CN101861187A - 用于治疗干眼病的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有蛋白酶抑制性肽底物的眼科组合物。在一个优选的实施方案中，蛋白酶抑制性肽底物是明胶。该组合物还可含有半乳甘露聚糖。在一个特别优选的实施方案中，该组合物含有明胶、半乳甘露聚糖和硼酸盐。本发明还描述了施用这些组合物抑制蛋白酶MMP-9的方法、向眼睛局部施用该组合物、特别是治疗干眼病的方法。

Description

用于治疗干眼病的方法和组合物
本申请要求2007年11月16日递交的美国临时专利申请60/988,623的优先权，其公开的内容在此明确引入作为参考。
发明背景
干眼病或干眼症是一种引起疼痛和不适的病症。对于大部分个体而言，每天中的眨眼和液体补充提供了一个清洁舒适的眼睛表面。在干眼病患者中，眼睛表面变得非常敏感，从而引起疼痛和刺激。干眼病的病因学尚不清楚，但关于该病症的起因有许多理论。一种理论认为是腺体缺陷，其中，分泌液体来补充在眨眼、流泪和蒸发中损失的液体的眼睛腺体功能下降，分泌出的液体量不足。干眼病的另一种可能的起因涉及结膜和角膜的神经。这些神经要么变得不敏感从而导致眨眼校少并引起干燥，要么变得过于敏感，从而直接引起疼痛和干眼病症状的刺激特征的增加。慢性炎症可能是干眼病的另一个致病或诱导因素，无论炎症发作的起因是什么。眼睛的感染可引起干眼病，由感染引起的炎症会造成泪腺管堵塞。自身免疫病症(机体错误地将其自身的组织识别为外来组织)可能会使眼组织受到免疫学攻击，因此也可能是干眼病的致病因素之一。在一类这样的自身免疫病症——干燥综合征中，眼干(以及口干)是免疫细胞攻击产生眼泪和唾液的外分泌腺所引起的标志性症状。据估计，干燥综合征仅在美国就影响着4百万人，是第二常见的自身免疫疾病。干眼病的其它可能的致病因素包括激素或维生素的不足或过量。事实上，干眼病有可能是多种不同病症的结果，其中的任何一种或多种都可能在任何个体患者中引起疾病。
无论其致病因素是什么，大部分干眼病患者都希望能够缓解这些疼痛和不适的症状。为此，已经尝试了很多方法，其范围从手术到处方药再到非处方滴眼液产品。可供选择的手术包括通过闭合鼻泪管来暂时或永久性地除去正常的排液途径。暂时性闭合采用被称为泪小点塞(punctal plugs)的装置。开发出的用于治疗干眼病的非手术装置包括用于增加眼睛湿度的湿气室。治疗剂旨在治疗根本的生理学状况，从而减轻干眼病的严重程度或者完全消除干眼病，其可以是滴眼液形式的也可以不是滴眼液形式的。但是，到目前为止，FDA仅批准了一种用于治疗干眼病的治疗剂。虽然这些治疗或改善方法可为某些患者提供益处，但这些方案需要患者承担很大的风险、花费和/或不便。对于干眼病患者，一种方便的、相对廉价并且低风险性的治疗是人工泪液产品。这些局部制剂通常在需要时以滴眼液的形式应用，以补充或修补泪膜。因此，从最根本的意义上讲，人工泪液只是另一种增加眼睛湿度的方法。虽然它们在某些情况下可提供症状上的缓解，但却很少能够改变任何根本的眼睛或角膜病状。
对于干眼病的起因或病因学的一条相对新的研究路线研究了角膜中的金属蛋白酶类的潜在作用。金属蛋白酶是一组蛋白水解酶类，其特征在于它们需要在其活性位点结合金属离子例如Zn2+或Ca2+以使其具有催化活性。已知金属蛋白酶(MMP)参与涉及组织重构的过程。因此，在生理学上，MMP在肿瘤转移、胚胎发育和伤口愈合中起作用。有大约20种已知的MMP，它们似乎在结构上均彼此关联，有大约40％的氨基酸同源性。以前，各MMP是根据被认定的它们的主要底物来命名(例如，(i)胶原酶，其降解间质胶原(I，II和III型)；(ii)IV型胶原酶和明胶酶，其降解4型基膜胶原和明胶(变性的明胶)；(iii)基质溶素，其降解多种底物，包括蛋白聚糖、层粘连蛋白、明胶和纤连蛋白)或者有时根据酶的细胞来源来命名(例如，多形核白细胞明胶酶)。最后发现，这些酶中的大部分可以裂解多种底物，包括其它家族成员的无活性的多肽形式(酶原)，并且这些酶还可以降解非基质蛋白例如髓磷脂碱蛋白和α-1-抗胰蛋白酶。在结构上，大部分MMP具有一个催化结构域、一个羧基末端血液结合素样结构域(血液结合素结构域)和一个在酶激活过程中被裂解的前结构域。
H.Nagase等人在1992年发表的文章中为当时已知的MMP提供了数字命名和图表(例如MMP-1、MMP-2等)，后来发现的MMP沿袭了这一系统。作为生理学组织重构剂，MMP-9(明胶酶-B，IV-B型胶原酶)可以降解多种细胞外基质(ECM)和基底膜成分。MMP-9似乎通过如下方式在介导炎症中起作用：将炎症细胞因子白介素IL-1β转化成其活性的分泌形式、催化肿瘤坏死因子(TNFα)的翻译后活化、增强IL-8、进程趋化因子的活性以及降解丝氨酸蛋白酶抑制剂。此外，MMP-9可能还在自身免疫中起作用，因为它可以促进自身免疫抗体结合位的发展。已证实在干燥综合征患者的泪液中，MMP-9的局部活性升高。许多研究证实，在患有溃疡性角膜炎的人类和其它哺乳动物的泪液膜中，明胶酶、包括MMP-9的活性与正常角膜的泪液膜相比有显著增加。还研究了明胶酶在溃疡性角膜炎的发病中的作用。用MMP-9敲除小鼠进行的研究证实，MMP-9缺乏使角膜上皮屏障破坏对实验诱导的干眼病有了一定程度的耐受性。
