CN113116897B - 木兰花碱在制备骨调节药物增效剂中的应用及包含木兰花碱的药物组合物 - Google Patents

木兰花碱在制备骨调节药物增效剂中的应用及包含木兰花碱的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了木兰花碱在制备骨调节药物增效剂中的应用及包含木兰花碱的药物组合物，属于生物医药技术领域。本发明所述的木兰花碱可用于制备骨调节药物增效剂，也可用于制备具有促进成骨细胞分化和矿化作用的药物组合物。本发明所述的药物组合物，包括补骨脂素和当药苷中的一种或两种，与木兰花碱。本发明可广泛应用于医药领域，能够为骨质疏松的疾病治疗提供新的药物来源。

Description

木兰花碱在制备骨调节药物增效剂中的应用及包含木兰花碱 的药物组合物
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及木兰花碱在制备骨调节药物增效剂中的应用及包含木兰花碱的药物组合物。
背景技术
骨科疾病是以骨的病变为特征的常见疾病之一，常见骨科病有髌骨骨折、骨质疏松、尺神经损伤、先天性髋内翻、断指再植、趾间神经痛、距骨后外结节骨折、髌骨骨折、拇指再造、先天性胫骨缺等。
骨质疏松症是以骨量减少、骨的微细结构被破坏进而导致骨折为特征的一种系统性、全身性代谢疾病。目前的数据显示全球约有2亿人口患有骨质疏松，其发病率在常见病、多发病中位列第7位。骨质疏松发病的最终原因都与骨重建失调有关。骨重建是指骨在成熟后仍不断进行的更新与改造，依赖于骨骼代谢中骨吸收和骨形成的动态平衡。骨吸收是由破骨细胞介导的骨质分解代谢活动，骨形成是由成骨细胞介导的骨质合成代谢活动。骨重建是成熟骨组织骨转换的细胞与形态学基础，具有预防骨组织疲劳和微损伤的积累、保持其正常生物力学功能的作用。正常的情况下，骨骼维持在健康状态，然而一旦骨重建的动态平衡被打破，骨吸收超过了骨形成，就容易导致骨质疏松疾病的发生。因为骨质疏松症的根本病理过程在于骨吸收(破坏)增加而骨生成减少，故而抗骨质疏松药物根据作用方式的不同大体可分为抗骨吸收药物(一般通过抑制破骨细胞的数量与功能实现)和促骨形成药物(一般通过促进成骨细胞的数量与功能实现)。按照药物的生化结构与具体作用途径，可细分为以下几个类型：
1.选择性雌激素受体调节剂，可选择性地结合并激活或拈抗体内不同部位的雌激素受体。作为一种经典的选择性雌激素受体调节剂，雷洛昔芬可用于临床防治绝经后骨质疏松症的常见药物；
2.双磷酸盐类药物，可抑制骨吸收过程。一些临床实验已证明通过口服或静脉注射方式给予双磷酸盐类药物可有效降低骨质疏松性脆性骨折的发生率；
3.狄诺塞麦，第一个被批准用于治疗骨质疏松症的生物制剂。与双磷酸盐类药物不同，狄诺塞麦通过结合“核因子KB配体(RANKL)”继而激活相应受体产生下游效应并最终抑制破骨细胞的分化成熟；
4.中草药，在研究领域多采用单味中药或复方作为治疗手段。单味中药比较有代表性的药物有淫羊藿、熟地黄、当归、杜仲、补骨脂、山药以及骨碎补等；复方制剂中最有代表性的方剂如六味地黄丸、仙灵骨葆胶囊等。
此外，前期大量研究表明，中药及天然来源的黄酮、香豆素、木脂素等成分具有不同程度的雌激素样作用，它们被称作植物雌激素，日益受到人们的关注。然而，这些中药成分效力往往比雌激素低得多(比雌激素低100-1000倍)，难以通过口服方式达到药用效果。因此，选择能够口服且具有协同增效作用的中药组合物具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供木兰花碱在制备骨调节药物增效剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供木兰花碱在制备具有促进成骨细胞分化和矿化作用的药物组合物中的应用。
