CN101695316A - 一种具有增强免疫功能的奶粉及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有增强免疫功能的奶粉及其生产方法，旨在提供一种利用人体消化系统所具有的蛋白酶水解乳源蛋白，制备具有增强免疫功能的水解产物，将所获得的水解产物添加到奶粉中，从而得到一种适合所有免疫力低下的人群食用的具有增强免疫功能的奶粉。该奶粉包括由奶粉基础组分组成的奶粉基质，在100克奶粉基质中添加1-6克水分含量小于5％的采用人体消化系统所具有的蛋白酶水解乳源蛋白的乳源蛋白水解产物，所述乳源蛋白水解产物为乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物中的至少一种。奶粉具有显著的增强免疫力的作用，所得产物安全，无毒副作用。具有非特异性免疫作用，适合所有免疫力低下的人群食用。
Description
技术领域
本发明涉及乳品加工领域，更具体的说，是涉及一种添加利用生物酶水解乳源蛋白的水解产物获得具有增强免疫功能的奶粉及其生产方法。
背景技术
随着环境的污染和工作压力的增大，以及2003年的“非典”和2005年的禽流感，使人们真正理解了免疫调节的重要性，消费者提高免疫力的意识空前强化，使具有免疫调节功能的食品的市场潜在需求已经转化成为现实的需求，市场的大门突然洞开，形成强大的购买力，使得免疫调节类制品的市场扩大和购买力持续攀升。
哺乳动物的乳中含有多种蛋白，这些蛋白不仅具有生理活性，同时，在其大分子内部还存在许多具有生理活性的蛋白肽，在蛋白质被水解之前它们是以非活性状态隐藏在蛋白质分子中，当蛋白质被水解后，这些肽的活性被释放出来。自从1979年Brant从牛乳β-酪蛋白的水解产物中分离出β-阿片样肽至今，已经从牛乳酪蛋白的水解中发现了多种活性肽，例如：阿片样肽(opioid)、抗血压升高肽(antihypertensive peptides)、酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides CPPs)、免疫多肽(immuunopeptides)、抗血栓肽(antithromboticpeptides)等。
在具有免疫功能的乳制品的开发方面，免疫乳是其中的一种。传统免疫乳是指给牛或山羊等哺乳动物，有选择地接种能够引起某些疾病的细菌、病毒，或其他外来的抗原，刺激肌体产生免疫应答，以分泌特异性抗体进入乳汁，这种乳称为免疫乳。传统免疫乳具有特异性免疫作用，具有针对性，适合特殊人群。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种利用人体消化系统所具有的蛋白酶水解乳源蛋白，制备具有增强免疫功能的水解产物，以水解产物对脾淋巴细胞和胸腺细胞的免疫刺激指数为指标确定水解产物的制备条件，将所获得的水解产物添加到奶粉中，从而得到一种适合所有免疫力低下的人群食用的具有增强免疫功能的奶粉。
本发明的另一个目的是提供一种上述具有增强免疫功能的奶粉的生产方法。
本发明通过下述技术方案实现：
一种具有增强免疫功能的奶粉，包括由奶粉基础组分组成的奶粉基质，其特征在于，在100克奶粉基质中添加1-6克水分含量小于5％的采用人体消化系统所具有的蛋白酶水解乳源蛋白的乳源蛋白水解产物，所述乳源蛋白水解产物为乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物中的至少一种；所述人体消化系统所具有的蛋白酶为胰蛋白酶或胃蛋白酶。
所述乳铁蛋白水解产物采用下述方法制备：将胃蛋白酶与乳铁蛋白在温度为35-40℃、pH值为2-4的条件下水解3-4h，将水解产物冷冻干燥至水分含量小于5％得到乳铁蛋白水解产物，其中底物的质量百分比浓度为2-7％，胃蛋白酶与底物的质量比为1∶30-150。
所述酪蛋白水解产物采用下述方法制备：将胰蛋白酶与酪蛋白在温度为40-50℃、pH值为7.5-8.5的条件下水解90-120min，将水解产物冷冻干燥至水分含量小于5％得到胰蛋白酶水解酪蛋白的酪蛋白水解产物，其中，底物的质量百分比浓度为2-8％，所述胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30-200。
所述乳清蛋白水解产物采用下述方法制备：将乳清蛋白与胰蛋白酶在温度为40-50℃、pH值为7.5-8.5的条件下水解90-120min，将水解产物冷冻干燥至水分含量小于5％得到胰蛋白酶水解乳清蛋白的乳清蛋白水解产物，其中，底物的质量百分比浓度为2-8％，所述胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30-150。
当奶粉中含有乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物三种乳源蛋白水解产物时，乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物的质量比例为乳源蛋白水解产物总量的0.5％∶80％∶19.5％。
当奶粉中含有乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物三种乳源蛋白水解产物时，在乳铁蛋白水解产物的添加量为0.5g条件下，酪蛋白水解产物和乳清蛋白水解产物的质量比为1-3∶1。
本发明中的具有增强免疫功能的奶粉可以是婴幼儿奶粉，又可以是老年奶粉。
对于婴幼儿奶粉，除了添加乳源蛋白水解产物外，在100g奶粉基质中还添加质量为1g的低聚果糖、质量为2g的低聚异麦芽糖和质量为1g的初乳粉。
