CN101730735B

CN101730735B - 啤酒中的阿糖基木寡糖

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Publication number: CN101730735B
Application number: CN2008800048380A
Authority: CN
Inventors: G·阿尔茨; W·布鲁克特; C·库尔坦; J·德尔库
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 2007-02-14
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2028-02-14
Also published as: CN101730735A; JP2010517592A; JP5268948B2; AU2008215111B2; RU2444565C2; WO2008098320A1; AU2008215111A8; RU2009134162A; EP2118257A1; MX2009008698A; US20100040731A1; AU2008215111A1; ZA200905879B; GB0702844D0

Abstract

本发明涉及提高啤酒中可溶性阿糖基木寡糖水平的方法，以便改善这种啤酒的口味和/或口感。

Description

啤酒中的阿糖基木寡糖

发明领域

本发明涉及提高啤酒中可溶性阿糖基木寡糖(arabinoxylo-oligosaccharide)水平的方法，以便改善这种啤酒的口味和/或口感。此外，本发明涉及富含可溶性阿糖基木寡糖的啤酒。

发明背景

由于啤酒中乙醇和可消化碳水化合物，尤其是麦芽糊精、麦芽糖和葡萄糖的含量相对较高因此富含卡路里。淀粉不完全降解成麦芽糖和葡萄糖和/或麦芽糖和葡萄糖不完全发酵成乙醇导致啤酒中存在可消化碳水化合物。无论是通过降低乙醇含量和/或可消化碳水化合物的含量，降低啤酒的卡路里含量通常导致口味和/或口感受损，这是大多数消费者不愿意接受的。在制造低卡路里啤酒和低乙醇啤酒时遇到的挑战是找到降低可消化碳水化合物水平和维持足以接受的口味和/或口感(这通常归功于这些碳水化合物)之间的平衡。本领域需要找到一种以相对适中的制造成本以及，如果可能的话，不显著改变标准酿造过程的解决该问题的方法。

本发明基于以下发现，即可溶性低分子量阿糖基木聚糖的浓度升高超过它们在啤酒中的天然浓度能增强所述啤酒的口味和/或口感。表1给出了不同市售啤酒中可溶性阿糖基木聚糖含量的概况，显示大多数啤酒含有限量的可溶性阿糖基木聚糖，通常低于约2.0g/l。此外，所述低分子量可溶性阿糖基木聚糖的浓度随啤酒类型改变。Schwarz和Han在1995年采用一种测定啤酒中阿糖基木聚糖含量的非验证方法已经发现了可溶性阿糖基木聚糖随啤酒类型有类似程度的改变。

发明概述

本发明基于以下发现，即可溶性阿糖基木聚糖，主要是低分子量阿糖基木寡糖的浓度决定了啤酒，尤其是下层发酵啤酒的口味和/或口感。此外，还发现通过将所述啤酒中平均聚合度低于50的阿糖基木寡糖(以后称为AXOS，结构示于EP-1.418.819-B1的图1)的浓度提高到高于特定水平能改善啤酒的口味和/或口感。AXOS通常作为β-1，4-木糖-主链的聚合度(下文称为DP)和β-1，4-木糖-主链被阿拉伯糖单元的取代程度(DS)相互不同的相关寡糖的非均匀混合物存在。AXOS的木糖或阿拉伯糖单元也可被残基取代，如被4-O-甲基葡糖醛酸、乙酸、阿魏酸或p-香豆酸取代。AXOS可通过部分水解，如采用酸或木聚糖内切酶的部分水解，由阿糖基木聚糖产生。阿糖基木聚糖，也称为戊聚糖(由于它由戊糖型单糖木糖和阿拉伯糖构成)，具有与AXOS相同的组成，但多糖链更长，DP通常为5,000或更高。阿糖基木聚糖和AXOS是不可消化的碳水化合物。完整的大麦或小麦颗粒(制造啤酒的传统原料)尤其富含阿糖基木聚糖，可含有多达6-10％的这种多糖。在传统啤酒酿造过程中，大部分阿糖基木聚糖未从谷粒中提取出来并在澄清(lautering)后留在废弃的谷粒残渣中。已知可溶性阿糖基木聚糖在啤酒酿造中会造成各种严重问题，包括降低麦芽汁分离率、降低麦芽提取物回收率、缩短滤器寿命、以及降低啤酒滤出率。

本发明涉及一种使啤酒中可溶性阿糖基木寡糖的含量提高至少约5％，优选至少20％，更优选至少30％，最优选至少40％，例如至少50％的方法，例如在啤酒制造期间通过外部加入的酶使谷物中的阿糖基木聚糖降解或者通过给麦芽汁或啤酒补充外部制造的阿糖基木寡糖。在本发明的一个实施方式中，在啤酒制造期间使用的外部加入的酶是木聚糖内切酶。在本发明的另一个实施方式中，所述外部制造的阿糖基木寡糖衍生自诸如植物材料等天然来源，更优选来自谷物。本发明所述阿糖基木寡糖水平提高的啤酒具有改善的口味和口感。

附图简述

图1显示了在其中添加了2g/l或10g/l AXOS的市售啤酒(Bud Light)的感官分析结果。柱表示平均评分，误差棒表示标准差。根据弗里德曼ANOVA检验，p＜0.05时不同字母表示的柱相互之间显著不同。

图2显示了从相同麦芽汁酿造的两种实验啤酒在AXOS富集前后的感官分析结果。柱表示平均评分，误差棒表示标准差。根据威尔科克森符号秩次检验，p＜0.05时用星号表示的柱与对应值显著不同。

发明详述

对不同市售啤酒中可溶性阿糖基木聚糖含量的分析显示，大多数啤酒含有限量的可溶性阿糖基木聚糖，通常低于约2.0g/l。如下表1所示，所述可溶性阿糖基木聚糖的浓度随啤酒类型改变，然而，基于它们可溶性阿糖基木聚糖含量，目前的市售啤酒可分成两组。

第一组包括通常通过下层发酵低比重麦芽汁或稀释的麦芽汁，或者通过稀释下层发酵麦芽汁制得的啤酒，其含有低于0.75g可溶性阿糖基木聚糖/升。在所述第一组中可区分出两种不同啤酒类型：

(i)含有低于3.5％(v/v)乙醇，优选低于1.5％(v/v)的啤酒，通常称为低乙醇啤酒或“无乙醇”啤酒；这种啤酒类型的麦芽糊精含量可能非常高，通常至少30g/升

(ii)含有高于3.5％(v/v)乙醇但含有低于3g实际提取物/100ml，优选低于2.5g/100ml的啤酒，通常称为低卡路里啤酒或“轻”啤酒；通常，这种啤酒类型的麦芽糊精含量低于约15g/升。

第二组包括乙醇含量高于3.5％(v/v)并含有高于约3g实际提取物/100ml的啤酒。该第二组中包含的啤酒通常含有约0.7至约2.0g可溶性阿糖基木聚糖/升，且所述组内中可区分出两种主要啤酒类型：

(i)通过下层发酵制造的储藏啤酒，如比尔森(Pilsner)型啤酒。这些啤酒中的大多数含有3.5-6％(v/v)乙醇以及3.0-5.0g实际提取物/100ml。然而，含有高于6％(v/v)乙醇和/或高于5.0g实际提取物/100ml的储藏啤酒也有出售。

(iii)含有高于3.5％(v/v)乙醇和高于3.0g实际提取物/100ml的上层发酵啤酒。它们可含有最高达约12.0％(v/v)乙醇和/或最高达9.0g实际提取物/100ml。

本发明基于以下发现，即啤酒中可溶性阿糖基木聚糖的浓度提高至少约5％能增强所述啤酒的口味和/或口感。因此，在本发明的第一个目的中，提供了一种改善啤酒口味和/或口感的方法，该方法通过提高可溶性阿糖基木聚糖的浓度，使其超过本领域目前已知常规酿造过程所得浓度至少约5％，例如至少约30％，如至少40％或至少50％，最高达约150％或更高。当可溶性阿糖基木聚糖的平均聚合度(DP)低于50时，麦芽汁或啤酒中这种可溶性阿糖基木聚糖水平的提高不会对酿造过程产生负面影响。此外，对富含这种DP低于50的可溶性阿糖基木聚糖的啤酒进行的感官分析未揭示觉察到啤酒的粘度有任何不需要的提高。因此，本发明提供了使啤酒富含平均DP低于50，优选DP介于3和40，更优选介于3和30，例如介于5和20之间的可溶性阿糖基木聚糖。

