両方に広範囲に影響する。例えば、現在、外来診療所の薬物の70%が細胞表面受容体を標的としており、癌及び炎症性疾患における抗体治療薬の成功により、受容体標的薬剤の非常に高い治療可能性がさらに強調されている。したがって、分泌タンパク質をそれらの同族の細胞表面受容体に結合させることは、細胞間コミュニケーションの根底にある基本的なシグナル伝達機構を理解し、新規の治療薬を開発する際の重要な工程である。
細胞は、セクレトームとして集合的に知られている数千のタンパク質を分泌する。ホルモン、成長因子、及び他の自己分泌/パラ分泌シグナル伝達因子を含むこれらのタンパク質は、発達、成長制御、及び組織恒常性に重要な役割を果たす。細胞間シグナル伝達の破壊は、発達障害、癌、及び免疫障害に因果的に関与している。分泌された又別の方法で放出されたシグナル伝達因子は、標的細胞の表面でそれらの特異的(同族)受容体に結合するとすぐに、特異的シグナル伝達カスケードを開始する。そのため、リガンド/受容体相互作用の同定は、基本的な生物医学研究と治療の両方に広範囲に影響する。例えば、現在、外来診療所の薬物の70%が細胞表面受容体を標的としており、癌及び炎症性疾患における抗体治療薬の成功により、受容体標的薬剤の非常に高い治療可能性がさらに強調されている。したがって、分泌タンパク質をそれらの同族の細胞表面受容体に結合させることは、細胞間コミュニケーションの根底にある基本的なシグナル伝達機構を理解し、新規の治療薬を開発する際の重要な工程である。
しかしながら、推定3,000個の分泌タンパク質を2,500個の細胞表面タンパク質に連結することは、依然として厄介な作業である。現代のタンパク質-タンパク質相互作用アッセイは、可溶性細胞内タンパク質間の相互作用を特徴付けるのに非常に成功しているが、偏りのない方法で受容体/リガンド相互作用を研究するための容易に拡張可能な方法はない。いくつかの既存のハイスループットアッセイ、結合活性に基づく細胞外相互作用スクリーニング(AVEXIS)の1つは、多量体化された受容体の細胞外ドメインを利用して、プレート上に固定した推定リガンドについてスクリーニングする。その結果、このアッセイは、複数の膜貫通受容体(GPCRなど)又はマルチサブユニット受容体に適合しない。さらに、観察された受容体-リガンド相互作用は、試験されたインビトロ条件に特異的であり、インビボでは当てはまらない可能性がある。最後に、該アッセイは、アッセイで試験された全てのタンパク質のクローニング、発現及び精製に依存し、これは、細胞外タンパク質に対して特に困難である。そのため、リガンド/受容体の対の同定は困難であり、その結果、既知の膜貫通受容体及び可溶性リガンドの実質的な画分は、オーファンのままである。これらの障害物は、細胞外シグナル伝達機構の基本的な理解と治療関連の研究の両方を著しく遅くする。
本発明者らは、細胞外タンパク質の受容体を同定する方法を開発した。この方法は、既存のアッセイの1以上の制限を克服する。本明細書に記載の方法及び組成物は、細菌外毒素などの毒素を利用する。細菌外毒素などの毒素は、例えば、分泌タンパク質と融合させた場合、受容体依存的に細胞を中毒にさせることができ、これにより、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)/Cas9ベースの陽性選択スクリーニングなどのゲノムワイド選択スクリーニングにより同族受容体の同定を容易にする。いくつかの実施形態では、受容体に加えて、本発明の方法は、他の因子、例えば、受容体の新生、成熟、又は輸送に関与する遺伝子などの受容体表面発現及び機能付与に必要な因子、リガンド及び/又は受容体エンドサイトーシスに関与する因子、並びに毒素活性に必要な中毒因子を同定することもできる。
したがって、本開示の態様は、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法であって、
(a)標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団であって、
該集団の個々の操作した細胞は標的化ライブラリーの核酸分子を含有し、該核酸分子は標的遺伝子に相補的な核酸配列を含む、細胞の集団を提供する工程;
(b)細胞の集団を、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて転位ドメインを含む組換え毒素融合体と十分な時間接触させることにより、細胞の選択プールを生成する工程;並びに
(c)細胞の選択プールの1以上の細胞に含まれる標的化ライブラリーの核酸分子の1以上の配列を決定し、1以上の細胞中の標的遺伝子であって、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質をコードする標的遺伝子を同定する工程、
を含む方法を含む。
(a)標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団であって、
該集団の個々の操作した細胞は標的化ライブラリーの核酸分子を含有し、該核酸分子は標的遺伝子に相補的な核酸配列を含む、細胞の集団を提供する工程;
(b)細胞の集団を、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて転位ドメインを含む組換え毒素融合体と十分な時間接触させることにより、細胞の選択プールを生成する工程;並びに
(c)細胞の選択プールの1以上の細胞に含まれる標的化ライブラリーの核酸分子の1以上の配列を決定し、1以上の細胞中の標的遺伝子であって、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質をコードする標的遺伝子を同定する工程、
を含む方法を含む。
一実施形態では、標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団を毒素と接触させる。例えば、これを対照として用いることができる。
一実施形態では、標的遺伝子に相補的な核酸配列を含む核酸分子は、gRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA、好ましくはgRNAを含むか、又はそれらである。
一実施形態では、gRNAはCRISPR-Casシステムの一部である。
別の実施形態では、CRISPR-CasシステムはCas9を含む。
一実施形態では、CRISPR-Casシステムは、Cpf1を含む。
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、哺乳動物ライブラリー、好ましくは、ヒト又はマウスのライブラリーである。
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、全ゲノムライブラリーである。
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体、好ましくはGタンパク質結合受容体(GPCR)を標的とする核酸分子を含む。
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体介在経路のタンパク質をコードする遺伝子を標的とする核酸分子を含む。
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、受容体成熟因子遺伝子を標的とする核酸分子を含む。
別の実施形態では、細胞集団は、哺乳動物細胞株、好ましくは、ヒト又はマウスの細胞株からの細胞を含む。
別の実施形態では、哺乳動物細胞株は、A431、A549、HCT116、K562、HeLa、好ましくは、HeLa-京都、又はHEK-293、好ましくは、HEK-293T、又は一倍体若しくはほぼ一倍体の細胞株、好ましくは、HAP1である。
別の実施形態では、標的化ライブラリーは、少なくとも1つのレトロウイルスベクター、好ましくは、少なくとも1つのレンチウイルスベクターで細胞に形質導入される。
別の実施形態では、毒素又は毒素ドメインは、ジフテリア毒素(DTA)、シュードモナス外毒素A(PE)、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン(bouganin)、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む。
別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。
別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。
一実施形態では、受容体結合分子は成長因子であるか、又はそれを含む。一実施形態では、成長因子は、表皮成長因子(EGF)、プレイオトロフィン(PTN)、又は線維芽細胞成長因子(FGF)である。一実施形態では、受容体結合分子は、サイトカインであるか、又はそれを含む。一実施形態では、サイトカインはケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド9(CXCL9)である。一実施形態では、受容結合分子は、リソソーム酵素であるか、又はそれを含む。一実施形態では、リソソーム酵素は、N-アセチルグルコサミン-6-スルファターゼ(GNS)又はGM2ガングリオシド活性化因子(GM2A)である。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。
別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。
別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。
別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。
別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。
別の実施形態では、転位ドメインは、DTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。
いくつかの実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端にある。他の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のカルボキシル末端にある。
転位ドメインを含む他の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインに融合される。
別の実施形態では、細胞に投与されたときに、組換え毒素融合体は、非操作細胞(例えば、標的化ライブラリーを含まない細胞)の少なくとも99%を死滅させる。
一実施形態では、配列決定はハイスループット配列決定を含む。
別の態様は、毒素耐性細胞株を生成する方法であって、
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;及び
(b)毒素耐性細胞株を生成するのに十分な時間、細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる工程
を含む方法を含む。
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;及び
(b)毒素耐性細胞株を生成するのに十分な時間、細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる工程
を含む方法を含む。
一実施形態では、本方法は、ジフテリア毒素(DTA)耐性細胞株を生成する方法であって、
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、HBEGF、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;並びに
(b)DTA耐性細胞株を生成するのに十分な時間、DTAと細胞を接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMのDTAと接触させる工程、
を含む。
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、HBEGF、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;並びに
(b)DTA耐性細胞株を生成するのに十分な時間、DTAと細胞を接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMのDTAと接触させる工程、
を含む。
また、さらに別の態様で提供されるのは、シュードモナス外毒素A(PE)耐性細胞株を生成する方法であって、
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、FURIN、MESDC2、LRP1、LRP1B、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;及び
(b)PE耐性細胞株を生成するのに十分な時間、PEと細胞を接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMのPEと接触させる工程、
を含む方法である。
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、FURIN、MESDC2、LRP1、LRP1B、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;及び
(b)PE耐性細胞株を生成するのに十分な時間、PEと細胞を接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMのPEと接触させる工程、
を含む方法である。
また別の態様で提供されるのは、毒素生成細胞株を生成する方法であって、
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;
(b)十分な時間、細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる工程;並びに
(c)毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程(b)の細胞に導入し、発現させる工程、
を含む方法である。
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;
(b)十分な時間、細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる工程;並びに
(c)毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程(b)の細胞に導入し、発現させる工程、
を含む方法である。
また別の態様で提供されるのは、毒素を生成する方法であって、
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;
(b)十分な時間、細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる工程;
(c)毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程(b)の細胞に導入し、発現させる工程;
(d)培地中で細胞を成長させる工程;並びに
(e)毒素又は組換え毒素融合体を含有する培地を収集し、必要に応じて、毒素又は組換え毒素融合体を単離する工程、
を含む方法である。
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;
(b)十分な時間、細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる工程;
(c)毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程(b)の細胞に導入し、発現させる工程;
(d)培地中で細胞を成長させる工程;並びに
(e)毒素又は組換え毒素融合体を含有する培地を収集し、必要に応じて、毒素又は組換え毒素融合体を単離する工程、
を含む方法である。
また一態様で提供されるのは、毒素耐性細胞株であって、該細胞株の細胞の各々が、Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つ核酸分子を含み、発現させる毒素耐性細胞株である。
一実施形態では、該細胞株は、Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、HBEGF、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含むジフテリア毒素(DTA)耐性細胞株である。
一実施形態では、該細胞株は、シュードモナス外毒素A(PE)耐性細胞株であり、該細胞株の細胞の各々が、Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、FURIN、MESDC2、LRP1、LRP1B、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を含み、発現させる、シュードモナス外毒素A(PE)耐性細胞株である。
また一態様で提供されるのは、毒素生成細胞株であって、該細胞株の細胞の各々が、Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列と、毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を含む、毒素生成細胞株である。
また提供されるのは、組換え毒素融合体をコードし、それを発現することができる核酸配列を含む核酸分子であって、組換え毒素融合体が毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含み、毒素ドメインが組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、該結合ドメインが毒素ドメインの反対側の末端にあり、該結合ドメインが受容体結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む、核酸分子である。
