CN101795713B - 偶联物纯化 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及纯化糖抗原-载体蛋白偶联物的方法。具体说，本发明提供了采用羟基磷灰石从游离的载体蛋白如CRM197纯化糖抗体-载体蛋白偶联物的方法。本发明还涉及采用该方法制备疫苗的方法。

Description

偶联物纯化
本申请要求英国专利申请0713880.3的优先权，其全部内容被纳入本文作为参考。
技术领域
本发明属于疫苗领域并涉及一种纯化糖抗原-载体蛋白偶联物的新方法。
背景技术
在过去20年中，开发了包含细菌荚膜多糖与蛋白质载体相偶联的偶联疫苗。例子包括b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Hib)偶联疫苗[1]以及针对肺炎链球菌[2]和脑膜炎奈瑟球菌血清型C(MenC)[3]的偶联疫苗。
已经批准的疫苗中所用的载体蛋白包括破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素的无毒CRM197突变体和脑膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜蛋白复合物。理想的是，载体蛋白应能诱导对偶联的B-细胞表位(如多糖)的强大辅助作用，而不诱导对其本身的抗体应答。采用在大多数II类主要组织相容性复合物分子结合时有免疫原性的通用表位是达到此目的的一种方法[4]。已在TT和其它蛋白中鉴定到这种表位。或者，可利用多表位载体蛋白，如参考文献5所述。
一旦糖抗原与载体蛋白偶联，应纯化反应混合物以去除未与糖蛋白偶联的游离载体蛋白和未偶联的糖。
本领域已知多种纯化游离和偶联的载体蛋白的方法，包括疏水色谱法、切向超滤法、透析法等[也可参见参考文献6和7等]。然而，这些方法存在各种缺陷。例如，参考文献8提出采用凝胶过滤来纯化GBS偶联物。然而，该方法需要大量凝胶过滤基质并且难以大规模生产应用。另一种方法涉及超滤，例如采用100KDa膜的切线流透析，该方法只有当糖抗原具有适当的高分子量时才有效，因而不适用于GBS血清型III偶联物或糖蛋白小于100kDa的其他偶联物。此外，超滤产率低下并可导致偶联物应激。
因此，本发明的目的是提供一种从诸如未偶联的载体蛋白和未偶联的糖等杂质纯化糖抗原-载体蛋白偶联物的改良方法。
发明内容
已发现糖抗原与载体蛋白的偶联可改变载体蛋白对羟基磷灰石的结合亲和力。因此，在包含糖抗原-载体蛋白偶联物、未偶联的载体蛋白和其他蛋白质的混合物中，污染物/未偶联的蛋白质与羟基磷灰石结合而糖抗原-载体蛋白偶联物基本上不发生结合。
因此，本发明提供了一种从混合物纯化糖抗原-载体蛋白偶联物的方法，该方法包括使所述混合物与羟基磷灰石接触并收集游离的糖抗原-载体蛋白偶联物。未结合的载体蛋白可任选地从羟基磷灰石洗脱，在偶联反应中重复使用、进行分析或弃去。
混合物可包含糖抗原-载体蛋白偶联物和未偶联的蛋白质。然而，混合物也可受到其他蛋白质的污染。本发明方法能够去除任何污染的蛋白质，从而提供纯化的糖抗原-载体蛋白偶联物。
本发明还提供了一种制备药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：i)使包含糖抗原-载体蛋白偶联物和游离载体蛋白的混合物与羟基磷灰石相接触，ii)收集游离的糖抗原-载体蛋白偶联物，和iii)将步骤ii)获得的所述糖抗原-载体蛋白偶联物与药学上可接受的稀释剂或载体混合。本发明还提供了由所述方法制备的组合物。
载体蛋白
载体蛋白可选自本领域已知的那些载体蛋白，例如破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)或其衍生物，如白喉毒素的无毒CRM197突变体[9-11]。其他合适的载体蛋白包括，脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[12]、合成肽[13、14]、热激蛋白[15，16]、百日咳蛋白[17，18]、细胞因子[19]、淋巴因子[19]、激素[19]、生长因子[19]、含有各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人造蛋白[20]如N19[21]、流感嗜血杆菌的D蛋白[22-24]、肺炎球菌溶血素[25]、肺炎球菌表面蛋白PspA[26]、铁摄取蛋白[27]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[28]等等。然而，可使用任何载体蛋白，只要它能够结合羟基磷灰石。
白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)和CRM197是目前儿科疫苗中使用的主要载体，例如来自GSK的HIBERIXTM和MENITORIXTM偶联物使用TT作为载体，HIBTITERTM产品使用CRM197，PREVENARTM中的肺炎球菌偶联物使用CRM197，MENJUGATETM和MENINGITECTM产品使用CRM197，NEISVAC-CTM使用TT。
或者，可使用多表位载体蛋白，如参考文献5所述。这些多表位载体包括N19。
优选地，本发明采用的载体蛋白是CRM197。
糖抗原
优选地，本发明纯化的组合物中偶联于载体蛋白的糖抗原是细菌糖，具体是细菌荚膜糖。也可使用LPS或LOS作为抗原。
优选地，本发明糖抗原的分子量为5KDa以上，更优选8KDa以上(即10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250KDa以上)。
本发明组合物中可包含的细菌荚膜糖的例子包括脑膜炎奈瑟球菌(血清群A、B、C、W135和/或Y)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，尤其是4、6B、9V、14、18C、19F和/或23F)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和/或VIII型，如参考文献29-32中所述的糖抗原)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(可分型菌株：a、b、c、d、e和/或f)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(如血清型5和8)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(E.faecium)(三糖重复)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、克雷伯菌(Klebsiella spp.)等的荚膜糖。本发明组合物可包含的其它糖包括葡聚糖(如真菌葡聚糖，如白色念珠菌(Candida albicans)的葡聚糖)和真菌荚膜糖，如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)荚膜的荚膜糖。可包含的另一种糖是酿脓链球菌群特异性抗原(GAS糖)。
LPS和LOS的例子包括从绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01、O5血清型分离的LPS。
脑膜炎奈瑟球菌血清群A(MenA)荚膜是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，在C3和C4位部分O-乙酰化。脑膜炎奈瑟球菌血清群B(MenB)荚膜是(α2→8)-连接的唾液酸的均聚物。脑膜炎奈瑟球菌血清群C(MenC)荚膜糖是(α2→9)-连接的唾液酸的均聚物，在位置7和/或8含有可变的O-乙酰化。脑膜炎奈瑟球菌血清群W135糖是含有唾液酸-半乳糖二糖单元[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→]的聚合物。它在唾液酸的7位和9位上含有可变的O-乙酰化[33]。脑膜炎奈瑟球菌血清群Y糖类似于血清群W135糖，除了二糖重复单元用葡萄糖代替了半乳糖[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→]。它也在唾液酸的7位和9位含有可变的O-乙酰化。
优选地，糖抗原来自GBS，血清型Ia，Ib和/或III。还优选是来自其他GBS血清型的糖抗原，例如血清型II、IV、V、VI、VII和/或VIII。具体说，糖抗原可以是来自这些血清型的无乳链球菌荚膜糖，与细菌肽聚糖主链中的GlcNAc残基共价相连。不同血清型的荚膜多糖化学相关，但抗原性显著不同。所有GBS荚膜多糖共有以下三糖核心：
