CN101798304B - 一种黄柏碱单体的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄柏碱单体的分离纯化方法，包括提取总生物碱、酸沉除去小檗碱、过滤进一步除杂、通过制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体、二氯甲烷萃取、干燥制备黄柏碱单体产品等步骤。该方法操作简便，生产周期短，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现大量黄柏碱单体的高纯度分离制备，得到纯度大于98％的黄柏碱单体。

Description

一种黄柏碱单体的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及从植物中分离化合物单体技术领域，尤其是一种黄柏碱单体的分离纯化方法。

背景技术

黄柏Cortex Phellodendri Chinensis是芸香科植物黄皮树Phellodendron chinensisSchneid.及黄檗P.amurense Rupr.的干燥树皮，前者习称“川黄柏”主产于四川、云南及湖北，后者称为关黄柏，主产辽宁、吉林、河北。《中国药典》2005年版一部对二者均有收载，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮之功效。用于湿热泻痢、黄疸、带下、热淋、脚气、骨蒸劳热、盗汗、遗精、疮疡肿毒。黄柏药材中主要含小檗碱、药根碱、黄柏碱、巴马亭、木兰花碱等生物碱；7-脱氢豆甾醇、β-谷甾醇等甾醇；金丝桃苷、双氢山奈酚等黄酮类成分以及少量的挥发油等成分。现代药理学研究表明黄柏提取液中生物碱类成分有免疫抑制、抗肿瘤、抗溃疡、抗菌、抗肾炎等作用。

黄柏碱(Phellodendrine)作为黄柏药材的特征性成分，具有中枢神经抑制、植物神经阻断、抑制细胞免疫应答期的诱导期、抗肾炎等作用，其在药材中的含量差异较大，大约为0.11％-0.43％，其结构式如下：

《中国药典》2005年版一部，成方制剂中收载了以黄柏为主要组分的药品如：二妙丸、三妙丸、九圣散、大补阴丸、小儿肝炎颗粒、小儿清热片、木香槟榔丸等制剂，在质量控制方面均采用盐酸小檗碱作为指标性成分进行含量测定。虽然小檗碱为黄柏生物碱中含量较高的成分，但是由于其并非黄柏的特征性成分，用其标定黄柏在成方中的用量存在着一定的片面性。

黄柏碱是黄柏中的特有成分，目前在黄连与小檗属其它药材中尚未发现，因此，以黄柏碱及小檗碱共同作为质量评价指标，既能较真实地反映其质量又具有专属性；但目前只有高纯度小檗碱单体在售，黄柏碱则无。近年来，随着对黄柏研究的深入，对黄柏制剂的开发也呈现勃勃生机如纳米黄柏制剂、黄柏分散片、黄柏搽剂、黄柏林芝茶、黄柏洗涤剂、手帕纸等。为更好的评价黄柏药材及制剂的质量，迫切需要对黄柏中特有成分黄柏碱单体进行高纯度的分离，以满足黄柏药材及制剂定量以及对黄柏碱单体药效进一步研究的需要。但目前，国内外多采用溶剂法和反复硅胶柱层析等传统方法分离黄柏碱单体，分离周期长，且都需要用到大量三氯甲烷，毒性大，产品得率低(通常为万分之几)，产品数量和质量都难以满足市场需求。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中缺少高纯度黄柏碱单体化合物、无法通过黄柏碱的含量测定加强对黄柏药材的质量控制等问题，提供一种黄柏碱单体的分离纯化方法；该方法操作简便，生产周期短，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现大量黄柏碱单体的高纯度分离制备，得到纯度大于98％的黄柏碱单体。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种黄柏碱单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤：

A、提取总生物碱：

取黄柏药材，切成宽1-5mm的细丝，装入渗漉装置中，加入体积百分比浓度为1-10％的盐酸水溶液，其加入量按照药材重量∶盐酸水溶液体积＝1Kg∶(5-25)L计算，浸泡5-36h，控制流速为1-10L/h，进行渗漉提取，收集渗漉液，弃去药渣，于45℃-85℃水浴减压浓缩收集的渗漉液至有淡黄色粉末析出，得浓缩后的总生物碱提取液，进行下述步骤B。

