CN1017906B - 生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents

生产l-赖氨酸的方法

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Abstract

本发明揭示了生产L-赖氨酸的方法，包括将一个含与合成二氢二吡啶羧酸合成酶或琥珀酰四氢吡啶羧酸合成酶有关基因DNA片段的重组DNA和一个载体DNA引入到属于棒状杆菌属或短颈细菌属微生物中，在培养基中培养该微生物，再回收在肉汤中积累的L-赖氨酸。

Description

本发明是关于生产L-赖氨酸的方法，包括将一个含与合成二氢二吡啶羧酸合成酶（DDPS）或琥珀酰四氢吡啶羧酸合成酶（THPS）有关基因的DNA片段的重组DNA和一个载体DNA引入棒状杆菌属（Corynebacterium）或短颈细菌属（Brevibacterium）的微生物中，在培养基中培养该微生物，再从培养肉汤中回收产生的L-赖氨酸。因此，本发明是属于生物工程领域，特别是涉及生产L-赖氨酸，将其用作饲料工业的添加剂。
用重组DNA技术改良诸如：棒状杆菌属和短颈细菌属等产生谷氨酸的微生物，从而增加L-赖氨酸的产率。这在日本专利公开No160997/81，126789/83中已经揭示了。
改进大量生产L-赖氨酸的方法一直是个悬而未解的问题，本发明通过大量研究，更有效地利用重组DNA技术解决了这个问题。
本发明人发现可以用一个含有负责生物合成L-赖氨酸的基因重组体和一个载体质粒的菌株来改善L-赖氨酸的产率。
本发明涉及生产L-赖氨酸的方法，该方法包括将一个与合成DDPS或THPS有关基因片段的重组DNA和一个载体DNA引入属于棒状杆菌属或短颈细菌属的微生物，将该微生物在适当培养基中培养，再从培养肉汤中回收累积产生的L-赖氨酸。
图1表示制备载体质粒PFC18的流程，其中SPC/SM表示抗壮观霉素和键霉素抗性标记，AP为氨苄青霉素抗性标记，而Tc是四环素抗性标记。
根据本发明，可通过将一个含与合成DDPS或THPS有关基因片 段的重组DNA和一个载体DNA的棒状杆菌属或短颈细菌属的微生物培养在适当培养基中，让其在肉汤培养基中积累生产的L-赖氨酸，然后从肉汤中回收L-赖氨酸。
当用棒状杆菌属或短颈细菌属微生物作为宿主微生物时，任一个已知是所谓产生谷氨酸的微生物均可应用。优选的是下列菌株;
谷氨酸棒杆菌corynebacterium    glutamicum    ATCC13022
嗜乙酰乙酸棒杆菌corynebacterium    ATCC13870
acetoacidophilum
力士棒杆菌corynebacterium    herculis    ATCC13868
百合棒杆菌corynebacterium    lilium    ATCC15990
叉开短杆菌Brevibacterium    divaricatum    ATCC14020
黄色短杆菌Brevibacterium    flavum    ATCC14067
非嗜海洋短杆菌Brevibacterium    ATCC14068
immariophilrium
乳酚发酵短杆菌Brevibacterium    ATCC13869
lactofermentun
产硫短杆菌Brevibacterium    ATCC19240
thiogenitalis
可用不产生赖氨酸的野生型菌株作为宿生微生物，但也可用产生赖氨酸菌株。作为生产赖氨酸的菌株，可用已知需要氨基酸的突变菌株及抗氨基酸类似物菌株。
作为与合成DDPS或THPS有关的基因，可用任何从真核生物、原核生物、病毒、噬菌体或质粒得到的。属于原核细菌菌株的基因，例如，属于大肠杆菌属，棒状杆属、短颈细菌属、细杆菌属（Microbacterium）、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属，或沙雷氏菌属为特别优选的。
本发明优选的用于结合到上述基因的DNA片段的载体有PCG1， PCG2，PCG4，PCG11，PCE54，PCB101等。生产这些载体的方法分别揭示在日本未审查专利N134500/82，183799/82，35197/83和105999/83。
根据重组DNA技术可得到含与合成DDPS或THPS有关基因DNA片段的重组DNA。该技术包括用限制酶体外酶切DNA，再用DNA连接酶重组酶切的DNA，然后用其转化属于棒状杆菌属或短颈细菌属突变菌株的缺乏赖氨酸基因的菌株，选择恢复产生赖氨酸能力的菌株。可根据日本未审查专利申请No186492/82和186489/82所述的方法进行DNA重组。
也可用其它已建立的宿主一载体系统如：大肠杆菌系统，代替直接在属于棒状杆菌属或短颈细菌属的微生物中克隆重组DNA。也就是说用下述方法从制备的转化体得到含该基因的无性繁殖的DNA片段，该方法包括体外用给体DNA和载体DNA连接混液转化缺少与合成DDPS或THPS有关基因的大肠杆菌突变体，选择恢复生产赖氨酸能力的转化体，通过将给体DNA与棒状杆菌属或短颈细菌属细菌的载体DNA体外重组，从而转化棒状杆菌属或短颈细菌属细菌，使我们得到具有无性繁殖的含给体基因重组DNA的细菌。
