CN101812098A - 一种从巴戟天药材中提取分离水晶兰苷单体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从巴戟天药材中提取分离水晶兰苷单体的方法，包括乙醇溶液提取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取、过滤进一步除杂、通过制备型高效液相色谱分离水晶兰苷单体、大孔树脂富集、干燥制得水晶兰苷单体产品等步骤。该方法操作简便，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现大量水晶兰苷单体的高纯度分离制备，得到的水晶兰苷单体纯度高，可达到98％以上。

Description

一种从巴戟天药材中提取分离水晶兰苷单体的方法

技术领域

本发明涉及从植物中分离化合物单体技术领域，尤其是一种从巴戟天药材中提取分离水晶兰苷单体的方法。

背景技术

巴戟天是著名的“南药”，为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根。性甘、辛微温，具有补肝肾、强筋骨、祛风湿的功效，用于治疗阳痿遗精，宫冷不孕，月经不调，少腹冷痛，风湿痹痛等症。巴戟天药材中含有包括大黄素甲醚、甲基异茜草素-1-甲醚、1-羟基蒽醌、1-羟基-2-甲氧基蒽醌等蒽醌类成分，葡萄糖、甘露糖、巴戟素等多种糖类成分，水晶兰苷、四乙酰车叶草苷等环烯醚萜苷类成分，还含有8种人体必需氨基酸，β-谷甾醇以及24-乙基胆甾醇等甾体化合物。药理研究表明，巴戟天属植物中环烯醚萜具有抗菌、抗氧化、抗诱变、抗肿瘤、消炎镇痛等广泛作用，其中环烯醚萜苷枛水晶兰苷是其特征性成分，在5年生药材中含量约为1.2％，结构式如下：

《中国药典》2005年一版中收载了巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天，但均只规定做定性鉴别对其进行质量控制，无含量检测要求。随着近年来研究的深入，发现巴戟天中环烯醚萜苷类成分具有显著生物活性，已引起人们的广泛关注，尤其是其特征性成分水晶兰苷具有较强的抗炎、镇痛作用这一研究成果，从药效学角度阐明了水晶兰苷作为巴戟天祛风湿的物质基础。因此，为加强对巴戟天及其同属药材及制剂的质量控制，仅依靠定性鉴别显然是不够准确的，需要对其特征性成分如水晶兰苷等进行定量检测。但目前市面上尚缺乏可用作含量检测对照品的高纯度水晶兰苷单体。而且现有技术在水晶兰苷分离纯化手段上多采用反复硅胶柱层析等传统方法，生产周期长，且存在水晶兰苷与糖分不易分离的情况，使得产品纯化困难、纯度不高，其质量和数量难以满足需要。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中无高纯度水晶兰苷的分离制备方法、因而缺少高纯度水晶兰苷单体化合物等问题，提供一种从巴戟天药材中提取分离水晶兰苷单体的方法。该方法操作简便，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现大量水晶兰苷单体的高纯度分离制备，得到的水晶兰苷单体纯度高，可达到98％以上。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种从巴戟天药材中提取分离水晶兰苷单体的方法，包括下述主要步骤：

A、乙醇溶液提取：

将巴戟天药材切成2-5mm左右的段，装入提取容器中，加入5-8倍量(ml/g，即按照每g药材加入溶剂5-8ml计算)的体积百分比为50％-85％的乙醇溶液，于35℃-55℃水浴加热提取2-4次，每次1-2h，过滤，弃去药渣，收集过滤液于35℃-50℃水浴减压浓缩至无醇味，得提取浓缩液，进行下述步骤B。