本发明的再一目的在于一种包含木兰花碱的具有促进成骨细胞分化和矿化作用的药物组合物及其应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：
木兰花碱在制备骨调节药物增效剂中的应用。
所述的骨调节药物包括治疗和/或预防骨相关疾病的药物。
所述的治疗和/或预防骨相关疾病的药物包含补骨脂素和/或当药苷。
所述的骨相关疾病包括骨质疏松、骨折、骨关节炎中的至少一种；更优选为骨质疏松。
木兰花碱在制备具有促进成骨细胞分化和矿化作用的药物组合物中的应用。
一种具有促进成骨细胞分化和矿化作用的药物组合物，包括补骨脂素和当药苷中的一种或两种，与木兰花碱。
所述的木兰花碱的分子式为：C20H24ClNO4，分子结构式如下：
Figure BDA0002367697860000021
补骨脂素的分子式为：C11H6O3，分子结构式如下：
Figure BDA0002367697860000022
当药苷的分子式为：C16H22O9，分子结构式如下：
Figure BDA0002367697860000023
所述的药物组合物包括木兰花碱、补骨脂素和当药苷时，木兰花碱、补骨脂素和当药苷的重量比为4～8:1～3:9～26。
所述的组合物包括木兰花碱、补骨脂素和当药苷时，给予小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1细胞(以下表述为MC3T3-E1细胞)的有效浓度为10nM木兰花碱、10nM补骨脂素和10nM当药苷。
所述的药物组合物，还包括药学上可接受的辅料。
所述的药学上可接受的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂中的至少一种。
所述的赋形剂优选为乳糖。
所述的填充剂优选为淀粉。
所述的粘合剂优选为滑石粉、10％淀粉浆和10％聚维酮k30中的至少一种。
所述的湿润剂优选为硬脂酸镁。
所述的崩解剂优选为淀粉、交联羧甲基纤维素钠中的至少一种。
所述的表面活性剂优选为泊洛沙姆188。
所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防骨相关疾病药物中的应用。
所述的骨相关疾病优选包括骨质疏松、骨折、骨关节炎中的至少一种；更优选为骨质疏松。
由上述药物组合物制备的药物组合物制剂，所述的药物组合物制剂的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂、口服液和注射剂中的至少一种。
所述的药物组合物制剂通过常规方法即可制备得到。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明人首次发现，木兰花碱在10nM浓度下没有显著促进成骨细胞分化和矿化活性，其与低于活性浓度的10nM补骨脂素或10nM当药苷组合，与补骨脂素和当药苷成分单独作用相比，可以明显的促进MC3T3-E1细胞的分化和矿化，因此，木兰花碱能够有效的降低补骨脂素、当药苷促进成骨活性所需的最低有效浓度，在诱导成骨细胞活性中产生增效作用。
(2)本发明人还发现，与活性浓度的补骨脂素(10μM)和当药苷(1μM)相比，10nM木兰花碱与远低于活性浓度的10nM补骨脂素和10nM当药苷的组合物MPS能明显的促进MC3T3-E1细胞的分化和矿化，因此可以保证补骨脂素在较低浓度下发挥骨调节药效而减轻其在高浓度引起的毒副作用如肝毒性。
(3)本发明人还发现，木兰花碱能有效的降低补骨脂素、当药苷改善骨质疏松模型小鼠股骨和胫骨的骨密度和骨容积所需的药效浓度，且木兰花碱、当药苷和补骨脂素三者形成的组合物能够提高骨质疏松模型小鼠股骨和胫骨的骨密度和骨容积。本发明为今后对骨质疏松等骨相关疾病的研究提供了方向。
(4)所述的组合物给予MC3T3-E1细胞的有效浓度为10nM木兰花碱、10nM补骨脂素和10nM当药苷。组合物MPS在治疗骨质疏松时，木兰花碱、补骨脂素和当药苷的有效组合剂量分别为0.8～4.0mg/kg/d、0.125～1.2mg/kg/d、1.8～10.4mg/kg/d。