また提供されるのは、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体であって、該毒素ドメインが組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、該結合ドメインが毒素ドメインの反対側の末端にあり、該結合ドメインが、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む、組換え毒素融合体である。
また提供されるのは、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのキットであって、
(a)第1の細胞株、
(b)組換え毒素融合体をコードし、該組換え毒素融合体又は少なくとも1つの組換え毒素融合体を発現させることができる核酸配列を含む少なくとも1つの核酸分子、並びに
(c)複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーであって、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー、
を含み、
第1の細胞株が該組換え毒素融合体に対して耐性があり、かつ
該組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む、キットである。
(a)第1の細胞株、
(b)組換え毒素融合体をコードし、該組換え毒素融合体又は少なくとも1つの組換え毒素融合体を発現させることができる核酸配列を含む少なくとも1つの核酸分子、並びに
(c)複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーであって、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー、
を含み、
第1の細胞株が該組換え毒素融合体に対して耐性があり、かつ
該組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む、キットである。
また提供されるのは、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのキットであって、
(a)第1の細胞株、
(b)毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む少なくとも1つの組換え毒素融合体、及び
必要に応じて、複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーであって、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー
を含む、キットである。
(a)第1の細胞株、
(b)毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む少なくとも1つの組換え毒素融合体、及び
必要に応じて、複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーであって、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー
を含む、キットである。
いくつかの実施形態では、該キットは、本明細書に記載の方法を実行するための説明書を含み、実行するためのものである。該キットは、本明細書に記載の1以上の構成要素を含むことができる。
また提供されるのは、組換え毒素融合体をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該組換え毒素融合体が毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含み、該毒素ドメインが該組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、該結合ドメインが該毒素ドメインの反対側の末端にあり、該結合ドメインが、受容体結合分子、ペプチド、抗体、若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含み、必要に応じて、該組換え毒素融合体は、さらに多量体化ドメインを含むポリペプチドである。一実施形態では、該組換え毒素融合体は複数の毒素ドメインを含む。一実施形態では、プローブは、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのものである。
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の実施形態を示す詳細な説明及び特定の実施例は、単なる例示として与えられており、特許請求の範囲は、実施例に記載された実施形態によって限定されるべきではないが、全体としての説明と一致する最も広い解釈が与えられるべきであることを理解すべきである。
本開示の実施形態を、これから図面を参照して説明する。
詳細な説明
A.定義
特に示さない限り、この節と他の節に記載される定義及び実施形態は、当業者に理解されるとおり、それらが適すると本明細書に記載される本開示の全ての実施形態及び態様に適用可能であることが意図される。
A.定義
特に示さない限り、この節と他の節に記載される定義及び実施形態は、当業者に理解されるとおり、それらが適すると本明細書に記載される本開示の全ての実施形態及び態様に適用可能であることが意図される。
本開示で使用されるように、単数形「1つ(a)」、「1つ(an)」及び「その」は、その内容が特に明確に指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「化合物」を含む実施形態が、ある種の態様を1種の化合物、又は2種以上のさらなる化合物を用いて提示されることを理解すべきである。
本開示の範囲を理解する際、本明細書で使用する用語「含む」及びその派生語は、記載される特徴、要素、構成要素、グループ、整数、及び/又は工程の存在を特定するオープンエンド用語であることが意図されるが、他の未記載の特徴、要素、構成要素、グループ、整数及び/又は工程の存在を除外するものではない。前述のものはまた、用語「含む」、「有する」及びそれらの派生語などの類似の意味を有する単語に適用される。本明細書で使用する用語「からなる」及びその派生語は、記載される特徴、要素、構成要素、グループ、整数、及び/又は工程の存在を特定するクローズド用語であることが意図されるが、他の未記載の特徴、要素、構成要素、グループ、整数及び/又は工程の存在を除外する。本明細書で使用する用語「から本質的になる」は、記載される特徴、要素、構成要素、グループ、整数、及び/又は工程の存在、並びに特徴、要素、構成要素、グループ、整数、及び/又は工程の基本的で、新規な特徴(複数可)に実質的に影響を及ぼさないものを特定することが意図される。
本明細書で使用する「実質的に」、「約」及び「およそ」などの程度の用語は、最終結果が著しく変更されないように、修飾される用語の妥当な量の偏差を意味する。この偏差が修飾する単語の意味を否定しない場合、これらの程度の用語は、修飾される用語の少なくとも±5%の偏差を含むものとして解釈されるべきである。
本明細書で使用する用語「核酸分子」又はその派生語は、修飾されていないDNA若しくはRNA又は修飾されたDNA若しくはRNAを含むことが意図され、かつcDNAを含む。例えば、核酸分子は、一本鎖及び二本鎖のDNA、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖及び二本鎖のRNA、並びに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖、より典型的には二本鎖、又は一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るDNA及びRNAを含むハイブリッド分子で構成することができる。加えて、核酸分子は、RNA又はDNA又はRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域で構成することができる。核酸分子はまた、安定性のために、又は他の理由で修飾される1以上の修飾された塩基又はDNA若しくはRNA骨格を含有してもよい。「修飾される」塩基には、例えば、トリチウム化塩基、及び天然に存在する塩基に結合するイノシンなどのまれな塩基が含まれる。DNA及びRNAに対して様々な修飾を行うことができる。そのため、「核酸分子」は、化学的、酵素的、又は代謝的に修飾された形態を包含する。用語「ポリヌクレオチド」は、対応する意味を有する。
核酸は、二本鎖又は一本鎖のいずれかであり得、センス鎖又はアンチセンス鎖を表す。用語「核酸」には、相補的な核酸配列及びコドン最適化されるか又は同義のコドン均等物が含まれる。
いくつかの実施形態では、表現「複数の核酸分子」は、細胞集団に導入される標的化ライブラリーに含まれる核酸分子を指すために使用される。
細胞に言及する時の用語「操作された」は、非天然の核酸分子を含有するように細胞が処理されたことを意味する。非天然の核酸分子は、当業者に公知のいくつかの方法で、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション、転位、及びエレクトロポレーションにより、細胞内に導入することができる。形質転換は、典型的には、当技術分野で公知の方法、例えば、細菌細胞に熱ショックを与えることによる細菌内への核酸分子の導入を指す。トランスフェクションは、核酸分子を真核細胞に導入する作業であり、例えば、脂質ベースの方法を含んでよい。転位は、トランスポゾン輸送機構によって使用される標的DNA配列を含むトランスポゾンの機構を含んでよい。エレクトロポレーション技術は、細胞に電界を印加して、細胞膜の透過性を増加させ、これにより、核酸分子が細胞内に導入されることを可能にする。形質導入は、ウイルス又はウイルスベクターによって核酸分子が細胞に導入される作業である。したがって、細胞内に核酸分子を導入する様々な方法により、「操作された」細胞を誘導することができる。
表現「受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質」は、受容体などのタンパク質及びリガンド自体、並びに細胞表面受容体介在経路及び受容体成熟因子に関与するタンパク質を包含する。例えば、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質は、受容体の新生、成熟、又は輸送に関与する遺伝子などの受容体の表面発現及び機能付与に必要な因子、並びにリガンド及び/又は受容体エンドサイトーシスに関与する因子を含む。受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質には、例えば、血漿膜、小胞体(ER)膜及び他の細胞内膜に局在化するタンパク質;エンドサイトーシス及び受容体成熟を調節する輸送因子;並びに細胞表面タンパク質又は任意のタンパク質の発現を調節する転写因子が含まれる。
用語「毒素」は、それらの起源及び生成方法を問わない、植物の、動物の、細菌、ウイルス、真菌、リケッチア若しくは原生動物を含むがこれらに限定されない微生物の、有毒な若しくは毒性の物質又は有毒な若しくは毒性の生成物、又は感染性物質、又は組換え分子若しくは合成分子を指し、バイオ技術の結果として操作され、生物によって生成される得る任意の有毒な物質若しくは生物学的生成物、又は任意の有毒な異性体若しくは生物学的生成物、そのような物質の相同体、若しくは誘導体を含む。毒素は、細胞に毒性を付与する毒素ドメインを有する。毒素は、以下に記載されるように、組換え毒素融合体を含む。本明細書で使用する毒素は、ピコモル効力で細胞を中毒にさせる。当業者なら、毒素が受容体媒介経路を介して成長阻害を引き起こし得る限り、本明細書に記載の受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法で使用できることを認識する。細胞が毒素と共に十分な時間インキュベートされたならば、25%で、又は10%ですら、成長阻害は十分であり得る。当業者は、インキュベーション時間と関連する毒性又はその逆を容易に調節することができる。また当業者なら、毒素と細胞をインキュベートするのに「十分な時間」、例えば、毒素とインキュベートされた非操作対照細胞が全て死滅し、gRNA処理細胞集団に生存者が存在する時を容易に認識することができる。
用語「組換え毒素融合体」は、結合ドメイン(例えば、リガンド)、毒素ドメイン、及び必要に応じて、標的結合及び細胞毒を可能にする任意の配向で融合された転位ドメインを有する融合分子を指す。本明細書に記載するように、毒素ドメインは、毒素の毒素ドメイン又はその毒性断片であり得る。本明細書で使用する組換え毒素融合体は、ピコモル効力で細胞を中毒にさせる。同様に、結合ドメインは、抗体、炭水化物、ペプチドなどの、本明細書に記載の特異性を有する細胞表面受容体などの細胞表面分子、又はそれらの結合断片に特異的に結合する分子であり得る。結合ドメインは、セクレトームのメンバー、例えば、受容体などの細胞表面実体に結合することができる分泌タンパク質又は分泌タンパク質の断片に由来し得る。結合ドメインはまた、細胞表面実体に結合することができる限り、膜タンパク質の切断産物又は細胞外ドメインに由来し得る。組換え毒素融合体は、融合体の多量体化を可能にする多量体ドメインをさらに含んでよい。
本明細書で使用する用語「受容体-リガンド相互作用」は、別の分子(例えば、「リガンド」)が特異的に結合することができる任意の細胞表面分子(例えば、「受容体」)を指す。例として、EGFR及びその同族リガンドEGFなどの従来の細胞表面受容体、並びに細胞シグナル伝達に影響を与えるか、かつ/又は細胞に入るように別の分子リガンドによって使用される細胞の細胞表面を包埋するか、そこから延在するか、又は他の方法で細胞表面上に曝される他の部分が含まれる。
本明細書で使用する用語「結合ドメイン」は、宿主細胞表面分子と相互作用し、細胞へのその侵入及び融合された積荷(すなわち、組換え毒素)の侵入を容易にする部分を意味し、例えば、同族受容体に結合するリガンド若しくはその結合断片などの受容体結合分子;受容体又は正に荷電したリン脂質に結合するペプチド若しくはその結合断片;細胞表面タンパク質に結合する抗体若しくはその結合断片;例えば、レクチンに結合する炭水化物;例えば、細胞表面タンパク質と相互作用する小分子;又は細胞表面脂質結合タンパク質と相互作用する脂質であり得る。結合ドメインは、目的の受容体と結合する抗体若しくは結合断片、又は受容体結合分子(例えば、リガンド)であってその受容体が知られていない受容体結合分子(例えば、オーファンリガンド)などの分子であってよい。機能的結合ドメインである受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子又は脂質については、宿主細胞表面分子に結合し、少なくとも1つの細胞型に内部移行する必要がある。受容体結合分子は、成長因子、サイトカイン、又はリソソーム酵素であり得る。成長因子は、細胞成長、増殖、治癒、及び細胞分化を刺激することができる分子を指す。成長因子のいくつかの例には、表皮成長因子(EGF)、プレイオトロフィン(PTN)、及び線維芽細胞成長因子(FGF)が含まれる。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子を含む、細胞シグナル伝達において重要である小さなタンパク質、典型的には約5~20kDaのタンパク質のカテゴリーを指す。サイトカインは、免疫調節剤としての自己分泌シグナル伝達、パラ分泌シグナル伝達及び内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインの例は、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド9(CXCL9)である。リソソーム酵素は、分泌、血漿膜修復、細胞シグナル伝達、及びエネルギー代謝を含む細胞プロセスに関与するリソソーム中に見出される酵素である。一実施形態では、受容体結合分子は成長因子であるか、又はそれを含む。例えば、N-アセチルグルコサミン-6-スルファターゼ(GNS)又はGM2ガングリオシド活性化因子(GM2A)はリソソーム酵素である。一実施形態では、受容結合分子は、成長因子、サイトカイン、又はリソソーム酵素を含むか、又はそれらである。一実施形態では、成長因子は、EGF、PLN又はFGFである。一実施形態では、受容体結合分子はサイトカインであるか、又はそれを含む。一実施形態では、サイトカインはCXCL9である。一実施形態では、受容体結合分子は、リソソーム酵素であるか、又はそれを含む。一実施形態では、リソソーム酵素は、N-アセチルグルコサミン-6-スルファターゼ(GNS)又はGM2ガングリオシド活性化因子(GM2A)である。宿主細胞表面分子と、受容体結合分子、ペプチド、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子又は脂質を含む前記結合ドメインとの間の一価の解離定数で測定された親和性は、例えば、リガンド結合アッセイによって測定した場合に50μM未満である。細胞に入ることができない受容体結合分子(例えば、リガンド)又はその結合断片、ペプチド、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子又は脂質は、結合ドメインとして排除される。本明細書で使用する「小分子」結合ドメインは、900ダルトン未満、又は1,000ダルトン未満の低分子量化合物を指す。
結合ドメインは、目的の細胞表面受容体又は未知の細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に結合するリガンドなどの分子であり得る。結合ドメイン特異性は、結合ドメインと結合する受容体又はタンパク質のスクリーニングを可能にする。本開示は、膜タンパク質の切断産物又は細胞外ドメインを用いることもできるので、従来の分泌タンパク質に限定されない。
