CN101870685B - 从紫色马铃薯中提制花色苷的方法 - Google Patents

Abstract

一种从紫色马铃薯中提制花色苷的方法，包括采用柠檬酸酸化乙醇安全无毒地提取紫色马铃薯花色苷粗提物，及以AB-8大孔吸附树脂分离纯化紫色马铃薯花色苷，该方法采用天然产物化学及中药现代化生产技术提取，及分离纯化紫色马铃薯主要活性成分花色苷，将其制成10～15％纯度规格的紫色马铃薯花色苷提取物，安全有效、简便、合理、经济地实现马铃薯资源的高值化利用和系列产品的工业化生产，充分体现了绿色化学生产的理念。

Description

从紫色马铃薯中提制花色苷的方法

技术领域：

本发明涉及一种提取、分离纯化园艺植物中生理活性成分的绿色化学工艺技术，尤指一种采用柠檬酸酸化乙醇提取、及以AB-8大孔吸附树脂分离纯化紫色马铃薯花色苷的绿色提取、及分离纯化方法。

背景技术：

花色苷是植物次生代谢过程中产生的类黄酮物质，具有抗氧化、抗衰老、防止血管硬化等多种生理作用，可作为食品、药品和化妆品等领域的天然原料。自20世纪50年代以来，随着对合成花色苷安全性问题的深入认识，许多国家大幅度减少甚至完全禁止合成花色苷用于食品、药品和化妆品等领域，使得天然花色苷成为了当前天然产物研究开发的热点。

紫色马铃薯(Solanum tuberosum L.)营养丰富，是一种富含花色苷的园艺植物资源。2000年以来，国内各研究机构对其进行了大量的栽培改良研究，如云南省农业科学院马铃薯研发中心改良筛选的200多份不同品系的彩色马铃薯，黑龙江省牡丹江市蔬菜科学研究所培育的高淀粉黑色马铃薯品系，青海的青薯168、宁夏的宁薯1号和宁薯3号等。目前在新疆、四川、青海、广西、陕西等地均已开始大面积种植。Gisela Jansen等研究认为，紫色马铃薯花色苷的含量最高可达2.704g/kg，花色苷平均含量可达0.65g/kg鲜薯。

研究表明，花色苷不稳定，易受温度、光、pH等的影响而发生颜色和性质的变化，但紫色马铃薯花色苷是以酰化为主的花色苷，能在加工、储藏及应用过程中保持较好的稳定性。紫色马铃薯花色苷主要为锦葵色素、牵牛花色素、芍药色素、飞燕草色素的酰化衍生物。然而，目前国内外对紫色马铃薯的开发利用主要集中于淀粉品质成分上，而花色苷等生理活性成分大多作为副产物而被浪费。

目前提取、分离纯化花色苷及马铃薯花色苷的主要技术方法有：

提取：针对花色苷的提取，国内外主要有溶剂提取法、发酵法、酶法提取法、超临界C0₂提取法、微波辅助提取法、液态静高压辅助提取法、高压脉冲电场辅助提取法等。李知敏研究认为采用体积分数75％的酸化乙醇、料液比(质量浓度)1∶10、50℃下浸提60min的提取技术，所得蓝莓花色苷含量最高。霍琳琳等研究认为采用体积分数30％的酸化乙醇、料液比1∶10、60℃下提取60min的提取技术，所得桑椹花色苷得率最高。Revilla等研究认为，采用1％的HCl甲醇溶液提取葡萄花色苷，效果最好。韩永斌等利用发酵法对紫甘薯花色苷的提取进行了研究，结果表明，酵母接种量为10％时，发酵温度27℃，初始pH值为3.0，发酵72h，花色苷产量达到66.6g/ml。李颖畅等采用纤维素酶、果胶酶及两者复合对蓝莓花色苷进行了提取，发现纤维素酶效果较好，且采用酶用量5mg/g、料液比(质量浓度)1∶8、pH5.0、提取时间60min、酶解温度45℃的操作参数，花色苷提取率最高。时海香等研究了超临界CO₂萃取常山胡柚天然色素的工艺，认为最佳工艺条件为：萃取时间2h、萃取压力25MPa、原料与乙醇(体积分数95％)比(质量浓度)1∶3、萃取温度35℃，花色苷提取率可达96.87％。许正虹等以甘薯粉为原料，在微波条件下萃取其花色苷，认为最佳萃取工艺参数为：微波辐射功率700W、温度70℃、辐射时间6.37min、固液比1∶15、HCl体积分数为0.3％。Corrales等采用液态静高压辅助提取的方法从葡萄皮中提取花色苷，认为最优工艺参数为：100％乙醇，温度50℃，压力600MPa，花色苷产率提高23％。张燕等研究了高压脉冲电场处理对红梅花色苷提取过程的影响，结果表明，用3.0kV/cm PEF处理420个脉冲后，用酸化甲醇提取15min，可使花色苷的提取率达到54.24％。

