CN104721678A - 高良姜提取物在制备抗骨质疏松保健食品及药品方面的应用 - Google Patents

Abstract

高良姜(Alpinia officinarum Hance，AOH)为双子叶植物姜科植物高良姜的根茎，本研究组发现高良姜浸膏，高良姜提取物，包括以高良姜为原料，采用溶剂提取法进行粗提，柱色谱法进行粗分离，得到的三个不同极性的化合物，即低极性化合物为富集挥发油提取物，中极性化合物为富集黄酮类提取物和高极性化合物为富集二苯基庚烷提取物对去卵巢大鼠骨质疏松有明显的预防及治疗作用，据此，本发明提出用高良姜浸膏或高良姜提取物制备一种供临床作为预防与治疗骨质疏松的保健食品及药品方面的应用，同时，高良姜浸膏或高良姜提取物还可以制备为胶囊，软胶囊，片剂，颗粒剂，冲剂，口服液，喷雾剂，注射剂，供临床作为预防及治疗骨质疏松的保健食品及药品方面的应用。

Description

高良姜提取物在制备抗骨质疏松保健食品及药品方面的应用

技术领域  本发明涉及中药高良姜提取物在制备预防骨质疏松的保健食品及药品方面的应用。

背景技术  骨质疏松是一种以骨量低下，骨微结构破坏，导致骨脆性增加，易发生骨折的全身性代谢性骨病。2011年全国老龄工作委员会发布的《2010年度中国老龄事业发展统计公报》，显示2010年全国60岁及以上老年人口已达1.7765亿，占人口总数的13.26％，全国65岁及以上老年人口达1.1883亿，占人口总数的8.87％，两者均已大于老龄化社会的标准(10％和7％)。2011年，卫生部疾病预防控制局“中国健康知识传播激励计划”上宣布骨质疏松是在中国排第4位(继高血压、糖尿病、冠心病之后)的常见慢性疾病，也是中老年人最常见的骨骼疾病。骨质疏松根据发病机制可以分为三类：一是原发性骨质疏松症，它是随着年龄的增长必然发生的一种生理性退行性病变，占发病总数的85％～90％，可以分为I型(绝经后骨质疏松)和II型(老年性骨质疏松)两种亚型；二是继发性骨质疏松症，诱因多为其他疾病或者药物等，占发病总数的10％～15％，如维甲酸致骨质疏松；三是特发性骨质疏松症，常发生于8～14岁的青少年或者成人，多半有遗传家族史，且女性多于男性，占发病总数的少数。

绝经后骨质疏松是原发性骨质疏松症中最主要的一种，一般发生在妇女绝经后5～10年内，主要是由于绝经后妇女卵巢功能衰退，导致雌激素减少，骨吸收大于骨形成，从而出现的以低骨量和骨组织的纤维结构退行性病变为特征的疾病。据报道，我国骨质疏松症患者总数已达9000万多，约占人口总数的7％，其中50岁以上的妇女发病率高达50％。绝经后骨质疏松的临床症状和体征主要有以下四种。一是疼痛，骨质疏松最主要的、最常见的症状。产生原因：一方面是由于骨转化过程快，骨吸收增加引起的，在骨吸收过程中，骨小梁的破坏、消失以及骨膜下皮质骨的破坏均会引起全身疼痛；另一方面是由于骨折引起的，在受外力压迫或者非外伤性脊椎椎体压缩性骨折时，会引起腰背部疼痛。二是身长缩短和驼背。产生原因：骨质疏松发生时，椎体内部骨小梁会遭到破坏，数量减少，这种疏松且脆弱的椎体受到压迫后会变形，经过数年，整个脊椎会缩短10～15cm，从而导致了身长缩短和 驼背。三是骨折。产生原因：一方面是由于绝经后雌激素缺乏，破骨细胞和成骨细胞功能异常，骨吸收大于骨形成，从而导致骨改建负平衡；另一方面是由于骨小梁变细，骨小梁数量变少，小梁间连续减少，小梁间距增宽等退行性改变及骨小梁微骨折。四是呼吸系统障碍。产生原因：骨质疏松症会导致胸腰椎压缩性骨折，进而导致脊柱后弯、胸廓畸形，引起多个脏器的功能改变，其中以呼吸系统的表现最为突出。这些并发症给患者造成极大地痛苦，严重限制患者的活动，甚至缩短患者的寿命，不仅给中老年妇女带来了肉体和精神上的双重痛苦，而且给社会和家庭带来了沉重的经济和社会负担。