在第一个实施方式中，本发明涉及一种改善下层发酵所得啤酒的口味和/或口感的方法，这种啤酒含有的乙醇水平低于3.5％(v/v)或实际提取物低于3.0g/100ml，所述方法通过使所述啤酒富含如上文所述的可溶性阿糖基木聚糖，从而导致每升啤酒中平均DP低于50的可溶性阿糖基木聚糖的浓度高于1.2g/升，优选介于3和40g/升之间，更优选介于3和30g/升之间，例如介于5和20g/升啤酒之间，例如高于1.4g/升，优选高于1.6g/升，更优选高于1.8g/升，最优选高于2.0g/升，如例如高于3.0g/升或者甚至高于4.0g/升，且最高达约20g/升。在本发明的一个实施方式中，所述啤酒是所谓的低乙醇或“无乙醇”啤酒，其含有低于3.5％(v/v)乙醇，优选低于1.5％(v/v)乙醇，更优选低于1.0％(v/v)乙醇。在本发明的另一个优选实施方式中，所述啤酒是所谓的低卡路里或“轻”啤酒，其含有低于3.0g实际提取物/100ml，更优选低于2.0g/100ml。

在本发明的第二个实施方式中，涉及一种改善乙醇水平介于3.5和6％(v/v)之间且实际提取物介于约3.0和5.0g/100ml之间的啤酒口味和/或口感的方法，包括用上述方式使所述啤酒富含可溶性阿糖基木聚糖，从而导致平均DP低于50的可溶性阿糖基木聚糖的浓度高于约2.0g/升，优选介于3和40g/升之间，更优选介于3和30g/升之间，例如介于5和20g/升啤酒之间，例如高于2.5g/升，优选高于3.0g/升，更优选高于3.5g/升，最优选高于4.0g/升，例如高于4.5g/升或者高于5.0或6.0g/升，且最高达约25g/升。在本发明的一个实施方式中，所述啤酒是采用本领域熟知的下层发酵法制造的。优选地，用上述方式使这种通过下层发酵获得的啤酒富含可溶性阿糖基木聚糖，从而导致平均DP低于50的可溶性阿糖基木聚糖的浓度高于约2.0g/升，优选介于3和40g/升之间，更优选介于3和30g/升之间，例如介于5和20g/升啤酒之间，例如高于2.5g/升，优选高于3.0g/升，更优选高于3.5g/升，最优选高于4.0g/升，如例如高于4.5g/升或者高于5.0或6.0g/升，且最高达约25g/升。

在本发明的另一个实施方式中，所述啤酒是采用本领域熟知的上层发酵过程制造的。优选地，用上述方式使这种通过上层发酵获得的啤酒富含可溶性阿糖基木聚糖，从而导致平均DP低于50的可溶性阿糖基木聚糖的浓度高于约2.0g/升，优选介于3和40g/升之间，更优选介于3和30g/升之间，例如介于5和20g/升啤酒之间，例如高于2.5g/升，优选高于3.0g/升，更优选高于3.5g/升，最优选高于4.0g/升，如例如高于4.5g/升或者高于5.0或6.0g/升，且最高达约25g/升。在一个具体实施方式中，使这种通过上层发酵获得的啤酒富含所述可溶性阿糖基木聚糖，从而导致所述可溶性阿糖基木聚糖的浓度为高于约7.0g/升，更优选高于8.0g/升和最高达约25g/升。

在本发明的再一个实施方式中，涉及一种改善乙醇水平高于6％(v/v)和实际提取物高于5.0g/100ml的啤酒的口味和/或口感的方法，包括用上述方式使所述啤酒富含可溶性阿糖基木聚糖，从而导致平均DP低于50的可溶性阿糖基木聚糖的浓度高于2.4g/升，优选介于3和40g/升之间，更优选介于3和30g/升，例如介于5和20g/升啤酒之间，优选高于3.0g/升，更优选高于4.0g/升，如例如高于5.0g/升或高于6.0g/升，且最高达约30g/升。在一个优选实施方式中，所述啤酒是采用本领域熟知的下层发酵过程制造的。在另一个优选实施方式中，所述啤酒是采用本领域熟知的上层发酵过程制造的。

啤酒样品的可溶性阿糖基木聚糖浓度优选如下测定。啤酒样品首先通过超声10分钟除去碳酸，然后通过标准纸膜过滤。将2.5ml所述除去碳酸的啤酒样品与2.5ml 4.0M三氟乙酸(终浓度2.0M)混合并在110℃培育60分钟。水解之后将混合物过滤，取3.0ml滤液加入1.0ml内标溶液(100mg β-D-阿洛糖，溶于100ml 50％饱和苯甲酸溶液)、1.0ml氨溶液(25％v/v)和3滴2-辛醇作进一步处理。加入200μl硼氢化钠溶液(200mg硼氢化钠溶于1.0ml 2M氨水)并将样品在40℃培育30分钟以将单糖还原成糖醇。加入400μl冰醋酸终止反应。为进行乙酰化反应，将500μl含有糖醇的样品加入5.0ml乙酸酐和500μl 1-甲基-咪唑中。10分钟后在样品中加入900μl乙醇以除去过量乙酸酐。然后加入水(10ml)和氢氧化钾溶液(2次，5.0ml 7.5M溶液，间隔数分钟)将糖醇乙酸酯浓缩于有机相。加入溴酚蓝溶液(500μl，0.04％w/v)作为水相指示剂。在装配有火焰离子化检测器的色谱仪(例如安捷伦(Agilent)6890系列，美国特拉华州惠明顿(Wilmington，DE，USA))上通过在合适的极性柱(例如，Supelco SP-2380柱，30m X 0.32mm I.D.；0.2μm膜厚度，美国宾西法尼亚州贝拉法特休科公司(Supelco，Bellefonte，PA，USA))上进行气相色谱来分离含上述糖醇乙酸酯的1μl有机相等份样品。出于校准目的，用各组样品平行处理纯化的单糖D-木糖、L-阿拉伯糖和任选的D-半乳糖。

出于本发明的目的，啤酒样品中可溶性阿糖基木聚糖的含量优选采用以下公式计算：

可溶性阿糖基木聚糖含量＝0.88×(％阿拉伯糖+％木糖)(1)。

然而，本领域技术人员将了解，在现有技术中，阿糖基木聚糖含量有时是采用下述公式用阿拉伯半乳聚糖含量的修正值计算的：

可溶性阿糖基木聚糖含量_corr＝0.88×(％阿拉伯糖-0.7×％半乳糖+％木糖)(2)。

可采用，即加入含有可溶性阿糖基木聚糖的制品作为酿造过程的一种成分使啤酒中具有所需DP的可溶性阿糖基木聚糖富集至少5％，优选至少20％，更优选至少30％，最优选至少40％，例如至少50％。优选含有所述阿糖基木聚糖的制品衍生自谷物，如例如小麦、黑麦、大麦、燕麦、黑小麦、大米、小米、高粱或玉米，并且所述制品可含有高于约15％(w/w)的平均DP低于50、优选DP介于3和40之间、更优选介于3和30之间、例如介于5和20之间的阿糖基木聚糖，所述制品中这种可溶性阿糖基木聚糖的含量优选高于30％(w/w)，更优选高于40％(w/w)，例如高于50％。在合适的实施方式中，本发明方法包括在啤酒酿造过程的调制麦芽浆(mashing)、麦芽汁煮沸、麦芽汁冷却、发酵或发酵后步骤中的任何一个步骤期间加入含所述可溶性阿糖基木聚糖的制品作为附加物或添加物。如果含所述可溶性阿糖基木聚糖的制品被用作在制造低乙醇或低卡路里啤酒时提供本发明口味和/或口感成分的添加物，则所有制品不含显著的或高水平的可发酵或可代谢的碳水化合物较为有利。

或者，使啤酒中具有所需DP的可溶性阿糖基木聚糖富集至少5％，优选至少20％，更优选至少30％，最优选至少40％，例如至少50％可在酿造过程中采用含有单一木聚糖内切酶或不同类型木聚糖内切酶的组合的木聚糖内切酶制品来实现。优选地，对所述木聚糖内切酶或木聚糖内切酶的组合进行选择，例如，以促进含阿糖基木聚糖的酿造成分如发芽的谷粒、未发芽的谷粒或谷粒衍生成分中水可提取的和水不可提取的阿糖基木聚糖溶解。优选地，添加给定量的木聚糖内切酶制品应导致麦芽汁中可溶性阿糖基木聚糖的含量比未添加任何木聚糖内切酶制得的麦芽汁高30％，更优选40％，例如50％。根据本发明，为使啤酒富含可溶性阿糖基木聚糖，给定浓度的木聚糖内切酶或木聚糖内切酶组合的适用性可如下测定：

在45℃制备含每升水含200g谷粉的麦芽浆，所述谷粉可包括，例如100％大麦麦芽或者80％大麦麦芽和20％小麦麦芽；

加入给定浓度的所述木聚糖内切酶制品；

将麦芽浆在45℃培育2小时；

以1℃分钟的速率将麦芽浆加热至70℃并将麦芽浆在70℃维持60分钟；

过滤澄清麦芽汁，然后将液体组分煮沸30分钟；

将煮沸的麦芽汁以10,000g离心15分钟除去悬浮颗粒后获得进行可溶性阿糖基木聚糖分析的样品；

测定所述麦芽汁样品中的可溶性阿糖基木聚糖，并将所述样品的可溶性阿糖基木聚糖含量与按照上述制备但未加入任何木聚糖内切酶的对照麦芽汁样品的可溶性阿糖基木聚糖含量进行比较。当含木聚糖内切酶或木聚糖内切酶组合的样品中可溶性阿糖基木聚糖的浓度比对照样品高出25％以上，更优选高30％以上，最优选高40％以上，例如高50％以上时可以断定，测试浓度的木聚糖内切酶或木聚糖内切酶组合适合根据本发明使啤酒富含可溶性阿糖基木聚糖。