本步骤通过盐酸水溶液浸泡、渗漉提取、减压浓缩，所得的总生物碱提取液中主要含有黄柏碱、小檗碱等成分。

B、酸沉除去小檗碱：

取步骤A所得浓缩后的总生物碱提取液，缓慢搅拌滴加盐酸至pH＝1-2，室温静置10-36h，滤除黄色沉淀物，母液(即滤液)于45℃-85℃水浴减压浓缩至有黄色固体析出，室温静置10-36h，再滤除黄色沉淀物，重复浓缩母液、过滤操作3-6次，将最终所得母液搅拌滴加氢氧化钠水溶液(可优选重量百分比为1-5％)调pH至7-9，于60℃-85℃水浴减压浓缩至干，得除杂富集后的黄柏碱半成品，再进行下述步骤C。

本步骤中，采用盐酸调pH使总生物碱提取液中大量的小檗碱成分沉淀、再过滤去除，通过反复浓缩、过滤，可较完全的去除小檗碱(可单独收集、制成盐酸小檗碱)，为后续分离减少杂质干扰，并同时起到富集黄柏碱的作用。

C、过滤进一步除杂：

将步骤B所得除杂富集后的黄柏碱半成品用≥70％的甲醇(包括体积百分比≥70％甲醇水溶液和纯甲醇，下同)溶解，甲醇用量按固体物重量∶甲醇体积＝1g∶(4-10)ml计算，溶解后的溶液用孔径0.22um-0.45um的有机滤膜过滤，得澄清透明滤液；再进行下述步骤D。

本步骤通过甲醇溶解、有机滤膜过滤，可进一步除去大分子杂质，纯化黄柏碱。

D、通过制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体：

采用填料为C₁₈的色谱柱；

流动相组成为：体积分数10％-40％的甲醇水溶液(其中还含体积分数为0.2％-0.5％的氨水)；

检测波长为284nm；

取步骤C所得的澄清透明滤液进样，进行黄柏碱单体的制备分离，紫外检测器在线监测，针对性收集黄柏碱单体的制备馏分溶液，得黄柏碱单体溶液，进行下述步骤E。

本步骤在进行高效制备液相色谱分离前，可通过液-质联用或其它本技术领域常用的方法(如气-质联用，核磁共振碳谱、氢谱等)确定高效液相色谱中黄连碱单体的峰形。

以液-质联用(HPLC-MS)方法为例，可采用填料为C₁₈的色谱柱，流动相组成可同上(也可略有差异)，柱温为室温(柱温无特别要求，室温即可)，检测波长为284nm，取步骤C所得的澄清透明滤液适量进样，进行黄柏碱单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定黄柏碱单体在液相色谱中所对应的峰形及归属(由于制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体也采用C₁₈色谱柱，对同样的样品，即使流动相等有差异而导致出峰时间有所不同，但出峰顺序及峰形等大致相同，因而可用于推断在制备型高效液相色谱中黄柏碱单体的出峰位置及峰形等)。

E、二氯甲烷萃取：

将步骤D所得的黄柏碱单体溶液，于45℃-85℃水浴减压浓缩至原体积的1/4-1/2，再加入0.8-1.5倍水饱和的二氯甲烷等体积萃取2-4次，收集二氯甲烷层，用无水硫酸钠脱水，得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，进行下述步骤F；

F、干燥制备黄柏碱单体产品：

取步骤E所得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，于25℃-55℃减压浓缩至干，再将固体物于45℃-85℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得所述的黄柏碱单体产品。

由于高效液相色谱对样品溶液的纯度、色泽等要求均较高，通过提取等简单处理得到的提取液不能直接作为样品溶液进入高效液相色谱系统，否则既可能达不到良好的分离效果，还可能对高效液相色谱系统的色谱柱等配件产生难以逆转的影响，缩短其使用周期；而色谱柱等液相色谱的相关配件成本通常较高，其使用周期的缩短显然将造成最终产品的生产成本大大提高；因而，对进入高效液相色谱的样品溶液要求较高，其前处理过程非常重要。