中西医对于绝经后骨质疏松的发生发展有着不同的认识。西医一般认为绝经后骨质疏松发生的主要原因是由于卵巢功能减退，雌激素水平下降所致。雌激素具有促进降钙素分泌和抑制破骨细胞、刺激成骨细胞的作用。妇女绝经后，雌激素缺乏，一方面可以使得破骨细胞过度活跃，骨吸收大于骨形成，进而影响骨胶原的成熟、转化和骨矿化；另一方面，可以抑制甲状旁腺素(PTH)的分泌，使得肾脏25-羟-1α-羟化酶的活化发生障碍，造成1，25(OH)₂D₃的合成减少，肠钙吸收减少，造成负钙平衡，骨矿含量减少，导致骨质疏松。中医则认为绝经后骨质疏松症的发生主要与肾虚有关。《医经精义》曰：“肾藏精，精生髓，髓养骨，故骨者，肾之和也，髓者，精之所生也，精足则髓足，髓在骨内，髓足则骨强。”充分说明了肾、骨与髓三者间存在密切的生理联系，骨的生长、发育、强劲、衰弱与肾精盛衰关系密切，肾精充足则骨髓生化有源，骨骼得以滋养而强健有力；肾精亏虚则骨髓生化无源，骨骼失养而痿弱无力。妇女七七之年天葵竭，肾虚则精髓不足或亏损，而致骨骼失养，这是形成绝经后骨质疏松的基本病因。

随着骨质疏松研究的不断深入，发现女性松质骨的骨量在达到峰值骨量(30岁左右)后就开始缓慢丢失，在绝经后4-8年内也并没有因为激素缺乏而出现快速丢失。绝大多数人的皮质骨丢失发生在65岁以后，远远滞后于激素迅速缺乏，并且雌激素替代疗法也不能达到改善骨结构的效果。因此，骨质疏松的发生发展并不能仅仅依靠雌激素的缺乏来很好的解释，组织和器官的衰老诱发的相关变化无疑是骨质疏松发生发展的另一个重要原因。氧化应激引起骨组织发生退行性病变的理论引起了众多骨质疏松研究者的兴趣。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。机体在正 常新陈代谢过程中可以产生ROS，主要包括超氧负离子(O^2-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟自由基(OH^-)和其他自由基，它们可以通过信号转导调节细胞的生长、分化和迁移等生理过程。正常情况下，机体抗氧化防御系统中的各种酶(如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和还原型谷胱甘肽等)和非酶类小分子抗氧剂(如维生素C、维生素E、叶黄素等)与ROS的产生处于动态平衡状态，机体不会因为ROS而产生氧化应激。当机体衰老时，首先由代谢过程缓慢产生前氧化剂，细胞中氧化损伤积累到一定程度后产生氧化应激，接着ROS会损伤蛋白质、脂质和DNA，并诱导细胞产生衰老和凋亡，最后导致机体产生衰老相关的退行性疾病。

氧化应激与骨质疏松的关系如何？主要表现在以下几个方面：一是氧化应激能够抑制成骨细胞前体细胞分化为成骨细胞，诱导成骨细胞凋亡，促进破骨细胞分化；二是ROS可诱导细胞外基质分子之间发生交联，引起胶原和纤连蛋白降解，抑制成骨细胞的增殖、分化和矿化过程，从而抑制骨形成作用；三是氧化应激可导致机体的晚期糖基化末端产物(AGEs)增多，明显改变骨质量与松质骨中微损伤的形态，导致骨折抵抗力下降，加速机体衰老。研究表明，抗氧化剂可以通过促进骨形成和/或抑制骨吸收，缓解氧化应激诱发的系列骨的变化，从而治疗骨质疏松。早衰鼠模型因氧化损伤而具有骨质疏松症状，但是给予抗氧剂N-乙酰半胱氨酸(N-aeetyl-cysteine，NAC)或过氧化氢酶(catalase，CAT)治疗后，骨组织中成骨细胞的凋亡明显减少；给予氧化剂前体丁硫氨酸治疗后，骨形成能力也可显著降低。因此，抗氧剂具有显著的抗骨质疏松潜能，值得进一步开发研究。