一种或多种木聚糖内切酶优选在调制麦芽浆期间加入，然而，在酿造过程的任何其他步骤中，如麦芽汁煮沸、麦芽汁冷却、发酵和发酵后加入木聚糖内切酶也是有利的。如果在酿造过程中使用一种以上的木聚糖内切酶，则不同类型的木聚糖内切酶可同时加入，或者可在酿造过程的不同步骤中加入各种类型的木聚糖内切酶。由于为提高啤酒中可溶性阿糖基木聚糖的总浓度，使发芽谷粒中所含水不可提取的阿糖基木聚糖溶解尤其重要，所以在酿造过程的调制麦芽浆步骤中加入至少一种能够方便水不可提取的阿糖基木聚糖溶解的木聚糖内切酶，如糖苷水解酶家族11-木聚糖内切酶是有利的。此外，发现由于谷物中存在的木聚糖内切酶抑制剂，所以一些木聚糖内切酶，包括家族11木聚糖内切酶不能有效地溶解相关量的阿糖基木聚糖。因此，优选一种或多种加入的木聚糖内切酶比较不容易被谷物中通常存在的木聚糖内切酶抑制剂类型所抑制。

此外，当所述一种或多种木聚糖内切酶中的至少一种木聚糖内切酶在调制麦芽浆步骤和澄清步骤期间采用的完整温度范围内保持活性时，发芽谷粒中所含阿糖基木聚糖的水解和/或溶解通常被增强，所述温度通常从约40℃至约80℃，优选介于45℃和78℃之间，例如介于60℃和72℃之间。此外，所述一种或多种木聚糖内切酶中的至少一种木聚糖内切酶在72℃时显示出的酶活性不低于所述酶在谷物基麦芽浆中最佳温度范围时酶活性的20％是有利的。

在本发明的具体实施方式中，适合溶解水不可提取的阿糖基木聚糖的木聚糖内切酶的加入或使用可与含相关量水不可提取的阿糖基木聚糖，如种壳、种麸或麦麸-衍生材料组合加入酿造成分。例如，所述种壳、麦麸或麦麸-衍生材料可作为谷粒如小麦、黑麦、大麦、燕麦、黑小麦、大米、小米、高粱或玉米的研磨成分获得。谷粉中的麦麸或麦麸-衍生材料与发芽或未发芽谷粒的重量比优选高于约1∶30，更优选高于约1∶20，例如高于约1∶15。在本发明的该实施方式中，发芽谷粒中所含阿糖基木聚糖溶解和片段化和加入含阿糖基木聚糖的材料导致啤酒富含可溶性阿糖基木聚糖。

本发明所述的使啤酒富含可溶性阿糖基木聚糖的过程也可通过使用除木聚糖内切酶活性外具有选自下组的一种或多种额外酶活性的酶混合物来实现：α-L-阿拉伯呋喃糖酶(从阿糖基木聚糖上切下阿拉伯糖侧链)、甲基葡糖醛酸糖苷酶(除去其甲基葡糖醛酸侧链)、阿魏酸酯酶(水解阿魏酸和阿糖基木聚糖之间的酯键)、β-葡聚糖酶(水解可能与阿糖基木聚糖相连的β-葡聚糖)和纤维素酶(水解可能与阿糖基木聚糖相连的纤维素)。

一般已知黑麦和黑麦麦芽包含相对高含量的阿糖基木聚糖。因此，可考虑组合使用用于制造本发明所述啤酒的木聚糖内切酶和包含黑麦或黑麦麦芽的谷粉。然而，观察到使用黑麦或黑麦麦芽会在下游酿造步骤如澄清和过滤中造成问题，尤其是与本发明的木聚糖内切酶制品组合使用时。因此，优选按照本发明制备的啤酒谷粉不含或仅含有限量的黑麦、黑麦麦芽或黑麦-衍生的谷粉，例如低于25％，更优选低于15％如低于10％。

本发明的第二个目的是提供按照本发明获得的啤酒。

相比使用包括菊糖、乳糖、乳果糖、棉子糖、水苏糖、阿拉伯半乳聚糖、抗性淀粉(resistant starch)、异麦芽糖和塔格糖在内的其他碳水化合物，本发明方法的一个显著优点在于，聚合度低于50的可溶性阿糖基木聚糖(AXOS)在许多(如果不是所有的话)啤酒中已经以可检测水平天然存在。这意味着本发明方法不会引入常规啤酒中不含的化合物，但仅是增加其含量指导获得独特口感和/或口味效果。由于AXOS已经存在于啤酒中并且可从小麦或大麦(即通常用于制造啤酒的成分)中提取，因此本发明方法满足大多数(如果不是所有)国家对于啤酒酿造的所有原则性要求，并且尤其符合德国“纯净法(purity law)”。

与使用XOS作为啤酒添加物相比，本发明方法的另一个优点在于，AXOS相比XOS不甜，因此能更好地适合啤酒的口味要求。已证实XOS的甜度为蔗糖的约30％，而AXOS低于蔗糖甜度的10％。此外，XOS价格非常昂贵，因此难以用于大体积产品如啤酒中，而AXOS可通过添加合适的酶或作为非常便宜的产品如麦麸提取物或作为工业淀粉/谷蛋白分离的副产物加入产品，从而在酿造期间原地制造。

与提高啤酒中不可消化的碳水化合物含量的已知方法相比，本发明方法的另一个优点是，所需酿造过程没有显著改变，仅是在调制麦芽浆、煮沸、冷却、发酵和/或发酵后步骤中加入了一种或多种合适的木聚糖内切酶，或者仅是加入了合适剂量的富含AXOS的成分。此外，与本领域已知的某些方法相比，本发明方法不会必然提高可消化碳水化合物含量。

在本发明中，术语“啤酒”是指用谷粒，优选大麦、小麦、黑小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、小米或大米以及研磨的谷物或者这种谷粒的芽制造任何发酵饮料，制造时添加或未添加芳香植物如酒花、芫荽、杜松、月桂、迷迭香、姜、薄荷、干草、洋蓍草、茴香或柑橘的部分或提取物，并且添加或未添加果实或果实提取物。术语啤酒在文中的含义包括，但不限于：淡色啤酒、烈性麦芽酒、中等麦芽酒、苦麦芽酒、英国黄啤酒、酸麦芽酒、烈性啤酒、烈黑啤酒、窖藏啤酒、麦芽酒、大麦酒、发泡酒(happoushu)、烈性黑啤酒、杜特勃克啤酒(doppelbock)、科隆啤酒(

beer)、德国棕色啤酒(Münchenerbeer)、多特蒙德啤酒、杜丝多佛阿特啤酒(Düsseldorfer alt beer)、比尔森啤酒、玛森啤酒(

beer)、德国韦森啤酒(German weizenbier)、柏林啤酒(Berlinerweisse)、塞森啤酒(Saisons beer)、修道院啤酒(abbey beer)、泰皮斯特啤酒(Trappist beer)、古泽啤酒(gueuze)、兰比克啤酒(lambic beer)、果味啤酒(fruitbeer)、比利时白啤酒、高乙醇啤酒、低乙醇啤酒、无乙醇啤酒、低卡路里啤酒、淡味啤酒等等。

根据啤酒类型，啤酒酿造步骤在一定程度上可能有所不同，但通常由以下主要步骤构成：

“发芽”涉及将谷粒浸泡在水中使其发芽。在发芽期间会产生几种类型的酶，包括催化淀粉转变成简单的可发酵糖的酶。发芽的谷粒然后被干燥和烘焙(该过程称为“窑烧”)以杀死萌芽以及为谷粒提供经过焙烧的谷粒味道和色泽。用这种方式处理的谷粒被称为发芽谷粒或简称为“麦芽”。研磨麦芽以使谷粒破碎和除去萌芽，这样可使发芽谷粒的内容物在调制麦芽浆和煮沸期间更好地接触水。

“调制麦芽浆”涉及将含或不含附加物的谷粉(即研磨过的发芽谷粒)与水一起研磨以获得所谓的“麦芽浆”。附加物是除了研磨的发芽谷粒之外被加入谷粉中的富含碳水化合物的成分。将麦芽浆加热至麦芽酶或外源酶的最佳酶活性温度。调制麦芽浆通常在约45℃至约75℃进行。在调制麦芽浆期间，复杂碳水化合物(主要是淀粉)酶断裂产生寡糖、二糖和单糖。这种简单糖形成发酵期间微生物的碳源和能源。