黄柏药材中除含有黄柏碱外，还含有小檗碱、药根碱、巴马亭、木兰花碱、7-脱氢豆甾醇、β-谷甾醇、金丝桃苷、双氢山奈酚等非常复杂的成分，要获得可直接进入高效液相色谱系统的样品，需要先进行特殊的提取及分离纯化处理。针对黄柏药材中存在的各种成分的理化性质，本发明方法通过前述步骤A、B、C的顺序搭配，以及适当的参数组合，可有效提取出黄柏药材中的黄柏碱等成分，并除去提取液中含有的小檗碱、大分子物质等大量杂质，获得可以进入制备型高效液相色谱系统的样品溶液(即步骤C得到的澄清透明滤液)，不至对高效液相色谱系统造成很大的影响，尽量延长其使用周期，节约生产成本。

在高效液相色谱分离过程中，色谱条件的选择非常重要，它对样品溶液中各物质的出峰顺序、峰形、分离效果等起着决定性的作用；色谱条件主要包括色谱柱(包括填料、柱长及内径等)、流动相(包括组成及流速等)、柱温、检测波长、检测器等，各色谱条件的选择及其组合至关重要。

本发明人通过大量的试验研究及对比分析，确定了如上所述的各色谱条件，使样品溶液中各物质的出峰时间、峰形、分离效果等最佳化，有利于黄柏碱单体得到充分有效的分离。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明方法采用制备型高效液相色谱系统对黄柏碱单体进行分离，通过最适宜的前处理方法和色谱条件等，达到良好的分离效果，并且紫外检测器在线监测，针对性收集黄柏碱单体，目标明确，避免了常规柱层析和先分离后检测造成的资源浪费。

2、本发明方法制备型高效液相色谱分离过程直观，目标性强，对产品的质量易于控制，产品纯度可达98％以上。

3、本发明方法操作简便，生产周期短，分离效率高，收率高，产量大，工艺稳定可靠，重现性好，成本低廉，适合工业化生产。

附图说明

图1是实施例1黄柏碱的高效液相制备色谱图，图中记录为3针样品连续进样色谱图，图中峰1、2、3为黄柏碱；

图2是实施例2黄柏碱单体产品复检的高效液相分析色谱图，图中峰A为黄柏碱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

下述各实施例中，终产品黄柏碱单体的纯度复检均采用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)法，色谱条件如下：

流动相组成为：乙腈-0.1％磷酸水(其中每100ml水中加入十二烷基磺酸钠0.2克)，二者体积比为25∶75；流速1.0mL/min；

色谱柱填料为C₁₈，粒度为5um，色谱柱内径为4.6mm，长度为150mm；

检测波长为284nm。

实施例1

本实施例黄柏碱单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤：

A、提取总生物碱：

取黄柏药材2Kg，切成宽约3mm的细丝，装入渗漉装置中，加入体积百分比浓度为10％的盐酸水溶液10L，浸泡36h，控制流速为4L/h，进行渗漉提取，收集渗漉液共9.6L，弃去药渣，于65℃水浴减压浓缩收集的渗漉液至有淡黄色粉末析出，得浓缩后的总生物碱提取液6L，进行下述步骤B。

本步骤通过盐酸水溶液浸泡、渗漉提取、减压浓缩，所得的总生物碱提取液中主要含有黄柏碱、小檗碱等成分；

B、酸沉除去小檗碱：

取步骤A所得浓缩后的总生物碱提取液，缓慢搅拌滴加浓盐酸至pH＝1.5，室温静置10h，滤除黄色沉淀物，母液于45℃水浴减压浓缩至有黄色固体析出，室温静置10h，再滤除黄色沉淀物，重复浓缩母液、过滤操作3次，将最终所得母液搅拌滴加5％氢氧化钠水溶液调pH至7，于60℃水浴减压浓缩至干，得除杂富集后的黄柏碱半成品(黄色固体)12g，再进行下述步骤C。

本步骤中，采用盐酸调pH使总生物碱提取液中大量的小檗碱成分沉淀、再过滤去除，通过反复浓缩、过滤，可较完全的去除小檗碱(小檗碱单独收集、制成盐酸小檗碱)，为后续分离减少杂质干扰，并同时起到富集黄柏碱的作用。

C、过滤进一步除杂：

将步骤B所得除杂富集后的黄柏碱半成品用纯甲醇溶解，甲醇用量按固体物重量∶甲醇体积＝1g∶6ml计算(即约72ml)，溶解后的溶液用孔径0.22um的有机滤膜过滤，得约70ml淡黄色澄清透明滤液；再进行下述步骤D。