(5)本发明可广泛应用于医药领域，能够为骨质疏松的疾病治疗提供新的药物来源。
附图说明
图1为补骨脂素、当药苷和木兰花碱的结构式图。
图2为不同测试浓度的木兰花碱、补骨脂素和当药苷分别对MC3T3-E1细胞分化活性的影响结果图；其中，A为不同测试浓度的木兰花碱对MC3T3-E1细胞分化活性的影响结果图；B为不同测试浓度的补骨脂素对MC3T3-E1细胞分化活性的影响结果图；C为不同测试浓度的当药苷对MC3T3-E1细胞分化活性的影响结果图；Con为空白对照组；E2为17β-雌二醇；Mag为木兰花碱；Pso为补骨脂素；Swe为当药苷；*表示该浓度组与空白对照组差异显著，**表示该浓度组与空白对照组差异非常显著，***表示该浓度组与空白对照组差异极显著。
图3为不同测试浓度的木兰花碱、补骨脂素和当药苷对MC3T3-E1细胞矿化活性的影响结果图；其中，A为不同测试浓度的木兰花碱对MC3T3-E1细胞矿化活性的影响结果图；B为不同测试浓度的补骨脂素对MC3T3-E1细胞矿化活性的影响结果图；C为不同测试浓度的当药苷对MC3T3-E1细胞矿化活性的影响结果图；Con为空白对照组；E2为17β-雌二醇；Mag为木兰花碱；Pso为补骨脂素；Swe为当药苷；*表示该浓度组与空白对照组差异显著，**表示该浓度组与空白对照组差异非常显著，***表示该浓度组与空白对照组差异极显著。
图4为木兰花碱对低于活性浓度的补骨脂素或当药苷诱导的MC3T3-E1细胞分化和矿化活性的影响结果图；其中，A为木兰花碱对低于活性浓度的补骨脂素或当药苷诱导的MC3T3-E1细胞分化活性的影响结果图；B为木兰花碱对低于活性浓度的补骨脂素或当药苷诱导的MC3T3-E1细胞矿化活性的影响结果图；C为利用茜素红S染色矿化钙结节结果图；Con为空白对照组，E2为17β-雌二醇，Mag为木兰花碱，Pso为补骨脂素，Swe为当药苷；*表示该浓度组与空白对照组差异显著，***表示该浓度组与空白对照组差异极显著。
图5为木兰花碱与补骨脂素和当药苷的组合物MPS对MC3T3-E1细胞分化和矿化活性的影响结果图；A为木兰花碱与补骨脂素和当药苷的组合物MPS对MC3T3-E1细胞分化活性的影响结果图；B为木兰花碱与补骨脂素和当药苷的组合物MPS对MC3T3-E1细胞矿化活性的影响结果图；Con为空白对照组，E2为17β-雌二醇，Mag为木兰花碱，Pso为补骨脂素，Swe为当药苷；*表示该浓度组与空白对照组差异显著，**表示该浓度组与空白对照组差异非常显著，***表示该浓度组与空白对照组差异极显著；#表示该浓度组与组合物MPS(Mag 10nM+Pso10nM+Swe 10nM)差异显著，##表示该浓度组与组合物MPS(Mag 10nM+Pso 10nM+Swe 10nM)差异非常显著，###表示该浓度组与组合物MPS(Mag 10nM+Pso 10nM+Swe 10nM)差异极显著。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1不同测试浓度的木兰花碱对MC3T3-E1细胞分化和矿化活性的影响
1、待测药物配置
木兰花碱(magnoflorine，CAS：6681-18-1)、补骨脂素(psoralen，CAS：66-97-7)和当药苷(sweroside，CAS：14215-86-2)纯度均大于98％，购于上海融禾医药科技发展有限公司，结构式如图1所示。为了避免溶剂对细胞的影响，本研究将药物溶解后按照给药培养基体积的千分之一进行给药，因此本研究的所有药物在给药前配制浓度为含药培养基终浓度的1000倍，例如：实施例中10nM 17β-雌二醇作为阳性药，其加药过程为取1μL的10μM 17β-雌二醇加入1mL分化诱导培养基混合后的终浓度为10nM 17β-雌二醇。