結合ドメインは、天然に存在する毒素の結合ドメイン又はその結合断片であり得る。例えば、ジフテリア毒素(DTA)については、結合ドメインは少なくとも1~193残基(Uniprot受託番号Q5PY51_CORDP)を含み、シュードモナス外毒素A(PE)については、結合ドメインは少なくとも405~638残基(TOXA_PSEAE)を含み、サポリンについては、結合ドメインは少なくとも22~277残基(RIP6_SAPOF)を含み、ゲロニンについては、結合ドメインは少なくとも47~297残基(RIPG_SURMU)を含み、パーフリンゴリジンについては、結合ドメインは少なくとも29~500残基(TACY_CLOPE)を含み、リステリオリシンについては、結合ドメインは少なくとも26~529残基(TACY_LISMO)を含み、α-ヘモリシンについては、結合ドメインは少なくとも27~319残基(HLA_STAAU)を含み、サブチラーゼ細胞毒については、結合ドメインは少なくとも22~347残基(SUBA_ECOLX)を含み、ボウガニン(bouganin)については、結合ドメインは少なくとも1~305残基(Q8W4U4_9CARY)を含み、リシンについては、結合ドメインは少なくとも36~302残基(RICI_RICCO)を含む。例えば、本明細書に開示される方法でこのような結合ドメインを使用して、特定の毒素ドメインに対する耐性を提供する「バックグラウンド」ヒットを同定することができる。
本明細書で使用する用語「毒素ドメイン」は、細胞に内部移行したときに、毒性を付与する毒素の最小ドメインを意味する。例えば、ジフテリア毒素(DTA)については、毒素ドメインは少なくとも1~193残基(Uniprot受託番号Q5PY51_CORDP)を含み、シュードモナス外毒素A(PE)については、毒素ドメインは少なくとも405~638残基(TOXA_PSEAE)を含み、サポリンについては、毒素ドメインは少なくとも22~277残基(RIP6_SAPOF)を含み、ゲロニンについては、毒素ドメインは少なくとも47~297残基(RIPG_SURMU)を含み、パーフリンゴリジンについては、毒素ドメインは少なくとも29~500残基(TACY_CLOPE)を含み、リステリオリシンについては、毒素ドメインは、少なくとも26~529残基(TACY_LISMO)を含み、α-ヘモリシンについては、毒素ドメインは少なくとも27~319残基(HLA_STAAU)を含み、サブチラーゼ細胞毒については、毒素ドメインは少なくとも22~347残基(SUBA_ECOLX)を含み、ボウガニン(bouganin)については、毒素ドメインは少なくとも1~305残基(Q8W4U4_9CARY)を含み、リシンについては、毒素ドメインは少なくとも36~302残基(RICI_RICCO)を含む。いくつかの毒素は、毒素ドメインのみを有し(例えば、サポリン)、他は毒素ドメインと結合ドメインを有する(例えば、α-ヘモリシン)。いくつかの他のものは、毒素ドメイン、結合ドメインと転位ドメインを有する(例えば、ジフテリア毒素)。
本明細書で使用する用語「転位ドメイン」は、エンドソームからサイトゾルへの毒素及び任意の融合された積荷の膜貫通経路を提供する毒素又は他の分子の最小ドメインを指す。転位ドメインは、毒素中に天然で存在するか、又は組換え毒素融合体中の別の毒素に由来するか、又はその膜貫通経路形成断片であり得る。ジフテリア毒素(DTA)については、転位ドメインは少なくとも201~380残基(Uniprot受託番号Q5PY51_CORDP)を含み、シュードモナス外毒素A(PE)については、転位ドメインは少なくとも278~389残基(TOXA_PSEAE)を含む。組換え毒素融合体において、エンドソームから細胞質への組換え毒素融合体の転位は、転位ドメインによって促進することができる。一実施形態では、転位ドメインは、DTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。いくつかの毒素は、これらのドメインが単一のドメインに埋め込まれているので、別々の若しくは特異的な転位ドメイン又は受容体結合分子を含有しない。例えば、サポリンは、転移ドメインを有していないリボソーム不活性化毒素である。同様に、サブチラーゼ細胞毒(SubAΒ)は、その標的BiPシャペロンが小胞体に存在するので、細胞質に転移する必要はない。
本明細書で使用する用語「多量体化ドメイン」は、毒素又は分子の多量体化のための最小ドメインを指す。例えば、組換え毒素融合体の多量体化は、融合体の生物学的活性及び/又は結合活性を増強する。このドメインは、当業者によって容易に認識され、例えば、シンデカン4の細胞質ドメイン、又は例えば、GCN4転写因子又は軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質(COMP)由来のコイルドコイルドメインを含み、二量体、三量体(timer)、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、及び十量体などを形成してよい。例えば、多量体化は、例えば、細胞外スクリーニングで使用される五量体化ドメインを含む。五量体化ドメインは、複数の毒素融合体を結集させ、受容体に対する結合活性を増加させることができる。
本明細書で使用する用語「ベクター」は、例えば、前記核酸分子が原核細胞及び/又は真核細胞に導入され、かつ/又はゲノムに組み込まれることを可能にする核酸分子のための任意の中間ビヒクルを含み、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ又はレトロウイルス系ベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを含む。本明細書で使用する用語「プラスミド」は、一般に、染色体DNAとは独立して複製することができる染色体外遺伝物質、通常は環状DNA二重鎖の構築物を指す。
核酸分子又はその断片を用いて、遺伝子の発現を調節してよい。本開示の核酸分子を用いるサイレンシングは、当技術分野で一般的に知られているいくつかの方法で、例えば、shRNA又はsiRNAを用いるRNA干渉技術、マイクロRNA(miRNA)技術、gRNAを用いるCRISPR-Cas又はCRISPR-Cpf1システム及び標的化突然変異誘発技術を用いて達成してよい。
本明細書で使用する用語「CRISPR-Cas」、「CRISPRシステム」、又は「CRISPR-Casシステム」は、Cas遺伝子をコードする核酸、tracr(トランス活性化CRISPR)配列(例えば、活性部分のtracrRNA)、tracrの仲間の配列(内因性CRISPRシステムの文脈で「直列反復配列」及びtracrRNA処理された部分的な直列反復配列を含む)、ガイド配列(gRNA、例えば、Cas9などのCasを誘導するRNA;CRISPR RNA及びトランス活性化(トレーサー)RNA又は単一ガイドRNA(sgRNA)又は他の配列及びCRISPR遺伝子座からの転写物を含むCRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現又は活性の指示に関与する転写物及び他の要素を総称して指す。CRISPR-Casは、必要に応じて、クラスII単量体Casタンパク質、例えば、II型Cas、又はV型Casである。II型Casタンパク質は、化膿性連鎖球菌、フランシセラ・ノビシダ、A.ネスランディ、黄色ブドウ球菌又は髄膜炎菌由来のCas9などのCas9タンパク質であってよい。必要に応じて、Cas9は、化膿性連鎖球菌由来である。V型Casタンパク質はRNA処理活性を有してよい。V型Casタンパク質は、ラクノスピラ属細菌(Lb-Cas12a)由来又はアシダミノコッカス種BV3L6(As-Cas12a)由来のCas12aなどのCas12a(Cpf1としても知られている)Casタンパク質であってよい。用語「Cpf1」及び「Cas12a」は、全体にわたって互換的に使用される。このように、CRISPRシステムはまた、CRISPR-Cpf1システムであり得、このシステムでは、Cas9などのCasはCpf1に置換されている。CRISPRシステムは、典型的には、標的配列の部位でCRISPR複合体の形成を促進する要素によって特徴付けられる。
本明細書で使用する用語「gRNA」又は「ガイドRNA」は、特異的DNA配列(例えば、crRNA)とハイブリダイズし、さらに、tracrRNAと呼ばれるCRISPR-Casタンパク質に結合するタンパク質結合セグメントを含むRNA分子を指す。gRNAは直列反復配列も含むことができる。特異的DNA配列とハイブリダイズするガイドRNAの一部を、本明細書では、核酸標的配列、又はcrRNA又はスペーサー配列と呼ぶ。gRNAはまた、文脈から理解されるように、gRNAをコードする対応するDNA配列を指すか、又はそれによって表すことができる。標的特異的部分又はcrRNAは、異なるtracrRNAと組み合わせることができるので、本明細書に提供されるガイド配列は、最小限crRNA配列を含む。
「スペーサー配列」とも呼ばれるか、又はスペーサー配列を含む、本明細書で使用する用語「crRNA」は、標的配列とのRNA-DNA二重鎖を形成するか、又は形成することができるgRNAの部分を指す。該配列は、特異的CRISPR標的配列に相補的であっても、又は対応していてもよい。crRNA/スペーサー配列のヌクレオチド配列は、CRISPR標的配列を決定し、所望のCRISPR標的部位を標的にするように設計されてよい。crRNAはまた、文脈から理解されるように、crRNAをコードする対応するDNA配列を指すか、又はそれによって表すことができる。
本明細書で使用する用語「CRISPR標的部位」又は「CRISPR-Cas標的部位」は、活性化されたCRISPR-Casタンパク質が適切な条件下で結合する核酸を意味する。CRISPR標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)及びCRISPR標的配列(すなわち、活性化されたCRISPR-Casタンパク質が結合するgRNAのcrRNA/スペーサー配列に対応する)を含む。PAMの配列及びCRISPR標的配列に対するPAMの相対位置は、CRISPR-Casタンパク質の種類に依存する。例えば、Cas9などのII型 CRISPR-Casタンパク質のCRISPR標的部位は、5'から3'に向かって、20個のヌクレオチドの標的配列、続いて、配列NGG(配列番号6)を有する3個のヌクレオチドPAMを含んでよい。したがって、II型CRISPR標的部位は、配列5’-n1-n2-n3-n4-n5-n6-n7-n8-n9-n10-n11-n12-n13-n14-n15-n16-n17-n18-n19-n20-NGG-3'(配列番号7)を有してよい。別の例として、Cpf1などのV型CRISPR-Casタンパク質のCRISPR標的部位は、5'から3'に向かって、配列TTTV(配列番号8;VはA、C、又はGである)を有する4個のヌクレオチドPAM、続いて、23個のヌクレオチド標的配列を含んでよい。したがって、V型CRISPR標的部位は、配列5'-TTTV-n1-n2-n3-n4-n5-n6-n7-n8-n9-n10-n11-n12-n13-n14-n15-n16-n17-n18-n19-n20-n21-n22-n23-3'(配列番号9)を有してよい。
CRISPR標的部位を結合するために、CRISPR標的部位を含有するDNAが、CRISPR-Casタンパク質にアクセス可能であることを当業者なら理解するであろう。したがって、CRISPR-Casタンパク質は、例えば、1以上の核局在化シグナル、必要に応じて、核プラスミン核局在化シグナルを含んでよい。
本明細書で使用する用語「tracrRNA」、また「トランスにコードされたcrRNA」は、例えば、Cas9などのCRISPR-Casタンパク質と相互作用し、gRNAと結合するか、又はその一部を形成し得るRNAである。tracrRNAは、例えば、化膿レンサ球菌由来のtracrRNAであってよい。tracrRNAは、例えば、5'-gtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3'(配列番号10)の配列を有してよい。他のtracrRNAも使用してよい。trRNAはまた、文脈から理解されるように、trRNAをコードする対応するDNA配列を指すか、又はそれによって表すことができる。
本明細書で使用する用語「直列反復配列」は、ステムループを形成し、例えば、Cpf1などのCRISPR-Casタンパク質と相互作用し、ガイドRNAと結合するか、又はその一部を形成し得るRNAを指す。直列反復配列は、例えば、ラクノスピラ属細菌又はアシダミノコッカス種BV3L6由来の直列反復配列であってよい。直列反復配列は、例えば、5'-taatttctactcttgtagat-3'(Lb-Cpf1用)(配列番号11)又は5'-taatttctactaagtgtagat-3'(As-Cpf1用)(配列番号12)の配列を有してよい。他の直列反復配列を使用してもよい。直列反復配列はまた、文脈から理解されるように、直列反復配列をコードする対応するDNA配列を指すか、又はそれによって表すことができる。
本明細書で使用する用語「標的化ライブラリー」は、例えば、目的の表現型に関連する遺伝子を同定(例えば、スクリーニング)するために使用することができる1組の遺伝子の発現を標的とし、下方制御する(例えば、抑制するか、阻害するか、又は低下させる)核酸分子のコレクション又は複数の核酸分子を指す。標的化ライブラリーは、広く基づくか、又はフォーカスすることができる(定義されたライブラリーとも呼ぶことができる)。全ゲノムライブラリーは、全て又はほとんど全ての遺伝子を、例えば、単一の生物のゲノムの少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%標的とする核酸分子を含有する広く基づく標的化ライブラリーである。フォーカスライブラリーは、目的のカテゴリー又は分野に関与する全て又はほぼ全ての経路に関連する複数の遺伝子を標的とする核酸を含むライブラリーであり得る。例えば、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体遺伝子などの遺伝子のカテゴリーに関連する全て又はほぼ全ての経路に関連する核酸分子を含有することができ、結合する場合には、例えば、受容体の新生、成熟、又は輸送に関与する遺伝子などの受容体の表面発現及び機能付与に必要な因子、並びにリガンド及び/又は受容体エンドサイトーシスに関与する因子を意味する。フォーカスライブラリーは、例えば、血漿膜、ER膜及び他の細胞内膜に局在化するタンパク質をコードする標的化遺伝子;エンドサイトーシス及び受容体成熟を調節する輸送因子;細胞表面タンパク質の発現を調節する転写因子、又はそのための任意のタンパク質を含んでよい。
全ゲノムライブラリー中の核酸分子の各々は、生物の特異的遺伝子を標的とする。特異的遺伝子の標的化は、標的化遺伝子発現を指す。標的化がgRNA、siRNA、shRNA又はmiRNAを使用する場合、核酸分子は、標的遺伝子の一部に相補的な部分を含む核酸配列を発現する。複数の核酸分子は、同じ遺伝子を標的化することができる。適切な標的化ライブラリーには、Addgene及びToronto Knockout Library(www.addgene.org/crispr/libraries and tko.ccbr.utoronto.ca)から入手可能なgRNA全ゲノムライブラリー及びフォーカスライブラリーが含まれる。実施例に示されるように、TKOV3ライブラリーなどの標的化ライブラリーを使用することができる。
本明細書で使用する語句「標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団」は、ライブラリーの異なる構成要素が集団の異なる細胞に含まれ、そこで発現するように形質導入、エレクトロポレーション、又は他の方法で処理された細胞の集団を意味する。
一実施形態では、標的化ライブラリーは全ゲノムライブラリーである。別の実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体遺伝子、好ましくは、GPCRを標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体介在経路をコードする遺伝子を標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、エンドサイトーシス及び受容体成熟因子遺伝子を調節する輸送因子の少なくとも1つを標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、受容体成熟因子遺伝子を標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、血漿膜、ER膜及び他の細胞内膜に局在化するタンパク質を標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、タンパク質の転写因子調節発現、必要に応じて、細胞表面タンパク質の発現を標的とする核酸分子を含む。
B.方法
本明細書に記載されているように、本発明者らは、本明細書に記載のCRISPR/Cas9ベースの陽性遺伝子スクリーニングなどのゲノムワイド遺伝子スクリーニングのための方法及び構成要素を決定した。本発明者らは、ゲノムワイドgRNAライブラリーを細胞に感染させ、続いて組換え毒素融合体処理を行うことにより、稀な耐性細胞の同定が可能になることを実証した。耐性細胞からのgRNAの配列決定は、同族受容体並びに受容体表面発現及び機能付与に必要な因子を同定することができる(図3)。
本明細書に記載されているように、本発明者らは、本明細書に記載のCRISPR/Cas9ベースの陽性遺伝子スクリーニングなどのゲノムワイド遺伝子スクリーニングのための方法及び構成要素を決定した。本発明者らは、ゲノムワイドgRNAライブラリーを細胞に感染させ、続いて組換え毒素融合体処理を行うことにより、稀な耐性細胞の同定が可能になることを実証した。耐性細胞からのgRNAの配列決定は、同族受容体並びに受容体表面発現及び機能付与に必要な因子を同定することができる(図3)。
一態様では、本明細書に記載されるのは、スクリーニングにおける受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法である。
したがって、本開示の態様は、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法であって、