“澄清”涉及将麦芽浆分离成称为“麦芽汁”的液体提取物和称为“酒糟”的不溶性物质。澄清通常在约78℃时进行。

“麦芽汁煮沸”涉及在水沸腾温度下加热麦芽汁。煮沸的关键目的是：(i)杀死微生物以消除与发酵微生物的竞争，(ii)使蛋白质或可能造成啤酒混浊的其他固体凝结和沉淀，和(iii)除去和化学修饰在麦芽汁煮沸之前或期间加入的草本或草本提取物中的苦味、芳香和调味化合物。

“冷却和接种”涉及将煮沸的麦芽汁冷却至发酵微生物的最佳温度。这些发酵微生物，例如啤酒酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))被故意加入麦芽汁(称为“投掷(pitching)”)或通过自发接种加入。

“发酵”涉及培育接种有发酵微生物的麦芽汁。在发酵期间，简单糖被这些微生物转变成二氧化碳、乙醇和许多其他副产物。

“发酵后处理”是从主发酵后直到制造和包装完成的啤酒的步骤。根据啤酒类型和使用的方法，这种发酵后处理可涉及以下一步或多步：对啤酒进行调理以进一步产生所需味道和香味和/或降低不需要味道和香味的水平；可将啤酒过滤以除去残余的酵母和其他造成混浊的物质；可用吸附剂处理啤酒以除去特定化合物，如亲水性蛋白质或多酚；可再对啤酒进行发酵(添加或不添加额外碳源)；可加入草本或草本提取物；可加入水果或水果提取物；可在啤酒中充碳酸气以增加啤酒的泡沫；可对啤酒进行巴氏灭菌或微过滤以增强微生物稳定性；以及可将啤酒包装，如装瓶、装罐或装桶。

术语“实际提取物”在本发明内容中被定义为将啤酒的液体和气体成分(水、乙醇、溶解气体)蒸发后获得的每100毫升啤酒中干物质克数。

在本发明内容中，术语“木聚糖内切酶”指能够水解含木糖的多糖中连接木糖残基的糖基键的酶。木聚糖内切酶可衍生自各种生物体，包括植物、真菌(如曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、双孢霉属(Disporotrichum)、脉孢菌属(Neurospora)、镰刀霉(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma))或细菌种类(如杆菌属(Bacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)、链霉属(Streptomyces)、诺卡土壤菌属(Nocardiopsis)、嗜热丝孢菌(Thermomyces))。适用于本发明的市售的纯化或部分纯化的木聚糖内切酶制品包括，但不限于：Shearzyme^TM(诺佛酶制品公司(Novozymes))、Biofeed Wheat^TM(诺佛酶制品公司)、Pentopan^TM Mono(诺佛酶制品公司)、Pulpzyme^TM(诺佛酶制品公司)、Ecopulp^TM(AB酶制品公司(AB Enzymes))、Veron^TM191(AB酶制品公司)、Veron^TM Special(AB酶制品公司)、Multifect^TM木聚糖酶(吉尼科公司(Genencor)/戴尼斯科公司(Danisco))、Multifect^TM 720(吉尼科公司/戴尼斯科公司)、Spezyme^TM CP(吉尼科公司/戴尼斯科公司)、Grindamyl^TM H640(戴尼斯科公司)、和Grindamyl^TM Powerbake^TM(戴尼斯科公司)。

术语“非抑制性木聚糖内切酶”指在存在蛋白质性木聚糖内切酶抑制剂(其浓度为原始比重范围为约7-25g/100ml的常规谷物基麦芽浆中的典型浓度)时培育1小时后酶活性被抑制20％以下的木聚糖内切酶。适用于本发明的市售的非抑制性木聚糖内切酶的非限制性例子是Grindamyl^TM Powerbake^TM(戴尼斯科公司)。这种属于家族11木聚糖内切酶的被较少抑制的酶的其他例子披露于WO2001066711。

术语“耐热性木聚糖内切酶”指在72℃培育1小时后，与最佳温度下原始比重范围为约7-25g/100ml的常规谷物基麦芽浆中发生的情况相比，酶活性降低少于80％的酶。适用于本发明的市售的耐热性木聚糖内切酶的非限制性例子是Ecopulp^TM TX200A(AB酶制品公司)。

术语“耐热性非抑制性木聚糖内切酶”指结合了非抑制性木聚糖内切酶和耐热性木聚糖内切酶的特性的木聚糖内切酶。这种耐热性非抑制性木聚糖内切酶家族11木聚糖内切酶的例子描述于WO200302923。

术语“口感”用来描述啤酒的碳酸化程度、丰满度和后味，其中的这些描述词被用来描绘负责在口腔表面产生特征性触觉感受的质地属性。

术语“麦麸”在本发明内容中表示衍生自谷粒的种子衍生的研磨部分，与对应的完整种子相比，它富含任一或所有选自下组的组织：糊粉、果皮、种皮、萼片和花瓣。

如果需要对制造方法进行质控，本发明可包括在酿造过程的一个或多个步骤上对啤酒中AXOS的浓度进行测量和/或分析。所述方法包括本发明实施例1中描述的分析技术。

将通过下述非限制性实施方式进一步阐述本发明。

实施例1：不同啤酒类型的AXOS含量

分析技术.已经采用不同分析技术来充分表征市售啤酒。

啤酒样品的乙醇含量是通过近红外光谱测定的(Alcolyzer Plus，安东帕公司(Anton Paar)，格拉茨，奥地利)，表观提取物的溶液密度用摆动U形管密度计测量(Alcolyzer Plus，安东帕公司)，实际提取物和原始提取物(originalextract)(原始麦芽汁比重)根据测得的乙醇和密度计算，都按照Analytica EBC(1998)中列出的标准方法进行。

用基于Courtin等2000(Journal of ChromatographyA，866，97-104)的方法测量啤酒中的总糖和还原糖含量。首先将啤酒样品超声10分钟以除去碳酸，然后通过标准纸膜过滤。为测定AXOS和麦芽糊精含量，将2.5ml啤酒与2.5ml4.0M三氟乙酸(终浓度2.0M)混合并在110℃培育60分钟。水解之后将混合物过滤，取3.0ml滤液加入1.0ml内标溶液(100mg β-D-阿洛糖，溶于100ml 50％饱和苯甲酸溶液)、1.0ml氨溶液(25％v/v)和3滴2-辛醇作进一步处理。加入200μl硼氢化钠溶液(200mg硼氢化钠溶于1.0ml 2M氨水)并将样品在40℃培育30分钟以将单糖还原成糖醇。加入400μl冰醋酸终止反应。为进行乙酰化反应，将500μl含有糖醇的样品加入5.0ml乙酸酐和500μl1-甲基-咪唑中。10分钟后在样品中加入900μl乙醇以除去过量乙酸酐。然后加入水(10ml)和氢氧化钾溶液(2次，5.0ml 7.5M溶液，间隔数分钟)将糖醇乙酸酯浓缩于有机相。加入溴酚蓝溶液(500μl，0.04％w/v)作为水相指示剂。在装配有自动进样器、分流器注射口(分流比1∶20)和火焰离子化检测器的安捷伦色谱仪(安捷伦6890系列，美国特拉华州惠明顿)上通过在Supelco SP-2380极性柱(30m X 0.32mmI.D.；0.2μm膜厚度)(美国宾西法尼亚州贝拉法特休科公司)上进行气相色谱来分离含上述糖醇乙酸酯的1μl有机相等份样品。出于校准目的，用各组样品平行处理纯化的单糖D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖和L-阿拉伯糖。

为测定啤酒中AXOS的平均DP，在2.5ml啤酒中加入500μl内标(100mgβ-D-阿洛糖，溶于100ml 50％饱和苯甲酸溶液)、50μl氨溶液(25％v/v)和9滴2-辛醇。加入200μl硼氢化钠溶液(200mg硼氢化钠溶于1.0ml 2M氨水)并将样品在40℃培育30分钟以将糖还原成糖醇。加入400μl冰醋酸终止反应。在2.5ml含还原糖的等份样品中加入500μl三氟乙酸(99％)并将样品在110℃培育60分钟以进行水解。水解之后如上所述进行乙酰化和气相色谱分析。出于校准目的，用各组样品平行处理纯化的单糖D-木糖、D-葡萄糖和L-阿拉伯糖。

啤酒样品的AXOS，以后也称为可溶性阿糖基木聚糖的含量(C-AXOS)是用公式(1)计算的。用阿拉伯半乳聚糖含量修正的AXOS含量(AXOS_cor)是用公式(2)计算的。AXOS的阿拉伯糖与木糖之比(A/XAXOS)是用公式(3)计算的。用阿拉伯半乳聚糖含量修正的AXOS的阿拉伯糖与木糖之比(A/X_corAXOS)是用公式(4)计算的。AXOS的平均聚合度(avDP)(avDPAXOS)，以后也称为可溶性阿糖基木聚糖的平均聚合度，是用公式(5)计算的。AXOS木聚糖主链的平均聚合度(avDP木聚糖)是用公式(6)计算的。麦芽糊精浓度是用公式(7)计算的。