β-D-GlcpNAc(1→3)β-D-Galp(1→4)β-D-Glcp
各种GBS血清型的区别在于修饰其核心的方式。例如，血清型Ia和III的区别在于，核心中采用GlcNAc(Ia)或Gal(III)来连接连续的三糖核心(图1)。血清型Ia和Ib的核心中都是[α-D-NeupNAc(2→3)β-D-Galp-(1→]二糖与GlcNAc相连，只是连接键是1→4(Ia)或1→3(Ib)。
GBS-相关疾病主要是由血清型Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII和VIII引起的，超过90％是由以下五种血清型引起的：Ia、Ib、II、III和V。本发明优选使用的糖来自这五种血清型中的一种。如图2所示，这五种血清型各自的荚膜糖包括：(a)末端N-乙酰基-神经氨酸(NeuNAc)残基(一般称为唾液酸)，在所有情况下2→3连接至半乳糖残基；和(b)三糖核心内的N-乙酰基-葡糖胺残基(GlcNAc)。
载体蛋白可以如参考文献34所述偶联于糖抗原的混合物。载体蛋白可偶联于一种糖或者可偶联于多种不同种类的糖。在本发明中，优选载体蛋白偶联于2、3、4或更多种不同的糖抗原。所述抗原可来自抗原性相同或不同的病原体。
因此，载体蛋白可以是单价，其中每个载体蛋白分子偶联于一种细菌血清群的糖，或者可以是多价，其中两个或更多个(例如2、3、4、5、6或更多)抗原性不同的糖抗原偶联于同一载体蛋白分子(例如，参见参考文献34)。
本发明组合物优选包含一种以上脑膜炎奈瑟球菌血清群的糖抗原，例如该组合物可包含血清群A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等的糖偶联物。优选这些组合物包含血清群C和Y的糖。其它优选组合物包含血清群C、W135和Y的糖。尤其优选的组合物包含血清群A、C、W135和Y的糖。
在其他组合中，载体蛋白可偶联于Hib糖偶联物和至少一种脑膜炎奈瑟球菌血清群，优选一种以上脑膜炎奈瑟球菌血清群的糖。例如，载体蛋白可偶联于Hib糖和脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和Y中一种或多种(即1、2、3或4种)的糖。本发明也提供上述病原体的糖的其它组合。
荚膜糖抗原的制备
制备荚膜糖抗原的方法是熟知的。例如，参考文献35描述了脑膜炎奈瑟球菌糖抗原的制备。参考文献36第14章描述了流感嗜血杆菌糖抗原的制备。现有技术描述了肺炎链球菌糖抗原和偶联物的制备。例如，PrevenarTM是一种7-价肺炎球菌偶联疫苗。参考文献37、38和39中详细描述了无乳链球菌糖抗原的制备方法。参考文献40中详细描述了无乳链球菌糖抗原的优选制备方法。可用已知技术纯化荚膜糖，如本文引用的几篇参考文献所述。
糖抗原可以经化学修饰。例如，可修饰它们，用封闭基团取代一个或多个羟基。这种方法对脑膜炎球菌血清群A特别有用，其中用封闭基团取代乙酰基可防止水解[41]。这种修饰的糖仍然是本发明意义上的血清群A糖。
具体说，可修饰来自GBS的糖抗原。例如，当糖抗原是无乳链球菌血清型V荚膜糖时，则可以如参考文献42所述修饰糖抗原。具体说，无乳链球菌血清型V荚膜糖可脱唾液酸化(图3)。脱唾液酸化的GBS血清型V荚膜糖可通过以下方式制备：在温和酸性条件下(例如0.1M硫酸，80℃持续60分钟)处理纯化的GBS血清型V荚膜糖或者用神经氨酸酶处理，如参考文献42所述。一种优选的制备脱唾液酸化GBS血清型V荚膜糖的方法是在81℃+/-3℃用1M乙酸处理纯化的糖2小时。
可以相对于与天然情况下发现的荚膜糖对该糖进行化学修饰。例如，糖可被去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙酰化(部分或全部)、N-丙酰化(部分或全部)等。可在偶联之前、期间或之后进行去乙酰化，但优选在偶联前进行。根据具体糖，去乙酰化可能或可能不影响其免疫原性，如NeisVac-CTM疫苗采用去-O-乙酰化的糖，而MenjugateTM是乙酰化的，但这两种疫苗都有效。可用常规实验评价去乙酰化等的影响。
所用的荚膜糖可以是寡糖形式。通过纯化荚膜多糖的片段化(如通过水解)方便地形成寡糖，片段化后通常要纯化所需大小的片段。优选进行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最终小于30。可通过离子交换色谱或比色测定方便地测定DP[43]。
如果进行水解，通常对水解产物进行筛分，以去除短链寡糖[44]。可用各种方法，如超滤后离子交换色谱实现此目的。对于血清群A脑膜炎球菌，优选去除聚合程度小于或等于约6的寡糖；对于血清群W135和Y，优选去除聚合程度小于4左右的寡糖。
载体-糖偶联物
本发明方法纯化的偶联物可包含少量游离(即未偶联)载体。当根据本发明方法纯化的组合物中给定载体蛋白存在游离和偶联形式时，以重量计，未偶联形式优选不多于组合物中载体蛋白总量的5％，更优选少于2％，更优选小于1％，优选小于0.5％。
本发明方法纯化的偶联物的糖∶蛋白质比例(w/w)在1∶5(即蛋白质过量)和5∶1(即糖过量)之间，例如比例在1∶2到5∶1之间，比例在1∶1.25到1∶2.5之间。如参考文献45所述，混合物中不同的脑膜炎球菌血清群偶联物具有不同的糖∶蛋白质比例，例如一种的比例为1∶2到1∶5之间，而另一种的比例在5∶1到1∶1.99之间。
可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。优选通过-NH2基团，例如载体蛋白中赖氨酸残基侧链或精氨酸残基侧链中的-NH2基团连接糖抗原与载体。当糖具有游离醛基时，醛基可与载体中的氨基反应，通过还原胺化形成偶联物。也可通过-SH基团，如半胱氨酸侧链中的-SH基团连接。
一般在偶联前活化或官能化糖。活化可包括例如：用氰化试剂如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[46，47等])。其它合适技术采用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU(也参见参考文献48的引言)
当糖抗原是无乳链球菌荚膜糖时，偶联通常包括糖与载体蛋白的还原胺化反应，如参考文献37所述。还原胺化涉及载体氨基酸侧链上的胺基与糖上醛基。由于GBS荚膜糖在其天然形式中不包括醛基，在偶联之前糖唾液酸残基的一部分发生高碘酸盐氧化反应产生醛基，如图4所示[37、49]。也可采用参考文献50所述方法实现无乳链球菌荚膜糖与载体蛋白的偶联。
如参考文献51所述，偶联物的混合物可包含一种糖/蛋白直接连接键的偶联物和另一种通过接头连接的偶联物。当使用来自不同脑膜炎球菌血清群的糖偶联物时这种设置尤其有用，例如MenA和MenC糖可通过接头偶联，而MenW135和MenY糖则直接偶联于载体蛋白。这种偶联物可以通过本发明的方法进行纯化。
各偶联物中载体的浓度(偶联和未偶联)可以不超过100微克/毫升，例如各偶联物中＜30微克/毫升载体蛋白。一些组合物中载体的总浓度小于500微克/毫升，例如＜400微克/毫升，＜300微克/毫升，＜200微克/毫升，＜100微克/毫升，＜50微克/毫升等。
接头
可用任何已知方法，如参考文献52和53所述的方法通过接头基团进行连接。一种连接类型包括糖的还原性胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将载体蛋白偶联于该己二酸接头基团的另一端[54，55]。其它接头包括B-丙酰胺基[56]、硝基苯基-乙基胺[57]、卤代酰基卤化物[58]、配糖键[59]、6-氨基己酸[60]、ADH[61]、C4-C12部分[62]等。作为采用接头的替代方法，可以采用直接连接。直接连接蛋白质可包括氧化多糖，然后与蛋白质进行还原性胺化，如参考文献63和64所述。
优选包括以下步骤的方法：将氨基引入糖(如用-NH2取代末端＝O基团)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生后，与载体蛋白反应。
可采用双功能接头提供偶联糖的氨基的第一基团和偶联载体(一般偶联于载体的氨基)的第二基团。因此，双功能接头中的第一基团能够与糖的氨基(-NH2)反应。此反应一般包括氨基氢原子的亲电取代。双功能接头中的第二基团能够与载体的氨基反应。此反应一般也包括氨基的亲电取代。
糖与载体的反应涉及氨基时，优选采用双功能接头X-L-X，其中：两个X基团彼此相同，可与氨基反应；L是接头中的连接部分。优选X基团是N-氧琥珀酰亚胺。L优选具有式L′-L2-L′，其中L′是羰基。优选的L2基团是含1-10个碳原子(如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)的直链烷基，如-(CH2)4-。