在为了提供能够在体内抑制各种MMP活性的治疗剂所进行的尝试中，许多不同的研究组织合成了大量新的化学实体。在这些合理化设计的MMP抑制剂中，有许多已经通过了多种临床前的障碍并且在许多被认为与MMP有关的疾病中表现为潜在的治疗剂。但不幸的是，在临床试验中，这些化合物中有许多并没有象期望的那样有效，例如广谱MMP抑制剂马立马司他(BB-2516)和MMP-1选择性抑制剂托卡特(Ro 32-3555)。它们未能获得成功的原因之一是明显的副作用，例如肌肉骨骼毒性，特别是对于广谱抑制剂而言。另一个问题是缺乏改善疾病的效力，以托卡特为例，其在兔关节炎模型中获得的鼓舞人心的结果无法在人类试验中重现。事实上，英国Biotech的马立马司他是至少五个失败的III期临床试验的受试对象，Bayer和Pfizer均已终止了III期MMP抑制剂试验。
最近发现了一个新的明胶结合位点，其是MMP-9的血液结合素亚单位的一部分。
国际公开号WO 95/2969涉及用于眼泪替代疗法的组合物，其中含有细胞因子和生长因子，特别是TGFβ8。
美国专利6,444,791(Quay)涉及使用蛋白酶抑制剂、包括α2-巨球蛋白和α1-蛋白酶抑制剂治疗圆锥形角膜的方法。
美国专利4,923,700(Kaufman)涉及人工泪液系统，包括粘蛋白型颗粒和脂质型材料的水性混悬液。粘蛋白型颗粒由胶原、明胶和/或血清形成。
美国专利6,455,583(Pflugfelder等人)涉及局部使用四环素来减轻与延迟的眼泪清洁有关的炎症。
发明概述
现已出人意料地发现，当将相对少量的天然肽蛋白酶抑制剂掺入到眼科可接受的载体例如在人工泪液型组合物中所用的载体中时，会显示出明显的对金属蛋白酶的抑制作用。此外，还出人意料地发现，所形成的组合物可以增加角膜上皮细胞的活力并减轻其干燥。本发明涉及MMP抑制型局部眼科组合物，其在眼科可接受的载体中含有蛋白酶抑制性肽底物。本发明还涉及治疗干眼病的方法，包括向眼睛表面施用在眼科可接受的载体中含有蛋白酶抑制性肽底物的组合物。
本发明的第一组实施方案涉及局部用眼科组合物，其含有蛋白酶抑制性肽底物和眼科可接受的载体。该组实施方案中的一个优选的实施方案是在眼科可接受的载体中的蛋白酶抑制性肽底物和半乳甘露聚糖。另一个优选的实施方案是含有明胶和半乳甘露聚糖的局部用眼科组合物。本发明的其它实施方案包括含有半乳甘露聚糖和卵巨球蛋白、半乳甘露聚糖和胶原以及半乳甘露聚糖和酪蛋白的组合物。优选的半乳甘露聚糖是HP-瓜尔胶。
本发明的第二组实施方案涉及治疗干眼病的方法，包括向眼睛表面施用有效量的MMP-9抑制性肽底物。在优选的实施方案中，肽底物的量足以抑制MMP-9达至少50％。
不希望受到任何理论的束缚，据信蛋白酶抑制性肽底物可以抑制蛋白酶例如MMP-9的活性，从而降低蛋白酶作用于通常存在于眼组织中的内源性底物从而引起干眼病的能力。通过该方式，它们可以减轻MMP-9或其它眼蛋白酶的直接损伤作用。蛋白酶抑制性肽底物对蛋白酶例如MMP-9的部分或全部抑制作用可以是间接的，即，以变构型抑制的方起作用。蛋白酶抑制性肽底物的大小或分子量可以影响该抑制作用的效力。此外，蛋白酶抑制性肽底物还可以为变敏感的眼睛表面组织提供直接或间接的抗炎作用以及抗组织重构作用。这些作用被认为是通过肽底物与MMP酶、特别是MMP-9的相互作用所介导的。此外，本发明的某些实施方案还可以通过使蛋白酶抑制性肽缓释来延长这些治疗作用。例如，在本发明的一个优选的实施方案中，将蛋白酶抑制性肽底物与HP-瓜尔胶和硼酸盐组合形成凝胶该凝胶可以增强泪膜稳定性并防止眼表面干燥。此外，该凝胶还可以捕获蛋白酶抑制性肽底物，从而使底物保留在泪膜中，导致活性更为持久。蛋白酶抑制性肽底物还可以作为可溶性粘蛋白的支架以形成明胶-粘蛋白凝胶基体，从而增强泪膜的稳定性。
附图概述
图1显示了明胶A在Tricine缓冲液中对MMP-9的剂量响应性抑制。
图2显示了0.1％w/v的明胶A与粘滑剂聚合物组合显示出对MMP-9的明显的抑制作用。
图3显示了掺入Systane中的明胶A对MMP-9的剂量响应性抑制。
图4显示了在新泪然滴眼液(Tears Naturale II)中的明胶A对MMP-9的剂量响应性抑制。
图5显示了明胶A对细菌胶原酶的剂量响应性抑制。
图6显示了在Systane中的明胶A对细菌胶原酶的剂量响应性抑制。
