CN101757054A - 黄蜀葵花有效部位——总黄酮提取物的制备工艺及新用途 - Google Patents

Abstract

本发明是一种黄蜀葵花有效部位——总黄酮提取物的制备工艺及其药物新用途，具体是在制备治疗更年期综合症药物、治疗老年痴呆药物、治疗抑郁症药物中的用途。

Description

黄蜀葵花有效部位——总黄酮提取物的制备工艺及新用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其是指一种黄蜀葵花有效部位——总黄酮提取物的药物新用途，具体是在制备治疗更年期综合症药物、老年痴呆及抑郁症药物中的用途。

背景技术

更年期综合征(神经衰弱)、老年痴呆、抑郁症，均是与中枢神经有关的常见疾病，现代病理机制研究表明，上述三种疾病，均与脑部缺血有关，尤其是脑缺血引起的脑卒中后抑郁及脑缺血性痴呆(又称血管性痴呆)，占到抑郁症及痴呆症的绝大多数，成为当今社会主要疾病之一。随着多种应激因素的加剧，如生活节奏加快，人口老龄化，社会竞争加剧等，上述疾病的发病率也随之逐年增加。目前尚缺乏特殊的病因治疗措施，预防老年痴呆的关键是保持血管及大脑功能。在临床上多采用改善认知功能和促进脑部代谢的药物，如氨酯醒、Y氨酷酸等，以及钙离子拮抗剂：西比灵、尼莫地平等，严重者可给于少量神经阻滞剂或抗焦虑或抗抑郁药物，但副反应较大。

鉴于上述西药制剂的毒副作用和单一靶点的不足，目前从中药中提取分离单一有效成分或有效部位的研究越来越深入。中药材在我国资源丰富，是一个大有可为的领域。

黄蜀葵花为锦葵科植物黄蜀葵Abelmoschus manihot(L.)Medic.的干燥花冠(带雄蕊及花柱)，收载于《江苏省中药材标准》(1989年版)增补本、《山东省中药材标准》2002年版。具有清利湿热，消炎解毒之功效，是我国传统的药用植物，入药历史可追溯至1500年前晋朝葛洪所著的《肘后方》，记载其“通淋，消肿，解毒。治淋病，痈疽肿毒，汤火烫伤。”在民间有较多的应用，用以治疗疔疮、腮腺炎、尿道感染、肺热咳嗽及烧烫伤等。现代化学成分研究资料表明，黄蜀葵花的主要成分为黄酮类化合物，在药理实验研究方面，有文献报道黄蜀葵花的黄酮类成分具有抗炎解热，抗疱疹病毒，治疗口腔粘膜溃疡、保护心肌缺血、心脑缺氧性损伤、治疗肾病综合症等药理作用。上述黄蜀葵花黄酮成分对心脑缺血缺氧的保护作用提示，黄蜀葵花黄酮成分在抑郁、更年期综合症及老年痴呆(尤其是血管性痴呆)等方面可能具有潜在的作用。近年来又有文献报道，从黄蜀葵花中提取分离的金丝桃苷和槲皮素等均有增加脑血流量，阻断脑缺血后脑细胞Ca²⁺内流，抗自由基和抑制NO生成等药理作用。深入的研究表明，金丝桃苷能调控HPA轴的功能，使ACTH和皮质酮水平下降，从而发挥抗抑郁的作用。

上述研究提示黄蜀葵花作为一种传统中药，有望在心脑血管及中枢神经系统疾病领域，取得新的应用突破。鉴于金丝桃苷的抗抑郁作用确切，而黄蜀葵花总黄酮提取物含有十余种结构类似的黄酮成分，其中金丝桃苷含量占10％以上，总黄酮含量高达50％以上，成分更加全面，由此推测黄蜀葵花总黄酮提取物可能具有相同或更佳的抗抑郁作用。但目前尚未有以黄蜀葵花总黄酮治疗更年期综合症、治疗老年痴呆、治疗抑郁症的相关药理或临床的文献报道。

因此，为了发掘黄蜀葵花总黄酮的新用途，我们进行了初步的药理预试研究，采用开场实验法和小鼠强迫游泳法观察其对小鼠活动行为的影响，结果表明，黄蜀葵花总黄酮对“行为绝望”动物模型有明显抗抑郁作用，作用强度高于单一成分金丝桃苷；进一步对大鼠血管性脑痴呆模型的治疗作用结果表明，黄蜀葵花总黄酮对血管性痴呆治疗有效。从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄蜀葵花有效部位——总黄酮提取物的药物新用途，具体是用作制备治更年期综合症、治疗老年痴呆、治疗抑郁症药物中的用途。