其它X基团是与HO-L-OH组合时形成酯的基团，如降冰片烷、对硝基苯甲酸和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。
用于本发明的其它双功能接头包括丙烯酰卤(如丙烯酰氯)和卤代酰基卤化物。
通常加入摩尔过量的接头以修饰糖。
偶联后，可分离游离和偶联的糖。有许多合适的分离方法，包括疏水色谱、切向超滤、透析等[也可参见参考文献65和66等]。
当本发明组合物包含解聚的糖时，优选在偶联之前进行解聚。
羟基磷灰石
本发明使用的羟基磷灰石((Ca5(PO4)3OH)2)可以是本领域已知的各种形式之一。羟基磷灰石可以是结晶、凝胶或者树脂的形式。可选地，正常结晶形式可以在高温下烧结以调节至陶瓷形式(Bio-Rad)。
优选羟基磷灰石是凝胶形式。优选地，将凝胶装填到柱中，如同柱色谱纯化中常用的那样。
如果羟基磷灰石是颗粒形式，优选直径20微米以上，优选40微米以上，优选80微米以上。
优选地，羟基磷灰石的动态结合容量大于10毫克溶菌酶/克(例如，12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、35、40、45、50或更高)。
pH值
优选方法在pH 6-8下进行，更优选6.5-7.5，更优选7.2。优选pH7.2，因为这有助于确保糖的稳定性。可使用本领域已知的酸/碱调节pH。
磷酸盐浓度
本发明方法中使用的各种磷酸盐浓度对反应形成的偶联物的产率有影响。优选地，原料以及平衡/加载后洗涤的磷酸盐浓度为50mM以下(即45、40、35、30、25、20、15、10、5或更低)。通常采用35mM的浓度。较高的浓度可导致羟基磷灰石结合的抑制。
通常采用磷酸钠缓冲剂。
其它抗原
如上所述，通过加入药学上可接受的稀释剂或载体可将本发明纯化的偶联物配制成药物组合物。这种组合物还可包含一种或多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)其他抗原，例如：
A.细菌抗原
脑膜炎奈瑟球菌：脑膜炎球菌抗原可包括纯化或衍生自脑膜炎奈瑟球菌血清群如A、C、W135、Y和/或B的蛋白质(如参考文献67-73中鉴定的蛋白质)，糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或外膜囊泡[74-77]。脑膜炎球菌蛋白质抗原可选自粘附素、自身转运蛋白、毒素、获铁蛋白(iron acquisition protein)和膜结合蛋白(优选完整的外膜蛋白)。也参见参考文献78-86。
肺炎链球菌：肺炎链球菌抗原可包括肺炎链球菌的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白质。蛋白抗原可选自(例如)参考文献87-92中任一篇所鉴定的蛋白质。肺炎链球菌蛋白可选自聚组氨酸三聚体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125或Sp133。也参见参考文献93-99。
酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)：A群链球菌抗原可包括参考文献100或101中鉴定的蛋白质(包括GAS40)，GAS M蛋白片段的融合物(包括参考文献102-104中描述的融合物)，纤连蛋白结合蛋白(Sfb1)，链球菌血红素相关蛋白(Shp)和链球菌溶血素S(SagA)。也参见参考文献100、105和106。
粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)：莫拉菌抗原包括参考文献107和108中鉴定的抗原，外膜蛋白抗原(HMW-OMP)，C-抗原和/或LPS。也可参见参考文献109。
百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)：百日咳抗原包括百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，还任选与百日咳杆菌外膜蛋白(pertactin)和/或凝集原2和3抗原联用。也参见参考文献110和111。
金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌抗原包括任选地偶联于无毒重组绿脓假单胞菌外毒素A的5型和8型金黄色葡萄球菌荚膜多糖，如StaphVAXTM，或衍生自表面蛋白、侵袭素(杀白细胞素、激酶、透明质酸酶)、抑制吞噬细胞吞噬(荚膜、A蛋白)、类胡萝卜素、过氧化氢酶产生的表面因子、A蛋白质、凝固酶、凝血因子和/或裂解真核细胞膜的膜损伤性毒素(任选地脱毒)(溶血素、白细胞毒素、杀白细胞素)。也可参见参考文献112。
破伤风梭菌(Clostridium tetani)(破伤风)：破伤风抗原包括破伤风类毒素(TT)，优选用作与本发明组合物结合/偶联的载体蛋白。
白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉)：白喉抗原包括白喉毒素或其脱毒突变体，如CRM197。此外，考虑将能够调节、抑制ADP核糖基化或与其相关的抗原与本发明组合物组合/共同给予/偶联。这些白喉抗原可用作载体蛋白。
流感嗜血杆菌：流感嗜血杆菌抗原包括B型的糖抗原，或蛋白D[24]。
无乳链球菌(B型链球菌)：B群链球菌抗原包括参考文献100和113-116中鉴定的蛋白质抗原。例如，抗原包括蛋白质GBS80、GBS104、GBS276和GBS322。
淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)：淋病球菌抗原包括Por蛋白(或通道蛋白)如PorB[117]，转运结合蛋白如TbpA和TbpB[118]，不透明蛋白(如Opa)，可还原修饰的蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制剂[119]。也参见参考文献67-69和120。
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)：沙眼衣原体抗原包括衍生自血清型A、B、Ba和C(沙眼病原体，引起失明)，血清型L1、L2和L3(与性病淋巴肉芽肿有关)和血清型D-K的抗原。沙眼衣原体抗原也可包括参考文献116和121-123中鉴定的抗原，包括PepA(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH-样(CT242)、L7/L12(CT316)、OmcA(CT444)、AtosS(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)和MurG(CT761)。也可参见参考文献124。
鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi)(伤寒)：抗原包括荚膜多糖，优选偶联物(Vi，如vax-TyVi)。
B.病毒抗原
正粘病毒：病毒抗原可衍生自正粘病毒，如流感病毒A、B和C。正粘病毒可选自以下病毒蛋白中的一种或多种，包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)、膜蛋白(M2)、一种或多种转录酶组分(PB1、PB2和PA)。
优选抗原包括HA和NA。
流感抗原可衍生自暴发流行期(一年一次)的流感毒株。或者，流感抗原可衍生自可能引起爆发流行的毒株(即与目前流行毒株的血凝素相比具有新型血凝素的流感毒株，或对禽类有致病性并可能水平传播给人群的流感毒株，或对人有致病性的流感毒株)。
副粘病毒科(paramyxoviridae)病毒：病毒抗原可衍生自副粘病毒，如肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)和麻疹病毒(麻疹)。[125-127]。
肺炎病毒：病毒抗原可衍生自肺炎病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒，小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒。肺炎病毒优选为RSV。肺炎病毒抗原可选自一种或多种下述蛋白，包括表面蛋白融合物(F)，糖蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)，基质蛋白M和M2，核衣壳蛋白N、P和L以及非结构蛋白NS1和NS2。优选的肺炎病毒抗原包括F、G和M。参见例如，参考文献128。肺炎病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可包含RSV和PIV二者的组分。