1.1、阳性药10μM 17β-雌二醇(E2)配制：称取17β-雌二醇标准品粉末适量，加入溶剂无水乙醇(购自上海慕百化工有限公司，下同)配制10mM的母液，随后用无水乙醇分别按照10倍稀释为1mM至10μM的加样液。
1.2、不同浓度的木兰花碱(magnoflorine，Mag)配制：称取木兰花碱标准品粉末适量，加入溶剂无水乙醇配制10mM的母液，随后用无水乙醇按照10倍浓度梯度稀释得到浓度分别为0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM的木兰花碱。此外，取200μL、100μM的木兰花碱加入800μL无水乙醇配制成1mL、20μM的木兰花碱，再取300μL、100μM的木兰花碱加入700μL无水乙醇配制成1mL、30μM的木兰花碱。
1.3、不同浓度的补骨脂素(psoralen，Pso)配制：称取补骨脂素标准品粉末适量，加入溶剂无水乙醇配制10mM的母液，随后用无水乙醇按照10倍浓度梯度稀释得到浓度分别为0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM、10mM的补骨脂素。另外，先取200μL、100μM的补骨脂素加入800μL无水乙醇配制成1mL、20μM的补骨脂素，再取300μL、100μM的补骨脂素加入700μL无水乙醇配制成1mL、30μM的补骨脂素。
1.4、不同浓度的当药苷(sweroside，Swe)配制：称取当药苷标准品粉末适量，加入溶剂无水乙醇配制10mM的母液，随后用无水乙醇按照10倍浓度梯度稀释得到浓度分别为0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM、10mM的当药苷。另外，先取200μL、100μM的当药苷加入800μL无水乙醇配制成1mL、20μM的当药苷，再取300μL、100μM当药苷加入700μL无水乙醇配制成1mL、30μM当药苷。
1.5、组合物MP配制：吸取20μM的补骨脂素和20μM的木兰花碱各100μL，混合配制200μL组合物MP，使补骨脂素和木兰花碱的终浓度均为10μM。
1.6、组合物MS配制：吸取20μM当药苷和20μM木兰花碱各100μL，混合配制200μL组合物MS，使当药苷和木兰花碱的终浓度均为10μM。
1.7、组合物PS配制：吸取20μM补骨脂素和20μM当药苷各100μL，混合配制200μL组合物PS，使补骨脂素和当药苷的终浓度均为10μM。
1.8、组合物MPS配制：吸取30μM补骨脂素、30μM当药苷和30μM木兰花碱各100μL，混合配制300μL组合物MPS，使木兰花碱、补骨脂素和当药苷的终浓度均为10μM。
2、实验方法
2.1、细胞分化活性
小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1细胞购于美国ATCC，细胞采用α-MEM细胞培养液(购自基诺生物医药技术有限公司)加入1％P/S(100unit/mL青霉素，100mg/mL链霉素)和10％FBS(澳洲胎牛血清，购自北京智杰方远科技有限公司)培养于5％CO2，温度37℃，湿度95％的条件下培养。待细胞长满后利用贝克曼库尔特细胞计数仪将细胞进行细胞计数，然后接种于12孔板中，每孔加入含1.2×104个细胞的0.5mLα-MEM细胞培养液(1％P/S和10％FBS)，贴壁培养待细胞长到80％以上后弃去培养基，更换为含矿化诱导剂(10mMβ-甘油磷酸钠，50μg/mL抗坏血酸)的α-MEM(1％P/S，10％FBS)成骨分化诱导培养基进行培养。具体加药为：分别取0.5mL上述成骨分化诱导培养基加入0.5μL下列溶液：空白溶剂(无水乙醇)，10μM阳性药17β-雌二醇，0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM的木兰花碱，0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM、10mM的补骨脂素，0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM、10mM的当药苷共培养7天，每2～3天更换一次含药诱导培养液。