现阶段，骨质疏松的药物治疗主要是通过抑制骨吸收、促进骨形成和骨矿化，进而达到缓解骨痛，增加骨量，降低骨折发生率的目的。目前，防治骨质疏松的西药主要分为三类：一是骨吸收抑制药，如雌激素、选择性雌激素受体调节剂、双磷酸盐和降钙素等；二是骨形成促进药，如甲状旁腺激素、甲状旁腺激素类似物、氟制剂等；三是骨矿化促进药，如钙剂、维生素D及其活性代谢物等。雌激素替代治疗(ERT)是目前临床上公认的治疗PMOP有效的西药治疗方案。研究表明，绝经后骨质疏松患者用雌激素治疗后，不仅可以防止绝经后骨丢失，降低骨质疏松发生的危险性，而且能减少妇女更年期因下丘脑-垂体轴反馈紊乱而引起的更年期综合征。因而，ERT是治疗绝经后骨质疏松疗效最确切的方法。但是长期单独使用雌激素可增加罹患乳腺癌和子宫内膜癌等生殖系统肿瘤的危险性。为了拮抗雌激素的副作 用，现更倾向于采用雌激素联合孕激素的激素替代疗法(HRT)，但是流行病学研究发现长期使用HRT可以增加心脏疾患、乳腺癌及中风的发病率。双磷酸盐是一类与含钙晶体有高度亲和力的人工合成化合物，是目前临床应用较广泛的，也是较重要的一类骨吸收抑制药物。但是双磷酸盐可过度抑制骨转换，导致骨的微创伤不能修复和骨折愈合不良、股骨头坏死、呼吸消化道和肾等不良反应。氟对机体的作用存在两面性，即摄入不足可致生长与发育缓慢，长期大量摄入又可导致骨骼硬化。氟化物虽然可以使得腰椎骨密度提高，但是并不能减少脊椎骨折的发生，加大剂量也对骨折的发生率没有影响，反而可增加脊椎外其他部位的骨折风险，加重胃肠道副作用，还可以引起新生骨小梁的不良连接和皮质骨空洞的出现，进而增加非脊椎骨折的风险。总之，氟化剂的疗效一直受争议，美国至今还没有上市。甲状旁腺激素，虽然有很好的疗效，但是价格非常昂贵，而防治绝经后骨质疏松是一个长期的过程，患者需要长期用药。钙剂和维生素D类制剂在临床上应用也比较广泛。采用钙剂和维生素D治疗，可以改善骨密度，减少骨折的风险，但是此类药物服用疗程过长，而且只能用做预防性药物，对于已罹患骨质疏松症患者因其疗效有限，只能作为辅助治疗，且对患者的依从性要求较高。

中药治疗绝经后骨质疏松，多采用复方，多种药物之间又存在“君臣佐使”之分，因而具有多环节、多水平、多靶点的整体调节的优点，可以充分治疗因多因素、多环节诱发的骨质疏松症。具有治疗骨质疏松作用的中草药和中成药众多，其中常用的中药丹参、淫羊藿、骨碎补、肉苁蓉、补骨脂、续断、蛇床子、杜仲、黄芪及其复方，它们均具有补肾健骨的功效。骨碎补，始载于《雷公炮炙论》，是水龙骨科植物槲蕨或中华槲蕨的干燥根茎，具有补肝肾，强筋骨，止痛通络的功效。淫羊藿，始载于《神农本草经》，是水檗科淫羊藿属植物，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功能。主治阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹病、麻木拘挛、更年期高血压症及骨质疏松等症。大豆为豆科植物大豆的成熟种子，其药用价值始载于《神农本草经》，具有健脾宽中，润燥消水、清热解毒、益气的功效，对绝经期综合症、骨质疏松和抗衰老均具有显着的疗效。流行病学调查显示，以豆类食品为主的东方女性骨质疏松和骨折的发病率明显低于以脂肪和肉类食物为主的西方女性。杜仲在《神农本草经》中被列为上品有主腰脊痛，补中益精气，坚筋骨的功效，对骨质疏松疗效显著。此外，许多中成药也可用于骨质疏松的治疗，如骨松宝颗粒、骨疏康颗粒、晶珠六 味壮骨颗粒、强骨胶囊、仙灵骨宝等。仙灵骨葆主要是由淫羊藿、续断、补骨脂、地黄、丹参、知母等组成的中药复方制剂，具有活血化瘀、补肾壮骨的功效。骨松宝颗粒是由淫羊藿、牡蛎、莪术、续断等9味中药组成的中药复方制剂，主治补肾活血、强筋健骨的功效。常用于骨质疏松引起的骨折、骨关节炎、骨痛，也可用于预防更年期骨质疏松。

植物雌激素是一类具有类似动物雌激素生物活性的植物成分，因具有相对安全、廉价、有效和不良反应小等优点，成为骨质疏松中药研究的一大热点。植物雌激素的分子结构与哺乳动物雌激素结构相似，能够调节下丘脑-垂体-性腺轴系统功能平衡，一方面提高性腺对促性腺激素的敏感性，另一方面调节性激素的分泌及其受体的合成。植物雌激素主要包括异黄酮类、木脂素类和香豆素类化合物，目前研究较多的是异黄酮类成分，如淫羊藿黄酮、大豆异黄酮、槲皮素，研究表明，植物黄酮可通过雌激素受体途径防治骨质疏松，对绝经后骨质疏松表现出明显的治疗作用。此外，黄酮具有强烈的抗氧化活性，是天然的抗氧化剂，可以中和清除自由基，进而减缓和阻止活性氧引起的上述一系列不良影响。因此，植物黄酮化合物的骨质疏松方面的研究具有重大的价值和意义，值得深入进行。