副粘病毒(paramyxovirus)：病毒抗原可衍生自副粘病毒，如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎、仙台病毒、猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒优选PIV或腮腺炎病毒。副粘病毒抗原可选自一种或多种下述蛋白质：血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基质蛋白(M)。副粘病毒蛋白优选包括HN、F1和F2。副粘病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可包含RSV和PIV二者的组分。市售腮腺炎疫苗包括单价形式或与麻疹和风疹疫苗(MMR)混合的减毒活腮腺炎病毒。
麻疹病毒：病毒抗原可衍生自麻疹病毒，如麻疹。麻疹病毒抗原可选自一种或多种下述蛋白：血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基质(M)。市售麻疹疫苗包括减毒的活麻疹病毒，一般与腮腺炎和风疹(MMR)联用。
肠道病毒：病毒抗原可衍生自肠道病毒，如1、2或3型脊髓灰质炎病毒，1-22型和24型柯萨奇病毒A，1-6型柯萨奇病毒B，1-9、11-27和29-34型艾柯(ECHO)病毒和肠道病毒68-71。肠道病毒优选脊髓灰质炎病毒。肠道病毒抗原优选选自一种或多种下述衣壳蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4。市售脊髓灰质炎疫苗包括灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。
嗜肝RNA病毒：病毒抗原可衍生自嗜肝RNA病毒，如甲肝病毒(HAV)。市售HAV疫苗包括灭活的HAV疫苗。[129、130]。
披膜病毒：病毒抗原可衍生自披膜病毒，如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒。优选抗原衍生自风疹病毒(rubivirus)，如风疹病毒抗原。披膜病毒抗原可选自E1、E2、E3、C、NSP-1、NSPO-2、NSP-3或NSP-4。披膜病毒抗原优选选自E1、E2或E3。市售风疹疫苗含有冷适应活病毒，一般与腮腺炎和麻疹疫苗(MMR)联用。
嗜肝DNA病毒：病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原可选自表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。市售HBV疫苗包含含有表面抗原S蛋白的亚单位疫苗[130，131]。
乳头状多瘤空泡病毒：抗原可衍生自乳头状多瘤空泡病毒，如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。HPV抗原优选衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原可选自衣壳蛋白(L1)和(L2)或E1-E7，或其融合物。优选将HPV抗原制成病毒样颗粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原可选自VP1、VP2或VP3。
C.抗原制剂
在本发明的其它方面，提供了吸附抗原的微粒的制备方法。该方法包括：(a)通过分散含有(i)水、(ii)去污剂、(iii)有机溶剂和(iv)可生物降解聚合物的混合物提供乳液，所述可生物降解的聚合物选自：聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯。相对于有机溶剂，该聚合物在混合物中的浓度一般约为1％-30％，而混合物中去污剂-聚合物的重量比一般约为0.00001∶1-0.1∶1(更一般约为0.0001∶1-0.1∶1，约为0.001∶1-0.1∶1，或约为0.005∶1-0.1∶1)；(b)除去乳液中的有机溶剂；和(c)使抗原吸附于微粒表面上。在一些实施方式中，相对于有机溶剂，可生物降解聚合物的浓度约为3％-10％。
本文使用的微粒由可灭菌的无毒并且可生物降解的材料形成。这些材料包括但不限于：聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。优选地，本发明所用微粒衍生自聚(α-羟酸)，具体说，衍生自聚(交酯)(″PLA″)或D，L-丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(″PLG″或″PLGA″)，或D，L-丙交酯和己内酯的共聚物。该微粒可衍生自具有各种分子量的各种聚合物原料，在共聚物如各种丙交酯乙交酯比例的PLG情况下，选择是主要问题，部分取决于共同给予的大分子。下面更全面地讨论这些参数。
医学方法和应用
一旦配制好后，本发明组合物可直接给予对象。治疗对象可以是动物；特别是，可治疗人类对象。可将该组合物配制成专门用于接种儿童和青少年的疫苗。可通过全身和/或粘膜途径给予它们。
一般地，将该组合物制备成溶液或悬液形式的注射剂；还可配制适合在注射前用液体载体溶解或悬浮的固体形式。通常通过胃肠道外(如注射，皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内，或者递送至组织间隙)直接递送该组合物。也可将该组合物给予病灶。其它给药方式包括口服给药和肺给药、栓剂和透皮或经皮施用(参见例如参考文献132)，针注射和无针注射。给药治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(如包括加强剂量)。
本发明疫苗优选为无菌疫苗。它们优选无热原。优选用缓冲液使(例如)pH 6-pH 8，通常约为pH 7。当疫苗包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[133]。
本发明疫苗可包含低水平(如＜0.01％)去污剂(如吐温，如吐温80)。本发明疫苗可含有(如)约15mg/ml的糖醇(如甘露醇)或海藻糖，尤其是在需要冻干或者已经冻干的情况下。
可凭经验评估各抗原的最佳剂量。然而通常，本发明方法纯化的偶联物抗原的给药剂量为每剂量各种糖0.1-100微克，典型剂量体积为0.5毫升。一般剂量为每剂每种糖5-20微克。以偶合物中的糖计量这些值。
本发明疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即在感染后治疗疾病)疫苗，但一般是预防性疫苗。
本发明提供了用作药物的本发明方法纯化的偶联物。
本发明也提供了诱导患者产生免疫应答的方法，所述方法包括给予患者本发明偶联物。免疫应答优选能产生抵抗脑膜炎球菌病、肺炎球菌病或乙型流感嗜血杆菌的保护力，包括体液免疫应答和/或细胞免疫应答。患者优选儿童。在已接受脑膜炎球菌、肺炎球菌或乙型流感嗜血杆菌初免的患者中该方法可产生加强应答。在其他实施方式中，免疫应答是针对无乳链球菌的保护性免疫应答，可包括体液免疫应答和/或细胞免疫应答。患者优选是儿童、新生儿或怀孕妇女。在已接受无乳链球菌初免的患者中该方法可产生加强应答。
本发明也提供本发明偶联物在制造诱导患者产生免疫应答的药物中的应用，其中所述患者已用与偶联于载体的组合物所含糖抗原不同的糖抗原预先治疗。
本发明也提供了偶联物在制造诱导患者产生免疫应答的药物中的应用，其中所述患者已用与偶联不同载体的组合物所含抗原相同的糖抗原预先治疗。
所述药物优选为免疫原性组合物(如疫苗)。该药物优选用于预防和/或治疗奈瑟球菌(如脑膜炎、败血症、淋病等)、流感嗜血杆菌(如中耳炎、支气管炎、肺炎、蜂窝织炎、心包炎、脑膜炎等)或肺炎球菌(如脑膜炎、败血症、肺炎等)引起的疾病。优选预防和/或治疗细菌性脑膜炎。在其它实施方式中，使用药物来预防和/或治疗无乳链球菌导致的疾病。因此也优选预防和/或治疗这种疾病。
可用标准动物模型检测这些疫苗(例如参见参考文献134)。
佐剂
本发明偶联物可与其它免疫调节剂联用。具体说，组合物通常含有佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：
A.含矿物质的组合物