分离纯化：目前花色苷分离纯化的方法主要是层析法，包括纸层析(PC)、薄层层析(TLC)、柱层析(CC)、高效液相色谱法(HPLC)以及高速逆流色谱法(HSCCC)等。卢其能等对紫色马铃薯Chieflmn和YNZH两个品种采用正己烷萃取纯化，再用薄层层析花色苷进行分离。Fiorini采用制备型高效液相色谱对草莓、接骨木、茄子、萝卜等的花色苷进行了分离纯化，结果表明HPLC是分离单糖基或酰化的二糖基和三糖基花色苷的一种有效的方法。Torgils Fossen采用XAD-7离子交换树脂层析对一种挪威马铃薯品种的花色苷进行纯化，再用流动相为甲酸-水(1∶19，体积比)(A)和甲酸∶水∶甲醇(1∶4∶5，体积比)(B)的制备型HPLC来进一步分离，使其中花色苷组分得到很好的分离。Eichhorn等采用XAD-7树脂及洗脱剂甲醇乙酸(19∶1，体积比)对马铃薯花色苷进行纯化.再用高速逆流色谱法对其组分进行了分离。Rodriguez-Saona等采用丙酮和氯仿提取马铃薯花色苷，然后采用氯仿∶丙酮(2∶1，体积比)过夜萃取，收集水相，在40℃下使残余的丙酮蒸发，分离得到了花色苷。

显然，上述有关马铃薯花色苷提取及植物源性花色苷分离纯化方法虽能制备具有一定纯度和得率的马铃薯花色苷提取物，但由于受到技术手段的限制以及加工过程中使用了大量的有毒有机溶剂或化学制剂，使得产品明显存在安全性欠佳或者纯度与得率不高、生产量小、易吸湿、功效不明显、产品的品质和市场竞争力不足等缺陷。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种高效、绿色安全、低成本、高得率、较高纯度、适用于工业生产的从紫色马铃薯中提制花色苷的方法，为以柠檬酸酸化乙醇提取、及AB-8大孔吸附树脂分离纯化紫色马铃薯花色苷的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种从紫色马铃薯中提制花色苷的方法，该方法包括如下步骤：

a、以柠檬酸酸化乙醇提取紫色马铃薯花色苷粗提物：将新鲜紫色马铃薯遮光切碎打浆，用体积浓度为60～95％并经柠檬酸调节pH值为1.0～3.0的乙醇，按1公斤紫色马铃薯浆加10～30升乙醇的比例在30～70℃下提取60～120分钟，得到的粗滤液过200目尼龙布，离心，取澄清液，离心转速为3000～5000转/分，离心时间为5～15min；将澄清液在-0.05～-0.09MPa、40～45℃下浓缩，回收乙醇溶剂后真空冷冻干燥，即得紫色马铃薯花色苷粗提物；

b、将上述花色苷粗提物以AB-8大孔吸附树脂分离纯化：按1～3克上述花色苷粗提物加10～30毫升水的比例溶解花色苷粗提物，得溶解液；在室温下，将溶解液上样，使AB-8大孔吸附树脂吸附至饱和，上样体积2～4BV，上样流速1～3BV/h，然后先采用1～3BV的水以1～3BV/小时的流速冲洗杂质，再用2～6BV的50～90％体积浓度的食用乙醇以1.0～3BV/小时的流速洗脱花色苷，收集洗脱液，并将洗脱液在-0.05～-0.09MPa、40～70℃条件下浓缩回收乙醇，真空冷冻干燥，即得紫色马铃薯花色苷提取物。

AB-8大孔吸附树脂的处理：试验所用新购树脂需先用体积浓度为80～95％食用乙醇浸泡20～30小时，充分溶胀后装柱，用体积浓度为80～95％的食用乙醇清洗至流出液加等量蒸馏水无白色浑浊为止，再用蒸馏水洗至无醇味即可。已使用过树脂则需采用1～5％NaOH浸泡1～5小时后水洗至中性，再用1～5％柠檬酸浸泡1～5h后水洗至中性即可。