高良姜(Alpinia officinarum Hance，AOH)为双子叶植物姜科植物高良姜的根茎，始载于《名医别录》，盛产于广东的雷州半岛、海南、广西、云南、台湾等地。具有温中散寒，行气导滞，温通止痛，和胃平逆的功效，临床常用于治疗脘腹寒痛、胃寒呕吐、消化不良、嗳气吞酸等病症。现代药理学研究表明高良姜具有较强的抗氧化、降血糖、抗菌、抗溃疡、止呕抗腹泻、镇痛、抗炎等独特的药理作用。高良姜的主要成分为黄酮类、二苯基庚烷类、挥发油类，其他成分还有甾醇类、糖苷类和苯丙素类化合物。黄酮是一类多酚类化合物，结构为含15个碳原子的多元酚化合物，高良姜中黄酮的主要成分为高良姜素、山奈素、槲皮素、山奈素-4’-甲醚等；二苯基庚烷化合物是一类具有1，7-二取代苯基以庚烷骨架为母体结构的化合物的总称，高良姜中二苯基庚烷的主要成分为1-苯基-7-(3-甲氧基-4-羟基)-4-羟基-3-庚酮、1，7-二苯基-4-羟基-3-庚酮等；高良姜中挥发油含量较高，主要成分为1，8-桉油素、β-蒎烯、柠檬烯、茨烯、α-松油醇等。

迄今为止，高良姜治疗骨质疏松方面的研究几乎没有，但是高良姜具有很大的抗骨质疏松潜能。主要依据如下：一是高良姜具有显著抗氧化作用，理论上，能够 很好抑制ROS的产生，从而对抗因氧化应激而造成的各种骨损伤；二是高良姜具有显著的抗炎作用。流行病学研究发现骨质疏松在各种炎症条件(如强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等)具有更高的发病率，而抗炎剂可以通过促进骨形成和抑制骨吸收治疗骨质疏松。三是高良姜中含有丰富的黄酮成分，如高良姜素、山奈素、槲皮素、山奈素-4’-甲醚等，黄酮类化合物普遍具有植物雌激素样作用。山奈素和槲皮素可以显著的抑制骨吸收，高良姜素在胶原诱导的关节炎和骨源性巨噬细胞中，也可通过NF-κB通路抑制破骨细胞破坏及破骨细胞形成；本实验通过去卵巢大鼠骨质疏松模型综合评价高良姜的抗骨质疏松作用，并且筛选出其抗骨质疏松的有效组分，及可能的作用机制。通过结合传统中医药理论及现代药理学研究成果，借助现代科学技术和方法，分离出有效成分并进行活性研究，不仅可以开发出具有成本低、疗效好、副作用小、易于被广大患者接受的产品，而且促进了南药道地药材的药用资源的研究与开发利用。

发明内容  本研究组发现高良姜浸膏，高良姜提取物，包括以高良姜为原料，采用溶剂提取法进行粗提，柱色谱法进行粗分离，得到的三个不同极性的化合物，即低极性化合物为富集挥发油提取物，中极性化合物为富集黄酮类提取物和高极性化合物为富集二苯基庚烷提取物对去卵巢大鼠骨质疏松有明显的预防及治疗作用，据此，本发明提出用高良姜浸膏或高良姜提取物制备一种供临床作为预防与治疗骨质疏松的保健食品及药品方面的应用，同时，高良姜浸膏或高良姜提取物还可以制备为胶囊，软胶囊，片剂，颗粒剂，冲剂，口服液，喷雾剂，注射剂，供临床作为预防及治疗骨质疏松的保健食品及药品方面的应用。

本发明提到的具有抗骨质疏松作用的主要成分高良姜挥发油，也可以高良姜为原料，分别采用水蒸气蒸馏法，有机溶剂提取法，超声波辅助提取法，超临界流体萃取法，微波辐射法，固相微萃取法提取，这些方法提取得到的高良姜挥发油对骨质疏松症也有效。

具体实施方式：

实施例一  用SPF级雌性大鼠，建立去卵巢大鼠骨质疏松模型，评价通过溶剂浸提法和硅胶柱分离法，得到高良姜主要组分的抗骨质疏松作用。

实验方法：选用4月龄SPF级雌性大鼠，建立去卵巢大鼠骨质疏松模型，通过骨组织形态计量学方法，观察高良姜及主要组分对去卵巢大鼠骨质疏松的影响，同时，观察血清超氧化歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力及丙二醛(MDA)、骨保护素(OPG)、可溶性破骨细胞激活因子(sRANKL)含量水平的影响；观察高良姜及主要组分对去卵巢大鼠骨组织中活性氧自由基(ROS)和谷胱甘肽(GSR)的影响；观察高良姜及主要组分对去卵巢大鼠骨髓中细胞凋亡和脂肪化的影响，观察高良姜及主要组分对去卵巢大鼠骨组织相关基因的表达的影响，综合评价高良姜及主要组分的抗骨质疏松作用机制。

1 高良姜主要组分的提取分离与鉴定

本实验采用溶剂提取法对高良姜进行粗提，柱色谱法进行粗分离，佐以薄层色谱法，得到三个不同极性的化合物：高、中、低极性化合物，接着，采用不同的方法进行初步鉴定，低极性组分采用GC/MS法定性；中极性组分采用颜色反应和薄层色谱法定性，高效液相法确定高良姜素的含量；高极性组分采用薄层色谱法定性。经分离鉴定，它们分别为富集二苯基庚烷、黄酮、挥发油。