本步骤通过甲醇溶解、有机滤膜过滤，可进一步除去大分子杂质，纯化黄柏碱。

D、通过制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体：

(a)、确定高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形及归属：

通过液-质联用(HPLC-MS)，采用填料为C₁₈的色谱柱(C₁₈粒度为5um，柱长为250mm，内径4.6mm)，流动相组成为体积分数20％的甲醇水溶液(其中还含体积分数为0.3％的氨水)，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为284nm，取步骤C所得的澄清透明滤液80ul进样，进行黄柏碱单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定黄柏碱单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t＝17.88-19.39min的峰所对应的物质为黄柏碱单体(由于制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体也采用C18色谱柱，对同样的样品，虽然因为流动相等略有差异而导致出峰时间有所不同，但出峰顺序及峰形等大致相同，因而可推断出在制备型高效液相色谱中黄柏碱单体的出峰位置及峰形等)。

(b)、制备黄柏碱单体：

采用填料为C₁₈的色谱柱(内径80mm，C₁₈粒度为8um)，流动相组成为体积分数20％的甲醇水溶液(其中还含体积分数为0.3％的氨水)，流速为140mL/min，检测波长为284nm，取步骤C所得的澄清透明滤液进样，进行黄柏碱单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤(a)确定的高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形等情况，针对性收集黄柏碱单体的制备馏分溶液(出峰时间为29-32min)，得黄柏碱单体溶液，进行下述步骤E。

E、二氯甲烷萃取：

将步骤D所得的黄柏碱单体溶液，于65℃水浴减压浓缩至原体积的1/4，再加入水饱和的二氯甲烷等体积萃取3次，收集二氯甲烷层，用无水硫酸钠脱水，得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，进行下述步骤F；

F、干燥制备黄柏碱单体产品：

取步骤E所得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，于35℃减压浓缩至干，再将固体物于65℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得黄柏碱单体产品6.82g。计算得产品收率为(6.82/2000)×100％＝0.341％。

通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)复检产品纯度，测得结果为98.82％。

实施例2

本实施例黄柏碱单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤：

A、提取总生物碱：

取黄柏药材0.5Kg，切成宽约1mm的细丝，装入渗漉装置中，加入体积百分比浓度为1％的盐酸水溶液12.5L，浸泡5h，控制流速为1L/h，进行渗漉提取，收集渗漉液共12L，弃去药渣，于45℃水浴减压浓缩收集的渗漉液至有淡黄色粉末析出，得浓缩后的总生物碱提取液8.5L，进行下述步骤B。

本步骤通过盐酸水溶液浸泡、渗漉提取、减压浓缩，所得的总生物碱提取液中主要含有黄柏碱、小檗碱等成分；

B、酸沉除去小檗碱：

取步骤A所得浓缩后的总生物碱提取液，缓慢搅拌滴加浓盐酸至pH＝2，室温静置36h，滤除黄色沉淀物，母液于55℃水浴减压浓缩至有黄色固体析出，室温静置36h，再滤除黄色沉淀物，重复浓缩母液、过滤操作4次，将最终所得母液搅拌滴加3％氢氧化钠水溶液调pH至8，于65℃水浴减压浓缩至干，得除杂富集后的黄柏碱半成品(黄色固体)3.6g，再进行下述步骤C。

本步骤中，采用盐酸调pH使总生物碱提取液中大量的小檗碱成分沉淀、再过滤去除，通过反复浓缩、过滤，可较完全的去除小檗碱(小檗碱单独收集、制成盐酸小檗碱)，为后续分离减少杂质干扰，并同时起到富集黄柏碱的作用。

C、过滤进一步除杂：

将步骤B所得除杂富集后的黄柏碱半成品用70％甲醇(水溶液，下同)溶解，甲醇用量按固体物重量∶甲醇体积＝1g∶4ml计算(即约14.4ml)，溶解后的溶液用孔径0.45um的有机滤膜过滤，得约13ml淡黄色澄清透明滤液；再进行下述步骤D。