下面将详述本发明，即如何得到与合成谷氨酸棒杆菌DDPS有关的基因（下面称之为DDPS基因或dap    A）及与合成谷氨酸棒杆菌THPS有关的基因（下面称之为THP    Sdap    C）。
可先用大肠杆菌系统克隆含谷氨酸棒杆菌dap    A和dap    C的DNA片段，用大肠杆菌克隆一个基因的程序已叙述在如：吴端编辑（Ray    Wu）的“酶学方法”68卷，该卷于1979年在纽约由Academic    Press出版。程序如下：
将萃取的谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体DNA和大肠杆菌载体质粒PBR322（含氨基苄青霉素和四环素抗性基因）用限制酶Sal    Ⅰ酶切， 而后用T4噬菌体DNA连接酶将它们重组。
用该重组体转化大肠杆菌K12的亚株TM103[hsd R-（宿主特异性限制缺陷型）和dap A（DDPS-缺陷型;需要二氨基庚二酸）]，选择能在含氨基苄青霉素的基本培养基上生长的转化体。根据常规方法可从不需二氨基庚二酸而具有氨苄青霉素抗性的转化体细菌培养液中分离出所含的质粒。然后用限制酶切割质粒DNA，再用琼脂糖凝胶电泳分析得到的
DNA片段，以此可测定它们的结构。得到的质粒之一是PCD1。PCD1的结构是有一个4.2千对碱基的Sal    IDNA片段插入到PBR322唯一的Sal    Ⅰ切点。（图1）。
用PCD1    DNA分别转化大肠杆菌亚株DDPS-缺陷型突变菌株AT998（Hfrdap    A16）和THPS-缺陷型突变菌株AT998（Hfrdap    C15）[见J·Bacteriol.105期844页（1971年）]没有得到抗氨苄青霉素的转化体，这个事实明显地说明在4.2千对碱基PCD1的Sal    ⅠDNA上有谷氨酸棒杆菌为恢复大肠杆菌DDPS和THPS缺陷型机能的dap    A和dapc基因。
所谓穿梭型重组质粒PAC2可在棒状杆菌属，短颈细菌属和大肠杆菌属细菌中复制，它是通过将含克隆在PCD1上的dap    A和dap    C的4.2千对碱基的Sal    IDNA片段插入到PFC18质粒唯一的Sal    Ⅰ切点（PFC18具有四环素和壮观霉素抗性）中形成的。通过将本发明人以前发现的棒状杆菌属和短颈细菌属的载体质粒pcG11插入到大肠杆菌载体质粒p    BR322的pst切点中，制备出穿梭型载体质粒PFC18。（见日本公开的未审查专利申请No134500/82），制备该质粒的过程及它的结构示在图1。
PAC2质粒是根据下列步骤制备的：
用限制酶Sal Ⅰ酶切PFC18和PCD1质粒DNAs，然后将二者混合，用T4连接酶连接。用连接混合物转化DDPS缺陷型大肠杆菌K12的亚株TM103，将转化体培养在含壮观霉素的基本培养基上筛选。从一个具壮观霉素性且不需要二氨基庚二酸的转化体的培养细胞中萃取质粒DNA。
为研究该质粒的结构，将质粒DNA的Sal Ⅰ酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分离。证实了从pcD1衍生的4.2千对碱基的Sal IDNA片段插入到p FC18载体质粒的Sal I切点。然后用该质粒转化大肠杆菌K1亚株DDPS缺陷型突变株AT998和THPS缺陷型突变株AT997。由于它们的缺陷都已恢复，证实了克隆在PCD1上的谷氨酸棒杆菌的dap A和dap C合并到该质粒中，该质粒被命名为PAC2（见图1）。
用PAC2质粒转化诱变得到的需要高丝氨酸产生赖氨酸的谷氨酸棒杆菌RH6菌株（该菌株贮存在工业科技处发酵研究所，贮藏号为FERM-BP704）。转化是根据采用本发明人发现的棒状杆菌属或短颈细菌属一个菌株的原生质体的转化方法，该方法已申请了专利（见日本公开的未审查专利申请No186492/82和186489/82）。用上述方法转化谷氨酸棒杆菌RH6菌株的原生质体，再在含壮观霉素的再生培养基上选择。通过上述方法将从一个得到的抗壮观霉素转化体的培养细胞分离出的质粒用同样限制酶酶解，然后用琼脂糖凝胶电泳，研究其结构，根据大肠杆菌K12的亚株AT998和AT997的转化试验证实了它含有dap A和dap C。还证实了质粒PAC2引入到RH6菌株中。
用PAC2转化体生产L-赖氨酸是根据常规的发酵方法进行的。即将转化体培养在常规培养基上，培养基含一种碳源，一种氮源，无机物，氨基酸，维生素等等，在通气条件下控制温度和pH。赖氨酸在肉汤培养基中生成和积累。用已知方法，如：活性炭处理，离子交换树脂处理等方法可从肉汤培养基中回收L-赖氨酸。
因此，用棒状杆菌属或短颈细菌属含PAC2菌株比用不含PAC2的菌株可以更高产率生产L-赖氨酸。本发明的实用性在于通过将一个重组DNA到一个棒状杆菌或短颈细菌属的菌株中，其中的DDPS和/或THPS基因和一个棒状杆菌属或短颈细菌属菌株的一个载体重组而能表达该特征。在本说明书中，指出了一个用从谷氨酸棒杆菌得到的与合成DDPS或THPS有关基因的例子。当其它生物相应的基因代替上述基因时，产赖氨酸微生物的赖氨酸产率也可得到改善。