1.1高良姜主要组分的分离提取选取高良姜优质根茎36kg，粉碎成粗粉，用98％乙醇室温冷浸提取5次，收集浸液，浓缩蒸干，即得浸膏。取适量浸膏，甲醇溶解，点薄层板，用5％香草醛-浓硫酸显色，借由QuantiScan Demo分析处理，确定三个极性段的分离度(Rf)范围分别为≤0.502，0.502～0.655，0.，655～1.0。

采用柱色谱法进行粗分离，具体步骤如下。

(1)装柱：将硅胶粉松散的装入砂芯漏斗中(约6cm)，用软木塞敲平实，然后用真空泵抽真空，边抽真空边压实(约5.0～5.5cm)；

(2)检测：待柱装好，在水冲击式真空泵低真空抽气条件下，加入1倍柱床体积的石油醚，以溶剂前沿齐平程度检测装柱质量，若溶剂前沿不齐平需要重装；

(3)上样(干法上样)：称取10.00g高良姜浸膏，将样品用乙酸乙酯充分溶解后，加入20g硅胶，在旋转蒸发仪上常温减压旋转至干。将吸附了样品的硅胶粉均匀的洒在柱的表面，铺平、压实；

(4)洗脱：闭合柱子，在水冲击式真空泵低真空抽气条件下，用石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸(64∶63∶2)体系进行洗脱。待第一滴洗脱液滴下，停止洗脱；

(5)分段：对柱子反向施压，挤出后按色带和不同极性段的分离度进行分割；

(6)再洗脱：将各色带段分别用甲醇洗脱，利用薄层色谱法定性，合并同类洗脱液。减压浓缩蒸干，即得三种不同极性组分：低极性组分、中极性组分和高极性组分。

1.2 高良姜低极性段成分的鉴定

(1)样品准备：取高良姜低极性组分两份(各0.1g)，分别用乙酸乙酯和庚烷溶解，配制成两种原液(A₀，B₀，浓度均为100mg/ml)。A₀用乙酸乙酯稀释至50、100μg/ml(A1和A2)，B₀用庚烷稀释至50μg/ml(B₁)。

(2)分离和检测：使用岛津气相色谱质谱仪(GC/MS)，全自动进样器吸取0.5μLA1、A2和B₁依次注射进入气化衬管，随载气经过RTx-5MS熔凝石英毛细管柱进行色谱分离，经过传输管进入质谱检测系统。GC/MS操作条件：分流进样(1∶6)模式；载气为氦气；恒流速度1.2mL/min；程序升温模式为60℃下维持2.0 min，然后以10℃/min匀速线性升温至180℃，保持2.0 min；再以30℃/min匀速线性升温至300℃，保持2.0 min；进样口温度设定为200℃；清洗时间设定为1min、流速20 mL/min；气相至质谱间传输管温度设定为220℃；离子源温度保持在200℃；检测器电压设定为-950 V；电子流轰击(-70eV)方法获得质谱碎片信息产生的质谱信号；全扫描方式进行数据采集(2500Hz)，扫描范围为m/z 50-800，溶剂延迟时间360s。

(3)分析数据：在采集色谱与质谱信号后，分析取得的样品色谱图中各个色谱峰保留时间、质谱谱图等参数，对照NIST(2008)标准化合物谱库(REPLIB，MAINLIB，MAXPLANCKQ，NIST-SALTS，NIST-MSMS，NIST-RI，T-MORITZ，JIYE-2012)以及新版Wiley标准化合物谱图(Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，Weinheim，Germany)对所采集谱图中的化合物进行鉴定。

(4)结果：高良姜低极性组分主要富集挥发油类组分。主要成分见表1：

表1 高良姜富集挥发油段成分鉴定

1.3.高良姜中极性段成分的鉴定

经检测高良姜中极性段成分富集黄酮段含有的高良姜素的含量为23.9％。

2 动物实验

采用SPF级3.5月龄SD大鼠[成年雌性未交配大鼠，体重(217±8)g]，中山大学实验动物中心提供，许可证号：4408500607，分笼饲养于室温23℃(冷暖空调控温)，相对湿度70％的清洁环境中，自由摄水。适应性喂养2周后，进行造模(假手术和去卵巢手术)。实验开始后，第6周前平均每只大鼠供应20g左右标准饲料，第6周后(含第6周)平均每只大鼠供应25g～30g左右标准饲料，标准饲料为SPF级大鼠维持饲料(钙含量为1.11％，磷含量0.74％，维生素D为1510IU/kg)，购自北京科澳协力有限公司。