本步骤通过甲醇溶解、有机滤膜过滤，可进一步除去大分子杂质，纯化黄柏碱。

D、通过制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体：

(a)、确定高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形及归属：

通过液-质联用(HPLC-MS)，采用填料为C₁₈的色谱柱(C₁₈粒度为5um，柱长为250mm，内径4.6mm)，流动相组成为体积分数10％的甲醇水溶液(其中还含体积分数为0.2％的氨水)，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为284nm，取步骤C所得的澄清透明滤液50ul进样，进行黄柏碱单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定黄柏碱单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t＝31.95-34.30min的峰所对应的物质为黄柏碱单体(由于制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体也采用C18色谱柱，对同样的样品，虽然因为流动相等略有差异而导致出峰时间有所不同，但出峰顺序及峰形等大致相同，因而可推断出在制备型高效液相色谱中黄柏碱单体的出峰位置及峰形等)。

(b)、制备黄柏碱单体：

采用填料为C₁₈的色谱柱(内径50mm，C₁₈粒度为5um)，流动相组成为体积分数10％的甲醇水溶液(其中还含体积分数为0.2％的氨水)，流速为60mL/min，检测波长为284nm，取步骤C所得的澄清透明滤液进样，进行黄柏碱单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤(a)确定的高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形等情况，针对性收集黄柏碱单体的制备馏分溶液(出峰时间为53-57min)，得黄柏碱单体溶液，进行下述步骤E。

E、二氯甲烷萃取：

将步骤D所得的黄柏碱单体溶液，于85℃水浴减压浓缩至原体积的1/3，再加入1.5倍量水饱和的二氯甲烷萃取2次，收集二氯甲烷层，用无水硫酸钠脱水，得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，进行下述步骤F；

F、干燥制备黄柏碱单体产品：

取步骤E所得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，于25℃减压浓缩至干，再将固体物于45℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得黄柏碱单体产品1.86g。计算得产品收率为(1.86/500)×100％＝0.373％。

通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)复检产品纯度，测得结果为99.11％。

实施例3

本实施例黄柏碱单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤：

A、提取总生物碱：

取黄柏药材4Kg，切成宽约5mm的细丝，装入渗漉装置中，加入体积百分比浓度为6％的盐酸水溶液60L，浸泡24h，控制流速为10L/h，进行渗漉提取，收集渗漉液共57L，弃去药渣，于65℃水浴减压浓缩收集的渗漉液至有淡黄色粉末析出，得浓缩后的总生物碱提取液45L，进行下述步骤B。

本步骤通过盐酸水溶液浸泡、渗漉提取、减压浓缩，所得的总生物碱提取液中主要含有黄柏碱、小檗碱等成分；

B、酸沉除去小檗碱：

取步骤A所得浓缩后的总生物碱提取液，缓慢搅拌滴加浓盐酸至pH＝1，室温静置16h，滤除黄色沉淀物，母液于85℃水浴减压浓缩至有黄色固体析出，室温静置15h，再滤除黄色沉淀物，重复浓缩母液、过滤操作6次，将最终所得母液搅拌滴加1％氢氧化钠水溶液调pH至9，于85℃水浴减压浓缩至干，得除杂富集后的黄柏碱半成品(黄色固体)23.38g，再进行下述步骤C。

本步骤中，采用盐酸调pH使总生物碱提取液中大量的小檗碱成分沉淀、再过滤去除，通过反复浓缩、过滤，可较完全的去除小檗碱(小檗碱单独收集、制成盐酸小檗碱)，为后续分离减少杂质干扰，并同时起到富集黄柏碱的作用。

C、过滤进一步除杂：

将步骤B所得除杂富集后的黄柏碱半成品用90％甲醇溶解，甲醇用量按固体物重量∶甲醇体积＝1g∶10ml计算(即约233.8ml)，溶解后的溶液用孔径0.45um的有机滤膜过滤，得约230ml淡黄色澄清透明滤液；再进行下述步骤D。