图7显示了在新泪然滴眼液(Tears Naturale II)中的明胶A对细菌胶原酶的剂量响应性抑制。
图8显示了明胶A与粘滑剂聚合物组合显示出不同程度的对细菌胶原酶的抑制作用。
图9显示了当用包含明胶A的人工泪液产品处理时，能够防止干燥并且细胞活力增强。
图10显示了α-2巨球蛋白对MMP-9的剂量响应性抑制。
图11显示了重组人明胶8.5kD对MMP-9的剂量响应性抑制。
图12显示了重组人胶原对MMP-9的剂量响应性抑制。
发明详述
除非另有说明，否则本文中使用的下列术语应被理解为具有如下含义：
术语“蛋白酶”包括催化肽键裂解的酶。代表性的蛋白酶包括胶原酶和基质金属蛋白酶。
术语“蛋白酶抑制性肽底物”包括在根本上表现出肽的性质的物质，即，由一个或多个氨基酸链组成并且具有作为蛋白酶的底物的特性的物质。代表性的蛋白酶抑制性肽底物包括明胶、α-2巨球蛋白、卵巨球蛋白、酪蛋白和胶原。
术语“MMP”是指基质金属蛋白酶(酶)。
术语“MMP-9”是指被称为基质金属蛋白酶-9的酶。
术语“半乳甘露聚糖”是指从含有甘露糖和/或半乳糖部分作为主要结构成分的天然树胶或类似的天然或合成树胶得到的多糖。
术语“CMC”是指羧甲基纤维素及其盐。
术语“HPMC”是指羟丙甲基纤维素。
术语“HP-瓜尔胶”是指羟丙基瓜尔胶。优选具有低摩尔取代的(例如，低于0.6)的羟丙基瓜尔胶。
术语“眼睛表面”是指可以从外表接触到的眼睛组织，非限制性的代表性实例包括角膜、结膜、穹窿和巩膜。
术语“抑制量”是指无毒但又足以提供所需活性的抑制性物质的量。
术语“眼科可接受的载体”是指具有与眼组织生理相容性的物理性质(例如pH和/或渗透性)的成分。
现已出人意料地发现，当将相对少量的天然肽蛋白酶抑制剂掺入到人工泪液型组合物中时会显示出明显的对金属蛋白酶的抑制作用。更出人意料的是，蛋白酶抑制性肽底物的量可以非常低，因为已经发现浓度低达0.1％w/v的蛋白酶抑制性肽底物(其一种实施方案是明胶)可以对MMP-9产生大于50％的抑制作用。
蛋白酶抑制性肽底物的实例包括明胶、α-2巨球蛋白、卵巨球蛋白、胶原和酪蛋白，以下将对它们进行进一步的描述。但是，应当理解，也可以使用其它蛋白酶抑制性肽底物，并且它们也在本发明的范围之内。
明胶是通过将得自动物结缔组织的胶原部分水解所产生的蛋白。可通过商业渠道获得两种类型的明胶：A型得自酸处理的前体，而B型得自碱处理的前体。两种类型的明胶都是各种MMP的底物，可以作为MMP的竞争性抑制剂。
α-2巨球蛋白是一种由肝脏产生的存在于血液中的大蛋白，其能够灭活多种蛋白酶，包括金属蛋白酶。据报道，该灭活机制是35氨基酸区域，其起到蛋白酶的“诱饵”的作用：当蛋白酶结合并裂解该区域时，其便被绑定在α-2巨球蛋白上。所形成的复合物随后被巨噬细胞从血液中清除。
酪蛋白是一种存在于奶酪和牛奶中的磷蛋白。酪蛋白含有相对高数量的脯氨酸残基，因此具有很少的二级或三级结构。虽然其相对疏水，但却很容易在稀的碱和盐溶液中分散。
卵巨球蛋白也称为卵固蛋白，是一种由四个通过二硫键成对连接的亚单位组成的糖蛋白。已证实其对各种类型的蛋白酶、包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、硫醇蛋白酶和金属蛋白酶具有广谱抑制活性。
胶原是动物中的主要的蛋白质，其占总蛋白含量的约25％，并且是结缔组织中的主要的蛋白质。它是一种长的纤维状蛋白，形成了坚韧的束或纤维，后者一起形成提供组织和细胞构架的细胞外基质。在某些细胞内部也发现了胶原。胶原通常以三螺旋的形式存在，称为原胶原。原胶原的部分水解产生了明胶。
用于本发明的蛋白酶抑制性肽底物通常来自于动物。例如，来自牛或猪的皮肤或骨头的明胶是当今药物产品中使用的最主要的形式。需要进行粗加工以提供尽可能均匀和纯净的产物以用于所需的用途(口服、胃肠外、装置)。不存在传染性海绵状脑病(TSR)和疯牛病(BSE)的胶原和/或明胶可从多个供应商购买到，包括例如Gelita(Sergeant Bluff，Iowa)和Rousselot(Sobel Company，Dubuque，Iowa)。使用通过合成和/或重组技术生产的材料是另一种选择。例如，Fibrogen(San Francisco，California)利用重组酵母系统生产全合成的明胶和胶原。这些合成的材料在一致性(批次间的一致性、确定的分子量以及物理化学性质)、用户化(预定的特性、设计的分子)和生物相容性以及安全性(诱导免疫应答的风险下降，消除了污染)方面具有一定的优势。
本发明的组合物和方法包括足以抑制金属蛋白酶的量的蛋白酶抑制性肽底物。优选的金属蛋白酶是MMP-9。蛋白酶抑制性肽底物的量可随具体的底物而变化，但通常的量为约0.010％至10％重量/体积(w/v)，更优选约0.05％至1.0％(w/v)，最优选约0.05％至0.25％(w/v)。MMP的抑制百分比优选大于约50％，更优选大于约60％，仍更优选大于约70％。