本发明中适合用作佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。这种矿物质组合物可包括矿物盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，参见参考文献135的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物(如磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地含有过量磷酸盐)，化合物可采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸附于该盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[136]。
本发明组合物中可包含铝盐，Al3+剂量为每剂量0.2-1.0mg。
磷酸铝佐剂一般是无定形羟基磷酸铝，PO4/Al摩尔比为0.84-0.92，包括约0.6mg Al3+/ml。可采用低剂量磷酸铝吸附，如50-100μg Al3+/偶联物/剂。采用磷酸铝并且不需要使抗原吸附于佐剂时，在溶液中包含游离的磷酸根离子(如采用磷酸盐缓冲液)比较有利。
B.油乳剂
适合用作本发明偶联物作为佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59(5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85，用微流化床配制成亚微米颗粒)[参考文献135第10章；也参见参考文献137-139]。将MF59用作FLUADTM流感病毒三价亚单位疫苗的佐剂。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。
用于组合物的尤其优选的佐剂是亚微米水包油乳剂。本文所用的优选亚微米水包油乳剂是任选地含有各种含量的MTP-PE鲨烯/水乳剂，如含有4-5％w/v鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和/或0.25-1.0％Span 85(山梨聚糖三油酸酯)，以及任选的N-乙酰基胞壁酰基-1-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-1-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂。参考文献137和140-141详细描述了亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂(如胞壁酰肽)在本发明组合物中的应用。
可采用鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。它也可含有司盘85(如1％)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1，因为这能使乳液更稳定。可通过下述方法制备一种这样的乳液：将吐温80溶解于PBS得到2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。
可采用含鲨烯、生育酚和Triton去污剂(如Triton X-100)的乳液。
可采用含鲨烯、聚山梨酸酯80和泊洛沙姆401(″PluronicTM L121″)的乳液。可以用磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与用″SAF-I″佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％Pluronic L121和0.2％聚山梨酸酯80)[142]配的苏氨酰基-MDP一起使用。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用″AF″佐剂(5％鲨烯、1.25％Pluronic L121和0.2％聚山梨酸酯80)[143]。优选微流体化。
也可用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)作为佐剂。
C.皂苷制剂[参考文献135的第22章]
皂苷制剂也可用作本发明偶联物的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的分离自皂树(Quillaia saponaria)Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophillapaniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标StimulonTM出售。
已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献144。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[145]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献135的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。ISCOM中可采用任何已知的皂苷。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献145-147中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[148]。
开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献149和150。
D.病毒体和病毒样颗粒
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常包含一种或多种任选地与磷脂组合或一起配制的病毒蛋白。病毒体和颗粒通常无病原性、不能复制，通常不含任何天然病毒基因组。可用重组方法产生或从全病毒分离得到这种病毒蛋白。这些适用于病毒体或VLP中的病毒蛋白包括来源于流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或包膜蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLP在参考文献151-156中有进一步描述。病毒体在(例如)参考文献157中有进一步描述。
E.细菌或微生物衍生物
适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌的脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献158中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以经0.22μm膜过滤除菌[158]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物如RC529[159，160]。
脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A衍生物，如OM-174。(例如)参考文献161和162中描述了OM-174。
适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酯键与鸟嘌呤连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。
CpG可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献163、164和165公开了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献166-171中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。
CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[172]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献173-175中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。
优选构建CpG寡核苷酸时使其5’端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献172和176-178。