本发明的载体质粒仅提供了合成重组DDPS或THPS有关的基因稳定遗传的自主复制能力。因此，不仅是在本说明书中作例子的PEC18可以应用，在棒状杆菌属或短颈细菌属微生物中自主复制的质粒和插入到宿主染色体，能稳定遗传的噬菌体也可应用。
尽管高产谷氨酸的微生物（称做产谷氨酸微生物）有很多共同的微生物学性质，由于它们在工业上的重要性，研究者还是将其分类在不同的种及诸如：棒状杆菌和短颈细菌等属。要指出的是，由于它们细胞壁中氨基酸的同质性及DNA中GC含量的同质性，所以将其分在同一种中。最近有报道，这些微生物间有高于70～80%的DNA-DNA杂交同质区，这说明它们是密切相关的。（参见刊在“Int.J.Syst.Bacteriol”，31期，131页（1981）Komatsu    Y，的文章“Report    of    the    Fermentative    Research    Institute”）。
本说明书说明了当将一个DNA重组体引入谷氨酸棒杆菌RH6时，该基因的表达改善了L-赖氨酸的产率，考虑到上述产谷氨酸微生物彼此密切的关系，就很容易断定本发明可用于所有产谷氨酸微生物。本发明的效果取决于DNA重组体是否在产谷氨酸微生物中自主复制及该基因是否在其中被表达，及产谷氨酸微生物间这种DNA同质性的轻微差别是否可被忽略。这些产谷氨酸微生物共同机能表现在从谷氨酸棒杆菌225～250（见日本公开未审查专利申请No183799/82）分离的具有壮观霉素和/或链霉 素抗性基因的质粒pcG4可在棒状杆菌属和短颈细菌属菌株中复制和表达。（见日本公开未审查专利申请No186492/82）。本发明人还揭示了短颈细菌属细菌的色氨酸合成基因可在棒状杆菌属细菌中表达，棒状杆菌属细菌的组氨酸合成基因可在短颈细菌属细菌中表达。（日本公开未审查专利申请No25398/83和25397/83）。看来，这两属细菌间可相互表达其基因。因此，本发明可用的细菌不仅包括谷氨酸棒状菌，而且还包括所有产谷氨酸的棒状杆菌属和短颈细菌属的细菌。
通过下列代表性例子说明本发明的一些特定的实施。
例1
（1）建立具有宿主特定限制缺陷型突变和DDPS缺陷突变的大肠杆菌Coli    K12亚菌株TM103;
为更容易地在大肠杆菌宿主载体系统中克隆一个与谷氨酸棒杆菌DDPS合成有关的外源基因，必须建立一个同时具宿主特定限制缺陷型突变（hsd    R2-）和DDPS缺陷突变（dapA16-）的大肠杆菌菌株作为宿主。步骤如下：
从一个具有限制缺陷突变的大肠杆菌Coli K12的WA802亚株（大肠杆菌Coli K12WA802，FERMBP-718）[Fmet Bl hsd R2;见分子生物学杂志”J.Mol Biol 16期118页（1966年）]衍生一个对25μg/ml利福平有抗性的自发突变菌株RF82。再将RF82和DDPS缺陷型突变菌株AT998（Hfr dap′A16）（大肠杆菌Coli K12AT998，FERM BP-720）培养在L培养基中[内含1%细菌用胰化胨（Difco），0.5%酵母萃取液（日本Daigo Eiyo Kagaku K.K.制造）和0.5%NaCl，用NaOH将PH调至7.0]，该培养基中还含有50μg/ml二氨基庚二酸，于37℃下培养3小时。用生理盐水将其离心洗涤两次之后，将洗后细胞涂布在M9琼脂基本培养皿上（1升中含2克葡萄 糖，1克NH4Cl，6克Na2HPO4，3克KH2PO4，0.1克MgSO4·7HO，15毫克CaCl2·2H2O，4毫克盐酸硫胺素和15克琼脂，将PH调至7.2），培养基中还含25μg/ml的利福平和50μg/ml的二氨基庚二酸。然后选择抗利福平而不需要硫胺素的转连体（trnsconjugants）。再从其选出需要二氨基庚二酸并具有限制缺陷突变的菌株，其中之一命名为TM103。通过在一个大肠杆菌K12菌株的修饰缺陷株[见M.Meselson“分子生物学杂志”9期，734页（1964）]C600r-m-菌株（ATCC33525）上繁殖的λ噬菌体的镀层效应鉴定限制缺陷突变的存在。λ噬菌体是根据常规方法从大肠杆菌K12λ溶源细菌ATCC10798制备的。显示和WA802一样镀层效应的一个菌株被看作是具有限制缺陷突变的转连体。
（2）克隆谷氨酸棒杆菌的DDPS基因（da    PA）：
用大肠杆菌Coli.的宿主载体系统来克隆该基因。用作载体的PBR322质粒是日本Ta    Kara    Shuzo公司制造的，市场上可买到。用作给体DNA的染色体DNA是从谷氨酸棒杆菌ATCC13032根据本发明人以前揭示的程序分离出的。[见日本公开未审查专利申请No126789/83，例1第（1）]