本步骤通过含醇水溶液加热提取、浓缩，所得的药材有效成分提取液中主要含水晶兰苷、蒽醌类和糖类等成分。

B、乙酸乙酯萃取：

向步骤A所得的提取浓缩液中加入体积比0.7-1.5倍量的乙酸乙酯，萃取2-4次，静置分层，收集下层水相，进行下述步骤C。

本步骤中，由于蒽醌类成分更易溶于乙酸乙酯中，而水晶兰苷等在乙酸乙酯中溶解度较小，因而，采用乙酸乙酯萃取可较完全的除去提取浓缩液中的蒽醌类成分(可单独收集、另行分离获得蒽醌类单体产品)，水晶兰苷和糖类等成分保留在下层水相中，为后续分离减少杂质干扰，并同时起到富集水晶兰苷的作用。

C、正丁醇萃取：

向步骤B所得的萃取后下层水相中，加入体积比2-4倍量的正丁醇萃取3-6次，弃去水相，合并正丁醇相，将正丁醇相于50℃-65℃水浴减压浓缩至干，得到的干品为水晶兰苷半成品，进行下述步骤D。

本步骤中，由于水晶兰苷在正丁醇中具有更大的溶解度，而糖类等成分更易溶于水中，因而，用正丁醇萃取可较完全的将水相中的水晶兰苷萃取出来，将糖类等其他杂质留在水中，起到除杂和富集水晶兰苷的作用。

D、过滤进一步除杂：

将步骤C所得的除杂富集后的水晶兰苷半成品用≤30％的甲醇(包括体积百分比≤30％的甲醇水溶液和纯水，下同)作为溶剂溶解，溶剂用量按固体物重量∶溶剂体积＝1g∶(4-8)ml计算，溶解后的溶液用孔径0.22um-0.45um的水系膜过滤，得澄清透明滤液；再进行下述步骤E。

本步骤中，通过≤30％的甲醇溶解、水系滤膜过滤，可进一步除去大分子杂质，纯化水晶兰苷。

E、通过制备型高效液相色谱分离水晶兰苷单体：

采用填料为C₁₈的色谱柱，

流动相组成为：体积分数5％-20％的甲醇水溶液(其中还含有体积分数为0.1％-0.3％的磷酸)，

检测波长为233nm，

取步骤D所得的澄清透明滤液进样，进行水晶兰苷单体的制备分离，紫外检测器在线监测，针对性收集水晶兰苷单体的制备馏分溶液，得水晶兰苷单体溶液，进行下述步骤F。

本步骤在进行高效制备液相色谱分离前，可通过液-质联用或其它本技术领域常用的方法(如气-质联用，核磁共振碳谱、氢谱等)确定高效液相色谱中黄连碱单体的峰形。

以液-质联用(HPLC-MS)方法为例，可采用填料为C₁₈的色谱柱，流动相组成可同上(也可略有差异)，柱温为室温(柱温无特别要求，室温即可)，检测波长为为233nm，取步骤D所得的澄清透明滤液适量进样，进行水晶兰苷单体的HPLC-MS检测，根据负离子检测结果，确定水晶兰苷单体在液相色谱中所对应的峰(由于制备型高效液相色谱分离水晶兰苷单体也采用C₁₈色谱柱，对同样的样品，即使流动相等有差异而导致出峰时间有所不同，但出峰顺序及峰形等大致相同，因而可用于推断在制备型高效液相色谱中水晶兰苷单体的出峰位置及峰形等)。

F、大孔树脂富集：

将步骤E所得的水晶兰苷单体溶液，于40℃-55℃水浴减压浓缩至无醇，水溶液用环烯醚萜苷专用大孔吸附树脂(环烯醚萜苷专用大孔吸附树脂可选自D301、HPD600、NKA-9、AB-8中的任意一种；大孔吸附树脂在使用前按相应的树脂产品附带的说明书进行活化处理)富集，用2.5-5倍柱体积的80％-95％(体积百分比)乙醇解吸附，收集该乙醇解吸附液，进行下述步骤G。

通过本步骤操作，将水溶液中的水晶兰苷吸附于树脂上，磷酸则随水通过树脂，起到将产品与杂质磷酸分离，同时用80％-95％乙醇解吸附，可将水晶兰苷从树脂转移至较高浓度醇溶液中，便于产品的回收，减少产品受热时间。