本发明所指的黄蜀葵花有效部位——总黄酮提取物特指中国发明专利200410035741.X所提取得到的黄蜀葵花总黄酮提取物，本发明严格遵守上述专利中的制备方法，为了确证质量，我们用高效液相和紫外—分光光度法控制提取物中主要有效成分金丝桃苷和总黄酮含量。

本发明的另一个目的是提供一种治疗更年期综合症、治疗老年痴呆、治疗抑郁症的药物组合物，含有治疗有效量的黄蜀葵花总黄酮提取物和药用载体。所述药物组合物，还可以含有有效治疗剂量的黄蜀葵花总黄酮提取物和其他具有改善脑缺血、改善中枢神经功能作用的药物。

上述药物组合物可以采用制剂学的常规方法制备成各种剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等。

建议临床患者使用黄蜀葵花总黄酮提取物的剂量为250～500mg/次，一日三次。

对中枢神经系统的影响的研究，经动物实验，结果显示，本发明提取物对动物的精神活动有一定的影响，能增强小鼠的探索行为，对调节神经功能具有良好的效果。

为更好的理解本发明的实质，下面具体说明黄蜀葵花总黄酮有效部位在制药领域中的新用途。

具体实施方式

实施例1黄蜀葵花有效部位——总黄酮提取物的制备

将黄蜀葵花加80％乙醇适量，提取1次，提取2小时，合并提取液，滤过，滤液浓缩成60℃时相对密度为1.13～1.16的浓缩液，加适量水水沉24h，抽滤，浓缩至相应体积，通过大孔吸附树脂柱，采用醇水梯度洗脱，水洗脱3个柱体积，10％及30％乙醇各洗脱3个柱体积，70％乙醇洗脱1个柱体积。洗脱液浓缩、干燥、粉碎后得到黄蜀葵花总黄酮提取物，其总黄酮含量为65％。

实施例2黄蜀葵花总黄酮有效部位胶囊的制备

取黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物250g，硬脂酸镁50g，过80目筛充分混匀，干法制粒，灌装胶囊1000粒，每粒含黄蜀葵花总黄酮有效部位250mg。用法：每次2粒，每日三次。

实施例3黄蜀葵花总黄酮有效部位片剂的制备

取黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物250g，微晶纤维素45g，混匀，乙醇湿法制粒，过20目筛。加入硬脂酸镁5g，混匀，压制成片重为0.3g/片的片剂1000片，每片含黄蜀葵花总黄酮有效部位250mg。用法：每次2片，每日三次。实施例4黄蜀葵花总黄酮有效部位颗粒剂的制备

取黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物250g，糊精150g，过80目筛充分混匀，乙醇湿法制粒，包装成每袋4g的颗粒剂1000袋，每袋含黄蜀葵花总黄酮有效部位250mg。用法：每次1～2袋，每日三次。

实施例5药效学实验

(一)抗抑郁试验

1、动物：昆明种小鼠，雄性，22～26g，分笼饲养，明暗周期12h/12h，室温20～23℃，自由饮水和取食。实验均在上午8:00～12:00进行，每只动物只用1次。

2、实验方法：

(1)采用开场实验法：木箱40cm×40cm×27cm，底面划分25方格，记录动物5min内由底面中心开始走动的穿越格数。

(2)小鼠强迫游泳法：水缸高20cm，直径14cm，水深10cm，水温25℃，将小鼠放入水中6min，记录后4min内累计不动时间。所谓不动是指小鼠在水中停止挣扎，或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面。

3、结果

(1)黄蜀葵花总黄酮提取物与金丝桃苷对小鼠自主活动的影响：

小鼠50只，随机分5组，每组10只。实验前30min，阳性对照组皮下注射10mg/kg地西帕明，空白对照组和给药组分别灌胃蒸馏水或黄蜀葵花总黄酮提取物0.5、1.0g/kg，金丝桃苷0.01g/kg，结果见表1。

表1不同样品对小鼠自发活动的影响

结果表明，黄蜀葵花总黄酮提取物各剂量组及金丝桃苷组均明显减少小鼠自主活动(P＜0.01)。

(2)对小鼠强迫游泳实验的影响：

小鼠50只，随机分5组，每组10只。实验前30min，阳性对照组皮下注射10mg/kg地西帕明，空白对照组和给药组分别灌胃蒸馏水或黄蜀葵花总黄酮提取物0.5、1.0g/kg，金丝桃苷0.01g/kg，，结果见表2。

表2不同样品对小鼠强迫游泳实验的影响

^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明，黄蜀葵花总黄酮提取物各剂量组均明显缩短小鼠强迫游泳不动时间，大剂量组与金丝桃苷组比较，具有明显的缩短趋势。