向含4μg PBR322 DNA和8μg谷氨酸棒杆菌染色体DNA的120μl反应液（内含10mMTris-HCl，7mMMg Cl，100mMNaCl，PH7.5）中加12个单位内切酶Sal（日本Ta Kara Shuzo公司产品）。放置37℃下反应60分钟，然后在65℃下加热10分钟中止反应。向得到的酶解产物加入30μl T4连接酶缓冲液（内含660mM Tris-HCl，66mMMg Cl2，100mM二硫苏糖醇，PH7.6），30μl 5mMATP，0.3个单位的T连接酶（日本Ta Kara Shuzo公司产品）及120μl水。在12℃下反应16小时。
用连接反应混液转化大肠杆菌Coli K12的TM103亚株。TM103的感受细胞是根据Dagert等人的方法制备的[Dagert，M.等人在“基 因”6期23页（1979年）]，将TM103菌株置于50ml补充有50μg/ml二氨基庚二酸的L培养基中，37℃下温育直至660纳米光吸收值达0.5（用日本东京Koden光度计测定）。培养液在冰水中冷却10分钟，然后离心收集细胞，再将其悬在20ml 0.1M冷氯化钙溶液中，将悬液保存在0℃下20分钟。离心收集细胞，再重悬在0.5ml 0.1M氯化钙溶液中，将悬液再放置0℃下18小时。向400μl中加入200μl如上制备的连接反应混液。将混液放置0℃下10分钟，再在37℃下加热5分钟。再加入9ml含50μg/ml二氨基庚二酸的L培养基，将混液在37℃下摇动培养2小时。用生理盐水离心洗涤培养细胞两次，然后将其涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的M9基本琼脂培养平皿上，37℃培养4天。将得到的具氨苄青霉素抗性又不需二氨基庚二酸的转化体在含50μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基平皿（L培养基含1.5%琼脂）上分离单菌落。
根据An等人的方法[见An，G.等人在“细菌杂志”J.Bacteriol.，140期400页（1979）的文章]从纯化转化体培养细胞分离质粒DNA。用内切酶酶解质粒DNA，然后用琼脂糖凝胶电泳分析发现，质粒DNA的结构是：在PBR322唯一的SalⅠ切点上插入4.2千对碱基的SalⅠDNA片段。该质粒命名为pcD1。
用pcD1转化大肠杆菌Coli K12的亚株，DDPS缺陷突变菌株AT998和THPS缺陷型突变菌株AT997，AT998和AT997菌株（大肠杆菌Coli K12AT997，FERM BP-719）的转化与TM103菌株的转化方式相同。从这两个需要二氨基庚二酸菌株没有得到具氨基苄青霉素抗性的转化体。该事实说明谷氨酸棒杆菌DDPS基因（da PA）和THPS基因（da PC）都在克隆到pcD1上的4.2千对碱基的SalⅠDNA片段上。
用在克隆步骤中的宿主微生物TM103菌株具有的限制缺陷突变只是被用来增加克隆的频率，不具这个突变的菌株也可用作宿主微生物。
（3）制备质粒PAC2：
用穿梭载体质粒PFC18（具壮观霉素抗性和四环素抗性）再克隆从谷氨酸棒杆菌衍生的含da    PA和da    PC的4.2千对碱基的SalⅠDNA片段。根据下列程序制备PFC18。
根据本发明人以前揭示的程序[见日本公开未审查专利申请No134500/82，例1（1）]从含pcG11（ATCC39022）的一个菌株分离出pcG11。为此所用的PBR322质粒是市场上可买到的日本Ta    Kara    Shuzo公司的产品。
在含4μg pcG11质粒DNA和4μg PBR322质粒DNA的120μl反应液中（内含20mM Tris-HCl，PH7.5，10mMMg Cl250mM（NH4）SO4和0.01%牛血清清蛋白）加入8个单位的限制酶PstⅠ（日本Ta Kara Shuzo公司产品），将混液于37℃反应60分钟。再在65℃下反应10分钟，然后中止反应。再加30μl T连接酶缓冲液，30μl，5mM的ATP，0.3个单位的T连接酶和120μl的水。将混液放置12℃下，16小时。根据例1（2）的程序，用连接反应产物转化大肠杆菌Coli K12的亚菌株WA802。从含100μg/ml壮观霉素和25μg/ml四环素的L琼脂培养平皿上繁殖的每个转化体分离出单个菌落，并在同样的琼脂培养基上培养，再根据An等人的方法从纯化菌株的培养细胞中分离质粒DNA。用限制内切酶解及琼脂糖凝胶电泳法研究质粒DNA的结构，发现PBR322插入pcG11唯一的PstⅠ切点（图1）。命名该质粒为PFC18。
根据下列程序，用PFC18为载体，制备含从谷氨酸棒杆菌得到的dap    A和dap    C的一个重组质粒。
在120μl含PFC18和PCD1质粒DNA各4μg的反应液中加入8个单位的限制酶SalⅠ，将混液在37℃下反应60分钟。再在65℃下加热10分钟，中止反应。然后加30μlT连接酶缓冲液，30μl5mM的ATP，0.3个单位T连接酶和120μl的水。将得到混液于12℃下反应16小 时。
用连接产物转化大肠杆菌Coli    TM103菌株。转化是根据例1（2）的程序进行的。在含100μg/ml壮观霉素的M9基本琼脂培养平皿上选择转化体。根据An等人的方法从得到的一个具壮观霉素抗性又不需要二氨基庚二酸的转化体中分离质粒DNA。用限制酶解和琼脂糖凝胶电泳研究分离出的质粒DNA的结构。发现该质粒的结构是从pcD1得来的4.2千对碱基的SalⅠDNA片段插入到PEC18质粒的单一SalⅠ切点中。该质粒命名为PAC2。