G、干燥制得水晶兰苷单体产品：

取步骤F所得的乙醇解吸附液，于40℃-55℃水浴减压浓缩至干，再将固体物于40℃-50℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得所述的水晶兰苷单体产品。

由于高效液相色谱对样品溶液的纯度、色泽等要求均较高，通过提取等简单处理得到的提取液不能直接作为样品溶液进入高效液相色谱系统，否则既可能达不到良好的分离效果，还可能对高效液相色谱系统的色谱柱等配件产生难以逆转的影响，缩短其使用周期；而色谱柱等液相色谱的相关配件成本通常较高，其使用周期的缩短显然将造成最终产品的生产成本大大提高；因而，对进入高效液相色谱的样品溶液要求较高，其前处理过程非常重要。

本发明方法通过前述步骤A、B、C、D的顺序搭配，以及适当的参数组合，可有效提取出巴戟天药材中的水晶兰苷等成分，并除去提取液中含有的蒽醌类、糖类、及一些大分子物质等大量杂质，获得可以进入制备型高效液相色谱系统的样品溶液(即步骤D得到的澄清透明滤液)，不至对高效液相色谱系统造成很大的影响，尽量延长其使用周期，节约生产成本。

在高效液相色谱分离过程中，色谱条件的选择非常重要，它对样品溶液中各物质的出峰顺序、峰形、分离效果等起着决定性的作用；色谱条件主要包括色谱柱(包括填料、柱长及内径等)、流动相(包括组成及流速等)、柱温、检测波长、检测器等，各色谱条件的选择及其组合至关重要。

本发明人通过大量的试验研究及对比分析，确定了如上所述的各色谱条件，使样品溶液中各物质的出峰时间、峰形、分离效果等最佳化，有利于水晶兰苷单体得到充分有效的分离。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明方法通过适当参数条件的选择、以及按照前后顺序缺一不可的前处理步骤，可从巴戟天药材中有效的提取出含水晶兰苷等成分，并有效除去提取液中的蒽醌类、糖类、及其它大分子杂质等，获得可以通过制备型高效液相色谱分离单体的样品溶液；再通过制备型高效液相色谱系统对水晶兰苷单体进行分离，紫外检测器在线监测，针对性收集水晶兰苷单体，过程直观，目标明确，避免了常规柱层析和先分离后检测造成的资源浪费，且对产品的质量易于控制，产品纯度可达98％以上。

另一方面，该方法操作简便，分离效率高，工艺稳定，重现性好，成本低廉，可实现大量水晶兰苷单体的高纯度分离制备，得到的水晶兰苷单体纯度高，收率高，产量大，适合工业化生产。

附图说明

图1是实施例2水晶兰苷的高效液相制备色谱图，图中记录为2针样品连续进样色谱图，图中峰1、2为水晶兰苷；

图2是实施例2水晶兰苷单体产品复检的高效液相分析色谱图，图中A为水晶兰苷。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

下述各实施例中，终产品水晶兰苷单体的纯度复检均采用反相分析型液相色谱(RPHPLC)法，色谱条件如下：

流动相组成为：甲醇水(水中含体积百分比为0.2％的磷酸)，二者体积比为15∶85；流速1.0mL/min；

色谱柱填料为C₁₈，粒度为5um，色谱柱内径为4.6mm，长度为150mm；检测波长为233nm。

实施例1

本实施例从巴戟天药材中提取分离水晶兰苷单体的方法，包括下述主要步骤：

A、乙醇溶液提取：

将1Kg巴戟天药材切成3mm左右的段，装入提取容器中，加入6.5L体积百分比为50％的乙醇溶液，于45℃水浴加热提取3次，每次2h，过滤，弃去药渣，收集过滤液19L，于45℃水浴减压浓缩至无醇味，得提取浓缩液8L，进行下述步骤B。