(1)C-AXOS＝0.88×(％阿拉伯糖+％木糖)

(2)C-AXOS_cor＝0.88×(％阿拉伯糖-0.7×％半乳糖+％木糖)

(3)A/X AXOS＝％阿拉伯糖/％木糖。

(4)A/X_corAXOS＝(％阿拉伯糖-0.7×％半乳糖)/％木糖。

(5)avDP AXOS＝(％阿拉伯糖-0.7×％半乳糖+％木糖)/％还原端木糖

(6)avDP木聚糖＝％木糖/％还原端木糖

(7)麦芽糊精＝0.9×(％葡萄糖)

公式(2)、(4)和(5)中减去％半乳糖表示对啤酒或麦芽汁中阿拉伯半乳聚糖含量的修正(Van den Bulck等2005)。应注意的是，在公式(6)中，avDP专门应用于AXOS的β-1，4-D-吡喃木糖基主链，不考虑阿拉伯糖侧链。

收集了一系列代表各种不同啤酒类型的市售啤酒，其中包括无乙醇啤酒、比尔森型啤酒、美国淡味啤酒、淡色啤酒、酸麦芽酒、比利时白啤酒、德国韦森啤酒(小麦啤酒)、金色烈性麦芽酒(其中包括比利时啤酒、修道院啤酒和曲培啤酒(tripel))、黑色烈性麦芽酒、以及古泽啤酒和兰比克啤酒。分析每种啤酒的乙醇含量、实际提取物、原始提取物(原始麦芽汁比重)、麦芽糊精含量、阿糖基木寡糖(AXOS)含量、以及平均阿拉伯糖/木糖比(A/X)和AXOS的平均聚合度(avDP)，结果示于表1。

美国淡味啤酒的AXOS含量最低，其AXOS含量介于0.58g/l(“NaturalLight”)和0.68g/l(“Bud Light”)之间。烈性麦芽酒的AXOS含量最高，其范围介于1.44g/l(“Westmalle Tripel”)和2.14g/l(“Kasteelbier bruin”)之间。通常，AXOS含量和原始提取物之间有良好的相关性，这点并不奇怪，因为较高的麦芽汁比重将导致包括阿糖基木聚糖在内的碳水化合物溶解得更多。

啤酒中AXOS的平均聚合度(avDP AXOS)范围从金色烈性麦芽酒“TripelKarmeliet”的8到德国韦森啤酒“Paulaner Hefe-Weissbier”的25。AXOS的平均聚合度和啤酒的实际或原始提取物水平之间不存在已知的相关性。发现低平均聚合度表明来自谷物的内源木聚糖内切酶在麦芽制造期间和/或调制麦芽浆期间具有活性。AXOS的平均A/X比在0.66到0.80的相对狭窄范围内波动(对阿拉伯半乳聚糖修正后介于0.55和0.67之间)。

Schwarz和Han(1995)之前采用测定啤酒中阿糖基木聚糖含量的非验证方法已经观察到可溶性阿糖基木聚糖含量随啤酒类型的类似变化程度。然而，Schwarz和Han报道的值系统性高于本研究测得的可溶性阿糖基木聚糖水平。这种差异可能是由于Schwarz和Han的研究(1995)过高估计了阿糖基木聚糖水平。例如，Schwarz和Han的研究(1995)报道小麦麦芽的阿糖基木聚糖含量为12.6％，而通常情况下小麦的阿糖基木聚糖含量为6-7％(Egi等，2004，MBAATQ卷41(3))，且预计麦芽制造过程不会对小麦的总阿糖基木聚糖含量造成显著影响。

实施例2-用木聚糖内切酶提高啤酒的AXOS

材料.Grindamyl

H640是一种购自戴尼斯科公司(哥本哈根，丹麦)的食品级木聚糖内切酶制品，它是通过在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中表达枯草芽孢杆菌糖苷水解酶家族(GHF)11木聚糖内切酶基因制造的。GrindamylH190是一种购自戴尼斯科公司(哥本哈根，丹麦)的食品级木聚糖内切酶制品，由黑曲霉(Aspergillus niger)制造。Grindamyl

Powerbake

是一种购自戴尼斯科公司(哥本哈根，丹麦)的食品级木聚糖内切酶制品，它是通过在枯草芽孢杆菌中表达枯草芽孢杆菌GHF 11木聚糖内切酶基因非抑制性变体制造的。Ecopulp

TX200A(ECOP)是一种购自AB酶制品公司(达姆施塔特，德国)的工业级木聚糖内切酶制品，通过重组表达木霉(Trichoderma longibrachiatum)GHF11木聚糖内切酶基因制造。Shearzyme

500L是一种购自诺佛酶制品公司(Bagsvaerd，丹麦)的食品级木聚糖内切酶制品，通过在米曲霉(Aspergillusoryzae)中重组表达米曲霉GHF10木聚糖内切酶基因制造。小麦木聚糖内切酶抑制剂TAXI I按照文献的描述纯化(Gebruers等2001，Biochem.J.353：239-244)。大麦麦芽和小麦获自比利时嘉吉公司(Cargill，Herent，Belgium)，小麦麦麸是获自比利时MB公司(Mills & Bakery，Deinze，Belgium)的Dossche，黑麦麦麸获自比利时MG公司(Molens Goethals，Ghent，Belgium)。

分析方法.为计算平行实验中不同麦芽汁或啤酒制品的AXOS含量，用平行测得的所有实验样品的平均甘露糖浓度除以各个实验样品的甘露糖浓度得到的因子对碳水化合物提取效率作数据标准化。

测量木聚糖分解酶(xylanolytic enzyme)活性.如麦格酶制品公司数据表9/95(Megazyme Data Sheet 9/95)所述，用可可碱醋酸钠交联的阿糖基木聚糖(Xylazyme AX片，爱尔兰麦格酶制品公司(Megazyme，Bray，Ireland))作为不可溶底物，用25mM乙酸钠(pH 4.7)作为缓冲液并在40℃培育10分钟，通过比色法测定木聚糖内切酶的酶活性。一个单位被定义为在测试条件下590nm的消光系数(extinction)改变1.0所需的酶量。

在第一个实验中，检测了不同类型的木聚糖内切酶、底物和培育条件以寻找导致调制麦芽浆处理期间麦芽汁中AXOS水平升高的条件。当AXOS是在调制麦芽浆期间产生时，它们将出现在最终的啤酒产品中，这是因为AXOS对热非常稳定不会在煮沸期间被破坏，并且因为它们不会被用作酿酒酵母的碳源，原因是这种微生物甚至不含编码木聚糖内切酶或阿拉伯呋喃糖苷酶的基因。Grindamyl Powerbake(一种来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的糖苷水解酶家族11木聚糖内切酶)被工程构造成能降低来自谷物的木聚糖内切酶抑制剂如TAXI和相关蛋白质对木聚糖内切酶活性的抑制作用。麦芽浆由200g/l比尔森型大麦麦芽构成，另一种麦芽浆由140g/l比尔森型大麦麦芽和60g/l小麦麦麸的混合物构成。将麦芽浆悬浮于45℃的水中并在开始加工时加入酶。首先将麦芽浆在45℃培育90分钟或150分钟，然后以1℃/分钟升至70℃，并保持70℃60分钟。通过过滤澄清之后将麦芽汁煮沸60分钟。冷却后将麦芽汁在-20℃冷冻直至进行碳水化合物分析。进行碳水化合物分析之前，将麦芽汁离心(10,000g，15分钟，18℃)以除去颗粒物质。

如表2所示，以20单位/升或100单位/升的酶活性加入的非抑制性酶Grindamyl Powerbake造成AXOS水平显著升高。当剂量为100单位/升且培育时间为150分钟时，Grindamyl Powerbake使大麦麦芽麦芽浆的AXOS含量相对于未加入酶的基础处理麦芽浆升高47％。

在第二个实验中，分析了加入不同类型木聚糖内切酶对麦芽汁释放AXOS的影响，所述麦芽汁是将比尔森型大麦麦芽以200g/l悬浮于麦芽浆制备的。温度方案为45℃120分钟，60℃30分钟，和72℃60分钟。测试的不同的酶是：Grindamyl H640，一种被谷物中的木聚糖内切酶抑制剂抑制的来自枯草芽孢杆菌的GHF11-木聚糖内切酶；Grindamyl H190，一种被谷物中的木聚糖内切酶抑制剂抑制的来自黑曲霉的GHF 11-木聚糖内切酶；Grindamyl Powerbake，一种被工程构造成能降低来自谷物的木聚糖内切酶抑制剂对木聚糖内切酶活性的抑制作用的来自枯草芽孢杆菌的GHF 11木聚糖内切酶；Shearzyme 500L，一种来自皮刺曲霉(Aspergillus aculeatus)的GHF 10-木聚糖内切酶，其活性不被谷物木聚糖内切酶抑制剂抑制。