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。优选该蛋白获自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)菌。参考文献179中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献180中描述了将其用作胃肠道外佐剂。毒素和类毒素优选包含A和B亚单位的全毒素形式。优选A亚单位含有脱毒突变；B亚单位优选不突变。佐剂优选脱毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献181-188中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂。优选根据参考文献189中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的排列对比对氨基酸取代基编号，该参考文献的全部内容特别纳入本文作为参考。
式I、II或III的化合物或其盐也可用作佐剂：
Figure GPA00001046674500191
如参考文献190所述，例如‘ER803058’、‘ER803732’、‘ER804053’、ER804058’、‘ER804059’、‘ER804442’、‘ER804680’、‘ER804764’、ER803022或‘ER804057’如：
Figure GPA00001046674500192
F.人免疫调节剂
适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[191]、IL-23、IL-27[192]等)[193]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子和巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-Iα)和MIP-1β[194]。
G.生物粘着剂和粘膜粘着剂
生物粘着剂和粘膜粘着剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[195]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[196]。
H.微粒
微粒也可用作本发明的佐剂。微粒(即直径约100纳米到约150微米，更优选直径约200纳米到约30微米，最优选地直径约500纳米到约10微米的颗粒)由可生物降解性无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-乙交酯共聚物)形成，并任选经处理而具有带负电荷表面(例如用SDS处理)或带正电荷表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。
I.脂质体(参考文献135的第13和14章)。
适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献197-199所述。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂
适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[200]。这种制剂还包括聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇[201]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[202]的混合物。优选的聚氧乙烯醚选自：优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)
参考文献203和204中描述了PCPP(聚[二(羧基苯氧基)磷腈]((poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene)制剂。
L.胞壁酰肽
适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。
M.咪唑并喹诺酮化合物。
适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，″瑞喹莫德3M″)，见参考文献205和206所述。
N.缩氨基硫脲化合物
缩氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和筛选适合用作本发明佐剂的所有这类化合物的方法包括参考文献207所述内容。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。
O.色胺酮化合物
色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和筛选适合用作本发明佐剂的所有这类化合物的方法包括参考文献208所述内容。色胺酮化合物在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子如TNF-α方面尤其有效。
P.核苷类似物
各种核苷类似物可用作佐剂，如(a)埃索他宾(Isatorabine)(ANA-245；7-硫杂-8-氧代鸟苷)及其前药：
Figure GPA00001046674500211
(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考文献209-211所述的化合物；(f)具有下式的化合物：
式中：
R1和R2各自独立地是氢、卤素、-NRaRb、-OH、C1-6烷氧基、取代的C1- 6烷氧基、杂环基、取代的杂环基、C6-10芳基、取代的C6-10芳基、C1-6烷基或取代的C1-6烷基；
R3不存在，或者是H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C6-10芳基、取代的C6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；
R4和R5各自独立地是氢、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C(O)-Rd、C1- 6烷基、取代的C1-6烷基，或结合在一起形成5元环，如R4-5：
Figure GPA00001046674500221
在
Figure GPA00001046674500222
所示的化学键处实现结合，
X1和X2各自独立地是N、C、O或S；
R8是氢、卤素、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-O-Rc、-O-(C1-6烷基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd；
R9是氢、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、杂环基、取代的杂环基或R9a，其中R9a是：
Figure GPA00001046674500223
在
Figure GPA00001046674500224
所示的化学键处实现结合，
R10和R11各自独立地是氢、卤素、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、-NRaRb或-OH；
Ra和Rb各自独立地是氢、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、-C(O)Rd、C6-10芳基；
Rc各自独立地是氢、磷酸酯基、二磷酸酯基、三磷酸酯基、C1-6烷基或取代的C1-6烷基；
Rd各自独立地是氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、-NH2、-NH(C1-6烷基)、-NH(取代的C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)2、-N(取代的C1-6烷基)2、C6-10芳基或杂环基；
Re各自独立地是氢、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C6-10芳基、取代的C6- 10芳基、杂环基或取代的杂环基；
Rf各自独立地是氢、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、-C(O)Rd、磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基；