在本发明的一个实施方案中，将蛋白酶抑制性肽底物与现有的干眼病制剂例如含有润滑聚合物系统的SYSTANE
Figure GPA00001138119000081
润滑滴眼液(AlconLaboratories，Inc.)组合。SYSTANE
Figure GPA00001138119000082
的聚合保护是通过粘滑剂(聚乙二醇400和丙二醇)、HP-瓜尔胶以及患者的天然眼泪的相互作用来实现的。当HP-瓜尔胶与天然眼泪混合时，发生了化学反应。HP-瓜尔胶与疏水性表面结合，形成了稠度像凝胶一样的网络。HP-瓜尔胶还可以使粘滑系统在眼睛表面保持更长的时间。
本发明的一个实施方案是含有半乳甘露聚糖、硼酸盐和明胶的组合物。可用于本发明的半乳甘露聚糖通常来自于瓜尔胶、槐豆胶和塔拉胶。此外，半乳甘露聚糖还可以通过经典的合成途径获得或通过化学修饰天然的半乳甘露聚糖获得。
本文所用的术语“半乳甘露聚糖”是指从上述天然树胶或含有甘露糖和/或半乳糖部分作为主要结构成分的类似的天然或合成树胶得到的多糖。本发明的优选的半乳甘露聚糖是由通过(1-6)连接键连接的(1-4)-β-D-吡喃甘露糖基单元和α-D-吡喃半乳糖基单元的直链组成的。对于优选的半乳甘露聚糖，D-半乳糖与D-甘露糖的比例可以改变，但通常是约1∶2至1∶4。最优选D-半乳糖与D-甘露糖的比例为约1∶2的半乳甘露聚糖。此外，在“半乳甘露聚糖”的定义中还包括其它化学修饰的多糖的改变形式。例如，可以对本发明的半乳甘露聚糖进行羟乙基、羟丙基和羧甲基羟丙基取代。当需要软凝胶时，对半乳甘露聚糖的非离子型取代例如含有烷氧基和烷基(C1-C6)基团的取代是特别优选的(例如羟丙基取代)。特别优选在非顺式羟基位的取代。由半乳甘露聚糖的非离子取代所形成的成分的例子是摩尔取代为约0.4的羟丙基瓜尔胶。也可以对半乳甘露聚糖进行阴离子取代。当需要强响应凝胶时，阴离子取代是特别优选的。
在本发明的某些实施方案中可以使用硼酸盐化合物。可用于本发明组合物中的硼酸盐化合物包括硼酸及其可药用盐例如硼酸钠(硼砂)和硼酸钾。本文所用的术语“硼酸盐”是指硼酸的所有药学上适用的形式。由于其在生理学pH下的良好的缓冲能力和公知的安全性以及与各种药物和防腐剂之间的相容性，硼酸盐是眼科制剂中的常用赋形剂。硼酸本身还具有抑菌和抑制真菌的特性，因此有助于组合物的防腐。
本发明的一个优选实施方案是含有0.01％至5％(w/v)的明胶、约0.1至5％(w/v)的一种或多种半乳甘露聚糖和约0.05至5％(w/v)的硼酸盐的组合物。优选地，组合物含有0.01％至1.0％(w/v)的明胶、0.2至2.0％(w/v)的半乳甘露聚糖和0.1至2.0％(w/v)的硼酸盐化合物。最优选地，组合物含有0.05％至0.5％(w/v)的明胶、0.3至0.8％(w/v)的半乳甘露聚糖和0.25至1.0％(w/v)的硼酸盐化合物。具体的量将随着所需的具体胶凝特性而改变。通常，可以对明胶、硼酸盐或半乳甘露聚糖的浓度进行调节，从而在凝胶化时(即给药后)能够达到适宜的组合物粘度。调节明胶、硼酸盐或半乳甘露聚糖的浓度可以在给定的pH下提供更强或更弱的胶凝作用。如果需要强烈胶凝的组合物，则可增加明胶、硼酸盐或半乳甘露聚糖的浓度。如果需要弱胶凝的组合物，例如部分胶凝的组合物，则可降低明胶、硼酸盐或半乳甘露聚糖的浓度。其它因素也可影响本发明组合物的胶凝特性，例如组合物中其它成分例如盐、防腐剂、螯合剂等的性质和浓度。通常，优选的本发明的非凝胶组合物，即，不会被眼睛凝胶化的组合物的粘度为约5至1000cps。通常，优选的本发明的凝胶组合物，即，可被眼睛凝胶化的组合物的粘度为约50至50,000cps。
最早的也是最为成功的人工泪液记载于美国专利4,039,662(Hecht等人)。该溶液已经以泪然(TEARS NATURALETM)润滑滴眼液(AlconLaboratories，Inc.，Fort Worth，Texas)的形式上市多年。在Hecht等人的上述美国专利4,039,662中记载并要求保护的溶液以及相应的市售产品使用了羟丙甲基纤维素、右旋糖酐70和苯扎氯铵的独特组合。在该产品的改进形式(目前以新泪然(TEARS NATURALETM II Polyquad
Figure GPA00001138119000101
)润滑滴眼液(Alcon Laboratories，Inc.)的名称销售)中，将苯扎氯铵用聚季铵盐-1(polyquaternium-1)代替，后者是聚合物型抗微生物剂/防腐剂。
可用于本发明的一种有机缓冲液的例子是Tricine，也称为N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸。有机缓冲液同时具有碱性和酸性基团，因此是两性离子型的；在生理学pH条件下，这些缓冲液同时携带正电荷和负电荷。