第八天弃去旧的含药诱导培养液，随后每孔先使用0.5mL PBS(浓度0.01M，pH为7.4，下同)润洗2次，再加入100μL Passive Lysis Buffer细胞裂解液在冰上持续摇晃裂解30min。首先每孔取20μL的细胞裂解液，按照Wako lab assay ALP检测试剂盒(购自日本Wako)上说明的相关步骤进行操作，最后用酶标仪在405nm波长下检测OD值。与此同时，每孔另取2μL细胞裂解液，按照BCA检测蛋白浓度试剂盒(购自上海纪宁实业有限公司)说明书进行操作，最后于562nm检测各孔的总蛋白含量。碱性磷酸酶ALP活性采用OD比值：每孔ODALP值/每孔ODBCA，并用碱性磷酸酶的相对活性即：每个孔OD比值×100％/空白溶剂对照组OD比值的平均值来表示ALP的活性。实验至少重复3次，进行统计分析，实验数据采用ANOVA检验进行统计学分析，p<0.05有统计学意义。
2.2、茜素红S染色测试矿化活性
利用贝克曼库尔特细胞计数仪对MC3T3-E1细胞进行细胞计数，然后接种于12孔板中，每孔加入含1×105个细胞的1.0mLα-MEM细胞培养液(1％P/S和10％FBS)，待细胞贴壁培养至细胞长到80％以上，更换为新鲜的成骨分化诱导培养基进行矿化钙结节的诱导培养，具体加药为：分别取1mL的分化诱导培养基加入1μL下列溶液：空白溶剂(无水乙醇)，10μM阳性药17β-雌二醇，0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM的木兰花碱，0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM、10mM的补骨脂素，0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM、10mM的当药苷共培养大约30天，共培养大约30天，并每2～3天更换新鲜的含药诱导培养液直至观察到矿化钙结节出现后终止培养。
终止培养后弃去旧的培养液并用0.5mL PBS溶液轻轻的浸洗2次，随后每孔加300μL的4％多聚甲醛溶液进行固定15分钟，再采用茜素红S染色法进行染色定性观察。其染色的具体步骤为：每孔使用0.5mL PBS浸洗一次后，加入0.5mL 1％茜素红S染液进行染色10分钟，然后反复用双蒸水润洗至洗去背景色后，待细胞板晾干后拍照进行定性观察并比较。为了进一步对矿化钙结节的形成进行定量分析，本实验采用每孔加入500μL的0.5M HCl-5％SDS溶液(pH为3～4)对矿化钙结节进行不断的振荡溶解30分钟，最后每孔吸取200μL溶解液转至96孔板中，在酶标仪中设置波长415nm检测OD值。以每个孔OD值×100％/空白溶剂对照组OD的平均值来表征矿化钙结节的促进率。实验至少重复3次，进行统计分析。实验数据采用ANOVA检验进行统计学分析，p<0.05有统计学意义。
3、实验结果
上述细胞分化实验结果分别如图2中的A图、B图和C图所示，木兰花碱在0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM浓度下单独作用没有显著性促进MC3T3-E1细胞分化活性，而在补骨脂素和当药苷单独作用下显著性促进细胞分化的活性浓度均为1μM和10μM。细胞矿化实验结果分别如图3中的A图、B图和C图所示，木兰花碱在0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM浓度下单独作用没有显著性促进细胞矿化活性，而在补骨脂素和当药苷单独作用下显著性促进细胞矿化的活性浓度均为1μM和10μM。由此可见，当补骨脂素和当药苷的浓度为1～10μM时，均具有显著性促进细胞分化和矿化的作用，而当药苷和补骨脂素促进细胞分化和矿化的最低有效浓度分别为1μM和10μM。