上述步骤中，采用经静态吸附与解吸筛选出来的大孔吸附树脂吸附紫色马铃薯花色苷，对未被大孔吸附树脂吸附部分，经减压浓缩回收乙醇。对上述步骤中吸附在大孔吸附树脂的紫色马铃薯花色苷进行洗脱回收，先用水洗去极性杂质，再采用较高浓度的食用乙醇洗脱紫色马铃薯花色苷。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1、集成采用柠檬酸酸化乙醇安全无毒地提取紫色马铃薯花色苷、AB-8大孔吸附树脂分离纯化紫色马铃薯花色苷的方法，不仅能安全有效地工业化生产10～15％纯度规格的紫色马铃薯花色苷提取物，用于后续的抗氧化、免疫调节、清除自由基等功能产品的研发以及花色苷高纯品的制备，而且可以安全、简便、合理、经济地实现马铃薯资源的高值化利用和系列产品的工业化生产，充分体现了绿色化学生产的理念和循环经济的策略。因而，本发明具有理论新颖、技术科学、操作及产品安全、工艺简便、资源节约、环境友好等特点。

2、采用天然产物化学及中药现代化生产技术提取、分离纯化紫色马铃薯主要活性成分花色苷，将其制成国际通行的各种纯度规格的紫色马铃薯花色苷提取物，较好地顺应和满足现代功能食品、保健品、药品、食品添加剂、饲料添加剂、日化用品等健康领域对其天然、安全、有效、方便的需求，同时，符合国家农业现代化与国际化的产业政策。

3、本发明所采用AB-8大孔吸附树脂对马铃薯花色苷的吸附率与解吸率显著高于D1400、XAD-7、D101、NKA-2、HP2MGL等树脂对马铃薯花色苷的吸附率与解吸率，同时，AB-8树脂价格稳定，再生容易，适用于工业化生产应用。

具体实施方式：

以四川大面积种植的紫色马铃薯为研究对象。

实施例1：

取1000克新鲜紫色马铃薯遮光切碎打浆，用体积浓度为80％并经柠檬酸调节pH值为2的酸化乙醇，按1公斤紫色马铃薯浆加20升酸化乙醇的比例在50℃下提取80分钟，得到的粗滤液过200目尼龙布，再用离心机在4000转/分钟下进行离心澄清10min，取澄清液；将澄清液-0.05～-0.09MPa、42℃下浓缩，回收乙醇溶剂后真空冷冻干燥，制得紫色马铃薯花色苷粗提物66.67克，采用pH示差法测得花色苷的提取得率为新鲜紫色马铃薯原料质量的0.068％，粗提取物中花色苷的纯度为1.02％。

按1克上述花色苷粗提物加10毫升水的比例溶解花色苷粗提物，然后在室温下，按照上样体积3BV、上样流速2BV的操作参数将溶解液进行上样，使AB-8大孔吸附树脂吸附至饱和，进而采用2BV的水以2BV/小时的流速冲洗杂质，再用5BV的体积浓度为70％的食用乙醇以2BV/小时的流速洗脱花色苷，收集洗脱液，并将洗脱液在-0.05～-0.09MPa、55℃条件下浓缩回收乙醇，真空冷冻干燥，即得紫色马铃薯花色苷提取物4.68克，用pH示差法测得分离纯化工艺中花色苷的得率为88.37％，纯度为12.84％，是花色苷粗提物的12.59倍。

实例2：

将1000克新鲜紫色马铃薯遮光切碎打浆，然后采用体积浓度为60％并经柠檬酸调节pH值为3的酸化乙醇，按1公斤新鲜紫色马铃薯浆加10升酸化乙醇的比例在30℃下提取120分钟，提取粗滤液过200目尼龙布，再用离心机在5000转/分钟下进行离心澄清5min，取澄清液；将澄清液-0.05～-0.09MPa、40℃下条件浓缩，回收乙醇溶剂后真空冷冻干燥，制得紫色马铃薯花色苷粗提物64.63克，采用pH示差法测得花色苷的提取得率为新鲜紫色马铃薯原料质量的0.053％，粗提取物中花色苷的纯度为0.82％。

按2克上述花色苷粗提物加20毫升水的比例溶解花色苷粗提物，在室温下，然后按照上样体积2BV、上样流速1BV/h的操作参数将溶解液进行上样，使AB-8大孔吸附树脂吸附至饱和，进而采用1BV的水以1BV/小时的流速冲洗杂质，再用6BV的体积浓度为50％的食用乙醇以1BV/小时的流速洗脱花色苷，收集洗脱液，并将洗脱液在-0.05～-0.09MPa、40℃条件下浓缩回收乙醇、真空冷冻干燥，即得紫色马铃薯花色苷提取物4.11克，用pH示差法测得分离纯化工艺中花色苷的得率为79.52％，纯度为10.26％，是花色苷粗提物的12.52倍。