因PAC2转化AT998和AT997证明具壮观霉素抗性的转化体都同时需要二氨基庚二酸。
（4）将PAC2引入到谷氨酸棒杆菌RH6菌株。
用PAC2转化谷氨酸棒杆菌RH6菌株（需要高丝氨酸）。
将0.1ml的RH6菌株种子培养液接种到10ml SSM培养基（将10g葡萄糖，4gNH4Cl，2g尿素，1g酵母萃取物，1gKH2PO4，3g K2HPO4，0.4g的Mg Cl2·6H2O，10mg的FeSO4·7H2O，0.2mg的Mn SO4，4-6H2O，0.9mg的Zn SO4·7H2O，0.4mg的Cu SO4·5H2O，0.09mg的Na2B4O7·10H2O，0.04毫克的（NH4）6MO7O24·4H2O，30μg的生物素和1mg盐酸硫胺素溶解在1升水中，将PH调至7.2），该培养基还含50μg/ml高丝氨酸，在30℃下摇动培养。当OD值达0.15时，加入青霉素G，使其浓度达0.5单位/ml。继续培养，当OD达约0.6时，收集培养细胞，将其重悬在2ml的RCGP培养基[将5g葡萄糖，5g的酪蛋白氨基酸，2.5g的酵母萃取物，3.5g的K2HPO4，1.5g的KH2PO4，0.41g的Mg Cl2·6H2O，10mg的Fe SO4·7H2O，2mg的Mn SO4·4-6H2O，0.9mg的Zn SO4·7H2O，0.04mg的（NH4）MO7O24·4H2O，30μg的生物素，2mg的盐酸硫胺素，135g的琥珀酸二钠和30g的聚乙烯吡咯烷酮（分子量为10，000）溶在1升水中，PH调至7.2J，其 中还含1mg/ml溶菌酶，将悬液在30℃轻微摇动温育14小时，得到原生质体。
将1ml原生质体液以2.500xg离心15分钟以沉淀之，将沉淀的原生质体重悬在1ml的TSMC缓冲液中（含10mMMg Cl2，30mMCa Cl2，50mMTris-HCl PH7.5和400mM蔗糖），再离心洗涤之。然后将原生质体重悬在0.1ml的TSMC缓冲溶液中。加入悬液20μl上面分离出的PAC质粒DNA，再加入0.8ml含20%/W/V）聚乙二醇（PEG分子量6，000）的TSMC缓冲液。3分钟后，将2ml的RCGP培养基加入混液，以2，500xg离心5分钟，沉淀原生质体。将其重悬在1ml的RCGP培养液，在30℃下轻微摇动培养2小时。然后将0.1ml原生质体悬液涂散在含400μg/ml的RCGP琼脂培养基（含1.4%琼脂），在30℃下培养6天。从根据本发明人揭示的程序得到的一种具壮观霉素抗性的转化体萃取质粒DNA[见日本公开未审查专利申请No134500/82，例1（1）]。根据限制酶解和琼脂凝胶电泳分析发现，分离出的质粒具有与pAC2同样的结构。根据与前述同样的转化试验还发现。该质粒与PAC2一样可使AT998和AT997菌株恢复需要二氨基庚二酸。并证实，被PAC2转化的菌株是棒状杆菌谷氨酸棒杆菌RH6/PAC。
（5）用含PAC2的菌株生产L-赖氨酸。
以下列方式用谷氨酸棒杆菌RH6/PAC2菌株和不含该质粒的母本菌株RH6生产L-赖氨酸。
将RH6/PAC2菌株和RH6菌株分别在3ml的NB培养基中（将20g的bouillon肉汤料和5g的酵母萃取物悬在1升水中，调PH至7.2（30℃下摇动培养16小时。然后用0.5ml培养的肉汤接种在5ml的L1生产培养基[将100g葡糖，30g的（NH4）2SO4，0.5g的KH2PO4，0.5g的K2HPO4，1g的Mg SO4·7H2O，10mg的Fe SO4·7H2O，10mg的Mn SO4·4-6H2O，100μg的生物素，200mg的高丝氨酸和30g的碳酸钙溶在1升水中，PH调至7.2]，在30℃下摇动培养72小时。培养后， 根据酸式铜茚三酮法用比色计定量测定培养液过滤物中产生的L-赖氨酸[见Chinard，F.D.在“生化杂志”199期，91页（1952年）]。结果示在表1。说明含谷氨酸棒杆菌的dap A-dap C的重组质粒PAC2可加强RH6菌株的L-赖氨酸产率。
表1
谷氨酸棒杆菌RH6及其引入质粒PAC2的菌株产生的L-赖氨酸：
L-赖氨酸（mg/ml）
棒杆菌RH614.8
杆菌RH6/PAC220.0

Claims (1)

1、一种利用遗传工程生产L-赖氨酸的微生物学方法，它包括以下步骤：
i)通过将从谷氨酸棒杆菌微生物中分离出的一个DNA片段插入到一质粒载体中而构建出一种重组DNA，所说的DNA片段含有编码二氢二吡啶羧酸合成酶的基因，其两端有 Sal切割位点，分子中有一个 BamHI切割位点和两个 PVu切割位点，分子大小约为4.2Kb；
ii)用该重组DNA转化谷氨酸棒杆菌微生物；
iii)在培养基中培养该转化体；
iv)在培养基中积累L-赖氨酸；
v)从其中回收L-赖氨酸。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018040469A1 (zh) 2016-09-01 2018-03-08 宁夏伊品生物科技股份有限公司 发酵生产l-赖氨酸的棒杆菌