实施例2木兰花碱对补骨脂素或当药苷诱导的MC3T3-E1细胞分化和矿化活性的影响
1、待测药物配制
参照实施例1中的1.1～1.8部分。
2、实验方法
2.1、细胞分化活性
木兰花碱对补骨脂素或当药苷诱导的MC3T3-E1细胞分化和矿化活性的影响实验参照实施例1中的2.1部分，不同之处在于，具体加药为：分别取0.5mL成骨分化诱导培养基加入0.5μL下列溶液：空白溶剂(无水乙醇)，10μM的阳性药17β-雌二醇，不同待测试样品溶液(10μM的补骨脂素、10μM的当药苷、10μM的木兰花碱、组合物MP、组合物MS)共培养7天，每2～3天更换一次含药诱导培养液。实验至少重复3次，进行统计分析。实验数据采用ANOVA检验进行统计学分析，p<0.05有统计学意义。
2.2、细胞矿化活性
木兰花碱对补骨脂素或当药苷诱导的MC3T3-E1细胞分化和矿化活性的影响实验参照实施例1中的2.2部分，不同之处在于，具体加药为：分别取1mL成骨分化诱导培养基加入1μL下列溶液：空白溶剂(无水乙醇)，10μM的阳性药17β-雌二醇，不同待测试样品溶液(10μM补骨脂素、10μM当药苷、10μM木兰花碱、组合物MP、组合物MS)共培养大约30天，并每2～3天更换新鲜的含药诱导培养液直至观察到矿化钙结节出现后终止培养。实验至少重复3次，进行统计分析。实验数据采用ANOVA检验进行统计学分析，p<0.05有统计学意义。
3、实验结果
结合实施例1中结果，以及上述实验结果如图4所示，从图4A可以看出，10nM补骨脂素、10nM当药苷、10nM木兰花碱单独作用下均未能促进MC3T3-E1细胞细胞分化活性，而组合物MP、组合物MS能显著性的促进细胞分化活性。从图4B和图4C可以看出，10nM补骨脂素、10nM当药苷、10nM木兰花碱单独作用下均未能促进细胞矿化活性及增加矿化钙结节染色数目，而组合物MP、组合物MS能显著性的促进细胞矿化活性。由此可见，10nM的木兰花碱能与10nM的当药苷或者10nM的补骨脂素在诱导成骨细胞活性中产生增效作用。
实施例3木兰花碱与补骨脂素和当药苷的组合物MPS对MC3T3-E1细胞分化和矿化活性的影响
1、待测药物配制
参照实施例1中的1.1～1.8部分。
2、实验方法
2.1、细胞分化活性
木兰花碱与补骨脂素和当药苷的组合物MPS对MC3T3-E1细胞分化和矿化活性的影响实验参照实施例1中的2.1部分，不同之处在于，具体加药为：分别取0.5mL成骨分化诱导培养基加入0.5μL下列溶液：空白溶剂(无水乙醇)，10μM的阳性药17β-雌二醇，不同待测试样品溶液(10μM木兰花碱、10mM补骨脂素、1mM当药苷、组合物PS和组合物MPS)，共培养7天，每2～3天更换一次含药诱导培养液，实验至少重复3次，进行统计分析。实验数据采用ANOVA检验进行统计学分析，p<0.05有统计学意义。
2.2、细胞矿化活性
木兰花碱与补骨脂素和当药苷的组合物MPS对MC3T3-E1细胞分化和矿化活性的影响实验参照实施例1中的2.2部分，不同之处在于，具体加药为：分别取1mL的分化诱导培养基加入1μL下列溶液：空白溶剂(无水乙醇)，10μM的阳性药17β-雌二醇，不同待测试样品溶液(10μM木兰花碱、10mM补骨脂素、1mM当药苷、组合物PS和组合物MPS)，共培养大约30天，并每2～3天更换新鲜的含药诱导培养液直至观察到矿化钙结节出现后终止培养。实验至少重复3次，进行统计分析。实验数据采用ANOVA检验进行统计学分析，p<0.05有统计学意义。
3、实验结果