强迫游泳实验是经典的抗抑郁剂评价模型，本实验结果表明，黄蜀葵花总黄酮提取物(0.5～1g/kg)和地西帕明类似，均能明显对抗“行为绝望”模型小鼠的绝望行为，使不动时间缩短。在开场实验中，黄蜀葵花总黄酮提取物能显著减少小鼠自发活动，故可排除其假阳性结果的可能性，说明黄蜀葵花总黄酮提取物对“行为绝望”动物模型有明显抗抑郁作用。

(二)对血管痴呆模型的观察

1材料与方法

1.1动物：健康清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体重200～250g

1.2药物：

黄蜀葵花总黄酮提取物，实验时用双蒸水配成浓度为0.05g/ml的混悬液。喜德镇为阳性对照药物，1mg/片。将药片碾碎溶于双蒸水经超声细胞粉碎机制成浓度为0.0625mg/ml的混悬液。药物配制后置4℃水箱保存备用，用前摇匀。

1.3血管性痴呆大鼠模型的建立

线栓采用直径为0.237mm的尼龙鱼线，头端覆以指甲油，距头端2cm处作标记，以10％水合氯醛(0.35ml/100g体重)腹腔注射麻醉大鼠后，将其腹卧位固定于手术板上，以络合碘消毒颈部皮肤。行颈部右侧切口，于胸骨舌骨肌与胸骨甲状肌间分离出右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎CCA近心端与ECA，用微动脉夹夹闭ICA远心端后，于CCA分叉处下端迅速作一切口，从切口处插入线栓。线插入ICA后，于入口处稍稍结扎尼龙线与入口出CCA段，然后松开夹闭ICA的动脉夹，继续插入尼龙线至稍有阻力后略回撤，至线插入深度为18～20mm左右，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。再次结扎入口处，尼龙线外留约3cm，缝合皮肤。2h后轻轻提拉所留线头至有阻力，实现大脑中动脉再灌，则造模完成。假手术组只结扎ECA与ICA。

1.4动物分组及给药

将40只大鼠完全随机分为4组(随机数字表法)：假手术组(10只)、模型组(10只)、中药组(10只)和西药组(10只)。中药组给予黄蜀葵花总黄酮提取物灌胃0.5g/kg，西药组给予喜德镇灌胃0.625mg/kg，假手术组和模型组给予等体积蒸馏水1ml/100g灌胃。术后第1天即用药，灌胃1次/d，连续给药28d后，进行行为学测试，然后取脑测定相应指标。

1.5行为学测试

跳台实验跳台装置自制为一25cm×20cm×75cm大小的被动回避反应箱，箱底铺直径为1mm铜栅，通360V交流电，箱壁由黑色塑料板围成，铜栅的一角固定8cm×8cm×5cm大小的塑料泡沫块作为动物回避电击反应的安全区。先将大鼠放入箱中自由活动3min，熟悉环境，然后接通铜栅电源，大鼠受到电击，其正常反应是跳回泡沫块以躲避伤害性刺激，多数大鼠可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击(双足同时接触铜栅)又跳回安全区，如此训练5min，并记录每只大鼠首次找到安全区所需的时间(反应时间)和5min内受到的电击次数(错误次数)，作为学习测试成绩。24h后重复上述试验，记录每只大鼠第一次跳下安全区的时间(潜伏期)和错误次数，作为记忆测试成绩。

1.6形态学观察

各组随机取4只大鼠，麻醉方法同前，腹卧位固定于手术板上。打开胸腔，暴露心脏，将灌注穿刺针自心尖部穿入左心室至升主动脉根部。予生理盐水冲洗及4％多聚甲醛心脏灌注固定，取右侧脑组织置4℃固定液后固定约6～8h。组织经蔗糖溶液脱水，于20℃在LEICA CM1800型恒冷箱切片机中冠状连续切片，片厚15μm，取海马和齿状回互包平面，每隔6张取1张，行冰冻切片HE染色，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜下观察海马形态学变化。

1.7统计学方法

计量资料数据以±s表示，应用SPSS11.0统计软件，组间比较应用单因素方分析，各实验组间的两两比较采用q检验，以P＜0.05认为有统计学意义。方差齐性检验以a＝0.10为检验水准。

2结果

2.1一般情况

造模后，手术组大鼠早期出现明显的神经行为功能缺陷症状，表现为右侧肢体无力，瘫痪，向右侧转圈，倾倒，甚至不能行走。假手术组大鼠神经行为功能正常。随着时间延长，模型组大鼠表现为活动减少，皮毛不光泽，神经行为功能缺陷症状有所减轻；黄蜀葵花总黄酮提取物组和喜德镇组大鼠行动灵活，体重增加，皮毛润泽，神经行为功能缺陷症状明显减轻。