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2602792B1 (fr) * 1986-08-05 1989-10-20 Transgene Sa Procede de stabilisation d'un plasmide contenu dans une souche bacterienne et souche obtenue
DE3737729A1 (de) * 1987-11-06 1989-05-18 Degussa Pendelvektor pz1, rekombinantes, ein aspartasegen enthaltendes plasmid, seine verwendung zur herstellung von aminosaeuren der aspartat-familie aus fumarat-haltigem naehrmedium und es enthaltende mikroorganismen
DE3823451C2 (de) * 1988-07-11 1997-02-20 Forschungszentrum Juelich Gmbh Rekombinante DNA, damit transformierte Mikrooganismen und Verwendung dieser Mikroorganismen zur Herstellung von L-Lysin mit Hilfe dieser Mikroorganismen
DE3908201A1 (de) * 1989-03-14 1990-09-27 Degussa Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin
DE3943117A1 (de) * 1989-12-27 1991-07-04 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna
JP2876739B2 (ja) * 1990-08-03 1999-03-31 味の素株式会社 発酵法によるｌ―リジンの製造法
JP3078312B2 (ja) * 1990-11-22 2000-08-21 協和醗酵工業株式会社 物質の製造法
JP2000262288A (ja) * 1999-03-16 2000-09-26 Ajinomoto Co Inc コリネ型細菌の温度感受性プラスミド
DE19912384A1 (de) * 1999-03-19 2000-09-21 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE19924365A1 (de) 1999-05-27 2000-11-30 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren und für das accDA Gen codierende Nukleotidsequenzen
US6797509B1 (en) 1999-07-09 2004-09-28 Degussa-Huls Ag Nucleotide sequences which code for the tal gene
DE19943587A1 (de) 1999-09-11 2001-03-15 Degussa Neue für das dapF-Gen codierende Nukleotidsequenzen
DE19947791A1 (de) * 1999-10-05 2001-04-12 Degussa Neue für das eno-Gen codierende Nukleotidsequenzen
US7132272B2 (en) 1999-10-05 2006-11-07 Degussa Ag Nucleotide sequence encoding corynebacterium glutamicum leucine response regulatory protein
US6713289B2 (en) 1999-10-05 2004-03-30 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the eno gene
DE19947792A1 (de) * 1999-10-05 2001-04-12 Degussa Neue für das Irp Gen codierende Nukleotidsequenzen
US6897055B2 (en) 1999-11-25 2005-05-24 Degussa Ag Nucleotide sequences coding for the genes sucC and sucD