在相等木聚糖内切酶活性时(250单位/升)，Grindamyl Powerbake释放的AXOS远多于Grindamyl H640或Grindamyl H190，证明非抑制性木聚糖内切酶在啤酒释放AXOS方面比抑制性木聚糖内切酶更加有效(表3)。同时，在相等酶活性时(250单位/升)，Grindamyl Powerbake比Shearzyme 500L释放更多AXOS，表明就AXOS在麦芽汁中溶解而言糖苷水解酶家族11-木聚糖内切酶的性能优于糖苷水解酶家族10-木聚糖内切酶。另一方面，Shearzyme 500L造成AXOS avDP的降低最高，使麦芽汁的avDP从13降至6，而Grindamyl H640和Grindamyl Powerbake对该参数影响甚微或没有影响。这与糖苷水解酶家族11木聚糖内切酶有利于不可溶阿糖基木聚糖底物释放AXOS，而糖苷水解酶家族10木聚糖内切酶优先切割可溶性AXOS的催化特性的观点一致。

在之前的实验中，调制麦芽浆的温度保持在相对较低(45℃)。对于大多数啤酒类型而言，使用较高的调制麦芽浆温度比较理想，因为这能降低氧化反应并避免不良的变味和口味不稳定性。在第三个实验中，检测了加入EcopulpTX200A的功效，Ecopulp TX200A是一种经工程构造热稳定性提高的来自木霉(Trichoderma longibrachiatum)(以前称为Trichoderma reesei)的GHF 11木聚糖内切酶。温度方案为60℃30分钟，72℃60分钟，和78℃120分钟。

以2,500木聚糖内切酶单位/升和5,000木聚糖内切酶单位/升的剂量加入Ecopulp TX200A使AXOS水平相比未加入酶的对照酿造过程分别提高129％(约2.3倍)和140％(约2.4倍)(表4)。加入Ecopulp TX200A使麦芽汁的AXOS水平最高达3.7g/L。Ecopulp TX200A和Shearzyme 500L的组合导致AXOS溶解更多同时使AXOS的avDP从相对应对照麦芽汁的16降至8。由这些实验可知，当在高调制麦芽浆温度下工作时优选使用耐热性酶来使啤酒富含AXOS。

如下评价小麦木聚糖内切酶抑制剂TAXI I对Ecopulp TX200A木聚糖内切酶活性的抑制作用。在不存在或存在65μg纯化的TAXII时将2木聚糖内切酶单位的Ecopulp TX200A在0.5ml磷酸钠缓冲液(25mM，pH 6.0)中室温预培育30分钟。之后在70℃通过比色法用Xylazyme(爱尔兰麦格酶制品公司)作为底物按照制造商的说明测定溶液的木聚糖内切酶活性。Ecopulp TX200A和TAXII混合物的活性为不存在TAXI时Ecopulp TX200A的104％。因此可认为EcopulpTX200A在其最佳温度70℃时不被存在的谷物木聚糖内切酶抑制剂如TAXI显著抑制，这使得该酶在调制麦芽浆操作中溶解AXOS的效率较高。

在第四个实验中，检测了在三种不同谷粉中加入Ecopulp TX200A的作用，Ecopulp TX200A是一种来自木霉(Trichoderma longibrachiatum)(以前称为Trichoderma reesei)的耐热性非抑制性糖苷水解酶家族11-木聚糖内切酶：第一种谷粉由100％的200g/l的比尔森型大麦麦芽构成，第二种由90％180g/l的比尔森型大麦麦芽和10％20g/l的小麦麦麸构成，第三种由90％180g/l的比尔森型大麦麦芽和10％20g/l的黑麦麦麸构成。温度方案为62℃60分钟，72℃30分钟，和78℃60分钟，Ecopulp TX200A木聚糖内切酶的加入剂量为4,000单位/升。

如表5所示，加入Ecopulp TX200A木聚糖内切酶使得用100％比尔森大麦麦芽制造的麦芽汁的AXOS含量从1.6g/l升至2.2g/l，用麦芽/小麦麦麸混合物制造的麦芽汁的AXOS含量从1.7g/l升至4.0g/l，用麦芽/黑麦麦麸混合物制造的麦芽汁的AXOS含量从2.0升至3.6g/l。

按照以下方法以中试规模制造两种啤酒。啤酒A的麦芽浆是将10kg比尔森麦芽与50升酿造用水混合制备的。啤酒B的麦芽浆是将9kg比尔森麦芽、1kg黑麦麦麸、10ml Ecopulp TX200A(15000单位/ml；AB酶制品公司)、5mlShearzyme 500L(2500单位/ml；诺佛酶制品公司)以及50升水混合制备的。酿造用水由通过反渗透纯化的水构成并向其中加入终浓度为40mg/l的Ca²⁺。调制麦芽浆的温度方案如下：63℃(45分钟)，72℃(45分钟)，78℃(1分钟)。麦芽浆的pH为5.6。当温度达到78℃时在两种酿造麦芽浆中各加入7.5ml α-淀粉酶制品Termamyl(Termamyl 120L，购自诺佛酶制品公司)。在温度为78℃时用滤桶澄清60分钟。将过滤后的麦芽汁煮沸60分钟，并在煮沸结束前5分钟时加入Zn²⁺至终浓度为0.2mg/l。用涡漩澄清煮沸的麦芽汁。一份澄清的麦芽汁用无氧水1∶1(v∶v)稀释以制造淡味储藏啤酒。另一份澄清的麦芽汁不稀释并用来制造常规比尔森型储藏啤酒。以10⁷细胞/毫升向冷却的澄清麦芽汁中投入窖藏啤酒酵母(Saflager 3470，购自Lesaffre)，然后在12℃发酵8天并在0℃窖藏7天。加入异构化的酒花酸提取物(20％异构化酸w/v，英格兰波坦尼克公司(Botanix Ltd.，Paddock Wood，England))至终浓度为25mg/l异构化酸来调节稀释啤酒的苦味。将啤酒通过硅藻土/纤维素层(1μm)过滤，最后用具有双重预排空功能的等压填装机(America monobloc，购自意大利思米克公司(Cimec，Italy))装瓶并密封在25cl标准棕色瓶中(O₂含量＜80ppb)。

啤酒B的AXOS水平为3.53g/l，而对照啤酒A为0.95g/l(表6)。因此，用黑麦麦麸代替10％的麦芽并在调制麦芽浆处理期间加入溶解阿糖基木聚糖的木聚糖内切酶导致AXOS含量升高到3.7倍(即提高272％)。麦芽汁的AXOS含量与与相对应啤酒类似，表明测量麦芽汁的AXOS含量能高度预言最终啤酒的AXOS含量。啤酒B的AXOS含量甚至略高于麦芽汁B，主要在麦芽汁煮沸期间发生的蒸发导致啤酒浓缩可解释这一点。淡味啤酒B的AXOS水平为1.93g/l，对比对照淡味啤酒A为0.88g/l，因此导致AXOS含量是对照淡味啤酒的约2.2倍(即增加119％)。啤酒B和淡味啤酒B的乙醇含量没有分别低于对照啤酒A和对照淡味啤酒A可以证明麦芽汁的AXOS含量提高显然没有抑制发酵过程(表6)。

本领域技术人员还将理解，除Ecopulp TX200A之外的其他改进的耐热性和非抑制性酶也可用于上述实验。可用于改进酶的方法包括，例如，提高木聚糖内切酶热稳定性的定向改进法，该方法通过基因位点饱和诱变和基因重新装配技术制造酶变体文库，然后在高温下筛选木聚糖分解活性。酶的改进也可通过合理位点定向工程构建以引入能产生在高温下具有改进的催化活性的酶的经过选择的密码子取代来实现。或者，可从相关的嗜热性或超嗜热性(hyperthermophilic)微生物中分离目前使用的细菌或真菌木聚糖内切酶基因的直向同源基因并通过在异源宿主生物中表达来制造耐热性酶。

除木聚糖内切酶之外的其他酶可与木聚糖内切酶一起使用以进一步增加啤酒制造的调制麦芽浆步骤或其他步骤期间AXOS的释放，如阿拉伯呋喃糖水解酶(arabinofuranohydrolase)、阿魏酸酯酶、甲基葡糖醛酸糖苷酶、β-葡聚糖酶或纤维素酶。这些酶能除去阿糖基木聚糖的侧链或降解阿糖基木聚糖中的其他基质，从而帮助阿糖基木聚糖接近木聚糖内切酶。

本领域技术人员还将理解，木聚糖内切酶可与诸如淀粉葡萄糖苷酶和/或支链淀粉酶等酶组合使用，加入这些酶的目的是降低最终啤酒中可发酵糖类的含量。淀粉葡萄糖苷酶、支链淀粉酶或其他所谓的衰减酶(attenuation enzyme)通常用于制造残留的可发酵麦芽糊精水平降低的淡味啤酒和/或低糖啤酒。因此，在啤酒制造的调制麦芽浆或其他步骤期间加入木聚糖内切酶和衰减酶的组合可用来制造AXOS含量提高的淡味啤酒。