在隐形眼镜和眼科溶液的情况下，需要加入各种试剂来增强与眼睛的相容性。为了避免刺痛或刺激，使溶液的张力和pH在生理学范围内(例如张力为200-350mOsmole，pH为6.5-8.5)是非常重要的。为此，经常加入各种缓冲剂和渗透剂。最简单的渗透剂是氯化钠，因为它是人泪液中最主要的溶质。此外，还可加入丙二醇、乳果糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇或其它渗透剂来替代部分或全部氯化钠。此外，可以使用各种缓冲液系统例如柠檬酸盐、磷酸盐(Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4的适宜混合物)、硼酸盐(硼酸、硼酸钠、四硼酸钾、偏硼酸钾及混合物)、碳酸氢盐、氨丁三醇以及其它适宜的含氮缓冲液(例如ACES、BES、BICINE、BIS-Tris、BIS-TrisPropane、HEPES、HEPPS、咪唑、MES、MOPS、PIPES、TAPS、TES、Tricine)来确保约pH 6.5至8.5的生理学pH。
本发明的蛋白酶抑制性肽底物组合物可与一种或多种选自据信可在治疗干眼病中产生有益效果的其它治疗剂类型的另外的治疗剂例如抗生素、免疫抑制剂和抗炎剂联合。
可包括在本发明组合物中的抗炎剂包括甾体类或非甾体类药物(NSAID)。NSAID的例子包括但不限于酮咯酸氨丁三醇(Acular)、吲哚美辛、氟比洛芬钠、奈帕芬胺、溴芬酸、舒洛芬和双氯芬酸(Voltaren)。皮质类固醇的例子包括但不限于瑞美松龙、氢化可的松、氟氢可的松、氟米龙、氯替泼诺、曲安缩松、地塞米松、泼尼松龙、可的松、醛固酮、甲羟松和倍他米松。性类固醇的例子包括基于雄激素、雌激素和/或孕激素的那些。
抗生素的例子包括但不限于四环素、多西环素和化学修饰的四环素类、β-内酰胺抑制剂例如头孢西丁、亚胺培南和其它噻烯霉素衍生物、氯霉素、新霉素、羧苄青霉素、粘菌素、青霉素G、多粘菌素B、万古霉素、头孢唑啉、头孢噻啶、利福霉素、短杆菌肽、杆菌肽、磺胺类、依诺沙星、氧氟沙星、西诺沙星、司帕沙星、甲砜霉素、萘啶酸、甲苯磺酸妥舒沙星、氟诺沙星、三水合吡哌酸、吡咯酸、氟罗沙星、金霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、诺氟沙星、磺胺醋酰、磺胺异噁唑、妥布霉素、莫西沙星和左氧氟沙星。
免疫抑制剂的例子包括例如环孢菌素类例如环孢菌素A和子囊霉素类例如FK-506、雷帕霉素和他克莫司。也可将其它成分加入到本发明的组合物中。所述成分通常包括渗透压调节剂、螯合剂、药物活性剂、增溶剂、防腐剂、pH调节剂和载体。对于特定的加工过程，也可加入其它聚合物或单体物质例如聚乙二醇和甘油。可用于本发明组合物的渗透剂包括盐类例如氯化钠、氯化钾和氯化钙；非离子型渗透剂可包括丙二醇和甘油；螯合剂可包括EDTA及其盐；增溶剂可包括Cremophor EL
Figure GPA00001138119000111
和吐温80；其它载体可包括AmberliteIRP-60；pH调节剂可包括盐酸、Tris、三乙醇胺和氢氧化钠；适宜的防腐剂可包括苯扎氯铵、聚季铵盐-1和聚六亚甲基双胍。以上所列的实例是为了说明的目的而给出的，并非穷举性的。可用于上述目的的其它试剂的例子是眼科制剂中公知的并且包括在本发明的范围内。
以下实施例进一步说明了本发明的各种实施方案。提供这些实施例是为了帮助更好地理解本发明而不是要限制本发明的范围。
实施例1：
若无另外说明，在本实施例以及随后的实施例中，MMP活性是用对MMP-1、-2和-9敏感的荧光探针底物进行测定的，包括DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH和DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2。这些荧光探针底物测定是本领域公知的，例如参见Bickett等人，Analytical Biochemistry 212，58-64(1993)和Netzel-Arnett等人，Analytical Biochemistry 195，86-92(1991)，这两篇文章均引入本文作为参考。在进行测定前，将pro-MMP-9用对氨基苯基醋酸汞激活，并且无需进行细菌胶原酶激活。为了进行测定，制备浓度为0.1mM的底物在DMSO中的储备溶液，并且所有存在或不存在抑制剂的酶活性测定均在含有0.2MNaCl、10mM CaCl2、50mM ZnSO4和0.05％Brij-35的50mM Tricine缓冲液，pH 7.5中在室温下进行。(Brij-35是一种可购买到的聚氧乙烯十二烷基醚表面活性剂)。总样品体积为200μl，在96孔微量培养板中进行。用针对所用的特定底物而设定在适宜的激发/发射波长(即，λex＝280nm；λem＝360nm和λex＝280nm；λem＝360nm)下的微量培养板荧光读数器(FLx800I型，Bio-Tek Instrument)每隔1分钟记录一次荧光变化，共记录10分钟。酶活性用每分钟的荧光变化表示，其是在10分钟内关于酶反应所记录的荧光-时间线性直线的斜率。用不含抑制剂样品的速率减去抑制剂样品的速率然后除以不含抑制剂样品的速率并乘以100％计算出抑制％。