实例3：

将1000克新鲜紫色马铃薯遮光切碎打浆，然后采用体积浓度为95％并经柠檬酸调节pH值为1的酸化乙醇，按1公斤新鲜紫色马铃薯浆加30升酸化乙醇的比例在70℃下提取60分钟，提取粗滤液过200目尼龙布，再用离心机在3000转/分钟下进行离心澄清15min，取澄清液；将澄清液-0.05～-0.09MPa、45℃下条件浓缩，回收乙醇溶剂后真空冷冻干燥，制得紫色马铃薯花色苷粗提物62.77克，采用pH示差法测得花色苷的提取得率为新鲜紫色马铃薯原料质量的0.059％，粗提取物中花色苷的纯度为0.94％。

按3克上述花色苷粗提物加30毫升水的比例溶解花色苷粗提物，在室温下，然后按照上样体积4BV、上样流速3BV/h的操作参数将溶解液进行上样，使AB-8大孔吸附树脂吸附至饱和，进而采用3BV的水以3BV/小时的流速冲洗杂质，再用2BV的体积浓度为90％的食用乙醇以3BV/小时的流速洗脱花色苷，收集洗脱液，并将洗脱液在-0.05～-0.09MPa、70℃条件下浓缩回收乙醇、真空冷冻干燥，即得紫色马铃薯花色苷提取物4.06克，用pH示差法测得分离纯化工艺中花色苷的得率为74.63％，纯度为10.85％，是花色苷粗提物的11.54倍。

对比实验：

将1000克新鲜紫色马铃薯遮光切碎打浆，然后采用体积浓度为75％并经盐酸调节pH值为2的酸化乙醇，按1公斤新鲜紫色马铃薯浆加10升酸化乙醇的比例在50℃下提取60分钟，提取粗滤液过200目尼龙布，再用离心机在4000转/分钟下进行离心澄清10min，取澄清液；将澄清液-0.05～-0.09MPa、42℃下条件浓缩，回收乙醇溶剂后真空冷冻干燥，制得紫色马铃薯花色苷粗提物59.38克，采用pH示差法测得花色苷的提取得率为新鲜紫色马铃薯原料质量的0.038％，粗提取物中花色苷的纯度为0.64％。

按1克上述花色苷粗提物加10毫升水的比例溶解花色苷粗提物，在室温下，然后按照上样体积3BV、上样流速2BV/h的操作参数将溶解液进行上样，使XAD-7大孔吸附树脂吸附至饱和，进而采用2BV的水以2BV/小时的流速冲洗杂质，再用5BV的体积浓度为70％的甲醇乙酸以1.5BV小时的流速洗脱花色苷，收集洗脱液，并将洗脱液在-0.05～-0.09MPa、55℃条件下浓缩回收甲醇乙酸、真空冷冻干燥，即得紫色马铃薯花色苷提取物4.63克，用pH示差法测得分离纯化工艺中花色苷的得率为51.34％，纯度为4.21％，是花色苷粗提物的6.58倍。

Claims (1)

1.一种从紫色马铃薯中提制花色苷的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

a、以柠檬酸酸化乙醇提取紫色马铃薯花色苷粗提物：将新鲜紫色马铃薯遮光切碎打浆，用体积浓度为60～95％并经柠檬酸调节pH值为1.0～3.0的乙醇，按1公斤紫色马铃薯浆加10～30升乙醇的比例在30～70℃下提取60～120分钟，得到的粗滤液过200目尼龙布，离心，取澄清液；将澄清液在-0.05～-0.09MPa、40～45℃下浓缩，回收乙醇溶剂后真空冷冻干燥，即得紫色马铃薯花色苷粗提物；

b、将上述花色苷粗提物以AB-8大孔吸附树脂分离纯化：按1～3克上述花色苷粗提物加10～30毫升水的比例溶解花色苷粗提物，得溶解液；在室温下，将溶解液上样，使AB-8大孔吸附树脂吸附至饱和，上样体积2～4BV，上样流速1～3BV/h，然后先采用1～3BV的水以1～3BV/小时的流速冲洗杂质，再用2～6BV的50～90％体积浓度的食用乙醇以1.0～3BV/小时的流速洗脱花色苷，收集洗脱液，并将洗脱液在-0.05～-0.09MPa、40～70℃条件下浓缩回收乙醇，真空冷冻干燥，即得紫色马铃薯花色苷提取物。