本步骤通过甲醇溶解、有机滤膜过滤，可进一步除去大分子杂质，纯化黄柏碱。

D、通过制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体：

(a)、确定高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形及归属：

通过液-质联用(HPLC-MS)，采用填料为C₁₈的色谱柱(C₁₈粒度为5um，柱长为250mm，内径4.6mm)，流动相组成为体积分数40％的甲醇水溶液(其中还含体积分数为0.5％的氨水)，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为284nm，取步骤C所得的澄清透明滤液100ul进样，进行黄柏碱单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定黄柏碱单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t＝7.81-8.93min的峰所对应的物质为黄柏碱单体(由于制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体也采用C18色谱柱，对同样的样品，虽然因为流动相等略有差异而导致出峰时间有所不同，但出峰顺序及峰形等大致相同，因而可推断出在制备型高效液相色谱中黄柏碱单体的出峰位置及峰形等)。

(b)、制备黄柏碱单体：

采用填料为C₁₈的色谱柱(内径200mm，C₁₈粒度为10um)，流动相组成为体积分数40％的甲醇水溶液(其中还含体积分数为0.5％的氨水)，流速为300mL/min，检测波长为284nm，取步骤C所得的澄清透明滤液进样，进行黄柏碱单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤(a)确定的高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形等情况，针对性收集黄柏碱单体的制备馏分溶液(出峰时间为13-15min)，得黄柏碱单体溶液，进行下述步骤E。

E、二氯甲烷萃取：

将步骤D所得的黄柏碱单体溶液，于45℃水浴减压浓缩至原体积的1/2，再加入0.8倍体积水饱和的二氯甲烷萃取4次，收集二氯甲烷层，用无水硫酸钠脱水，得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，进行下述步骤F；

F、干燥制备黄柏碱单体产品：

取步骤E所得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，于55℃减压浓缩至干，再将固体物于85℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得黄柏碱单体产品12.9g。计算得产品收率为(12.9/4000)×100％＝0.323％。

通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)复检产品纯度，测得结果为98.25％。

实施例4

本实施例黄柏碱单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤：

A、提取总生物碱：

取黄柏药材5Kg，切成宽约3mm的细丝，装入渗漉装置中，加入体积百分比浓度为5％的盐酸水溶液60L，浸泡36h，控制流速为8L/h，进行渗漉提取，收集渗漉液共57L，弃去药渣，于65℃水浴减压浓缩收集的渗漉液至有淡黄色粉末析出，得浓缩后的总生物碱提取液35L，进行下述步骤B。

本步骤通过盐酸水溶液浸泡、渗漉提取、减压浓缩，所得的总生物碱提取液中主要含有黄柏碱、小檗碱等成分；

B、酸沉除去小檗碱：

取步骤A所得浓缩后的总生物碱提取液，缓慢搅拌滴加浓盐酸至pH＝1，室温静置10h，滤除黄色沉淀物，母液于45℃水浴减压浓缩至有黄色固体析出，室温静置10h，再滤除黄色沉淀物，重复浓缩母液、过滤操作3次，将最终所得母液搅拌滴加5％氢氧化钠水溶液调pH至8，于60℃水浴减压浓缩至干，得除杂富集后的黄柏碱半成品(黄色固体)38.2g，再进行下述步骤C。

本步骤中，采用盐酸调pH使总生物碱提取液中大量的小檗碱成分沉淀、再过滤去除，通过反复浓缩、过滤，可较完全的去除小檗碱(小檗碱单独收集、制成盐酸小檗碱)，为后续分离减少杂质干扰，并同时起到富集黄柏碱的作用。

C、过滤进一步除杂：

将步骤B所得除杂富集后的黄柏碱半成品用纯甲醇溶解，甲醇用量按固体物重量∶甲醇体积＝1g∶6ml计算(即约230ml)，溶解后的溶液用孔径0.45um的有机滤膜过滤，得约226ml淡黄色澄清透明滤液；再进行下述步骤D。

本步骤通过甲醇溶解、有机滤膜过滤，可进一步除去大分子杂质，纯化黄柏碱。

D、通过制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体：

(a)、确定高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形及归属：

通过液-质联用(HPLC-MS)，采用填料为C₁₈的色谱柱(C₁₈粒度为5um，柱长为250mm，内径4.6mm)，流动相组成为体积分数16％的甲醇水溶液(其中还含体积分数为0.3％的氨水)，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为284nm，取步骤C所得的澄清透明滤液80ul进样，进行黄柏碱单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定黄柏碱单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t＝22.08-23.95min的峰所对应的物质为黄柏碱单体(由于制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体也采用C18色谱柱，对同样的样品，虽然因为流动相等略有差异而导致出峰时间有所不同，但出峰顺序及峰形等大致相同，因而可推断出在制备型高效液相色谱中黄柏碱单体的出峰位置及峰形等)。