B、乙酸乙酯萃取除去蒽醌类杂质：

将步骤A所得的浓缩水溶液，加入体积比1.5倍量的乙酸乙酯，萃取2次，静置分层，收集下层水相7.5L，进行下述步骤C。

C、正丁醇萃取：

向步骤B所得的萃取后下层水相中，加入体积比2倍量的正丁醇萃取6次，弃去水相，合并正丁醇相，将正丁醇相于65℃水浴减压浓缩至干，得到干品(水晶兰苷半成品)20.1g，进行下述步骤D。

D、过滤进一步除杂：

将步骤C所得的除杂富集后的水晶兰苷半成品用15％的甲醇溶解，甲醇用量约120ml，溶解后的溶液用孔径0.45um的水系膜过滤，得澄清透明滤液117ml；再进行下述步骤E。

E、通过制备型高效液相色谱分离水晶兰苷单体：

采用填料为C₁₈的色谱柱(内径80mm，C₁₈粒度为8um)，

流动相组成为：体积分数5％的甲醇水溶液(其中还含有体积分数为0.1％的磷酸)，流速140ml/min，

检测波长为233nm，

取步骤D所得的澄清透明滤液进样，进行水晶兰苷单体的制备分离，紫外检测器在线监测，针对性收集水晶兰苷单体的制备馏分溶液(出峰时间为48.2-52.3min)，得水晶兰苷单体溶液，进行下述步骤F。

本步骤在进行高效制备液相色谱分离前，通过液质联用(HPLC-MS)方法确定高效液相色谱中水晶兰苷单体的峰形，采用填料为C₁₈的色谱柱(C₁₈粒度为5um，柱长为250mm，内径4.6mm)，流动相组成同上，流速1ml/min，柱温为室温(柱温无特别要求，室温即可)，检测波长为233nm，取步骤D所得的澄清透明滤液80ul进样，进行水晶兰苷单体的HPLC-MS检测，根据负离子检测结果，确定水晶兰苷单体在液相色谱中的出峰顺序及其所对应的峰形。

F、大孔树脂富集：

将步骤E所得的水晶兰苷单体溶液，于45℃水浴减压浓缩至无醇，水溶液用经活化(活化方法按树脂产品附带的说明书操作)的环烯醚萜苷专用大孔吸附树脂D301富集，用2.5倍柱体积的95％乙醇解吸附，收集该95％乙醇解吸附液，进行下述步骤G。

G、干燥制得水晶兰苷单体产品：

取步骤F所得的95％乙醇解吸附液，于45℃水浴减压浓缩至干，再将固体物于40℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得所述的水晶兰苷单体产品14g。

计算产品收率为(14/1000)×100％＝1.4％。

利用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)复检产品纯度，测得结果为98.95％。

实施例2

本实施例从巴戟天药材中提取分离水晶兰苷单体的方法，包括下述主要步骤：

A、乙醇溶液提取：

将0.3Kg巴戟天药材切成2mm左右的段，装入提取容器中，加入2.4L体积百分比为85％的乙醇溶液，于35℃水浴加热提取2次，每次1.5h，过滤，弃去药渣，收集过滤液5L，于35℃水浴减压浓缩至无醇味，得提取浓缩液约0.5L，进行下述步骤B。

B、乙酸乙酯萃取除去蒽醌类杂质：

将步骤A所得的浓缩水溶液，加入体积比0.7倍量的乙酸乙酯，萃取2次，静置分层，收集下层水相0.4L，进行下述步骤C。

C、正丁醇萃取：

向步骤B所得的萃取后下层水相中，加入体积比3倍量的正丁醇萃取4次，弃去水相，合并正丁醇相，将正丁醇相于50℃水浴减压浓缩至干，得到干品(水晶兰苷半成品)7.3g，进行下述步骤D。

D、过滤进一步除杂：

将步骤C所得的除杂富集后的水晶兰苷半成品用30％的甲醇溶解，甲醇用量约58ml，溶解后的溶液用孔径0.22um的水系膜过滤，得澄清透明滤液55ml；再进行下述步骤E。