(a)標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団であって、該集団の個々の操作した細胞が標的化ライブラリーの核酸分子を含有し、該核酸分子が標的遺伝子に相補的な核酸配列を含む、細胞の集団を提供する工程;
(b)該細胞集団を、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体と十分な時間接触させることにより、細胞の選択プールを生成する工程;並びに
(c)細胞の選択プールに含まれる核酸分子の1以上の配列を決定することにより、標的遺伝子を同定する工程
を含む方法を提供する。
(a)標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団であって、該集団の個々の操作した細胞が標的化ライブラリーの核酸分子を含有し、該核酸分子が標的遺伝子に相補的な核酸配列を含む、細胞の集団を提供する工程;
(b)該細胞集団を、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体と十分な時間接触させることにより、細胞の選択プールを生成する工程;並びに
(c)細胞の選択プールに含まれる核酸分子の1以上の配列を決定することにより、標的遺伝子を同定する工程
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態は、十分な時間、細胞の集団を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる対照スクリーニングを含む。いくつかの実施形態は、結合ドメインが毒素ドメインに対応する結合ドメインである(例えば、毒素ドメインと結合ドメインの両方がDT由来である)対照スクリーニングを実行することを含む。例えば、対照スクリーニングにおいて、上記(c)で同定したいくつかの遺伝子は、毒素による中毒に必要な遺伝子であり、これらの遺伝子が結合ドメインの特異性とは無関係に中毒を調節するので(例えば、結合ドメインがオーファンリガンドなどの所望の標的のためのものである場合)、その後のスクリーニングで対照遺伝子として機能することができる。例えば、実施例1に示すように、FURIN、MESDC2、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、及びDNAJC24は、シュードモナス外毒素A(PE)介在毒性に必要な遺伝子として同定されており、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、及びDNAJC24は、ジフテリア毒素(DTA)介在毒性に必要な遺伝子として同定されている。したがって、いくつかの実施形態では、毒素による中毒に必要であり、かつ/又は結合ドメインタンパク質が関与する経路に関連しない一般的な毒素耐性遺伝子であり、かつ対照として機能することができる遺伝子を同定するために、対照又はバックグラウンドのスクリーニングが行われる。目的の遺伝子のスクリーニングは、組換え毒素融合体の結合ドメインが目的の遺伝子を同定するための標的化部分に置換されている(例えば、その同族受容体を同定するリガンドに置換されている)という点で、対照スクリーニング中の結合ドメインとは異なる選択された結合ドメインを含む組換え毒素融合体を使用する。目的の遺伝子スクリーニングで同定された遺伝子は、対照遺伝子及び目的の遺伝子を含有してよい。目的の遺伝子を同定するために、対照遺伝子を同定し、目的の遺伝子スクリーニングで組換え毒素融合体によって同定した遺伝子から差し引くことにより比較を行う。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子を同定することは、対照スクリーニングで同定された対照遺伝子と、毒素及び目的の遺伝子スクリーニングで組換え毒素融合体によって同定された遺伝子とを比較することを含み、目的の遺伝子スクリーニングにおける組換え毒素融合体の結合ドメインの結合特異性は、対照スクリーニングにおける毒素の結合ドメインの結合特異性とは異なる。いくつかの実施形態では、対照スクリーニングにおける毒素は、目的の遺伝子スクリーニングにおける組換え毒素融合体とは異なり、対照スクリーニングにおける毒素の結合ドメインは、該組換え毒素融合体に含まれる異なる結合ドメインによって目的の遺伝子スクリーニングで置換される。
標的化ライブラリーは、gRNA、siRNA、shRNA又はmiRNAを含む核酸分子を有することができる。一実施形態では、特異的遺伝子発現を標的とする核酸分子は、gRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA、好ましくは、gRNAを含む。別の実施形態では、CRISPR-CasシステムはCas9を含む。
標的化ライブラリーは、哺乳動物の種における遺伝子のスクリーニングライブラリーである「哺乳動物ライブラリー」を含む目的の種の遺伝子を標的とすることができる。別の実施形態では、標的化ライブラリーは、哺乳動物ライブラリー、好ましくは、ヒト又はマウスのライブラリーである。「標的遺伝子」又はその派生語は、標的遺伝子の一部に相補的な核酸配列を有する核酸分子の細胞への導入により、本明細書に記載の機構により発現が下方制御されている遺伝子を指す。
標的化ライブラリーは、広く基づくか、又はフォーカスさせることができる。一実施形態では、標的化ライブラリーは、全ゲノムライブラリーである。別の実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体遺伝子、好ましくは、GPCR遺伝子を標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、細胞表面受容体介在経路のタンパク質をコードする遺伝子を標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、標的化ライブラリーは、受容体成熟因子遺伝子を標的とする核酸分子を含む。
一実施形態では、細胞の集団は、哺乳動物細胞株、好ましくは、ヒト又はマウスの細胞株からの細胞を含む。別の実施形態では、哺乳動物細胞株は、A431、A549、HCT116、K562、HeLa、好ましくは、HeLa-京都、又はHEK-293、好ましくは、HEK-293T、又は一倍体若しくはほぼ一倍体の細胞株、好ましくは、HAP1である。当業者なら、受容体-リガンド相互作用関連タンパク質を同定するのに適する代替の細胞株を容易に認識することができる。
標的化ライブラリーは、いくつかの方法によって細胞株の細胞の集団に導入することができる。1つの方法は、レトロウイルス系ベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いた形質導入である。一実施形態では、標的化ライブラリーは、少なくとも1つのレトロウイルスベクター、好ましくは、少なくとも1つのレンチウイルスベクターで細胞に形質導入される。一実施形態では、形質導入細胞は、毒素で処理する前に、2~10日間、又は少なくとも2、3、4、5、6、7、若しくは8日間、又は最長で3、4、5、6、7、8、9、若しくは10日間維持される。一実施形態では、形質導入細胞を、1~5日間、又は少なくとも1、2、3、若しくは4日、又は最長で2、3、4、若しくは5日間、毒素と接触させる。
本発明に記載の方法は、細胞のプール中の受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質をスクリーニングするための薬剤として組換え毒素融合体を使用する。組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む。
ジフテリア毒素(DTA)及びシュードモナス外毒素A(PE)は、細胞、特に哺乳動物細胞に対してピコモル効力で毒性である細菌外毒素である。これらの毒素の毒素ドメインは、タンパク質の合成を強力に阻害し、急速な細胞死をもたらす。DTAの場合、毒素ドメインは、Cドメインとして知られ、異常なベータ+アルファ折り畳みを有する触媒ドメインである。Cドメインは、NADから真核性伸長因子2(eEF-2)のジフタミド残基へのADPリボースの転移によるタンパク質合成を阻止する。PEによるタンパク質合成阻害は同様の機構に従う。一実施形態では、組換え毒素融合体は、ジフテリア毒素(DTA)又はシュードモナス外毒素A(PE)毒素ドメイン、又はその毒性断片を含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。組換え毒素融合体は、2つのattR部位間にクローニングされたリガンドをコードする核酸配列を有するpcDNA3.1-SP-DTA-GS-ccdB(配列番号1)、pET15b-SHT-SUMO-DTA-ccdB(配列番号2)、pcDNA3.1-SP-codB-GSリンカー-PE40(配列番号3)、pET15b-SHT-ccd-PE40(配列番号4)、又はpcDNA3.1-ccdB-PE38-6×His(配列番号5)から発現させることができる。
組換え毒素融合体では、結合ドメインは、リガンド-受容体相互作用に関連付けられる受容体又はタンパク質をスクリーニングするための「選択性」を提供する。結合ドメインは、リガンド-受容体相互作用に関連付けられる同族の受容体又はタンパク質が同定すべき任意の分子であるか、又はそれを含むことができる。該分子は、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であり得る。一実施形態では、結合ドメインは、所望の分子の受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質である。
いくつかの実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメイン及び/又は転位ドメインに直接コンジュゲートされる。他の実施形態では、リンカーは、これらのコンジュゲーションのうちの1以上に使用される。任意のリンカーを使用することができる。例えば、グリシン-セリンリッチリンカーは、柔軟性を増大させる。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン-セリンリッチリンカーである。好適なリンカーの例は、実施例に提供される。
別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF(受託番号NM_001963)、PTN(受託番号NM_002825)、CXCL9(受託番号NM_002416)、GNS(受託番号P15586)、GM2A(受託番号P17900)、FGF2(受託番号P09038)、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。
結合ドメイン又はその結合断片は、受容体への結合に影響を及ぼすことができる翻訳後修飾を受けることができる。結合に影響を及ぼすことができる翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加を含む。リン酸化は、分子へのホスホリル基の結合を指す。分子がタンパク質である場合、リン酸化は、典型的にはセリン、トレオニン及びチロシンで起こる。アセチル化は、分子へのアセチル基の導入を指す。グリコシル化は、例えば、タンパク質又は脂質にグリカンを付着させる酵素的プロセスによって、炭水化物、例えば、グリコシル供与体を分子に付加することを指す。一般的なグリコシル化は、N結合グリコシル化及びO結合グリコシル化を含む。N結合グリコシル化は、典型的には、ドリコールリン酸を必要とし、アスパラギン又はアルギニンの側鎖の窒素に結合したN結合グリカンを含む。O結合グリコシル化では、グリカンは、セリン、トレオニン、チロシン、ヒドロキシリジン、又はヒドロキシプロリン側鎖のヒドロキシル酸素、又はセラミドなどの脂質上の酸素に結合している。アミド化は、例えば、ペプチドがC末端にアミド化を有する分子へのアミドの付加を指す。修飾されるアミノ酸は、典型的には、アミド基を提供するグリシンに続く。例えば、グリシンを酸化して、α-ヒドロキシグリシンを形成すると、酸化されたグリシンは、C末端アミド化ペプチドとN-グリオキシル化ペプチドに分解する。ヒドロキシル化は、分子へのヒドロキシル基の導入を指す酸化過程である。ヒドロキシラーゼは、ヒドロキシル化反応を触媒することができる酵素である。メチル化とは、分子へのメチル基の付加を指す。細胞内で、メチル化は、酵素によって達成され、メチル化の基質がタンパク質である場合、典型的には、タンパク質配列中のアルギニン又はリジンアミノ酸残基上で起こる。ユビキチン化は、分子へのユビキチンの付加である。分子がタンパク質である場合、ユビキチン化は、単一のユビキチンタンパク質(すなわち、モノユビキチン化)又はユビキチンの鎖(すなわち、ポリユビキチン化)であり得る。マンノース-6-リン酸は、リソソームへの輸送に向けられたタンパク質の標的化シグナルである。マンノース-6-リン酸のタンパク質への付加は、典型的には、シス-ゴルジ装置で起こり、通常、タグ付きと呼ばれ、すなわち、修飾タンパク質上のマンノース-6-リン酸は、マンノース-6-リン酸タグと呼ばれる。例えば、ウリジン二リン酸(UDP)及びN-アセチルグルコサミンを含む反応において、酵素N-アセチルグルコサミン-1-リン酸トランスフェラーゼは、マンノース-6-リン酸を用いたアスパラギン残基のN結合グリコシル化を触媒する。マンノース-6-リン酸タグ付きタンパク質はトランス-ゴルジに移動し、マンノース-6-リン酸タグは、マンノース-6-リン酸受容体(MPR)タンパク質が認識し、結合することができる。一実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。
別の実施形態では、細胞に投与された場合、組換え毒素融合体は、操作した細胞の少なくとも約99%、99.5%、99.9%又は100%を死滅させる。別の実施形態では、組換え毒素融合体は、細胞に投与された場合、細胞の成長を、操作した細胞の少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%又は100%阻害する。
本発明に記載の方法からの受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質の素性は、細胞の選択プールに含まれる特異的遺伝子発現を標的とする核酸分子のうちの1以上の配列を決定することによって決定される。一実施形態では、配列決定はハイスループット配列決定を含む。いくつかの遺伝子は、毒素の毒性効果を可能にするのに必須であるとして本開示により同定された。例えば、DPH1(受託番号NM_001383)、DPH2(受託番号NM_001384)、DPH3(受託番号NM_206831)、DPH5(受託番号NM_001077394)、DPH7(受託番号NM_138778)、又はDNAJC24(受託番号NM_181706)の下方制御又は発現抑制は、DTA又はPEに対してHEK-293T細胞を耐性にさせる。
また具体的に提供されるのは、毒素耐性細胞株を生成する方法であって、
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;かつ
(b)毒素耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる工程
を含む方法である。
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;かつ
(b)毒素耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる工程
を含む方法である。
一実施形態では、細胞を約0.1nM~100nMの毒素と接触させた。一実施形態では、細胞を1~4日間、又は2、3、若しくは4日間、毒素と接触させた。一実施形態では、細胞を少なくとも2、3、4、又は5日間、最長で6、7、8、9、10、11、12、13、又は14日間、約0.1nM~100nMの毒素と接触させた。
一実施形態では、本方法は毒素DTA又はPEを含む。別の実施形態では、本方法のCasはCas9である。別の実施形態では、本方法の細胞株はHEK-293、好ましくは、HEK-293Tである。
DTA耐性については、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24の下方制御又は発現抑制に加えて、HBEGFの下方制御又は発現抑制はまた、HEK-293T細胞をDTAに対して耐性にさせる。
したがって、また提供されるのは、具体的に、ジフテリア毒素(DTA)耐性細胞株を生成する方法であって、
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、HBEGF、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;かつ
(b)DTA耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞をDTAと接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMのDTAと接触させる工程
を含む方法である。
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、HBEGF、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;かつ
(b)DTA耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞をDTAと接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMのDTAと接触させる工程
を含む方法である。
一実施形態では、DTA耐性細胞株の生成方法におけるCasはCas9である。別の実施形態では、DTA耐性細胞株はHEK-293、好ましくは、HEK-293Tである。一実施形態では、細胞を約0.1nM~100nMのDTAと接触させた。一実施形態では、細胞を1~4日間、又は2、3、若しくは4日間、DTAと接触させた。一実施形態では、細胞を少なくとも2、3、4、又は5日間、最長で6、7、8、9、10、11、12、13、又は14日間、約0.1nM~100nMのDTAと接触させた。