造模方法：用戊巴比妥钠(1.5ml/kg)麻醉大鼠，取侧卧位，两侧背腹部均剪毛，用碘酒和乙醇局部消毒皮肤。先在一侧背腹部离腰椎一指和肋下一指交界处做纵行切口(约1～1.5cm)，切开皮肤，分离出腹肌，腹腔内即可见到一侧呈淡粉红色的卵巢及周围脂肪。行去卵巢手术时，用镊子轻轻提起脂肪团，露出与子宫紧密相连的卵巢，结扎并切除，余下组织送入腹腔内，关腹，分别缝合肌层和皮肤。另一侧与之相同操作。行假手术时，找到双侧卵巢，轻轻取出观察，然后又放回腹腔，不切除，缝合伤口即可。

在实验开始前两周，按随机区组法即配伍分组法原则，先将动物分别按体重区分为若干个区组，然后将各区组通过Microsoft Excel软件随机函数Rand平均分配到9组，每组8只，按下表设计方案。

表2 实验设计分组与药物干预

分组说明：造模手术后第3天开始灌胃给药，实验时程为90d。实验过程中每天观察大鼠进食、饮水、活动情况并记录，每周称重1次，并按体重变化调整给药量。

在动物实验给药结束前第14d、13d、4d和3d行颈部皮下注射calcein(10mg/kg)，以在骨表面形成绿色双荧光标志，两次荧光标记间隔时间为10d。实验结束时，用戊巴比妥钠(5mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后心脏取血，4℃静置3h，3500rpm/min离心10min，分离并分装血清，置于-70℃冰箱备用；取出子宫，称取湿重，计算子宫系数(子宫湿重/体重)；分离大鼠双侧后肢及腰椎，迅速取下双侧股骨、双侧胫骨、第5腰椎，剔除肌肉，右侧胫骨用于检测骨组织形态计量学：右侧胫骨近端制成不脱钙骨切片、右侧胫骨中段骨制成不脱钙骨磨片，分别进行形态计量学参数(静态和动态参数)检测；右股骨用于检测骨密度、骨生物力学和骨微结构；第五腰椎用于检测骨密度。以此综合评价实验大鼠骨微结构、骨量和骨生物力学等骨代谢的变化。

3.实验结果

3.1 高良姜及主要主要组分对去卵巢大鼠体重的影响

高良姜及主要主要组分对去卵巢大鼠体重的影响见表3：

表3 高良姜及主要主要组分对去卵巢大鼠体重的影响(n＝8)

注：VS Sham*p＜0.05；VS OVX ▲p＜0.05.

如表3所示，与假手术组相比，去卵巢组大鼠从去势手术后第4周即明显变重，并随着实验的进程而继续保持比假手术组显著增加的体重(p＜0.05)；与去卵巢组相比，在4～10周期间，各给药组均可以使去卵巢大鼠体重显著减小(p＜0.05)；10周后，中极性高剂量组和高极性低剂量组大鼠体重仅是有下降趋势，无统计学意义。

3.2 高良姜及主要主要组分对去卵巢大鼠子宫指数的影响

高良姜及主要组分对去卵巢大鼠子宫系数的影响结果见表4：

表4 高良姜及主要组分对去卵巢大鼠子宫系数的影响(n＝8)

注：VS Sham*p＜0.05；VS OVX ▲p＜0.05.

如表4所示，与假手术组相比，去卵巢组大鼠子宫系数明显萎缩；与去卵巢组 相比，高良姜低极性组分可使得去卵巢大鼠子宫明显增生，而其他给药组对去卵巢大鼠子宫影响均不大。

3.3 高良姜及其主要组分对去卵巢大鼠胫骨上段松质骨骨组织形态计量学静态参数的影响

高良姜及其主要组分对去卵巢大鼠胫骨上段松质骨骨组织形态计量学静态参数的影响结果见5：

表5 高良姜及主要组分对去卵巢大鼠胫骨上段静态参数的影响(n＝8)

注：VS Sham*p＜0.05；VS OVX ▲p＜0.05.

如表5所示，与假手术组相比，去卵巢组大鼠胫骨上段松质骨骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)和骨小梁数量(Tb.N)依次减少66.7％和63.7％(both P＜0.05)，骨小梁分离度(Tb.Sp)增加327.2％(P＜0.05)，骨小梁厚度(Tb.Th)虽有所增加，但是无统计学意义。与去卵巢组相比，高良姜浸膏组大鼠胫骨上段松质骨Tb.N增加41.1％(P＜0.05)，Tb.Sp减少39.7％(P＜0.05)，％Tb.Ar和Tb.Th也有不同程度的增加，但是均无统计学意义；高良姜低极性组分组大鼠胫骨上段松质骨％Tb.Ar和Tb.N依次增加49.8％和57.5％(both P＜0.05)，Tb.Sp减少49.0％(P＜0.05)，Tb.Th无显著变化；其它给药组对去卵巢大鼠胫骨上段松质骨静态参数的影响均不明显。

3.4 高良姜及其主要组分对去卵巢大鼠胫骨上段松质骨骨组织形态计量学动态参数的影响

高良姜及其主要组分对去卵巢大鼠胫骨上段松质骨骨组织形态计量学动态参 数的影响见表6：

表6 高良姜及主要组分对去卵巢大鼠胫骨上段动态参数的影响(n＝8)

注：VS Sham*p＜0.05；VS OVX ▲p＜0.05.