n各自独立地是0、1、2或3；
p各自独立地是0、1或2；或者
或(g)(a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐，(a)-(f)中任一项的互变异构体，或互变异构体的药学上可接受的盐。
Q.连接于含磷酸无环主链的脂质
含有连接于含磷酸无环主链的脂质的佐剂包括TLR4拮抗剂E5564[212，213]：
Figure GPA00001046674500231
R.小分子免疫增强剂(SMIP)
SMIP包括：
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫代]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺
1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙酸乙酯；
4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑[4，5-c]喹啉-2-酮；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇
1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇
N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺。
S.蛋白质体
一种佐剂是由第一种革兰阴性菌制备的外膜蛋白蛋白质体制剂与衍生自第二种革兰阴性菌脂多糖制剂的组合，其中外膜蛋白蛋白质体和脂多糖制剂形成稳定的非共价佐剂复合物。这类复合物包括″IVX-908″，它是由脑膜炎奈瑟球菌外膜和脂多糖组成的复合物。已将它们用作流感疫苗佐剂[214]。
T.其它佐剂
参考文献135和215中公开了用作免疫刺激剂的其它物质。其它有用的佐剂物质包括：
·甲基肌苷5′-单磷酸酯(″MIMP″)[216]。
·多聚羟化吡咯双烷类化合物[217]，如下式化合物：
Figure GPA00001046674500241
式中，R选自：氢，直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、烷基(如环烷基)、烯基、炔基和芳基，或其药学上可接受的盐或衍生物。例子包括但不限于：木麻黄(casuarine)、木麻黄-6-α-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄、7-表-木麻黄、3，7-二表-木麻黄等。
·γ菊糖[218]或其衍生物，如阿尔加穆林(algammulin)。
·参考文献219所述化合物。
·参考文献220所述化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[221，222]、水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、异噁唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[223]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶化合物和吲哚化合物[224]。
·洛索立宾(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[225]。
阳离子脂质与(通常为中性)共脂质(co-lipid)，如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙铵-二植酰基磷脂酰-乙醇胺(″VaxfectinTM″)或氨基丙基-二甲基-双十二烷基氧基-溴化丙铵-二油酰基磷脂酰-乙醇胺(″GAP-DLRIE:DOPE″)的制剂。优选含有(±)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-双(顺-9-四癸烯氧基)-1-丙铵盐的制剂[226]。
本发明也可包括以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，以下组合可用作本发明佐剂组合物：(1)皂苷和水包油乳剂[227]；(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[228]；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)[229]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[230]；(6)SAF，含有10％鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液。(7)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem)，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)；和(9)一种或多种无机盐(如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(如含CpG基序的核苷酸序列)。
定义
术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。可认为本文中所有数值都由″约″限定，除非文中另有说明。
术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。
附图简述
图1显示了GBS血清型Ia和III中重复结构之间的差异。
图2显示了GBS血清型Ia、Ib、II、III和V中荚膜糖的重复结构。
图3显示了来自GBS血清型V的荚膜多糖脱唾液酸化形式的重复结构。
图4显示了末端唾液酸残基的高碘酸盐氧化反应。
图5和6分别显示了用I型和II型羟基磷灰石进行偶联物纯化的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)。列关键点：1-CRM、3-粗品偶联物、5-流出相(偶联物)、7-洗脱相(未偶联CRM)。
图7和8分别显示了I型和II型羟基磷灰石的HPLC输出。第一峰是偶联的CRM197-GBS血清型III，第二峰是未偶联的CRM197。
本发明实施方式
实施例1
偶联物制备
来自无乳链球菌血清型Ia、Ib和III的纯化荚膜多糖通过高碘酸盐氧化反应然后是还原胺化而与载体蛋白偶联。载体蛋白是CRM197。
比较超滤纯化与采用羟基磷灰石的纯化
用超滤(使用100KDa膜进行切线流透析)或羟基磷灰石树脂(I型或II型80微米树脂，Bio-Rad)纯化偶联物。I型HA树脂具有较高的蛋白质结合容量并且对于酸性蛋白质的容量更佳，而II型树脂的蛋白质结合容量较低但对某些蛋白质的分辨率较佳。CRM197的分子量约为60KDa。虽然采用100KDa膜进行超滤能够从偶联/未偶联CRM197混合物分离高分子量多糖的偶联物(例如约150KDa的血清型Ia偶联物，导致偶联物总质量约210KDa)，但不能用于偶联和未偶联的载体蛋白的分子质量之间差异不显著的分子量较低的偶联物(例如血清型III偶联物)。
相反，初步实验表明可采用I型和II型羟基磷灰石树脂从未偶联的CRM197纯化其偶联形式。未偶联的CRM197结合于树脂，偶联蛋白因偶联糖的保护作用而存在于流出相中。
测试羟基磷灰石纯化的各种参数
pH值
用羟基磷灰石进行色谱分离通常采用pH 6.8。然而，在本实验中采用pH7.2以确保糖的稳定性。未发现这种pH的改变对色谱效率产生影响。
磷酸盐浓度
测试了不同的磷酸盐浓度以确定其对纯化偶联物的产率的影响。确定当原料和平衡/加载后洗涤缓冲液(pH7.2)中的磷酸盐浓度≤35mM时，CRM197完全结合于羟基磷灰石柱。在这种浓度下，总能在柱流出相中完全回收CRM197-Ia/Ib偶联物，而CRM197-III偶联物的回收产率为80-85％。
洗涤体积(加载后)
由于与羟基磷灰石的相互作用，加载期间并非所有的偶联物都能立即从柱子流出。然而发现，磷酸盐度30mM时，用不到1.5个柱体积(CV)的加载后洗涤液即可使所有偶联物流出。因此，加载体积约为0.6CV，收集随后的包含偶联物的0.4-2.2CV。
柱加载(容量)
磷酸盐浓度35mM时，发现羟基磷灰石能够完全结合CRM197，总CRM：柱体积之比约为每毫升树脂小于2.5毫克CRM。为了减少流出相中存在未偶联CRM197的几率，采用较低的CRM：柱体积，每毫升树脂约1.5毫克CRM。