(b)、制备黄柏碱单体：

采用填料为C₁₈的色谱柱(内径80mm，C₁₈粒度为8um)，流动相组成为体积分数20％的甲醇水溶液(其中还含体积分数为0.3％的氨水)，流速为140mL/min，检测波长为284nm，取步骤C所得的澄清透明滤液进样，进行黄柏碱单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤(a)确定的高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形等情况，针对性收集黄柏碱单体的制备馏分溶液(出峰时间为36-40min)，得黄柏碱单体溶液，进行下述步骤E。

E、二氯甲烷萃取：

将步骤D所得的黄柏碱单体溶液，于65℃水浴减压浓缩至原体积的1/4，再加入水饱和的二氯甲烷等体积萃取3次，收集二氯甲烷层，用无水硫酸钠脱水，得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，进行下述步骤F；

F、干燥制备黄柏碱单体产品：

取步骤E所得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，于35℃减压浓缩至干，再将固体物于60℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得黄柏碱单体产品17.8g。计算得产品收率为(17.8/5000)×100％＝0.356％。

通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)复检产品纯度，测得结果为99.25％。

实施例5

本实施例黄柏碱单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤：

A、提取总生物碱：

取黄柏药材10Kg，切成宽约5mm的细丝，装入渗漉装置中，加入体积百分比浓度为4％的盐酸水溶液100L，浸泡24h，控制流速为10L/h，进行渗漉提取，收集渗漉液共90L，弃去药渣，于55℃水浴减压浓缩收集的渗漉液至有淡黄色粉末析出，得浓缩后的总生物碱提取液73L，进行下述步骤B。

本步骤通过盐酸水溶液浸泡、渗漉提取、减压浓缩，所得的总生物碱提取液中主要含有黄柏碱、小檗碱等成分；

B、酸沉除去小檗碱：

取步骤A所得浓缩后的总生物碱提取液，缓慢搅拌滴加浓盐酸至pH＝1.5，室温静置16h，滤除黄色沉淀物，母液于85℃水浴减压浓缩至有黄色固体析出，室温静置15h，再滤除黄色沉淀物，重复浓缩母液、过滤操作6次，将最终所得母液搅拌滴加1％氢氧化钠水溶液调pH至8，于85℃水浴减压浓缩至干，得除杂富集后的黄柏碱半成品(黄色固体)76.2g，再进行下述步骤C。

本步骤中，采用盐酸调pH使总生物碱提取液中大量的小檗碱成分沉淀、再过滤去除，通过反复浓缩、过滤，可较完全的去除小檗碱(小檗碱单独收集、制成盐酸小檗碱)，为后续分离减少杂质干扰，并同时起到富集黄柏碱的作用。

C、过滤进一步除杂：

将步骤B所得除杂富集后的黄柏碱半成品用90％甲醇溶解，甲醇用量按固体物重量∶甲醇体积＝1g∶10ml计算(即约760ml)，溶解后的溶液用孔径0.45um的有机滤膜过滤，得约755ml淡黄色澄清透明滤液；再进行下述步骤D。

本步骤通过甲醇溶解、有机滤膜过滤，可进一步除去大分子杂质，纯化黄柏碱。

D、通过制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体：

(a)、确定高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形及归属：

通过液-质联用(HPLC-MS)，采用填料为C₁₈的色谱柱(C₁₈粒度为5um，柱长为250mm，内径4.6mm)，流动相组成为体积分数22％的甲醇水溶液(其中还含体积分数为0.2％的氨水)，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为284nm，取步骤C所得的澄清透明滤液70ul进样，进行黄柏碱单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定黄柏碱单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t＝16.99-18.21min的峰所对应的物质为黄柏碱单体(由于制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体也采用C18色谱柱，对同样的样品，虽然因为流动相等略有差异而导致出峰时间有所不同，但出峰顺序及峰形等大致相同，因而可推断出在制备型高效液相色谱中黄柏碱单体的出峰位置及峰形等)。