PE耐性については、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24の下方制御又は発現抑制に加えて、FURIN(受託番号NM_002569)、MESDC2又はLRP1(受託番号NM_002332)の下方制御又は発現抑制も、HEK-293T細胞をPEに対して耐性にさせる。
したがって、また提供されるのは、PE耐性細胞株を生成する方法であって、
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、FURIN、MESDC2、LRP1、LRP1B、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;かつ
(b)PE耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞をPEと接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMのPEと接触させる工程
を含む方法である。
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、FURIN、MESDC2、LRP1、LRP1B、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;かつ
(b)PE耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞をPEと接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMのPEと接触させる工程
を含む方法である。
一実施形態では、細胞を約0.1nM~100nMのPEと接触させた。一実施形態では、細胞を12nMのPEと接触させた。一実施形態では、細胞を1~4日間、又は2、3、若しくは4日間、PEと接触させた。一実施形態では、細胞を少なくとも2、3、4、又は5日間、最長で6、7、8、9、10、11、12、13、又は14日間、約0.1nM~100nMのPEと接触させた。一実施形態では、細胞を少なくとも2日間、0.1nMのPEと接触させた。具体的な実施形態では、細胞を12nMのPEと2日間接触させた。
一実施形態では、PE耐性細胞株の生成方法におけるCasはCas9である。別の実施形態では、PE耐性細胞株はHEK-293、好ましくは、HEK-293Tである。
サブチラーゼ細胞毒耐性については、SLC35A1(受託番号NM_001168398及びNM_006416)、SLC35A2(受託番号NM_001032289、NM_001042498、NM_001282647、NM_001282648、NM_001282649、NM_001282650、NM_001282651、及びNM_005660)、CMAS(受託番号NM_018686)、又はCOG1(受託番号NM_018714)、COG2(受託番号NM_001145036及びNM_007357)、COG3(受託番号NM_031431)、COG4(受託番号NM_001195139、NM_001365426、及びNM_015386)、COG5(受託番号NM_001161520、NM_006348、及びNM_181733)、COG6(受託番号NM_001145079及びNM_020751)、COG7(受託番号NM_153603)、COG8(受託番号NM_032382)を含む保存されたオリゴマーゴルジ(COG)複合体の下方制御又は発現抑制により、HEK-293T細胞をサブチラーゼ細胞毒に耐性にさせる。
したがって、また提供されるのは、サブチラーゼ細胞毒耐性細胞株を生成する方法であって、
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、SLC35A1、SLC35A2、CMAS、COG1、COG2、COG3、COG4、COG5、COG6、COG7又はCOG81を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;かつ
(b)サブチラーゼ細胞毒耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞をサブチラーゼ細胞毒と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMのサブチラーゼ細胞毒と接触させる工程
を含む方法である。
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、SLC35A1、SLC35A2、CMAS、COG1、COG2、COG3、COG4、COG5、COG6、COG7又はCOG81を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;かつ
(b)サブチラーゼ細胞毒耐性細胞株を生成するのに十分な時間、該細胞をサブチラーゼ細胞毒と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMのサブチラーゼ細胞毒と接触させる工程
を含む方法である。
一実施形態では、細胞を約0.1nM~100nMのサブチラーゼ細胞毒と接触させた。一実施形態では、細胞を1~4日間、又は2、3、若しくは4日間、サブチラーゼ細胞毒と接触させた。一実施形態では、細胞を少なくとも2、3、4、又は5日間、最長で6、7、8、9、10、11、12、13、又は14日間、約0.1nM~100nMのサブチラーゼ細胞毒と接触させた。
毒素又は組換え毒素融合体を生成することができる細胞株については、細胞株は、毒素又は組換え毒素融合体に対して耐性であり、毒素又は組換え毒素融合体を生成するための遺伝物質を包含する必要がある。
したがって、また提供されるのは、毒素生成細胞株を生成する方法であって、
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;
(b)十分な時間、該細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる工程;かつ
(c)毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程(b)の細胞に導入し、発現させる工程
を含む方法である。
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;
(b)十分な時間、該細胞を毒素と接触させ、必要に応じて、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる工程;かつ
(c)毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程(b)の細胞に導入し、発現させる工程
を含む方法である。
一実施形態では、(b)又は(c)の毒素は、ジフテリア毒素(DTA)又はシュードモナス外毒素A(PE)である。別の実施形態では、(c)の組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、DTA若しくはPE毒素ドメイン、又はその毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、該ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはDTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、CasはCas9である。別の実施形態では、細胞株はHEK-293、好ましくは、HEK-293Tである。
毒素生成細胞株は、毒素の生成を可能にする。また提供されるのは、毒素を生成する方法であって、
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;
(b)十分な時間、細胞を毒素と接触させる工程;
(c)毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程(b)の細胞に導入し、発現させる工程;
(d)培地中で細胞を成長させる工程;かつ
(e)毒素又は組換え毒素融合体を含有する培地を収集する工程
を含む方法である。
(a)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程;
(b)十分な時間、細胞を毒素と接触させる工程;
(c)毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を工程(b)の細胞に導入し、発現させる工程;
(d)培地中で細胞を成長させる工程;かつ
(e)毒素又は組換え毒素融合体を含有する培地を収集する工程
を含む方法である。
一実施形態では、毒素を生成する方法は、ジフテリア毒素(DTA)又はシュードモナス外毒素A(PE)を生成する。別の実施形態では、本方法は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体を生成する。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素又は毒素ドメインは、DTA若しくはPE毒素ドメイン、又はその毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはDTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、CasはCas9である。別の実施形態では、細胞株はHEK-293、好ましくは、HEK-293Tである。
毒素はまた、細菌、昆虫又は酵母細胞などの細胞によって生成することができる。また提供されるのは、細菌、昆虫又は酵母細胞などの細胞において毒素を生成する方法であって、
(a)毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を細胞に導入し、発現させる工程;
(b)培地中で細胞を成長させる工程;かつ
(c)毒素又は組換え毒素融合体を含有する培地を収集する工程
を含む方法である。
(a)毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を細胞に導入し、発現させる工程;
(b)培地中で細胞を成長させる工程;かつ
(c)毒素又は組換え毒素融合体を含有する培地を収集する工程
を含む方法である。
一実施形態では、(a)の毒素は、ジフテリア毒素(DTA)、シュードモナス外毒素A(PE)、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、又はリシンである。別の実施形態では、(a)の組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、DTA、PE、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、又はリシンの毒素ドメイン、若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはDTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、細菌細胞は大腸菌である。別の実施形態では、酵母細胞は、出芽酵母又はP.パストリスである。
C.細胞株及び毒素生成細胞
別の態様では、本開示は、毒素耐性細胞株、特に、ジフテリア毒素(DTA)耐性及びシュードモナス外毒素A(PE)耐性細胞株を提供する。
別の態様では、本開示は、毒素耐性細胞株、特に、ジフテリア毒素(DTA)耐性及びシュードモナス外毒素A(PE)耐性細胞株を提供する。
したがって、また提供されるのは、少なくとも1つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含む毒素耐性細胞株であって、該核酸分子が、Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む。一実施形態では、該細胞株は、毒素に対して耐性のある細胞の集団を含む。別の実施形態では、毒素は、ジフテリア毒素(DTA)又はシュードモナス外毒素A(PE)である。別の実施形態では、細胞の集団は、50、100、150又は200μM、必要に応じて、100μMまでの毒素に対して耐性である。別の実施形態では、CasはCas9である。別の実施形態では、細胞株はHEK-293、好ましくは、HEK-293Tである。
また提供されるのは、具体的には、少なくとも1つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含むジフテリア毒素(DTA)耐性細胞株であって、該核酸分子が、Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、HBEGF、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含むジフテリア毒素(DTA)耐性細胞株である。一実施形態では、細胞の集団は、50、100、150又は200μM、必要に応じて、100μMまでのDTAに対して耐性である。別の実施形態では、CasはCas9である。別の実施形態では、DTA耐性細胞株はHEK-293、好ましくは、HEK-293Tである。
また提供されるのは、具体的には、少なくとも1つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含むシュードモナス外毒素A(PE)耐性細胞株であって、該核酸分子が、Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、FURIN、MESDC2、LRP1、LRP1B、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含むシュードモナス外毒素A(PE)耐性細胞株である。一実施形態では、細胞の集団は、50、100、150又は200μM、必要に応じて、100μMまでのPEに対して耐性である。別の実施形態では、CasはCas9である。別の実施形態では、PE耐性細胞株はHEK-293、好ましくは、HEK-293Tである。
別の態様では、本開示は、少なくとも1つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含む毒素生成細胞株を提供し、該核酸分子が、Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列と、毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列とを含む。一実施形態では、毒素は、ジフテリア毒素(DTA)又はシュードモナス外毒素A(PE)である。別の実施形態では、組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素又は毒素ドメインは、DTA若しくはPE毒素ドメイン、又はその毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはDTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、CasはCas9である。別の実施形態では、毒素生成細胞株はHEK-293、好ましくは、HEK-293Tである。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号1と少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%、又は99.999%の配列同一性を有する核酸配列を含む。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号3と少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%、又は99.999%の配列同一性を有する核酸配列を含む。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号5と少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%、又は99.999%の配列同一性を有する核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列を有するDPH1を標的とするgRNAは、配列番号13、14、15及び16のうちの少なくとも1つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するDPH2を標的とするgRNAは、配列番号17、18、19及び20のうちの少なくとも1つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するgRNA標的DPH3は、配列番号21、22、23及び24のうちの少なくとも1つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するgRNA標的DPH5は、配列番号25、26、27、及び28のうちの少なくとも1つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するgRNA標的DPH7は、配列番号29、30、31、及び32のうちの少なくとも1つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するDNAJC24を標的とするgRNAは、配列番号33、34、35、及び36の少なくとも1つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するHBEGFを標的とするgRNAは、配列番号37、38、39、及び40のうちの少なくとも1つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するFURINを標的とするgRNAは、配列番号41、42、43、及び44のうちの少なくとも1つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するMESDC2を標的とするgRNAは、配列番号45、46、47、及び48のうちの少なくとも1つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するLRP1を標的とするgRNAは、配列番号49、50、51、及び52のうちの少なくとも1つを含む。一実施形態では、核酸配列を有するgRNA標的LRP1Bは、配列番号53、54、55、及び56のうちの少なくとも1つを含む。