E、通过制备型高效液相色谱分离水晶兰苷单体：

采用填料为C₁₈的色谱柱(内径50mm，C₁₈粒度为5um)，

流动相组成为：体积分数20％的甲醇水溶液(其中还含有体积分数为0.2％的磷酸)，流速60ml/min，

检测波长为233nm，

取步骤D所得的澄清透明滤液进样，进行水晶兰苷单体的制备分离，紫外检测器在线监测，针对性收集水晶兰苷单体的制备馏分溶液(出峰时间为24.6-26min)，得水晶兰苷单体溶液，进行下述步骤F。

本步骤在进行高效制备液相色谱分离前，通过液质联用(HPLC-MS)方法确定高效液相色谱中水晶兰苷单体的峰形，采用填料为C₁₈的色谱柱(C₁₈粒度为5um，柱长为250mm，内径4.6mm)，流动相组成同上，流速1ml/min，柱温为室温(柱温无特别要求，室温即可)，检测波长为233nm，取步骤D所得的澄清透明滤液100ul进样，进行水晶兰苷单体的HPLC-MS检测，根据负离子检测结果，确定水晶兰苷单体在液相色谱中的出峰顺序及其所对应的峰形。

F、大孔树脂富集：

将步骤E所得的水晶兰苷单体溶液，于40℃水浴减压浓缩至无醇，水溶液用经活化(活化方法按树脂产品附带的说明书操作)的环烯醚萜苷专用大孔吸附树脂HPD600富集，用5倍柱体积的80％乙醇解吸附，收集该80％乙醇解吸附液，进行下述步骤G。

G、干燥制得水晶兰苷单体产品：

取步骤F所得的80％乙醇解吸附液，于55℃水浴减压浓缩至干，再将固体物于55℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得所述的水晶兰苷单体产品3.3g。

计算收率为(3.3/300)×100％＝1.1％；

利用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)复检产品纯度，测得结果为98.11％。

实施例3

本实施例从巴戟天药材中提取分离水晶兰苷单体的方法，包括下述主要步骤：

A、乙醇溶液提取：

将2.5Kg巴戟天药材切成5mm左右的段，装入提取容器中，加入12.5L体积百分比为65％的乙醇溶液，于55℃水浴加热提取4次，每次1h，过滤，弃去药渣，收集过滤液47L，于50℃水浴减压浓缩至无醇味，得提取浓缩液15L，进行下述步骤B。

B、乙酸乙酯萃取除去蒽醌类杂质：

将步骤A所得的浓缩水溶液，加入体积比1倍量的乙酸乙酯，萃取3次，静置分层，收集下层水相14.3L，进行下述步骤C。

C、正丁醇萃取：

向步骤B所得的萃取后下层水相中，加入体积比4倍量的正丁醇萃取3次，弃去水相，合并正丁醇相，将正丁醇相于60℃水浴减压浓缩至干，得到干品(水晶兰苷半成品)28g，进行下述步骤D。

D、过滤进一步除杂：

将步骤C所得的除杂富集后的水晶兰苷半成品用5％的甲醇溶解，甲醇用量约112ml，溶解后的溶液用孔径0.45um的水系膜过滤，得澄清透明滤液108ml；再进行下述步骤E。

E、通过制备型高效液相色谱分离水晶兰苷单体：

采用填料为C₁₈的色谱柱(内径150mm，C₁₈粒度为10um)，

流动相组成为：体积分数15％的甲醇水溶液(其中还含有体积分数为0.3％的磷酸)，流速200ml/min，

检测波长为233nm，

取步骤D所得的澄清透明滤液进样，进行水晶兰苷单体的制备分离，紫外检测器在线监测，针对性收集水晶兰苷单体的制备馏分溶液(出峰时间为11.5-12.3min)，得水晶兰苷单体溶液，进行下述步骤F。