实施例3-在发酵后加入富含AXOS的制品来提高啤酒中的AXOS

从麦麸制备AXOS(AXOS-18-0.31).将市售小麦麦麸(Dossche，购自比利时MB公司(Mills & Bakery，Deinze，Belgium))用作制备AXOS-18-0.31的原料。将小麦麦麸与水(1∶7w/v)的悬浮液先用耐热性α-淀粉酶(Termamyl 120LS，购自丹麦诺佛酶制品公司；1μl/g小麦麦麸)在90℃处理90分钟以将淀粉水解。冷却至50℃后，用浓HCl将悬浮液的pH调至6.0并将悬浮液与蛋白酶(Neutrase0.8L，丹麦诺佛酶制品公司；40μl/g小麦麦麸)一起在50℃培育4小时以水解残余的蛋白质。之后，将悬浮液煮沸20分钟，过滤并弃去滤液。残余物用水洗涤并重悬于去离子水(1∶14w/v)。悬浮液在连续搅拌条件下与每克脱浆并去蛋白的小麦麦麸1.4单位的木聚糖内切酶Grindamyl H640(戴尼斯科公司，哥本哈根，丹麦)一起在50℃培育10小时，以每克脱浆并去蛋白的小麦麦麸1.1单位加入第二剂量的Grindamyl H640后再在50℃培育10小时。通过煮沸(30分钟)将酶灭活后浓缩溶液直到降膜蒸发器上留下20％干物质并在旋转干燥器内干燥。将旋转干燥的材料溶于水(1∶25w/v)并用活性碳处理以除去制造过程中可能产生的怪味。将AXOS和活性碳(0.75g/g AXOS)的悬浮液在18℃搅拌1小时。倾析之后离心(10,000g，30分钟，18℃)除去活性碳并将上清液冻干。制品的AXOS含量(表示为干物质中的阿糖基木聚糖％)为78.8％，AXOS中阿拉伯糖与木糖之比为0.31，avDP为18。

制备含AXOS的啤酒.用市售淡味啤酒(Bud light，由美国圣路易斯的AB公司(Anheuser-Bush，St Louis，USA)发酵)作为制备含AXOS啤酒的基础。通过搅拌将25.4g/l AXOS-18-0.31(78.8％纯)溶于啤酒，然后将该溶液1∶10(v/v)稀释于啤酒，从而制得含2g/l纯AXOS-18-0.31的啤酒。通过搅拌将127g/lAXOS-18-0.31(78.8％纯)溶于啤酒，然后将该溶液1∶10(v/v)稀释于啤酒，从而制得含10g/l纯AXOS-18-0.31的啤酒。相应的对照啤酒是将搅拌的啤酒1∶10稀释于啤酒制备的。

感官分析.感官分析是在一个安静的会议室内由最多10名志愿者立即进行的。首先使受试者熟悉生产过程，然后让他们品尝编号的具有不同AXOS浓度的啤酒样品。在品尝期间蒙上受试者的眼睛，由助手单独帮助他们递送样品和记录反应。样品的出现顺序是随机的。让受试者按照口感提升的顺序对样品进行排序。采用Analyse-it软件(版本1.71)通过弗里德曼秩和检验进行统汁分析。

在市售淡味啤酒(Bud light，由美国AB公司酿造)中添加2g/l或10g/l富含AXOS的制品(称为AXOS-18-0.31，采用包含木聚糖内切酶的方法从小麦麦麸分离)。进行感官分析以确定加入AXOS对淡味啤酒口感的影响。如图1所示，加入2g/l和10g/l AXOS-18-0.31都改善了淡味啤酒的口感，而在10g/l时与对照啤酒的区别是显著的。

由该实验可知，AXOS是从富含阿糖基木聚糖的来源外部制造的，可加入啤酒，并且在啤酒中加入AXOS可改善啤酒的口感。添加AXOS的啤酒均未显示出粘度有显著升高。

本领域技术人员将理解，富含AXOS的制品可在啤酒制造过程的不同步骤中加入，所述步骤包括但不限于调制麦芽浆、麦芽汁煮沸、麦芽汁冷却、麦芽汁发酵、啤酒调理或啤酒完成。

实施例4-在发酵前加入富含AXOS的制品来提高啤酒中的AXOS

从淀粉/谷蛋白分离的支流制备AXOS(AXOS-5-0.5)。

小麦戊聚糖浓缩物(WPC，购自德国PL公司(Pfeifer & Langen，Dormagen，Germany))衍生自将小麦粉加工成淀粉和谷蛋白的支流，其化学组成已由Courtin和Delcour详细描述(1998，J.Agric.Food Chem.，46：4066-4073)。WPC富含水可提取的阿糖基木聚糖(约43％)和蛋白质材料(约30％)。其余部分主要由阿拉伯半乳聚糖肽(约14％)以及更少的聚合葡萄糖(6％)构成。WPC中的阿糖基木聚糖的阿拉伯糖与木糖之比为0.58，avDP为58。将WPC溶于去离子水(1∶10w/v)并加入二氧化硅形成水性悬浮液(20％w/v)直到二氧化硅/蛋白质之比为7∶1。用0.1M HCl将混合物的pH调至4.8以获得蛋白质在二氧化硅上的最大吸附。搅拌30分钟后通过布氏漏斗过滤悬浮液。弃去含二氧化硅/蛋白质的残余物，将滤液再在30℃与29单位/克WPC的Shearzyme 500L(诺佛酶制品公司，Bagsvaerd，丹麦)一起培育24小时。通过煮沸(30分钟)将酶灭活之后将所得溶液冷却并进行乙醇沉淀。边连续搅拌边加入乙醇(95％v/v)直到终浓度为80％(v/v)，再搅拌30分钟，静置(24小时，4℃)并过滤，将所得残余物溶于去离子水并再次进行乙醇沉淀。边连续搅拌边加入乙醇(95％v/v)直到终浓度为65％(v/v)，再搅拌30分钟，静置(24小时，4℃)并过滤，除去沉淀物。对所得上清液进行旋转蒸发以除去乙醇，将其溶于去离子水并冻干。将所得物质均质并通过250μm筛筛分。制品的AXOS含量(表示为干物质中的阿糖基木聚糖％)为78.5％，AXOS中阿拉伯糖与木糖之比为0.5，avDP为5。

制备含AXOS的啤酒.如下所述以中试规模制造实验啤酒。将33.33kg比尔森麦芽(用双辊粉碎机粗磨)、2.83kg葡萄糖和120l酿造用水(加入Ca2+至终浓度为40mg/l来反渗透)混合来调制麦芽浆。调制麦芽浆的温度方案如下：63℃(35分钟)，72℃(20分钟)，78℃(1分钟)。加入乳酸来控制麦芽浆的pH为5.2。在78℃的滤桶中澄清90分钟。将过滤的麦芽汁分成两份：第一份10l(对照啤酒)，第二份10l(富含AXOS的啤酒)。将两部分麦芽汁分别煮沸60分钟。煮沸结束前5分钟时在麦芽汁中加入异构化的酒花酸提取物(20％异-α-酸w/v，购自英格兰波坦尼克公司)至终浓度为25mg/l异-α-酸，从而使麦芽汁含啤酒花。在煮沸结束前5分钟加入Zn2+至终浓度为0.2mg/l。在煮沸结束前5分钟时在第二份10l麦芽汁部分中加入76.4g AXOS-5-0.5来制造富含AXOS的啤酒。加入之前AXOS-5-0.5用水1∶10(w/v)稀释，并搅拌30分钟。

煮沸的麦芽汁用涡漩澄清。澄清的麦芽汁用无氧水1∶1(v∶v)稀释。

以10⁷细胞/毫升向冷却的澄清麦芽汁中投入窖藏啤酒酵母(Saflager 3470，购自Lesaffre)，然后在12℃发酵8天并在0℃窖藏7天。

加入异构化的酒花酸提取物(20％异-α-酸w/v，英格兰波坦尼克公司)至终浓度为25mg/l异-α-酸来调节稀释啤酒的苦味。将啤酒通过硅藻土/纤维素层(1μm)过滤。用具有双重预排空功能的等压填装机(America monobloc，购自意大利思米克公司)装瓶和密封在25cl标准棕色瓶中(O₂含量＜80ppb)。

感官分析.感官分析是在一个安静的会议室中由经过训练的评判小组进行的。样品的出现顺序是随机的。用0(未觉察)到8(非常强烈)给甜味、酸味、苦味、涩味和口感(丰满度)这些感官特性评分。感官特性苦味品质用0(非常不愉快)到8(非常愉快)评分。评分采用Analyse-it软件(版本1.71)通过成对t检验进行统计分析。让受试者指出对两种啤酒中一种的偏爱。偏爱数据采用Analyse-it软件(版本1.73)通过麦氏变化检验(McNemar’s change test)进行统计分析。