上述实验结果如图5所示，10μM补骨脂素和1μM当药苷能促进MC3T3-E1细胞分化和矿化的活性，而实施例1中的结果显示补骨脂素和当药苷浓度分别降低1000倍和100倍的浓度即10nM补骨脂素和10nM当药苷单独作用没有明显的促进细胞分化和矿化的活性。且本实施例中10nM补骨脂素和10nM当药苷组合物PS也无明显促进作用，但加入10nM木兰花碱后即组合物MPS具有明显的促进分化和矿化活性的作用，并与组合物PS、10μM补骨脂素和1μM当药苷的分化和矿化活性均有明显的统计学差异，组合物MPS的分化活性相当于1.32倍的组合物PS、1.20倍的10μM补骨脂素、1.20倍的1μM当药苷；组合物MPS矿化活性相当于1.42倍的组合物PS、1.21倍的10μM补骨脂素、1.20倍的1μM当药苷。
综上实施例1～3的结果，我们发现非活性浓度(10nM)的木兰花碱能够有效的降低补骨脂素、当药苷促进成骨活性所需的最低有效浓度，表明木兰花碱能对补骨脂素或者当药苷在低于其活性浓度下诱导的MC3T3-E1细胞分化和矿化活性产生增效作用。同时三者的组合物MPS的促成骨活性远高于单独给予补骨脂素(10μM)和当药苷(1μM)的促成骨活性。上述研究首次发现了该浓度下的三个成分组合物MPS具有促进细胞分化和矿化的作用，提示该组合物MPS具有促进骨折愈合、防治骨质疏松的作用，且木兰花碱能产生显著性的增效作用从而使较低浓度下的补骨脂素在发挥骨调节作用的同时减轻其毒副作用。
实施例4组合物MPS对去卵巢诱导的骨质疏松模型小鼠的影响
1、实验方法
清洁级C57BL/6J小鼠(由广东省实验动物中心提供)80只，随机挑取10只作为对照组，剩余70只采用12周龄的雌性SD小鼠，小鼠乙醚麻醉后俯位固定，在背部靠脊柱处切口，于无菌条件下摘除双侧卵巢造成骨质疏松模型小鼠，假手术组(Sham)缝合切口后作为对照组。手术后恢复2周，存活下来64只，随机分为8组，分别灌胃以下药物：大鼠卵巢切除术模型组(OVX组)，给予阳性药17β-雌二醇给药组(E2，3.2mg/kg/d)，木兰花碱组(4.0mg/kg/d)，补骨脂素组(16.0mg/kg/d)，当药苷组(80.0mg/kg/d)，组合物PS组(补骨脂素0.8mg/kg/d和当药苷4.8mg/kg/d组合)，组合物MPS组(木兰花碱4.0mg/kg/d，补骨脂素0.8mg/kg/d和当药苷4.8mg/kg/d组合)。同时设置假手术组作为对照组(即Sham组)。连续培养给药3个月后将小鼠处死，剥离小鼠左侧股骨和胫骨，剔除肌肉和软骨并用浸湿PBS纱布包好，在股骨远端和胫骨近端0.3mm处开始的80片连续切片进行Micro-CT分析，将每片选取的骨小梁进行三维重建(Sigma＝1.2，support＝2，Threshold＝220)，计算骨密度(BMD)及形态计量学参数骨容积骨体积/组织体积(BV/TV)。
2、实验结果
OVX组相对于Sham组微观骨参数显著变化(表1)，提示造模成功。而阳性对照组(17β-雌二醇)相对于OVX组能显著增加BMD和BV/TV。木兰花碱组和组合物PS组没有明显的促进作用，而补骨脂素组、当药苷组和组合物MPS组相比于OVX组均能增加骨密度BMD和骨容积BV/TV两个指数。同时组合物MPS组相比于补骨脂素组、当药苷组和组合物PS组的药效有显著性的提高。以上结果说明组合物MPS能够显著改善由去卵巢诱导的骨量丢失，且木兰花碱能产生显著性的增效作用从而使补骨脂素在较低剂量下发挥骨调节作用的同时减轻其引起的毒副作用。
表1 组合物MPS对去卵巢诱导的骨质疏松模型小鼠的影响
Figure BDA0002367697860000101
OVX模型组与Sham组、E2组、补骨脂素组、当药苷组和MPS组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；MPS组与补骨脂素组、当药苷组、木兰花碱组和PS组比较，#p<0.01，##p<0.01，###p<0.001。
实施例5组合物MPS片剂
处方：
Figure BDA0002367697860000111