进行该测定来研究明胶A抑制MMP-9活性的潜力。在该研究中，MMP-9的浓度为360μU/测定(在Tricine缓冲液中)，所用的明胶为明胶A(Sigma目录号1890-50G，标签号014K0077，来自猪皮肤的酸提取物)，所用的底物为MMP-2/MMP-9荧光探针底物I(Calbiochem目录号44215，标签号B47246；肽结构＝DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH)20μM/测定。明胶A在Tricine缓冲液中表现出对MMP-9活性的剂量响应性抑制。从0.01％开始到最高0.2％(w/v)，观察到了抑制作用的成比例增加。在0.2％后，抑制作用停止增加。在图1中以图解的方式描述了该结果。
实施例2：
进行该实验来研究明胶A与各种粘滑剂聚合物一起使用时抑制MMP-9活性的潜力。为此，选择在实施例1中产生约59％抑制作用的0.1％w/v明胶A。MMP-9＝Calbiochem目录号444231；标签号B56458；人嗜中性粒细胞。所用活性为200μU/测定。明胶＝明胶A。Sigma目录号1890-50G，标签号014K0077(来自猪皮肤的酸提取物)。测定缓冲液＝50mM Tricine，pH 7.5，含0.2M NaCl，10mM CaCl2。底物＝MMP-1/MMP-9荧光探针底物。Calbiochem目录号44221，标签号B54710。MWt，1077.2；测定中的浓度为1μM。肽结构＝DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2。Ex，365nm；Em，450nm。
该研究的结果表明，浓度为0.1％w/v的明胶A与0.18％w/v HP-瓜尔胶、0.3％w/v HPMC和0.5％w/v CMC的组合能够分别对MMP-9产生74.8％、71.8％和79.1％的抑制作用，如图2所示。
实施例3：
下一系列的实验研究了当将明胶-A掺入到两种代表性的人工泪液中时对MMP-9活性的抑制能力。为此，选择了称为Systane和新泪然(TearsNaturale II)的两种人工泪液。对于该系列的实验，将从0.01％至0.20％(w/v)的各种浓度的明胶-A掺入到两种市售的Systane和新泪然(Tears NaturaleII)溶液中。使用与实施例2所述相同的酶和底物进行测定，并采用相同的方法。该实验的结果表明，当将明胶-A掺入到Systane和新泪然(TearsNaturale II)溶液中时，其表现出对MMP-9活性的剂量响应性抑制，当在Systane中时，0.01％w/v及以上的浓度可以产生大于50％的抑制作用；当在新泪然(Tears Naturale II)中时，0.05％w/v及以上的浓度可以产生大于50％的抑制作用。在图3和4中以图解的方式描述了这些实验结果。
实施例4：
进行该实验来研究明胶A对细菌胶原酶的抑制作用。细菌胶原酶是一种外毒素，其在细菌性疾病的发病机理中协助破坏细胞外结构。为了进行实验，在含有0.2M NaCl、10mM CaCl2、ZnSO4和Brij-35的50mM Tricine缓冲液(pH 7.5)中制备从0.05％至0.8％(w/v)的各种浓度的明胶A。通过用荧光谱仪在25℃下记录荧光变化10分钟来测定细菌胶原酶的活性。活性用每分钟的荧光变化来表示。细菌胶原酶和底物I的浓度分别为20单位/测定和20μM/测定。所用的胶原酶是Clostridopeptidase(Sigma目录号C-7657；标签号107H8632)。所用的明胶是明胶A(Sigma目录号1890-50G，标签号014K0077，来自猪皮肤的酸提取物)。所用的底物是MMP-2/MMP-9荧光探针底物I(Calbiochem目录号44215，标签号B47246；肽结构＝DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH)。结果表明，需要浓度在0.4％w/v以上的明胶A来对细菌酶产生50％以上的抑制作用，而浓度为0.05％至0.1％(w/v)的明胶A则可以轻易地对MMP-9产生50％以上的抑制作用。因此，明胶A对细菌胶原酶的抑制似乎并不像对MMP-9那样有效。在图5中以图解的方式描述了该实验的结果。