DE19956686A1 (de) * 1999-11-25 2001-05-31 Degussa Neue für die Gene sucC und sucD codierende Nukleotidsequenzen
DE19958160A1 (de) 1999-12-02 2001-06-07 Degussa Neue für das gpm-Gen codierende Nukleotidsequenzen
DE19958159A1 (de) 1999-12-02 2001-06-07 Degussa Neue für das glk-Gen codierende Nukleotidsequenzen
US6927046B1 (en) * 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
DE10001101A1 (de) * 2000-01-13 2001-07-19 Degussa Neue für das ptsH-Gen codierende Nukleotidsequenzen
US6818432B2 (en) 2000-01-13 2004-11-16 Degussa Ag Nucleotide sequences encoding the ptsH gene
DE10014546A1 (de) * 2000-03-23 2001-09-27 Degussa Für das dapC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
US20020081673A1 (en) * 2000-06-02 2002-06-27 Bettina Mockel Novel nucleotide sequences coding for the glbO gene
DE10210527A1 (de) 2002-03-09 2003-09-18 Degussa Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien
BRPI0510746A (pt) 2004-06-10 2007-11-20 Univ Michigan State sìntese de caprolactama a partir de lisina
RU2416636C2 (ru) 2004-12-06 2011-04-20 Сейдж Байосайенсиз Инк. Способ выращивания продуцирующей лизин грамположительной бактерии для доставки биологически активных соединений жвачным животным, кормовая добавка (варианты) и способ кормления жвачных животных
DE102005013676A1 (de) 2005-03-24 2006-09-28 Degussa Ag Allele des zwf-Gens aus coryneformen Bakterien
US20070092951A1 (en) 2005-03-24 2007-04-26 Degussa Ag Alleles of the zwf gene from coryneform bacteria
DE102005043979A1 (de) 2005-09-15 2007-03-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Produktion von Aminosäuren in aminosäureproduzierenden Mikroorganismen
DE102006032634A1 (de) 2006-07-13 2008-01-17 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
DE102007005072A1 (de) 2007-02-01 2008-08-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cadaverin
BRPI0804506A2 (pt) * 2007-02-20 2011-08-30 Univ Michigan State processos para preparar caprolactama ou um derivado da mesma e ácido pipecolìnico, caprolactama ou um derivado da mesma, e, ácido pipecolìnico ou um derivado do mesmo
DE102008001874A1 (de) 2008-05-20 2009-11-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