从相同的麦芽汁开始以中试规模制造两种实验性低乙醇淡味啤酒，一种加入AXOS，而另一种不加AXOS。AXOS制品的平均DP为5，A/X之比为0.5，称为AXOS-5-0.5，分离自工业小麦加工的支流(见材料和方法)，在麦芽汁煮沸结束时将其加入两种酿造物中的一种。两种啤酒的特性示于表7。这两种啤酒有非常类似的乙醇含量(约2.7％v/v)，类似的实际提取物(约2.3g/100ml)和原始提取物(约6.7g/100ml)，但富含AXOS啤酒的麦芽糊精含量略低，而其AXOS含量为对照啤酒的约2.5倍(高151％)(富含AXOS的啤酒和对照啤酒的AXOS含量分别为2.78g/l和1.09g/l)。

进行感官分析以确定加入AXOS制品对啤酒口味和口感的影响(图2)。在啤酒中加入AXOS-5-0.5导致酸味和苦味显著(p＜0.05)降低，而苦味的品质以及口感显著提升。在13名测试人员中，有12人相比对照啤酒比较偏爱富含AXOS的啤酒(根据麦氏检验，精确p值＝0.0034)。这些数据再次清楚表明，AXOS对啤酒口味和口感有积极影响。

实施例5-提高含约7％乙醇和5.8g/100ml实际提取物的啤酒中的AXOS

如下制备另一种富含axos的烈性啤酒：谷粉∶细磨的比尔森麦芽(28kg)，来自小麦麦麸的富含AXOS的制品称为AXOS-18-0.31(见实施例3的材料和方法)(6g/l)；酿造用水：加入Ca²⁺(40mg/l)反渗透(100l)；酿造方案：63℃(30分钟)，72℃(45分钟)，78℃(120分钟，包括用滤桶进行麦芽汁过滤)；麦芽浆的pH控制在pH 5.6；麦芽汁煮沸：75分钟；麦芽汁澄清：涡漩；在澄清的麦芽汁中加入Zn²⁺(0.2mg/l)；加入啤酒花(hopping)：在麦芽汁煮沸结束时加入异构化的酒花酸提取物(20％异-α-酸w/v，英格兰波坦尼克公司)；酵母投入率：5x10⁶上层发酵酵母细胞/毫升；发酵：22-25℃9天；成熟：木桶中(2℃10天)；啤酒过滤：硅藻土/纤维素层(1μm)。富含axos的烈性麦芽酒的乙醇含量约7％，实际提取物含量约5.8g/100ml，AXOS含量约5g/l。

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Claims

1.一种啤酒，它含有低于3.5％(v/v)乙醇或低于3g/100ml实际提取物的啤酒，所述啤酒含有高于1.2克/升且最高达20克/升啤酒的平均聚合度(DP)低于50的可溶性阿糖基木寡糖。

2.一种下层发酵啤酒，其包含3.5至6％(v/v)的乙醇水平和3-5克/100毫升的实际提取物，所述啤酒包含超过3.5克且最高达25克/升啤酒的平均聚合度(DP)低于50的可溶性阿糖基木寡糖。

3.一种啤酒，其包含高于6％(v/v)醇和至少5克/100毫升的实际提取物，所述啤酒包含至少2.4克且最高达30克/升啤酒的平均聚合度(DP)低于50的可溶性阿糖基木寡糖。

4.一种通过酿造过程制造啤酒的方法，所述方法包括发芽步骤、调制麦芽浆步骤、澄清步骤、麦芽汁煮沸步骤、麦芽汁冷却和接种步骤以及发酵步骤，所述酿造过程还包括使所述啤酒富含可溶性阿糖基木寡糖的富集步骤，其中所述富集导致含有低于3.5％(v/v)乙醇或低于3g/100ml实际提取物的下层发酵啤酒中平均聚合度(DP)低于50的可溶性阿糖基木寡糖的终浓度为高于1.2克/升且最高达20克/升。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述啤酒含有低于3.5％(v/v)乙醇或低于3g/100ml实际提取物，以及低于15克麦芽糊精/升啤酒。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述富集步骤包括在啤酒制造过程的调制麦芽浆步骤期间加入一种或多种木聚糖内切酶以使麦芽汁中可溶性阿糖基木寡糖含量比未加入任何木聚糖内切酶制备的相同麦芽汁高至少30％，所述酶的酶活为20-5000单位/升。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一种或多种木聚糖内切酶中的至少一种是非抑制性木聚糖内切酶。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一种或多种木聚糖内切酶中的至少一种是糖苷水解酶家族11-木聚糖内切酶。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述富集步骤还包括加入含有至少15重量％的水不可提取的阿糖基木聚糖的材料作为所述方法的酿造过程中的一种成分。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含水不可提取的阿糖基木聚糖的材料选自小麦麸、黑麦麸、大麦麸、燕麦麸、黑小麦麸、大米麸、小米麸、高粱麸或玉米麸。

11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述富集步骤包括加入含有至少20重量％的平均聚合度低于50的可溶性阿糖基木寡糖的谷物衍生材料作为在所述方法的酿造过程的调制麦芽浆步骤、麦芽汁煮沸步骤、麦芽汁冷却步骤和发酵步骤的任一步骤期间的一种成分。

12.一种通过酿造过程制造啤酒的方法，所述方法包括发芽步骤、调制麦芽浆步骤、澄清步骤、麦芽汁煮沸步骤、麦芽汁冷却和接种步骤以及发酵步骤，所述酿造过程还包括使所述啤酒富含可溶性阿糖基木寡糖的富集步骤，其中所述富集导致含有3.5-6％(v/v)的乙醇水平和3-5克/100毫升实际提取物的下层发酵啤酒中平均聚合度(DP)低于50的可溶性阿糖基木寡糖的终浓度高于3.5克且最高达25克/升。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述富集步骤包括在啤酒制造过程的调制麦芽浆步骤期间加入一种或多种木聚糖内切酶以使麦芽汁中可溶性阿糖基木寡糖含量比未加入任何木聚糖内切酶制备的相同麦芽汁高至少30％，所述酶的酶活为20-5000单位/升。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述一种或多种木聚糖内切酶中至少一种是非抑制型木聚糖内切酶或热稳定性木聚糖内切酶。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述一种或多种木聚糖内切酶中至少一种是糖苷水解酶家族11-木聚糖内切酶。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述富集步骤还包括加入含有至少15％重量的水不可提取的阿糖基木聚糖的材料作为所述方法的酿造过程中的一种成分。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述含有水不可提取的阿糖基木聚糖的材料选自小麦麸、黑麦麸、大麦麸、燕麦麸、黑小麦麸、大米麸、小米麸、高粱麸或玉米麸。

18.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述富集步骤包括加入含有至少20重量％的平均聚合度低于50的可溶性阿糖基木寡糖的谷物衍生材料作为在所述方法的酿造过程的调制麦芽浆步骤、麦芽汁煮沸步骤、麦芽汁冷却步骤和发酵步骤的任一步骤期间的一种成分。

19.一种通过酿造过程制造啤酒的方法，所述方法包括发芽步骤、调制麦芽浆步骤、澄清步骤、麦芽汁煮沸步骤、麦芽汁冷却和接种步骤以及发酵步骤，所述酿造过程还包括使所述啤酒富含可溶性阿糖基木寡糖的富集步骤，其中所述富集导致含有高于6％(v/v)的乙醇水平和高于5克/100毫升实际提取物的啤酒中平均聚合度(DP)低于50的可溶性阿糖基木寡糖的终浓度为至少2.1克且最高达30克/升。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述富集步骤包括在啤酒制造过程的调制麦芽浆步骤期间加入一种或多种木聚糖内切酶以使麦芽汁中可溶性阿糖基木寡糖含量比未加入任何木聚糖内切酶制备的相同麦芽汁高至少30％，所述酶的酶活为20-5000单位。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述一种或多种木聚糖内切酶中至少一种是非抑制型木聚糖内切酶或热稳定性木聚糖内切酶。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述一种或多种木聚糖内切酶中至少一种是糖苷水解酶家族11-木聚糖内切酶。

23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述富集步骤还包括加入含有至少15％重量的水不可提取的阿糖基木聚糖的材料作为所述方法的酿造过程中的一种成分。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述含有水不可提取的阿糖基木聚糖的材料选自小麦麸、黑麦麸、大麦麸、燕麦麸、黑小麦麸、大米麸、小米麸、高粱麸或玉米麸。

25.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述富集步骤包括加入含有至少20重量％的平均聚合度低于50的可溶性阿糖基木寡糖的谷物衍生材料作为在所述方法的酿造过程的调制麦芽浆步骤、麦芽汁煮沸步骤、麦芽汁冷却步骤和发酵步骤的任一步骤期间的一种成分。