本步骤在进行高效制备液相色谱分离前，通过液质联用(HPLC-MS)方法确定高效液相色谱中水晶兰苷单体的峰形，采用填料为C₁₈的色谱柱(C₁₈粒度为5um，柱长为250mm，内径4.6mm)，流动相组成同上，流速1ml/min，柱温为室温(柱温无特别要求，室温即可)，检测波长为233nm，取步骤D所得的澄清透明滤液50ul进样，进行水晶兰苷单体的HPLC-MS检测，根据负离子检测结果，确定水晶兰苷单体在液相色谱中的出峰顺序及其所对应的峰形。

F、大孔树脂富集：

将步骤E所得的水晶兰苷单体溶液，于55℃水浴减压浓缩至无醇，水溶液用经活化(活化方法按树脂产品附带的说明书操作)的环烯醚萜苷专用大孔吸附树脂NKA-9富集，用3.5倍柱体积的85％乙醇解吸附，收集该85％乙醇解吸附液，进行下述步骤G。

G、干燥制得水晶兰苷单体产品：

取步骤F所得的85％乙醇解吸附液，于40℃水浴减压浓缩至干，再将固体物于40℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得所述的水晶兰苷单体产品36g。

计算收率为(36/2500)×100％＝1.4％；

利用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)复检产品纯度，测得结果为98.43％。

Claims (2)

1.一种从巴戟天药材中提取分离水晶兰苷单体的方法，包括下述主要步骤：

A、乙醇溶液提取：

将巴戟天药材切成2-5mm的段，装入提取容器中，加入5-8倍量体积百分比为50％-85％的乙醇溶液，于35℃-55℃水浴加热提取2-4次，每次1-2h，过滤，弃去药渣，收集过滤液于35℃-50℃水浴减压浓缩至无醇味，得提取浓缩液，进行下述步骤B；

B、乙酸乙酯萃取：

向步骤A所得的提取浓缩液中加入体积比0.7-1.5倍量的乙酸乙酯，萃取2-4次，静置分层，收集下层水相，进行下述步骤C；

C、正丁醇萃取：

向步骤B所得的萃取后下层水相中，加入体积比2-4倍量的正丁醇萃取3-6次，弃去水相，合并正丁醇相，将正丁醇相于50℃-65℃水浴减压浓缩至干，得到的干品为水晶兰苷半成品，进行下述步骤D；

D、过滤进一步除杂：

将步骤C所得的除杂富集后的水晶兰苷半成品用≤30％的甲醇作为溶剂溶解，溶剂用量按固体物重量∶溶剂体积＝1g∶(4-8)ml计算，溶解后的溶液用孔径0.22um-0.45um的水系膜过滤，得澄清透明滤液，再进行下述步骤E；

E、通过制备型高效液相色谱分离水晶兰苷单体：

采用填料为C18的色谱柱，

流动相组成为：体积分数5％-20％的甲醇水溶液(其中还含有体积分数为0.1％-0.3％的磷酸)，

检测波长为233nm，

取步骤D所得的澄清透明滤液进样，进行水晶兰苷单体的制备分离，紫外检测器在线监测，针对性收集水晶兰苷单体的制备馏分溶液，得水晶兰苷单体溶液，进行下述步骤F；

F、大孔树脂富集：

将步骤E所得的水晶兰苷单体溶液，于40℃-55℃水浴减压浓缩至无醇，水溶液用环烯醚萜苷专用大孔吸附树脂富集，用2.5-5倍柱体积的80％-95％乙醇解吸附，收集该乙醇解吸附液，进行下述步骤G；

G、干燥制得水晶兰苷单体产品：

取步骤F所得的乙醇解吸附液，于40℃-55℃水浴减压浓缩至干，再将固体物于40℃-50℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得所述的水晶兰苷单体产品。

2.根据权利要求1中的方法，其特征在于：

所述的步骤F“大孔树脂富集”过程中，大孔吸附树脂选自D301、HPD600、NKA-9、AB-8中的任意一种。

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