前导工艺
上述实验之后，采用以下参数设定试验工艺：
柱体积＝4L(可接受的范围：＞3L)。选定柱的直径为20厘米(相应的高度约为11±2.5厘米)。
柱冲洗与平衡：5CV的400mM磷酸钠pH 6.8缓冲液以80厘米/小时(419毫升/分钟)的速率加上5CV的35mM磷酸钠pH 7.2缓冲液以80厘米/小时的速率。
柱加载与产物收集：加载产物(80厘米/小时)，然后用平衡缓冲液洗涤；废弃的流出液一直到0.4CV，收集产物一直到2.2CV，然后弃去一直到2.9CV。
用2CV 400mM磷酸钠pH 6.8缓冲液以80厘米/小时的流速洗脱柱，收集结合于柱的未偶联的CRM(该馏分与所述工艺无关)。
I型羟基磷灰石与II型羟基磷灰石的比较
发现I型和II型羟基磷灰石能够以相等的效率从混合物纯化偶联物。图5和6分别显示了I型和II型羟基磷灰石的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。这些凝胶结果清楚表明，流出相中不存在未偶联的CRM197(道5)。正如预期的那样，在洗脱相中发现未偶联的CRM197(道7)。采用SE-HPLC分析原料(偶联和未偶联CRM197的混合物)、流出相和洗脱相。图7和8分别显示了I型和II型树脂HPLC过程的图像。各图显示了与纯化的偶联物和未偶联CRM197相关的两个不同的峰。在图7中，双重峰是原料，第一峰是流出相(纯化的偶联物)，第二峰是从树脂洗脱的物质(未偶联CRM197)。在图8中，第一峰是流出相(纯化的偶联物)，第二峰是从树脂洗脱的物质(未偶联CRM197)。
实施例2
偶联物制备
来自无乳链球菌血清型V的纯化脱唾液酸化荚膜多糖通过高碘酸盐氧化反应然后是还原胺化而与载体蛋白偶联。载体蛋白是CRM197。
测试羟基磷灰石纯化的柱加载参数
柱加载
磷酸盐浓度35mM时，发现羟基磷灰石能够完全结合CRM197，总CRM：柱体积之比约为每毫升树脂小于2.5毫克CRM。为了减少流动相中存在未偶联CRM197的几率，采用较低的CRM：柱体积，每毫升树脂约1.5毫克CRM。
测试工艺
根据该实验，采用以下参数设立一些测试工艺：
  参数  测试1  测试2   测试3   测试4
  柱高度(厘米)   5.5   12   12.75   12.75
  柱直径(厘米)   5   1.6   2.6   2.6
  柱体积(厘米)   108   24   68   68
  加载体积(毫升)   337   46   154   153
  偶联反应/柱体积中存在的CRM的质量(每毫升树脂CRM的毫克数)   5.0   3.5   3.6   3.5
  流出相体积(毫升)   750   95   270   245
  洗脱相体积(毫升)   125   28   100   104
  0.2微米过滤洗脱相   无   有   有   有
分析以下测试工艺：
  参数   测试1   测试2   测试3   测试4
  流出相蛋白质浓度(μg/ml)   564   691.1   755   789
  洗脱相蛋白质浓度(μg/ml)   816   474.4   342   245
  流出相糖浓度(μg/ml)   未检测   832.52   1067.09   1166.29
  洗脱相糖浓度(μg/ml)   未检测   159.78   92.35   65.35
  洗脱相中偶联物的百分估计值(％总蛋白)   11.2   未检测   8.57   6.35
  流出相中未偶联的CRM(％总蛋白)   16％   未检测   不可检测   不可检测
测定测试工艺的产率：
 参数   测试1   测试2   测试3   测试4
 估计粗品中未偶联的CRM(SE-HPLC确定百分比)   29.5   15.1   11.3   8.9
 流出相中的蛋白质回收率(％偶联反应中存在的CRM)   78.3   77.8   84.5   68.2
 洗脱相中的蛋白质回收率(％偶联反应中存在的CRM)   18.9   24.8   14.2   9.0
 流出相中的糖回收率(％偶联反应中存在的糖)   未检测   81.7   90.2   96.4
 洗脱相中的糖回收率(％偶联反应中存在的糖)   未检测   5.8   2.9   2.3
这些数据表明，羟基磷灰石色谱能够从混合物回收超过90％与CRM197偶联的脱唾液酸化的GBS血清型V荚膜多糖。虽然测试工艺给出的值约为80％，这些值是相对于偶联反应中存在的CRM197总量而言的，其中的10-25％在加载到羟基磷灰石树脂上之前可能是未偶联的。
采用SE-HPLC分析原料(偶联和未偶联CRM197的混合物)、流出相和洗脱相。对于上述GBS血清型Ia、Ib和III偶联物，可见与纯化的偶联物和未偶联CRM197相关的不同峰。该结果表明，羟基磷灰石色谱能够从偶联物中基本上完全去除未偶联的CRM197。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可在本发明的范围和构思内进行修改。
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Claims (16)

1.一种从包含游离的载体蛋白和糖抗原-载体蛋白偶联物的混合物中纯化糖抗原-载体蛋白的方法，该方法包括：使所述混合物与羟基磷灰石接触，使得所述载体蛋白结合所述羟基磷灰石而所述偶联物不发生结合；和收集游离的糖抗原-载体蛋白偶联物；其中，所述载体蛋白为CRM197，所述糖抗原为细菌荚膜多糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物还包含其他污染蛋白。
3.如前述权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖抗原的分子量为5kDa以上。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述糖抗原的分子量为50kDa以上。
5.如前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述糖抗原是糖基化的。
6.如前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述糖抗原来自：脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、流感嗜血杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌或伤寒沙门菌。
7.如前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白与来自多于一种细菌种类的糖抗原相偶联。
8.如前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述糖抗原通过接头与载体蛋白相偶联。
9.如前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在pH6.5-pH7.5进行。
10.如前述权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法在pH7.2进行。
11.如前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在50mM以下的磷酸盐浓度进行。
12.如前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述羟基磷灰石是凝胶形式。
13.如前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述羟基磷灰石是颗粒形式，粒径为40μm以上。
14.如前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述羟基磷灰石的动态结合容量大于10毫克溶菌酶/克。
15.一种制备药物组合物的方法，该方法包括前述权利要求1-14中任一项所述的方法，并且还包括以下步骤：iii)将步骤ii)获得的糖抗原-载体蛋白偶联物与药学上可接受的稀释剂或载体混合。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(iv)将步骤(iii)的产品与佐剂混合。
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