別の態様では、本開示は、核酸分子を含む、毒素生成細胞、必要に応じて、細菌、昆虫又は酵母細胞を提供し、該核酸分子は、毒素又は組換え毒素融合体を発現する核酸配列を含む。一実施形態では、毒素生成細胞株は細菌細胞である。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号2と少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%、又は99.999%の配列同一性を有する核酸配列を含む。一実施形態では、該核酸分子は、配列番号4と少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%、又は99.999%の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一実施形態では、毒素は、DTA、PE、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、又はリシンである。別の実施形態では、組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む。別の実施形態では、毒素ドメインはDTA、PE、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、又はリシン毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片である。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはDTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、細菌細胞は大腸菌である。別の実施形態では、酵母細胞は、出芽酵母又はP.パストリスである。
D.核酸分子及び組換え毒素融合体
本開示はまた、組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供し、該組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含み、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にあり、結合ドメインは、受容体結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。一実施形態では、毒素ドメインは、ジフテリア毒素(DTA)、シュードモナス外毒素A(PE)、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインは、DTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。
本開示はまた、組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供し、該組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含み、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にあり、結合ドメインは、受容体結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。一実施形態では、毒素ドメインは、ジフテリア毒素(DTA)、シュードモナス外毒素A(PE)、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインは、DTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。
組換え毒素融合体をコードする核酸は、必要に応じて、実施例に記載されるように、プラスミドなどのベクターに含めることができる。プラスミドは、実施例に記載のプラスミドの1以上の配列部分又は構成要素を含んでよい。例えば、ベクターは、必要に応じて、ヒスチジンタグなどのタグを含むPE融合ベクター、必要に応じて、実施例に記載のPE融合ベクター又はそれらの構成要素を含むベクターであり得る。
また本開示により提供されるのは、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体であって、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にあり、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。一実施形態では、毒素ドメインは、DTA、PE、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインは、DTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。
E.キット及びプローブ
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される方法を実行するためのキットを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される方法を実行するためのキットを提供する。
したがって、本開示は、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのキットであって、
(a)第1の細胞株、
(b)組換え毒素融合体をコードし、組換え毒素融合体を発現することができ、必要に応じて、ベクター中に含まれる核酸配列を含む少なくとも1つの核酸分子、かつ必要に応じて、
(c)複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーで、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー
のうちの1以上を含み、
該第1の細胞株が該組換え毒素融合体に対して耐性であり、かつ
該組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む、キットを提供する。
(a)第1の細胞株、
(b)組換え毒素融合体をコードし、組換え毒素融合体を発現することができ、必要に応じて、ベクター中に含まれる核酸配列を含む少なくとも1つの核酸分子、かつ必要に応じて、
(c)複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーで、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー
のうちの1以上を含み、
該第1の細胞株が該組換え毒素融合体に対して耐性であり、かつ
該組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む、キットを提供する。
一実施形態では、第1の細胞株は、HAP1、A431、A549、HCT116、K562、HeLa、好ましくは、HeLa-京都、又はHEK-293である。該組換え毒素融合体は、組換え毒素融合体に対して耐性のある第1の細胞株から生成することができる。該組換え毒素融合体はまた、細菌細胞、昆虫細胞又は酵母細胞から生成することができる。一実施形態では、該キットはさらに、(d)細菌細胞、必要に応じて、大腸菌、昆虫細胞、又は酵母細胞、必要に応じて、出芽酵母又はP.パストリスを含む。
該キットはまた、特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする核酸分子を含有する標的化ライブラリーの標的細胞又はレシピエント細胞として使用することができる第2の細胞株を含有することができる。一実施形態では、該キットはさらに、(e)第2の細胞株、必要に応じて、A431、A549、HCT116、K562、HAP1、HeLa-京都又はHEK-293T細胞を含む。
別の実施形態では、毒素耐性細胞株は、Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24、好ましくは、DNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む少なくとも1つの核酸分子を有し、発現する細胞を含む。一実施形態では、毒素は、毒素ドメイン及び結合ドメインを含む組換え毒素融合体である。別の実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。一実施形態では、毒素ドメインは、DTA、PE、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、DTA若しくはPE毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインはDTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、該標的化ライブラリーは、少なくとも1つのレンチウイルスベクターに含まれる。別の実施形態では、該キットは、タンパク質を同定するための一組の説明書をさらに含む。別の実施形態では、該キットは、少なくとも1つの細胞株、核酸分子、標的化ライブラリー及び一組の説明書、必要に応じて、細菌細胞又は酵母細胞を包装するための容器をさらに含む。
組換え毒素融合体をコードする核酸は、必要に応じて、実施例に記載されるように、プラスミドなどのベクターに含めることができる。
また提供されるのは、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのキットであって、
(a)第1の細胞株、
(b)少なくとも1つの組換え毒素融合体であって、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体、並びに
必要に応じて、複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーであって、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー
を含む、キットである。
(a)第1の細胞株、
(b)少なくとも1つの組換え毒素融合体であって、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含む組換え毒素融合体、並びに
必要に応じて、複数の核酸分子を含む標的化ライブラリーであって、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー
を含む、キットである。
一実施形態では、毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にある。別の実施形態では、結合ドメインは、受容体結合分子若しくはその結合断片、ペプチド若しくはその結合断片、抗体若しくはその結合断片、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、又はそれらを含む。一実施形態では、毒素ドメインは、DTA、PE、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、毒素ドメインは、DTA若しくはPE毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。
また提供されるのは、組換え毒素融合体をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのプローブであって、該組換え毒素融合体は、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び必要に応じて、転位ドメインを含み、該毒素ドメインは、組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、該結合ドメインは、毒素ドメインの反対側の末端にあり、該結合ドメインは、受容体結合分子、ペプチド、抗体、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。一実施形態では、毒素ドメインは、DTA、PE、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、リガンド若しくはその結合断片、必要に応じて、オーファンリガンド若しくはその結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、受容体結合分子は、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGF、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、ペプチドは、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42、又はそれらの結合断片であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、結合ドメインは翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、又はマンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれらを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、マンノース-6-リン酸付加であるか、又はそれを含む。別の実施形態では、転位ドメインは、DTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、又はそれらを含む。
本明細書に記載の方法を使用して、細胞外タンパク質/タンパク質相互作用ネットワークのつながりを解読して、新規な薬物標的を同定することができる。再生医薬において、本方法は、例えば、操作し、移植した細胞への宿主組織の応答を調節する受容体及び経路を同定するために使用することができる。さらに、新規な細胞型特異的組換え毒素融合体の同定は、インビトロ分化中に望ましくない細胞型の選択的な減少を可能にする。これらの同定された毒素は、特異的細胞型を死滅させるための複数の細胞型の培養集団に適用することができる。癌治療、免疫学及び免疫腫瘍学において、本明細書に記載の方法は、抗体及び他の生物製剤の標的細胞への結合を調節する因子を同定することができる。例えば、毒素に対するコンジュゲートモノクローナル抗体/生物製剤を用いて、細胞への抗体又は毒素コンジュゲートの侵入を調節する因子をスクリーニングすることができる。当業者は、Gタンパク質結合受容体(GPCR)などの膜タンパク質を介して作用する小分子の細胞標的を同定するためのアッセイを容易に改変することができる。
上記の開示は、本開示を概説する。以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単なる例示の目的で説明されており、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。状況が便宜を示唆又は与える可能性があるので、形態の変形及び均等物の置換は企図される。特定の用語が本明細書で用いられてきたが、そのような用語は、説明の意味で意図されており、限定のためのものではない。
以下の非限定的な実施例は、本開示の例示である。
実施例1
細胞外タンパク質の細胞表面受容体の発見方法
受容体-リガンド相互作用プラットフォーム
理論に拘束されるものではないが、ジフテリア毒素(DTA)及びシュードモナス外毒素A(PE)などの細菌外毒素は、三段階機構によってピコモル効力で細胞を中毒にさせる(図1)。第1に、毒素の受容体結合分子は、宿主細胞表面上の特異的受容体又は複数の受容体(例えば、DTAについてはHBEGF、PEについてはLRP1及びLRP1B(受託番号NM_018557))に結合し、続いてエンドサイトーシスが行われる。第2の工程において、毒素は、その転位ドメインを用いることによりエンドソームから細胞質へと移動する。第3に、毒素ドメインは、細胞死を引き起こすか、又は、例えば、タンパク質合成を強力に阻害することによって成長を阻害し、急速な細胞死をもたらす。異なる毒素は、成長を阻害するか、又は細胞死を引き起こす異なる機構を有する。例えば、SubAは、ER常駐シャペロンのBiPを切断することにより過剰なERストレスを引き起こし、他の毒素はRas経路構成要素などを阻害する。特に、毒素の受容結合分子が無関係の分泌タンパク質に置換されている場合、毒素はその効力を保持するが、新たな同族受容体を介して細胞に入る。DTA-IL2融合デニロイキン・ディフティトックス(denileukin diftitox)(ONTAK(登録商標))は、IL2受容体を発現する細胞を標的とするFDA認可薬物であり、そのような融合毒素の特異性及び効力を強調する。
細胞外タンパク質の細胞表面受容体の発見方法
受容体-リガンド相互作用プラットフォーム
理論に拘束されるものではないが、ジフテリア毒素(DTA)及びシュードモナス外毒素A(PE)などの細菌外毒素は、三段階機構によってピコモル効力で細胞を中毒にさせる(図1)。第1に、毒素の受容体結合分子は、宿主細胞表面上の特異的受容体又は複数の受容体(例えば、DTAについてはHBEGF、PEについてはLRP1及びLRP1B(受託番号NM_018557))に結合し、続いてエンドサイトーシスが行われる。第2の工程において、毒素は、その転位ドメインを用いることによりエンドソームから細胞質へと移動する。第3に、毒素ドメインは、細胞死を引き起こすか、又は、例えば、タンパク質合成を強力に阻害することによって成長を阻害し、急速な細胞死をもたらす。異なる毒素は、成長を阻害するか、又は細胞死を引き起こす異なる機構を有する。例えば、SubAは、ER常駐シャペロンのBiPを切断することにより過剰なERストレスを引き起こし、他の毒素はRas経路構成要素などを阻害する。特に、毒素の受容結合分子が無関係の分泌タンパク質に置換されている場合、毒素はその効力を保持するが、新たな同族受容体を介して細胞に入る。DTA-IL2融合デニロイキン・ディフティトックス(denileukin diftitox)(ONTAK(登録商標))は、IL2受容体を発現する細胞を標的とするFDA認可薬物であり、そのような融合毒素の特異性及び効力を強調する。