制备工艺：将补骨脂素、当药苷和木兰花碱采用等量递加法混合淀粉，再将混合物过80目筛使其混合均匀，将上述粉末和淀粉浆混匀润湿粉末表面和内部，以用手握紧成团不粘手、用手指轻压即裂开为标准制成塑性软材后，将所制软材过16目筛网制得湿粒，放入烘箱中60℃干燥30min。将干燥后的颗粒过14目筛网后，称取硬脂酸镁、滑石粉和交联羧甲基纤维素钠加入到颗粒中混匀后，用单冲压片机压片，压成1000片，制成片重为250mg，每片含组合物药量为16.0mg的片剂。
实施例6组合物MPS胶囊剂
处方：
Figure BDA0002367697860000112
制备工艺：将补骨脂素、当药苷、木兰花碱和辅料分别过80目筛，与乳糖、淀粉和交联羧甲基纤维素钠充分混合，10％PVP溶液制软材，18目筛制粒，60℃下干燥30min，16目筛整粒后，混匀，灌胶囊，每粒胶囊重为250mg，含组合物药量为35.0mg。
实施例7组合物MPS片剂和组合物MPS胶囊剂对去卵巢诱导的骨质疏松模型小鼠的影响
1.1、实验方法
清洁级C57BL/6J小鼠(由广东省实验动物中心提供)90只，随机挑取10只作为对照组，剩余80只采用12周龄的雌性SD小鼠，小鼠乙醚麻醉后俯位固定，在背部靠脊柱处切口，于无菌条件下摘除双侧卵巢造成骨质疏松模型小鼠，假手术组(Sham组)缝合切口后作为对照组。手术后恢复2周，存活下来72只，随机分为9组，分别灌胃以下药物：大鼠卵巢切除术模型组(OVX)，阳性药己烯雌酚组(Pos，0.4mg/kg/d)，组合物MPS片剂粉末低剂量(T-L，25mg/kg/d)、中剂量(T-M，50mg/kg/d)、高剂量组(T-H，100mg/kg/d)、组合物MPS胶囊内容物低剂量(C-L，25mg/kg/d)、中剂量(C-M，50mg/kg/d)、高剂量组(C-H，100mg/kg/d)。连续培养给药3个月后将小鼠处死，剥离小鼠左侧股骨和胫骨，剔除肌肉和软骨并用浸湿PBS纱布包好，在股骨远端和胫骨近端0.3mm处开始的80片连续切片进行Micro-CT分析，将每片选取的骨小梁进行三维重建(Sigma＝1.2，support＝2，Threshold＝220)，计算骨密度(BMD)及形态计量学参数骨容积；其中，骨容积＝骨体积/组织体积(BV/TV)。
1.2、实验结果
如表2所示，组合物MPS片剂粉末中、高剂量组相比于OVX组均能显著增加BMD和BV/TV，且以高剂量组最为显著。而组合物MPS胶囊内容物低、中、高剂量组相比于OVX组也均能显著增加BMD和BV/TV两个指数，且以高剂量组最为显著。
表2 PS组合物MPS片剂和组合物MPS胶囊剂对去卵巢诱导的骨质疏松模型小鼠的影响
Figure BDA0002367697860000121
OVX模型组与Sham组、Pos组、T-M组、T-H组、C-L组、C-M组和C-H组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种具有促进成骨细胞分化和矿化作用的药物组合物在制备用于治疗和/或预防骨相关疾病药物中的应用，其特征在于，
所述的具有促进成骨细胞分化和矿化作用的药物组合物为补骨脂素和当药苷中的一种或两种，与木兰花碱；
所述的木兰花碱、补骨脂素和当药苷的浓度均为10nM。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的具有促进成骨细胞分化和矿化作用的药物组合物为10nM木兰花碱、10nM补骨脂素和10nM当药苷。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的骨相关疾病为骨质疏松。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述的具有促进成骨细胞分化和矿化作用的药物组合物，还包括药学上可接受的辅料；所述的药学上可接受的辅料进一步为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂中的至少一种。
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