2.2跳台实验

跳台实验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠表现为反应时间延长，潜伏期缩短，错误次数增加，提示模型组大鼠存在着明显的学习记忆障碍；与模型组比较，黄蜀葵花总黄酮提取物和喜德镇两治疗组均能明显缩短大鼠反应时间，延长潜伏期，减少错误次数，改善VD大鼠学习记忆能力，且中西药组相比无显著性差异。结果见表3。

表3各组大鼠跳台实验的学习记忆成绩比较

与假手术组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.3形态学观察

光镜下假手术组大鼠海马锥体细胞排列整齐，紧密，层次丰富，形态正常，无变性，无胶质细胞增生，锥体细胞核大而圆，呈均匀淡蓝色或蓝色，核仁清晰，细胞质丰富。模型组大鼠海马锥体细胞排列稀疏紊乱，细胞脱失明显，尤以CA1区显著，甚至仅见少量残存的不规则细胞；细胞核体积变小，深染，呈核固缩，或细胞核仅呈很淡的蓝色甚至蓝色消失。中、西药两治疗组大鼠海马神经元脱失现象较轻，CA1区锥体细胞排列较模型组整齐，形态较正常，接近假手术组。

3.结论及分析：

(1)血管性痴呆的发生与脑血管疾病密切相关。大脑中动脉区是人群脑卒中的多发部位，大脑中动脉闭塞(MCAO)模型是目前研究缺血性脑卒中的经典动物模型。痴呆主要表现为智能衰退，智能通常包括抽象思维能力、理解力、判断力、学习记忆、适应社会环境的能力等，其中学习记忆是智力的最基本要素，且易于测定分析，故目前常把学习记忆成绩作为评价智能的一个主要指标。本研究中跳台试验成绩显示，模型组大鼠较假手术组大鼠在学习记忆测试中表现为反应时间延长(P＜0.05)，潜伏期缩短(P＜0.05)，错误次数增加(P＜0.05)，存在着明显的学习记忆障碍，进一步证实了大脑中动脉闭塞模型作为VD动物模型的可靠性。

(2)实验结果提示黄蜀葵花总黄酮对VD模型大鼠有治疗作用，但对其改善学习记忆能力的机制值得进一步探讨。

实施例6黄蜀葵花总黄酮胶囊治疗更年期综合症48例临床观察(一)病例选择

96例患者均为门诊病例，随机分为治疗组48例，年龄40～59岁，病程小于1年28例，1～5年，病情评分6～26分，平均(17.6±5.3)分。对照组48例，年龄41～58岁，平均(8.2±3.5)岁，病程小于1年者26例，1～5年者14例，病情评分6～24分，平均(17.4±5.4)分。两组在年龄、病情、病程等方面无显著性差异(P＜0.05)，具有可比性。

(二)诊断标准

参照《中药新药临床研究指导原则》(第三辑)女性更年期综合症诊断标准拟定。(1)年龄在40～60岁之间；(2)症状除月经失调外，具有烘热汗出，潮热面红，头晕耳鸣，手足心热、烦躁易怒，心悸失眠，情志异常，记忆力减退，血压波动等；(3)血清E2水平下降，FSH、LH水平升高。

(三)治疗方法

1、治疗组药物：黄蜀葵花总黄酮胶囊，每次500mg，一日3次。

2、对照组：选用更年康片，每次4片，每天3次，温水送服。两组均以2个月为1疗程，治疗期间停用其他药物。

(四)治疗结果：

疗效结果见表4、5。

表4两组临床疗效比较

表5治疗前后FSH、LH及E2比较(x±s)

结果表明，治疗组总有效率93.75％，对照组总有效率89.58％，差异有显著性意义(P＜0.05)。治疗组治疗后E2水平明显增加，与治疗前比较有显著性差异(P＜0.05)；与对照组治疗后比较有显著性差异(p＜0.05)。两组FSH和LH均未见明显变化(P＜0.05)。

(五)结论

本临床研究表明，黄蜀葵花总黄酮胶囊能明显缓解更年期妇女失眠多梦、潮热多汗、腰酸背痛、记忆力减退等症状，并能改善卵巢内分泌功能，使血中E2水平明显增高，且副作用小，值得临床推广使用。

Claims (4)

1.一种黄蜀葵花有效部位——总黄酮提取物，其特征在于该有效部位由下述方法制得：取黄蜀葵花药材，加50～90％乙醇回流提取，提取液浓缩，水沉24h，抽滤，滤液通过大孔吸附树脂柱，采用醇水梯度洗脱，洗脱液浓缩、干燥，得到黄蜀葵花有效部位——总黄酮提取物。

2.如权利要求1所述的黄蜀葵花有效部位，在制备治疗更年期综合症药物中的用途。

3.如权利要求1所述的黄蜀葵花有效部位，在制备治疗老年痴呆药物中的用途。

4.如权利要求1所述的黄蜀葵花有效部位，在制备治疗抑郁症药物中的用途。