重要なことに、本明細書に示すように、中毒は受容体介在エンドサイトーシスを必要とするので、組換え融合体毒素に対する同族受容体を欠く細胞は、毒素に対して完全に耐性である(例えば、ジフテリア毒素Aに特有の受容体であるHB-EGFを欠く耐性HEK293T細胞を示す図2を参照されたい)。本明細書に記載するように、この根拠に基づいて、本明細書に記載のCRISPR-Cas9ベースの陽性遺伝子スクリーニングなどのゲノムワイド遺伝子スクリーニングのための方法及び構成要素が提供される。ゲノムワイドgRNAライブラリーを細胞に感染させ、続いて組換え毒素融合体処理を行うことにより、稀な耐性細胞の同定が可能になる。耐性細胞からのgRNAの配列決定により、受容体表面発現及び機能付与に必要な同族受容体並びに因子が同定される(図3)。
実験の設定
プラスミド
本開示は、以下のプラスミドを提供する。
プラスミド
本開示は、以下のプラスミドを提供する。
プラスミド1:ジフテリア毒素-リガンドの哺乳動物発現用の目的プラスミドpcDNA3.1-SP-DTA-GS-ccdB(図4;配列番号1)。リガンドを、ゲートウェイLRクローニングを用いて2つのattR部位間にクローニングした。
プラスミド2:ジフテリア毒素-リガンドの細菌発現用の目的プラスミドpET15b-SHT-SUMO-DTA-ccdB(図5、配列番号2)。リガンドを、ゲートウェイLRクローニングを用いて2つのattR部位間にクローニングした。
プラスミド3:リガンド-外来毒素Aの哺乳動物発現用の目的プラスミドpcDNA3.1-SP-ccdB-GSリンカー-PE40(図6;配列番号3)。リガンドを、ゲートウェイLRクローニングを用いて2つのattR部位間にクローニングした。
プラスミド4.リガンド-外来毒素Aの細菌発現用の目的プラスミドpET15b-SHT-ccd-PE40(図7;配列番号4)。リガンドを、ゲートウェイLRクローニングを用いて2つのattR部位間にクローニングした。
プラスミド5.リガンド-外来毒素Aの哺乳動物発現用の目的プラスミドpcDNA3.1-ccdB-PE38-6×His(図21;配列番号5)。リガンドを、ゲートウェイLRクローニングを用いて2つのattR部位間にクローニングした。これは、C末端に6×Hisタグを有するPE融合ベクターを提供する。
プラスミド3とプラスミド5の違いは、プラスミド5中のPE38が野生型外毒素Aの1つのループを欠いていることである。
本明細書に記載の核酸配列は、プラスミドの配列については表1Aに、CRISPR-Cas PAM配列、標的部位及びgRNAの配列については表1Bに記載されている。
毒素耐性細胞株の作製
野生型哺乳動物細胞内で毒素を生成することは、生成細胞自体に対して毒性であるので、本発明者らは、まず、ジフテリア毒素A(DTA)及びシュードモナス外毒素A(PE)に耐性のある細胞株を作製した。これを行うために、CRISPR-Cas9を用いて、これらの毒素による中毒に必要な遺伝子のDNAJC24をノックアウトした。
野生型哺乳動物細胞内で毒素を生成することは、生成細胞自体に対して毒性であるので、本発明者らは、まず、ジフテリア毒素A(DTA)及びシュードモナス外毒素A(PE)に耐性のある細胞株を作製した。これを行うために、CRISPR-Cas9を用いて、これらの毒素による中毒に必要な遺伝子のDNAJC24をノックアウトした。
HEK-293T細胞を、DNAJC24を標的とするgRNAとCas9をコードするPX459プラスミドで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、PE(最終12nM)で2日間処理した。生存細胞(DNAJC24 KO)をさらに2日間再増殖させ、その後の毒素生成に使用した。
哺乳動物細胞及び細菌細胞における組換え毒素融合体の生成
DNAJC24 KO細胞を、Lipofectamine(登録商標)2000を用いて、分泌される野生型又は組換え型の毒素融合体をコードするプラスミド(例えば、pcDNA3.1-SP-DTA-GS-ccdB及びpcDNA3.1-SP-codB-GSリンカー-PE40(図4及び図6を参照されたい))でトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間の時点で、培地を補充し、細胞をさらに2日間培養した。トランスフェクション後72時間の時点で、分泌毒素を含有する馴化培地を収集し、5分間、1,000rpmで遠心分離し、標的細胞に適用した。組換え毒素融合体はまた、適切な宿主細菌細胞をプラスミド、例えば、pET15b-SHT-SUMO-DTA-ccdB(図5)及びpET15b-SHT-ccdB-PE40(図7)で形質転換することにより細菌内で生成することができる。簡単に説明すると、組換え毒素融合体を、BL21(pLysS)細胞内で発現させ、18℃で16時間、0.5mMのIPTGで誘導した。Ni-NTAビーズを用いて、毒素融合体タンパク質を細菌溶解物から精製し、250mMのイミダゾールで溶出した。遠心カラムを用いてタンパク質を濃縮し、緩衝液を1×PBSに交換した。
DNAJC24 KO細胞を、Lipofectamine(登録商標)2000を用いて、分泌される野生型又は組換え型の毒素融合体をコードするプラスミド(例えば、pcDNA3.1-SP-DTA-GS-ccdB及びpcDNA3.1-SP-codB-GSリンカー-PE40(図4及び図6を参照されたい))でトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間の時点で、培地を補充し、細胞をさらに2日間培養した。トランスフェクション後72時間の時点で、分泌毒素を含有する馴化培地を収集し、5分間、1,000rpmで遠心分離し、標的細胞に適用した。組換え毒素融合体はまた、適切な宿主細菌細胞をプラスミド、例えば、pET15b-SHT-SUMO-DTA-ccdB(図5)及びpET15b-SHT-ccdB-PE40(図7)で形質転換することにより細菌内で生成することができる。簡単に説明すると、組換え毒素融合体を、BL21(pLysS)細胞内で発現させ、18℃で16時間、0.5mMのIPTGで誘導した。Ni-NTAビーズを用いて、毒素融合体タンパク質を細菌溶解物から精製し、250mMのイミダゾールで溶出した。遠心カラムを用いてタンパク質を濃縮し、緩衝液を1×PBSに交換した。
ゲノムワイドノックアウト細胞の作製
HAP1、HeLa-京都及びHEK-293T細胞をそれぞれ、レンチウイルス形質導入のために播種した。TKOv3レンチウイルス(70,000ガイド)を0.3のMOIで添加して、1細胞当たりの単一の感染を確実にした。当業者なら、より高いMOIが依然として感染を提供し、感染させるべきより多くの初期細胞が存在する場合には、MOIを低下させることができることを認識する。形質導入細胞を、2日間、ピューロマイシン(最終1.5μg/ml)で選択した。形質導入細胞を、その後のスクリーニングのために継代するか、又は将来の使用のために凍結した。HAP1細胞については、レトロウイルス又はトランスポゾンによる挿入変異誘発も有用である。例えば、ピギーバックシステムを使用するトランスポゾン挿入変異誘発。
HAP1、HeLa-京都及びHEK-293T細胞をそれぞれ、レンチウイルス形質導入のために播種した。TKOv3レンチウイルス(70,000ガイド)を0.3のMOIで添加して、1細胞当たりの単一の感染を確実にした。当業者なら、より高いMOIが依然として感染を提供し、感染させるべきより多くの初期細胞が存在する場合には、MOIを低下させることができることを認識する。形質導入細胞を、2日間、ピューロマイシン(最終1.5μg/ml)で選択した。形質導入細胞を、その後のスクリーニングのために継代するか、又は将来の使用のために凍結した。HAP1細胞については、レトロウイルス又はトランスポゾンによる挿入変異誘発も有用である。例えば、ピギーバックシステムを使用するトランスポゾン挿入変異誘発。
組換え毒素融合体を用いたCRISPRスクリーニング
600万個の形質導入細胞を、2枚の10cmプレートに播種した(T0でそれぞれ300万個の細胞を、T5まですなわち形質導入の5日目まで維持した)。この細胞数は、TKOv3ライブラリーの85倍のカバレッジを反映する。細胞を、T6で、0.9:2の比率で毒素を含有する馴化培地(すなわち、4.5mlの馴化培地+10mlの培地)で処理した。T8で、細胞を洗浄し、追加の毒素処理なしで、100%集密度まで再増殖させた。
600万個の形質導入細胞を、2枚の10cmプレートに播種した(T0でそれぞれ300万個の細胞を、T5まですなわち形質導入の5日目まで維持した)。この細胞数は、TKOv3ライブラリーの85倍のカバレッジを反映する。細胞を、T6で、0.9:2の比率で毒素を含有する馴化培地(すなわち、4.5mlの馴化培地+10mlの培地)で処理した。T8で、細胞を洗浄し、追加の毒素処理なしで、100%集密度まで再増殖させた。
あるいは、HAP1及びHEK293T細胞について、340万個の形質導入細胞を10cmプレート中に播種して、TKOv3ライブラリーの50倍のカバレッジを提供することができる。
次世代配列決定及び分析
毒素耐性細胞を、トリプシン処理及びゲノムDNA抽出のために遠心分離により収集した。製造業者のプロトコルを用いてQIAamp blood maxiキットを用いて、ゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAをその後のPCRの鋳型として用いて、gRNAコード領域を増幅した。増幅したgRNA領域を、次世代配列決定のための特有の配列でさらにバーコード化した。
毒素耐性細胞を、トリプシン処理及びゲノムDNA抽出のために遠心分離により収集した。製造業者のプロトコルを用いてQIAamp blood maxiキットを用いて、ゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAをその後のPCRの鋳型として用いて、gRNAコード領域を増幅した。増幅したgRNA領域を、次世代配列決定のための特有の配列でさらにバーコード化した。
分析
次世代配列決定の結果を、Liら(2014)に記載のMAGeCKパッケージを用いて分析した。要約すると、各gRNAについての読み取りカウントを取得し、それを毒素未処理対照集団と比較することによって正規化した。MAGeCKを、まず、富化スコアに基づいて個々のgRNAを計算し、著しく富化された遺伝子をランク付けする。最も富化された遺伝子の中でスクリーニング特異的な血漿膜タンパク質を探すと、所与のリガンドの受容体が同定される。以下で報告するQ値は、調整したp値とも呼ばれる。
次世代配列決定の結果を、Liら(2014)に記載のMAGeCKパッケージを用いて分析した。要約すると、各gRNAについての読み取りカウントを取得し、それを毒素未処理対照集団と比較することによって正規化した。MAGeCKを、まず、富化スコアに基づいて個々のgRNAを計算し、著しく富化された遺伝子をランク付けする。最も富化された遺伝子の中でスクリーニング特異的な血漿膜タンパク質を探すと、所与のリガンドの受容体が同定される。以下で報告するQ値は、調整したp値とも呼ばれる。
結果
本発明者らは、ゲノムワイドレンチウイルスgRNAライブラリーを使用して、ヒト一倍体HAP1細胞における天然PE及びDTAに対する耐性を付与する因子についてゲノムワイドCRISPR-Cas9スクリーニングを行った(図8)。これらのスクリーニングは、3種類のヒットを明らかにした。第1に、本発明者らは、スクリーニングにおけるトップヒットのうち、DTA受容体のHBEGF及びPE受容体のLRP1を同定し、本開示の手法の主要原理を確認した(図9;表2及び表3)。
表2.CRISPRスクリーニングからのジフテリア毒素に対する耐性を与える遺伝子のリスト。HBEGFはDTA受容体である。DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、及びDNAJC24は、ジフタミド生合成に関与する。
本発明者らは、ゲノムワイドレンチウイルスgRNAライブラリーを使用して、ヒト一倍体HAP1細胞における天然PE及びDTAに対する耐性を付与する因子についてゲノムワイドCRISPR-Cas9スクリーニングを行った(図8)。これらのスクリーニングは、3種類のヒットを明らかにした。第1に、本発明者らは、スクリーニングにおけるトップヒットのうち、DTA受容体のHBEGF及びPE受容体のLRP1を同定し、本開示の手法の主要原理を確認した(図9;表2及び表3)。
第2に、PEスクリーニングはまた、血漿膜へのLRPファミリー受容体の輸送に特異的に必要なERシャペロンMESDC2を同定した(表3)。これは、本開示の方法が、受容体シグナル伝達経路の重要な構成要素を同定することを実証する。最後に、本発明者らは、PE及びDTA中毒に必要な一般的な因子を同定した。これらのヒットは、図10に示すDTAによる中毒に必要な遺伝子と共に、標的化部分とは独立して中毒を調節するので、全てのスクリーニングにおいて陽性対照として機能する。
本開示の方法が、受容体結合分子、例えば、外毒素に融合された分泌タンパク質などのリガンドを含む組換え毒素融合体のための受容体を同定することができることを実証するために、EGF-PE(PE転位ドメイン及び毒素ドメインに融合したリガンド表皮成長因子(EGF);図11)を有するHeLa細胞において、ゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングを行った。スクリーニングにおける第2の最高ヒットは、EGFの既知の同族受容体であるEGFRであり、本開示のプラットフォームを確証した(表4)。
さらに、HEK293T細胞中のCXCL9-PE(外毒素Aの転位ドメインと毒素ドメイン、及び受容体結合分子CXCL9を含む組換えリガンドコンジュゲート毒素融合体)並びにPTN-PE(外毒素Aの転位ドメインと毒素ドメイン、及び受容体結合分子PTNを含む組換えリガンドコンジュゲート毒素融合体)を用いると、異なる毒性効果が示される(図13)。加えて、ジフテリア毒素の転位ドメインと毒素ドメイン及びTATペプチドの結合ドメインを含む組換え毒素融合体(図14)は、野生型ジフテリア毒素よりもHEK293T細胞に対して異なる毒性効果を有することが示される(図15)。さらに、ジフテリア毒素の転位ドメインと毒素ドメイン、及びAβ40又はAβ42ペプチドである結合ドメインを含む組換え毒素融合体(図16)は、HeLa及びHEK293Tに対して異なる毒性効果を有することが示される(図17)。理論に拘束されるものではないが、これらの結果は、毒素が受容体介在エンドサイトーシスを介して細胞に入ることを示唆する。これらの結果は、組換え外毒素を、代替の受容体又は機構を介して(例えば、TATの場合には適応翻訳を介して)細胞に入るように操作することができることを示す。
考察
これらのデータから、本開示の手法が分泌タンパク質などのリガンドの細胞表面受容体(及びそれらの品質管理因子)の発見のための強力なプラットフォームであることが実証される。例えば、本方法は、基本研究において、細胞外タンパク質/タンパク質相互作用ネットワークのつながりを解読するために使用することができ、新規な生物学的洞察及び薬物標的をもたらす。再生医療において、本方法は、例えば、操作され、移植された細胞に対する宿主組織の応答を調節する受容体及び経路を同定するために使用することができる。さらに、新規な細胞型特異的組換え毒素融合体の同定は、インビトロ分化中に望ましくない細胞型の選択的な減少を可能にする。癌治療、免疫学及び免疫腫瘍学において、それは、抗体及び他の生物製剤の標的細胞への結合を調節する因子を同定することができる。最後に、当業者なら、GPCRなどの膜タンパク質を介して作用する小分子の細胞標的を同定するためのアッセイを容易に改変することができる。
これらのデータから、本開示の手法が分泌タンパク質などのリガンドの細胞表面受容体(及びそれらの品質管理因子)の発見のための強力なプラットフォームであることが実証される。例えば、本方法は、基本研究において、細胞外タンパク質/タンパク質相互作用ネットワークのつながりを解読するために使用することができ、新規な生物学的洞察及び薬物標的をもたらす。再生医療において、本方法は、例えば、操作され、移植された細胞に対する宿主組織の応答を調節する受容体及び経路を同定するために使用することができる。さらに、新規な細胞型特異的組換え毒素融合体の同定は、インビトロ分化中に望ましくない細胞型の選択的な減少を可能にする。癌治療、免疫学及び免疫腫瘍学において、それは、抗体及び他の生物製剤の標的細胞への結合を調節する因子を同定することができる。最後に、当業者なら、GPCRなどの膜タンパク質を介して作用する小分子の細胞標的を同定するためのアッセイを容易に改変することができる。
実施例2
マンノース-6-リン酸修飾に依存する細胞外相互作用の同定
本実施例では、マンノース-6-リン酸修飾に依存する細胞外相互作用を同定した。N-アセチルグルコサミン-6-スルファターゼ(GNS)及びガングリオシドGM2活性化因子(GM2A)などのリソソームタンパク質のリソソームへの輸送は、翻訳後のマンノース-6-リン酸(M6P)修飾によって調節される。陽イオンに依存しないマンノース-6-リン酸受容体(IGF2R、CI-MPRとしても知られている)は、細胞表面又はリソソーム表面上に局在化し、M6Pタグに結合する(図18)。実施例1の工程に続いて、GNS-PE38(外毒素A(PE38)のC末端断片に融合したGNS)と、GM2A-PE38(PE38に融合したGM2A)を用いて、HAP1細胞においてゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングを行った。両方の場合において、IGF2Rが、それぞれのスクリーニングで最も富化された第2の遺伝子であり、スクリーニングプラットフォームが分泌タンパク質に関する翻訳後修飾に依存する相互作用を同定できることを実証した(表5及び表6)。GNS-PE38の場合に、スクリーニングは、タンパク質輸送に関与するVPS37A、PTPN23、HGS及びUBAP1と、ジフタミド生合成に関与するDPH1、DPH2、DPH5、DPH7及びDNAJC24も同定した(表5A及びB)。GM2A-PE38の場合に、スクリーニングは、タンパク質輸送に関与するKDELR1、KDELR2、DNAJC13、ARL5B、及びARFRP1と、ジフタミド生合成に関与するDPH2及びDPH7も同定した(表6A及びB)。