JP2011529087A (ja) * 2008-07-24 2011-12-01 ドラス コーポレイション 環状アミドモノマーを作製する方法、ならびに関連する誘導体および方法
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
WO2017100376A2 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Zymergen, Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US10544411B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a glucose permease library and uses thereof
EP3478833A4 (en) 2016-06-30 2019-10-02 Zymergen, Inc. METHODS OF GENERATING A BACTERIAL HEMOGLOBIN LIBRARY AND USES THEREOF
EP3635117A2 (en) 2017-06-07 2020-04-15 Zymergen, Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum and uses thereof in regulating ancillary gene expression
EP3467099A1 (en) 2017-10-05 2019-04-10 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
RU2019128538A (ru) 2018-09-26 2021-03-11 Эвоник Оперейшенс ГмбХ Способ ферментативного получения l-лизина
WO2023222510A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222505A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222515A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56160997A (en) * 1980-05-16 1981-12-11 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-lysine by fermenaition method
JPS58126789A (ja) * 1981-12-29 1983-07-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd レースレオニンの製造法
JPS58179497A (ja) * 1982-04-10 1983-10-20 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ−ヒスチジンの製造法
DE3484378D1 (de) * 1983-02-17 1991-05-08 Kyowa Hakko Kogyo Kk Herstellungsverfahren fuer l-histidin.
US4601983A (en) * 1983-06-15 1986-07-22 Ajinomoto Co., Inc. Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-threonine and L-isoleucine
US4861722A (en) * 1983-08-24 1989-08-29 Ajinomoto Company, Inc. Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-lysine

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018040469A1 (zh) 2016-09-01 2018-03-08 宁夏伊品生物科技股份有限公司 发酵生产l-赖氨酸的棒杆菌
US11242545B2 (en) 2016-09-01 2022-02-08 Ningxia Eppen Biotech Co., Ltd Corynebacterium for producing L-lysine by fermentation

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Publication number Publication date
JPS61209597A (ja) 1986-09-17
DE3677399D1 (de) 1991-03-14
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