如表6所示，与假手术组相比，去卵巢组大鼠胫骨上段松质骨动态参数荧光标记周长百分数(％L.Pm)、矿化沉积率(MAR)、骨表面新骨形成率(BFR/BS)、骨转换率(BFR/BV)依次增加66.6％、40.3％、138.9％和157.3％(all P＜0.05)，新骨年形成率(BFR/TV)的变化无统计学差异。与去卵巢组相比，高良姜浸膏使得去卵巢大鼠胫骨上段松质骨BFR/BS降低32.2％(P＜0.05)，％L.Pm、MAR、BFR/BV和BFR/TV均有不同程度的降低，但降低均无统计学意义；高良姜低极性组分组大鼠胫骨上段松质骨％L.Pm、BFR/BS和BFR/BV依次减少45.4％、54.0％和50.9％(all P＜0.05)，MAR和BFR/TV均有不同程度的降低，但降低均无统计学意义；其它给药组对去卵巢大鼠胫骨上段的动态学参数无明显影响。

3.5 高良姜及其主要组分对去卵巢大鼠胫骨上段松质骨骨组织形态计量学骨形成和骨吸收参数的影响

高良姜及其主要组分对去卵巢大鼠胫骨上段松质骨骨组织形态计量学骨形成和骨吸收参数的影响结果见表7：

表7：高良姜及主要组分对去卵巢大鼠骨形成和骨吸收参数的影响(n＝8)

注：VS Sham*p＜0.05；VS OVX ▲p＜0.05.

如表7结果所示，与假手术组相比，去卵巢组大鼠胫骨上段％Ob.Pm(成骨细胞周长百分率)、Oc.N(单位骨小梁周长破骨细胞数)和％Oc.Pm(破骨细胞周长百分率)依次增加136.5％、116.5.5％和71.1％(all P＜0.05)。与去卵巢组相比，高良姜浸膏组大鼠胫骨上段Oc.N和％Oc.Pm依次减少48.3％和39.7％(both P＜0.05)，％Ob.Pm虽有所减少，但是无统计学意义；高良姜低极性组分组大鼠胫骨上段Oc.N和％Oc.Pm依次减少48.4％和39.9％(both P＜0.05)，％Ob.Pm虽有所减少，但是无统计学意义；高良姜中极性高剂量组大鼠胫骨上段Oc.N减少35.7％(P＜0.05)，％Ob.Pm和％Oc.Pm虽有所减少，但是均无统计学意义；淫羊藿黄酮组大鼠胫骨上段％Ob.Pm、Oc.N和％Oc.Pm依次增加30.2％、29.7％和11.4％，但是变化均无统计学意义；其它给药组对去卵巢大鼠胫骨上段骨形成和骨吸收参数无明显影响。

4 讨论

高良姜浸膏及主要组分对去卵巢大鼠体重和子宫系数的影响

本实验采用4月龄大鼠，进行去卵巢手术90d后，观察到去卵巢组大鼠从去势后4周即明显变重，并随着实验的进程保持比假手术组显著增加的体重。另外，雌激素能维持子宫的功能，与孕激素等共同作用于子宫内膜。本实验发现，与假手术组相比，去卵巢组大鼠子宫重量明显下降。这同样与去卵巢大鼠雌激素的撤退有关，卵巢的功能之一是分泌雌激素，大鼠去卵巢后，雌激素缺乏，相应的子宫缩小，内 膜变薄。雌激素对体脂分布和脂代谢具有显著的影响，具体表现在：直接影响下丘脑，抑制摄食和影响能量消耗；诱导激素敏感性脂肪酶(HSL)的活性或通过增加肾上腺素的脂解作用来间接地增加脂肪的分解；降低脂蛋白脂肪酶(LPL)活性，抑制脂肪的形成。大鼠去卵巢后，雌激素缺乏，脂肪堆积，导致大鼠体重增加。本实验观察到，高良姜浸膏组、低极性组、中极性组、高极性组和淫羊藿黄酮组大鼠体重从去势后4周有明显的减少趋势，与假手术组基本保持一致，且一直持续到实验结束。提示它们能抑制去卵巢引起的体重增加，可能部分纠正去卵巢引起的代谢紊乱，从而维持体重的正常。此外，与去卵巢组相比，高良姜浸膏、中极性组分、高极性组分和淫羊藿黄酮对去卵巢大鼠子宫影响不大，这与其不存在直接的性激素样作用有关，提示它们可能不容易发生子宫内膜增生等不良反应。而低极性组分可以使得去卵巢大鼠重量增加，表明低极性组分对去卵巢大鼠子宫存在一定的刺激作用，具体作用机制需进一步研究。