マンノース-6-リン酸修飾に依存する細胞外相互作用の同定
本実施例では、マンノース-6-リン酸修飾に依存する細胞外相互作用を同定した。N-アセチルグルコサミン-6-スルファターゼ(GNS)及びガングリオシドGM2活性化因子(GM2A)などのリソソームタンパク質のリソソームへの輸送は、翻訳後のマンノース-6-リン酸(M6P)修飾によって調節される。陽イオンに依存しないマンノース-6-リン酸受容体(IGF2R、CI-MPRとしても知られている)は、細胞表面又はリソソーム表面上に局在化し、M6Pタグに結合する(図18)。実施例1の工程に続いて、GNS-PE38(外毒素A(PE38)のC末端断片に融合したGNS)と、GM2A-PE38(PE38に融合したGM2A)を用いて、HAP1細胞においてゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングを行った。両方の場合において、IGF2Rが、それぞれのスクリーニングで最も富化された第2の遺伝子であり、スクリーニングプラットフォームが分泌タンパク質に関する翻訳後修飾に依存する相互作用を同定できることを実証した(表5及び表6)。GNS-PE38の場合に、スクリーニングは、タンパク質輸送に関与するVPS37A、PTPN23、HGS及びUBAP1と、ジフタミド生合成に関与するDPH1、DPH2、DPH5、DPH7及びDNAJC24も同定した(表5A及びB)。GM2A-PE38の場合に、スクリーニングは、タンパク質輸送に関与するKDELR1、KDELR2、DNAJC13、ARL5B、及びARFRP1と、ジフタミド生合成に関与するDPH2及びDPH7も同定した(表6A及びB)。
実施例3
グリコサミノグリカンに依存する細胞外相互作用の同定
グリコサミノグリカンに依存する細胞外相互作用をこの実施例で同定した。FGF2などの線維芽細胞成長因子(FGF)は、決定的なヘパリン硫酸への結合特性を有する細胞シグナルタンパク質であり、可変的に硫酸化した反復二糖単位からなる炭水化物のグリコサミノグリカンファミリーのメンバーである。実施例1の工程に続いて、6.5nMのFGF2-サポリン(FGF2-サポリンをAdvanced Targeting Systemsから購入した、製品番号IT-38;サポリンに融合したFGF2(図19A))を用いて、HeLa細胞においてゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングを行った。表7に示すように、耐性を付与する最も富化された遺伝子は、グリコサミノグリカン生合成経路に関与し、FGF/FGFR相互作用におけるヘパラン硫酸の確立された役割と一致し(図19B)、これにより、ヘパリン硫酸が、FGFR1、FGFR2、FGFR3又はFGFR4とのFGF相互作用に必要である。また、結果から、一般的なサボンソウ(soapwort)由来の植物毒素であるサポリンが、スクリーニングプラットフォームにおいて中毒因子として使用できることが示される。
グリコサミノグリカンに依存する細胞外相互作用の同定
グリコサミノグリカンに依存する細胞外相互作用をこの実施例で同定した。FGF2などの線維芽細胞成長因子(FGF)は、決定的なヘパリン硫酸への結合特性を有する細胞シグナルタンパク質であり、可変的に硫酸化した反復二糖単位からなる炭水化物のグリコサミノグリカンファミリーのメンバーである。実施例1の工程に続いて、6.5nMのFGF2-サポリン(FGF2-サポリンをAdvanced Targeting Systemsから購入した、製品番号IT-38;サポリンに融合したFGF2(図19A))を用いて、HeLa細胞においてゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングを行った。表7に示すように、耐性を付与する最も富化された遺伝子は、グリコサミノグリカン生合成経路に関与し、FGF/FGFR相互作用におけるヘパラン硫酸の確立された役割と一致し(図19B)、これにより、ヘパリン硫酸が、FGFR1、FGFR2、FGFR3又はFGFR4とのFGF相互作用に必要である。また、結果から、一般的なサボンソウ(soapwort)由来の植物毒素であるサポリンが、スクリーニングプラットフォームにおいて中毒因子として使用できることが示される。
実施例4
サブチラーゼ外毒素を利用するスクリーニングプラットフォーム
本開示は、異なる毒素に適合するスクリーニングプラットフォームを提供する。スクリーニング用プローブの一部としてのサブチラーゼ外毒素の使用をこの実施例に示した。実施例1の工程の後に、SibTech社(Brookfield,Connecticut、USA;カタログ番号SBT077-012)(図20)から得た20nMのEGF-SubAを用いて、ゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングをA549細胞において行った。SubAは、サブチラーゼ外毒素の毒素ドメインである。表8に示すように、生存細胞集団中の最も富化された遺伝子は、EGF受容体(EGFR)であった。これらの結果から、上記の実施例1に示した結果を考慮して、本明細書に開示したスクリーニングプラットフォームは、同じリガンド(例えば、EGF)に融合した異なる毒素(例えば、SubA及びPE)と適合性があることが実証された。
サブチラーゼ外毒素を利用するスクリーニングプラットフォーム
本開示は、異なる毒素に適合するスクリーニングプラットフォームを提供する。スクリーニング用プローブの一部としてのサブチラーゼ外毒素の使用をこの実施例に示した。実施例1の工程の後に、SibTech社(Brookfield,Connecticut、USA;カタログ番号SBT077-012)(図20)から得た20nMのEGF-SubAを用いて、ゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングをA549細胞において行った。SubAは、サブチラーゼ外毒素の毒素ドメインである。表8に示すように、生存細胞集団中の最も富化された遺伝子は、EGF受容体(EGFR)であった。これらの結果から、上記の実施例1に示した結果を考慮して、本明細書に開示したスクリーニングプラットフォームは、同じリガンド(例えば、EGF)に融合した異なる毒素(例えば、SubA及びPE)と適合性があることが実証された。
本開示を、現在好ましい実施例であると考えられるものを参照して説明してきたが、本開示は開示した実施例に限定されないことが理解されるべきである。逆に、本開示は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれる様々な変更並びに等価な構成を網羅することが意図される。
全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許又は特許出願が、その全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、例えば、表又は他の場所に提供される受託番号及び/又はバイオマーカー配列(例えば、タンパク質及び/又は核酸)を含む本明細書に提供される各受託番号に関連付けられる配列は、その全体が参照により組み込まれる。
特許請求の範囲は、好ましい実施形態及び実施例によって限定されるべきではないが、全体としての説明と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
参考文献
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WO2011006145A2
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WO2011006145A2
Claims (24)
- 受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのin vitroの方法であって、
(a)標的化ライブラリーを含む操作した細胞の集団であって、前記集団の個々の操作した細胞が標的化ライブラリーの核酸分子を含有し、前記核酸分子が標的遺伝子に相補的な核酸配列を含む、細胞の集団を提供する工程、
(b)前記操作した細胞の集団を、前記組換え毒素融合体の結合ドメインが前記操作された細胞の細胞表面受容体と相互作用できるように、毒素ドメイン及び結合ドメインを含む組換え毒素融合体と十分な時間接触させることにより、細胞の選択プールを生成し、前記細胞の選択プールが毒素に耐性のある細胞である工程、及び
(c)毒素に耐性の前記細胞の選択プールに含まれる標的化ライブラリーの核酸分子のうちの1以上の配列を決定して、受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質をコードする前記標的遺伝子を同定する工程、
を含み、
前記毒素ドメインが、前記組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、
前記結合ドメインが、前記毒素ドメインの反対側の末端にあり、かつ
前記結合ドメインが、受容体結合分子、ペプチド、抗体、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、あるいは受容体結合分子、ペプチド、抗体、炭水化物、小分子、又は脂質を含む、
in vitroの方法。 - 前記組換え毒素融合体が、転位ドメインをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸分子が、gRNA、siRNA、shRNA又はmiRNAを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記核酸分子がgRNAを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記gRNAがCRISPR-Casシステムの一部であり、任意選択で前記CRISPR-CasシステムがCas9を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記標的化ライブラリーが哺乳動物ライブラリー、任意選択でヒト又はマウスのライブラリーであり、及び/又は前記標的化ライブラリーが全ゲノムライブラリーである、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的化ライブラリーが、細胞表面受容体、任意選択でGタンパク質共役受容体、を標的とする核酸分子、細胞表面受容体介在経路のタンパク質を標的とする核酸分子、及び/又は受容体成熟因子を標的とする核酸分子を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記毒素ドメインが、ジフテリア毒素(DTA)、シュードモナス外毒素A(PE)、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン(bouganin)、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片であるか、あるいはジフテリア毒素(DTA)、シュードモナス外毒素A(PE)、サポリン、ゲロニン、パーフリンゴリジン、リステリオリシン、α-ヘモリシン、サブチラーゼ細胞毒、ボウガニン(bouganin)、若しくはリシンの毒素ドメイン、又はそれらの毒性断片を含み、任意選択で前記毒素ドメインが前記組換え毒素融合体のアミノ末端若しくはカルボキシル末端にある、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記受容体結合分子が、リガンド又はオーファンリガンドであるか、あるいはリガンド又はオーファンリガンドを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記受容体結合分子が、EGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGFであるか、あるいはEGF、PTN、CXCL9、GNS、GM2A若しくはFGFを含む、
又は前記ペプチドが、TATペプチド、Aβ40若しくはAβ42であるか、あるいはTATペプチド、Aβ40若しくはAβ42を含む、
請求項9に記載の方法。 - 前記結合ドメインが翻訳後修飾を含み、任意選択で前記翻訳後修飾が、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、若しくはマンノース-6-リン酸付加であるか、あるいはリン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、若しくはマンノース-6-リン酸付加を含み、任意選択で前記結合ドメインが、前記毒素ドメインの反対側の末端にある、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記転位ドメインが、DTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片であるか、あるいはDTA若しくはPE転位ドメイン、又はその膜貫通経路形成断片を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞に投与されたとき、前記組換え毒素融合体が、非操作細胞の少なくとも99%を死滅させる、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 毒素耐性細胞株、毒素生成細胞株又は毒素を生成するin vitroの方法であって、
(I)Cas又はCpf1をコードする核酸配列と、HBEFG、FURIN、MESDC2、LRP1、LRP1B、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列とを含む、少なくとも1つの核酸分子を選択細胞株の細胞に導入し、発現させる工程、
並びに
(II)
(a)前記毒素耐性細胞株を生成するのに十分な時間、前記細胞を毒素と接触させる工程、又は
(b)
(i)前記毒素耐性細胞株を生成するのに十分な時間、前記細胞を毒素と接触させる工程、及び
(ii)工程(b)(i)の細胞に、前記毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を導入し、発現させる工程、
又は
(c)
(i)前記毒素耐性細胞株を生成するのに十分な時間、前記細胞を毒素と接触させる工程、
(ii)工程(c)(i)の細胞に、前記毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子を導入し、発現させる工程、
(iii)培地中で前記細胞を成長させる工程、及び
(iv)前記毒素又は前記組換え毒素融合体を含有する前記培地を収集する工程、
を含む、方法。 - 前記毒素が、ジフテリア毒素(DTA)、シュードモナス外毒素A(PE)、サポリン又はサブチラーゼ細胞毒である、請求項14に記載の方法。
- 前記CasがCas9である、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記細胞株がHEK-293、好ましくは、HEK-293Tである、請求項14~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を、少なくとも2日間、少なくとも0.1nMの毒素と接触させる、請求項14~17のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの核酸分子を含み、発現させる細胞集団を含む毒素耐性細胞株又は毒素生成細胞株であって、前記核酸分子が、(i)Cas又はCpf1をコードする核酸配列、及び(ii)HBEFG、FURIN、MESDC2、LRP1、LRP1B、DPH1、DPH2、DPH3、DPH5、DPH7、又はDNAJC24を標的とする少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列を含み、
前記毒素生成細胞株が毒素又は組換え毒素融合体をコードする核酸配列をさらに含む、
毒素耐性細胞株又は毒素生成細胞株。 - 前記毒素が、ジフテリア毒素(DTA)又はシュードモナス外毒素A(PE)である、請求項19に記載の細胞株。
- 前記細胞集団が、100μMまでの前記毒素に対して耐性である、請求項19又は20に記載の細胞株。
- 前記CasがCas9である、請求項19~21のいずれか一項に記載の細胞株。
- 前記細胞株がHEK-293、好ましくは、HEK-293Tである、請求項19~22のいずれか一項に記載の細胞株。
- 受容体-リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するためのキットであって、
(a)第1の細胞株、
(b)組換え毒素融合体、又は前記組換え毒素融合体をコードし発現させることができる核酸配列を含む少なくとも1つの核酸分子であって、
前記組換え毒素融合体が、毒素ドメイン、結合ドメイン、及び任意選択で転位ドメインを含み、
前記毒素ドメインが、前記組換え毒素融合体のアミノ末端又はカルボキシル末端にあり、
前記結合ドメインが、前記毒素ドメインの反対側の末端にあり、かつ
前記結合ドメインが、受容体結合分子、ペプチド、抗体、炭水化物、小分子、又は脂質であるか、あるいは受容体結合分、ペプチド、抗体、炭水化物、小分子、又は脂質を含む、
組換え毒素融合体又は少なくとも1つの核酸分子、
のうちの1以上、
並びに任意選択で、
(c)標的化ライブラリーであって、個々の核酸分子が特異的遺伝子の遺伝子発現を標的とする標的化ライブラリー、
(d)細菌細胞、昆虫細胞若しくは酵母細胞、及び/又は
(e)第2の細胞株
のうちの1以上を含み、
前記第1の細胞株が前記組換え毒素融合体に対して耐性がある、キット。
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