实施例5：
该实验研究了当将明胶-A掺入到人工泪液产品中时对细菌胶原酶的抑制能力。对于该系列实验，将从0.05％至0.25％(w/v)的各种浓度的明胶-A掺入到市售的Systane和新泪然(Tears Naturale II)溶液中。使用与实施例4所述相同的方法和底物进行测定。结果表明，当将明胶-A掺入到人工泪液产品Systane和新泪然(Tears Naturale II)中时，也可以对细菌胶原酶产生剂量响应性抑制。但是，其效力较低，在两种人工泪液中，均需要浓度大于0.25％w/v的明胶来产生50％的抑制作用，在图6和7中以图解的方式描述了这些实验结果。
实施例6：
进行该实验来研究明胶A与各种粘滑剂聚合物一起使用时抑制细菌胶原酶活性的潜力。为此，将浓度为0.1％w/v的明胶A与HP-瓜尔胶、CMC和HPMC组合。使用与实施例4所述相同的方法和底物进行测定。结果表明，与0.18％HP-瓜尔胶组合产生了51％的抑制，而与0.3％HPMC和0.5％CMC组合仅分别产生了24％和21％的抑制作用，结果如图8所示。
实施例7：
这些实验研究了明胶A提供干燥保护和增强人角膜上皮细胞活力的能力。在这些研究中，用本文所述的Alamar Blue法测定CEPI 17人角膜上皮细胞。使人角膜上皮细胞系(CEPI 17，Alcon Laboratories Inc.)在96孔微量培养板中生长至汇合。从试验孔中除去培养液并加入100μl各种试验溶液。含有培养液的对照孔保持不变。将板子放回保温箱中60分钟。保温后，将所有的孔抽取并用200μl每孔的HyQ缓冲液(改良的Dulbecco磷酸盐缓冲液，Hyclone目录号SH30028.02)冲洗一次。将Alamar Blue(Biosource，DAL1100)在HyQ中进行1/10稀释并将100μl加入至各孔中并在37℃进行保温。保温4小时后，将板子用激发光设定在560nm并且发生光设定在590nm的荧光微量培养板读数器(FLx800型，Bio-Tek Instrument)读数。通过将样品的平均荧光除以对照的平均荧光并乘以100％来计算细胞活力％。
为了测定干燥保护作用，采用类似方法，该方法包括15分钟的预保温期和30分钟的干燥期。在预保温后，将除对照孔之外的所有试验孔进行抽吸。将对照孔用Parafilm覆盖。将板子放在向下吹气流的罩子中30分钟以对细胞进行干燥。干燥后，将所有的孔用200μl HyQ洗涤一次。用在细胞活力测定法中所述的Alamar Blue测定法分析细胞的活力。通过将样品的平均荧光除以对照的平均荧光并乘以100％来计算干燥保护。
该实验的结果表明，将明胶A掺入各种人工泪液产品、包括Systane、新泪然(Tears Naturale II)和GenTeal Mild中时，似乎对细胞提供了更好的干燥保护并增强了细胞的活力。在图9中以图解的方式给出了该实验结果。
实施例8：
进行该实验来研究α-2巨球蛋白抑制MMP-9活性的能力。通过用荧光谱仪在25℃下记录荧光变化10分钟来测定MMP-9的活性。活性用每分钟的荧光变化来表示。使用360μU/测定的MMP-9(Calbiochem目录号444231，标签号B56458；人中性白细胞)。α2-巨球蛋白(Sigma目录号M-6159，标签号118H7606；来自人胎盘)。所用底物为MMP-2/MMP-9荧光探针底物I10μM/测定(Calbiochem目录号44215，标签号B47246；肽结构＝DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH)。结果表明α-2-巨球蛋白以剂量响应的方式抑制MMP-9活性。在图10中以图解的方式描述了该实验结果。
实施例9：
进行该实验来测定已知大小的重组明胶抑制MMP-9活性的效果。通过用荧光谱仪在25℃下记录荧光变化10分钟来测定MMP-9的活性。活性用每分钟的荧光变化来表示。使用浓度为200μU/测定的在Tricine缓冲液(50mMTricine，pH 7.5，含有0.2M NaCl、10mM CaCl2)中的MMP-9(Calbiochem目录号444231，标签号B56458；人中性白细胞)。所用的明胶为重组人明胶8.5kD(FibroGen，标签号04AE001R-01)。所用底物为MMP-1/MMP-9荧光探针底物(Calbiochem目录号44221，标签号B54710；肽结构＝DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2；Ex 365nm；Em450nm)。用量1.0μM/测定。在该测定中，需要0.15％至0.25％(w/v)的重组人明胶8.5kD来获得50％以上的抑制作用。在图11中以图解的方式描述了该实验结果。