3.4.2 高良姜浸膏及主要组分对去卵巢大鼠骨组织形态计量学的影响

本实验观察到去卵巢对大鼠骨组织的影响：一是使得大鼠胫骨上段和股骨骨小梁严重丢失，一是骨小梁面积百分数、骨小梁宽度、骨小梁数量均显著减少，骨小梁分离度则显著增加；二是使得大鼠胫骨上段成骨细胞和破骨细胞活性均增强，骨吸收增快，骨形成和骨矿化也明显增快，但是骨吸收大于骨形成，出现快速丢骨；骨组织微结构的变化，往往较骨质量和功能的变化之前出现，这些参数在阐明骨功能的预后方面提供参考意义。

本实验还观察到，高良姜浸膏组大鼠与去卵巢组比较，在骨形态计量学中，胫骨上段的Tb.N明显增加，Tb.Sp明显降低，但不能恢复到Sham组正常水平，同时也未能增加％Tb.Ar和Tb.Th。提示高良姜浸膏部分预防了去卵巢大鼠胫骨上段和股骨远端松质骨的骨丢失。另外，高良姜浸膏组Oc.N等骨吸收指标和骨形成率(BFR/BS)的动态指标都显著减少，反映了高良姜浸膏即抑制去卵巢大鼠胫骨上段松质骨的骨吸收，又抑制其骨形成，并且抑制骨吸收作用大于抑制骨形成的作用，高的骨转化率被逆转，骨量在一定程度上有所增加。

本实验还观察到，高良姜低组分的胫骨上段骨形态计量学％Tb.Ar和Tb.N明显增加，Tb.Sp明显降低，且Oc.N等骨吸收指标和各骨形成率(BFR/BS和BFR/TV)的动态指标都显著减少，提示高良姜低极性组分部分预防了去卵巢大鼠胫骨上段和股骨远端松质骨的骨丢失，同时抑制骨吸收和骨形成，逆转去卵巢大鼠骨转化率进 而使得骨量增加。而其他组分的骨微结构与去卵巢组相比，几乎没有变化，提示高良姜抗骨质疏松有效组分有可能为低极性组分。

结论：高良姜浸膏可以抑制去卵巢大鼠胫骨上段松质骨的骨吸收，又抑制其骨形成，并且抑制骨吸收作用大于抑制骨形成的作用，高的骨转化率被逆转，骨量在一定程度上有所增加，对骨质疏松有一定的预防作用。

高良姜低极性组分(即挥发油部分)有明显预防去卵巢大鼠胫骨上段骨丢失的作用，可用于骨质疏松症的预防及治疗。

Claims (6)

1.高良姜提取物在制备抗骨质疏松保健食品及药品方面的应用。

2.如权利要求1所述的高良姜提取物在制备抗骨质疏松保健食品及药品方面的应用，其特征是高良姜提取物是指从高良姜中提取到的高良姜挥发油，高良姜黄酮类，高良姜二苯基庚烷类。

3.如权利要求1和2所述的高良姜提取物在制备抗骨质疏松保健食品及药品方面的应用，其特征是高良姜提取物是指以高良姜为原料，采用溶剂提取法进行粗提，柱色谱法进行粗分离，得到的三个不同极性的化合物，即低极性化合物为富集挥发油提取物，中极性化合物为富集黄酮类提取物和高极性化合物为富集二苯基庚烷提取物。

4.如权利要求1和2所述的高良姜提取物，其特征是高良姜挥发油的提取方法是采用高良姜浸膏，用乙酸乙酯充分溶解后，加入20g硅胶，在旋转蒸发仪上常温减压旋转至干。将吸附了样品的硅胶粉均匀的洒在柱的表面，铺平、压实；闭合柱子，在水冲击式真空泵低真空抽气条件下，用石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸(64∶63∶2)体系进行洗脱，待第一滴洗脱液滴下，停止洗脱；对柱子反向施压进行分段，挤出后按色带和不同极性段的分离度进行分割；将各色带段分别用甲醇再洗脱，利用薄层色谱法定性，合并同类洗脱液，减压浓缩蒸干，即得三种不同极性组分：低极性组分、中极性组分和高极性组分，其中低极性化合物为富集挥发油提取物，中极性化合物为富集黄酮类提取物，高极性化合物为富集二苯基庚烷提取物。

5.如权利要求1和2所述的高良姜挥发油，其特征是指以高良姜为原料，分别采用水蒸气蒸馏法，有机溶剂提取法，超声波辅助提取法，超临界流体萃取法，微波辐射法，固相微萃取法提取得到的高良姜挥发油。

6.如权利要求1所述的高良姜提取物在制备抗骨质疏松保健食品及药品方面的应用，其特征是高良姜提取物是指高良姜浸膏。