(b)、制备黄柏碱单体：

采用填料为C₁₈的色谱柱(内径200mm，C₁₈粒度为10um)，流动相组成为体积分数22％的甲醇水溶液(其中还含体积分数为0.2％的氨水)，流速为300mL/min，检测波长为284nm，取步骤C所得的澄清透明滤液进样，进行黄柏碱单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤(a)确定的高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形等情况，针对性收集黄柏碱单体的制备馏分溶液(出峰时间为28-30min)，得黄柏碱单体溶液，进行下述步骤E。

E、二氯甲烷萃取：

将步骤D所得的黄柏碱单体溶液，于45℃水浴减压浓缩至原体积的1/2，再加入0.8倍体积水饱和的二氯甲烷萃取4次，收集二氯甲烷层，用无水硫酸钠脱水，得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，进行下述步骤F；

F、干燥制备黄柏碱单体产品：

取步骤E所得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，于55℃减压浓缩至干，再将固体物于85℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得黄柏碱单体产品35.1g。计算得产品收率为(35.1/10000)×100％＝0.351％。

通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)复检产品纯度，测得结果为99.02％。

Claims (5)

1.一种黄柏碱单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤：

A、提取总生物碱：

取黄柏药材，切成宽1-5mm的细丝，装入渗漉装置中，加入体积百分比浓度为1-10%的盐酸水溶液，其加入量按照药材重量:盐酸水溶液体积=1Kg:(5-25)L计算，浸泡5-36h，控制流速为1-10L/h，进行渗漉提取，收集渗漉液，弃去药渣，于45℃-85℃水浴减压浓缩收集的渗漉液至有淡黄色粉末析出，得浓缩后的总生物碱提取液，进行下述步骤B；

B、酸沉除去小檗碱：

取步骤A所得浓缩后的总生物碱提取液，缓慢搅拌滴加盐酸至pH=1-2，室温静置10-36h，滤除黄色沉淀物，母液于45℃-85℃水浴减压浓缩至有黄色固体析出，室温静置10-36h，再滤除黄色沉淀物，重复浓缩母液、过滤操作3-6次，将最终所得母液搅拌滴加氢氧化钠水溶液调pH至7-9，于60℃-85℃水浴减压浓缩至干，得除杂富集后的黄柏碱半成品，再进行下述步骤C；

C、过滤进一步除杂：

将步骤B所得除杂富集后的黄柏碱半成品用≥70%的甲醇溶解，甲醇用量按固体物重量:甲醇体积=1g:(4-10)ml计算，溶解后的溶液用孔径0.22um-0.45um的有机滤膜过滤，得澄清透明滤液；再进行下述步骤D；

D、通过制备型高效液相色谱分离黄柏碱单体：

采用填料为C18的色谱柱；

流动相组成为：体积分数10%-40%的甲醇水溶液-其中还含体积分数为0.2%-0.5%的氨水；

检测波长为284nm；

取步骤C所得的澄清透明滤液进样，进行黄柏碱单体的制备分离，紫外检测器在线监测针对性收集黄柏碱单体的制备馏分溶液，得黄柏碱单体溶液，进行下述步骤E；

E、二氯甲烷萃取：

将步骤D所得的黄柏碱单体溶液，于45℃-85℃水浴减压浓缩至原体积的1/4-1/2，再加入0.8-1.5倍水饱和的二氯甲烷萃取2-4次，收集二氯甲烷层，用无水硫酸钠脱水，得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，进行下述步骤F；

F、干燥制备黄柏碱单体产品：

取步骤E所得黄柏碱单体的二氯甲烷溶液，于25℃-55℃减压浓缩至干，再将固体物于45℃-85℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得所述的黄柏碱单体产品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤A“提取总生物碱”过程中，盐酸水溶液的浓度为：5%-6%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤A“提取总生物碱”过程中，盐酸水溶液的加入量按照药材重量:盐酸水溶液体积=1Kg:(10-15)L计算。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤B“酸沉除去小檗碱”过程中，氢氧化钠水溶液的重量百分比浓度为1-5%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤D中，流动相的组成为：体积分数16%-22%的甲醇水溶液-其中还含体积分数为0.2%-0.3%的氨水。

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