实施例10：
进行该实验来测定I型重组人胶原抑制MMP-9活性的效果。通过用荧光谱仪在25℃下记录荧光变化10分钟来测定MMP-9的活性。活性用每分钟的荧光变化来表示。使用浓度为200μU/测定的在Tricine缓冲液(50mMTricine，pH 7.5，含有0.2M NaCl、10mM CaCl2)中的MMP-9(Calbiochem目录号444231，标签号B56458；人中性白细胞)。所用的胶原为I型重组人胶原(FibroGen，标签号04AE001R-01)。所用底物为MMP-1/MMP-9荧光探针底物(Calbiochem目录号44221，标签号B54710；肽结构＝DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2；Ex 365nm；Em450nm)。用量1.0μM/测定。在该测定中，需要0.03％至0.04％(w/v)的I型重组人胶原来获得50％以上的抑制作用。在图12中以图解的方式描述了该实验结果。
实施例11：
以下是本发明的两种人工泪液的实施例。
化合物            量％(w/v)
                                                               
                  Systane        新泪然(Tears Naturale II)
                                                               
明胶              0.1            0.1
硼酸              1.0            n/p
硼酸钠            n/p            0.35
HPMC              n/p            0.3
羟丙基瓜尔胶      0.18           n/p
丙二醇            0.3            n/p
PEG-400           0.4            n/p
右旋糖酐70        n/p            0.1
氯化钠            0.1            0.6
氯化钾            0.12           0.12
氯化钙(二水合物)  0.0053         n/p
氯化镁(六水合物)  0.0064         n/p
聚季铵盐-1        0.001          0.001
氢氧化钠/盐酸     至pH7.0        至pH7.4
纯净水            适量至100％    适量至100％

Claims (15)

1.一种局部用眼科组合物，其在眼科可接受的载体中含有蛋白酶抑制性肽底物。
2.权利要求1所述的组合物，其还含有半乳甘露聚糖。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中的蛋白酶抑制性肽底物能够抑制蛋白酶MMP-9。
4.权利要求1、2或3所述的组合物，其中的蛋白酶抑制性肽底物选自明胶、α-2-巨球蛋白、卵巨球蛋白、胶原和酪蛋白。
5.权利要求2所述的组合物，其中的半乳甘露聚糖包括HP-瓜尔胶。
6.治疗干眼病的方法，其包括向眼睛表面施用含有有效量的蛋白酶抑制性肽底物的组合物。
7.治疗干眼病的方法，其包括向眼睛表面施用含有抑制MMP-9有效量的蛋白酶抑制性肽底物的组合物。
8.权利要求6或7所述的方法，其中的蛋白酶抑制性肽底物选自明胶、α-2-巨球蛋白、卵巨球蛋白、胶原和酪蛋白。
9.治疗干眼病的方法，其包括向眼睛表面施用含有有效量的蛋白酶抑制性肽底物和半乳甘露聚糖的组合物。
10.治疗干眼病的方法，其包括向眼睛表面施用MMP-9抑制量的权利要求1所述的组合物。
11.权利要求1所述的组合物，其中的蛋白酶抑制性肽底物以大于约0.05％并且小于约0.25％的量存在。
12.权利要求11所述的组合物，其中的蛋白酶抑制性肽底物是以大于约0.05％w/v的量存在的明胶。
13.权利要求11所述的组合物，其中的蛋白酶抑制性肽底物是以大于约0.03％w/v的量存在的胶原。
14.权利要求11所述的组合物，其中的底物是以大于约0.015％w/v的量存在的α-2-球蛋白。
15.权利要求1、2、3、4、5或11任意一项所述的组合物，其还包含选自抗生素、抗炎剂和免疫抑制剂的治疗剂。
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PB01 Publication
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