在老年奶粉中，除了添加乳源蛋白水解产物外，在100g奶粉基质中还添加质量为3g的山药粉、质量为2g的低聚异麦芽糖和质量为1g的初乳粉。
一种上述具有增强免疫功能的奶粉的生产方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)采用人体消化系统所具有的蛋白酶水解乳源蛋白制备乳源蛋白水解产物：
称取乳铁蛋白，用去离子水溶解，配成底物的质量百分比浓度为2-7％的乳铁蛋白水溶液，调整pH为2-4，将胃蛋白酶溶液缓慢加到乳铁蛋白水溶液中，于35-40℃条件下，水解3-4h，水解过程中维持pH值不变；水解结束后，80℃加热15min灭酶，调节pH值为中性，离心，收集上清液，冷冻干燥至水分含量小于5％，获得胃蛋白酶水解乳铁蛋白的乳铁蛋白水解产物；其中，胃蛋白酶与底物的质量比为1∶30-150。最佳水解条件为：底物的质量百分比浓度为6％，胃蛋白酶与底物的质量比为1∶30，水解pH值为3.0，水解温度为37℃，水解时间3h。通过试验检测，胃蛋白酶水解乳铁蛋白的乳铁蛋白水解产物中含有乳铁素，在最佳水解条件下得到的水解产物对脾细胞的免疫刺激指数为5.33，100克水解产物中乳铁素含量大于2.5％。
调整质量百分比浓度为2％-8％的酪蛋白溶液pH值为7.5-8.5，将胰蛋白酶溶液加入到酪蛋白溶液中，于40-50℃水解90-120min，水解过程中维持pH值不变，水解结束后80℃灭酶15min，调节pH值为中性，离心，取上清液，冷冻干燥至水分含量小于5％，获得胰蛋白酶水解酪蛋白的酪蛋白水解产物；其中，胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30-200。最佳水解条件为：底物的质量百分比浓度为8％，胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30，水解pH值为8.0，水解温度为45℃，水解时间110min。通过试验检测，胰蛋白酶水解酪蛋白的酪蛋白水解产物中含有Trpi(具有抗菌作用的免疫活性肽，由57个氨基酸组成)。试验检测在最佳水解条件下得到的水解产物对脾细胞的免疫刺激指数能够达到5.83，100克水解产物中Trpi含量为3.5％。
调整质量百分比浓度为2-8％的乳清蛋白溶液的pH值为7.5-8.5，将胰蛋白酶溶液加入到乳清蛋白溶液中，于温度为40-50℃的条件下水解90-120min，水解过程中维持pH值不变，水解结束后80℃灭酶15min，调节pH值为中性，离心，取上清液，冷冻干燥至水分含量小于5％得到胰蛋白酶水解乳清蛋白的乳清蛋白水解产物，其中，胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30-150。最佳水解条件为：底物的质量百分比浓度为8％，胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30，水解pH值为8.0，水解温度为45℃，水解时间为110min。试验检测在最佳水解条件下得到的水解产物对胸腺细胞免疫刺激指数能够达到8.2。
上述所用的乳清蛋白是指蛋白含量在80％以上的牛乳乳清蛋白。
(2)将上述得到的乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物中的至少一种按照每100克奶粉基质中添加1-6克的比例加入到奶粉基质中混合均匀得到具有增强免疫功能的奶粉。
对于奶粉中添加低聚果糖、低聚异麦芽糖、初乳粉等辅料配制婴幼儿奶粉时，在步骤(2)中，100g奶粉基质添加质量为1g的低聚果糖、质量为2g的低聚异麦芽糖和质量为1g的初乳粉与乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物中的至少一种以及婴幼儿配方奶粉基质充分混合，得到具有免疫功能的婴幼儿奶粉。
对于奶粉中添加山药粉、低聚异麦芽糖、初乳粉等辅料配制老年奶粉时，在步骤(2)中，100g奶粉基质中添加质量为3g的山药粉、质量为2g的低聚异麦芽糖和质量为1g的初乳粉与乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物中的至少一种以及老年配方奶粉基质充分混合，得到具有免疫功能的老年奶粉。
本发明具有下述技术效果：
1、本发明的奶粉中含有利用人体消化系统所具有的蛋白酶(胰蛋白酶或胃蛋白酶)水解乳源蛋白得到的乳源蛋白水解产物，该水解产物中含有多种生物活性肽，同时含有具有免疫调节作用的活性肽，其中包括乳铁素和Trpi，奶粉具有显著的增强免疫力的作用，对免疫系统尚未发育健全的婴幼儿、身体虚弱的老年、由于免疫低下所造成疾病的患者，均有增强免疫力和对疾病抵抗力的作用。而且，所得产物安全，无毒副作用。本发明通过适量的水解产物与奶粉基础组分的组合，得到一种新型的具有非特异性免疫作用，适合所有免疫力低下的人群食用的具有免疫功能的乳制品，不仅能够满足市场的需求，同时也提升了乳品加工的技术含量，为乳品深加工开辟了新的途径。
2、奶粉中所添加的山药粉、低聚异麦芽糖、低聚果糖，有益于肠道中有益菌的生长和繁殖，具有调理肠道菌群的作用。
3、本发明所提供的方法简单，利用对脾淋巴细胞和胸腺细胞的免疫刺激指数作为水解条件的评价指标，无需对水解产物进行复杂的分离和纯化，适合大规模生产。所制备的配方奶粉与原配方奶粉相比无不良味道，品质稳定。
具体实施方式
本发明是利用乳源蛋白质，经人体消化系统主要蛋白酶(胃蛋白酶或胰蛋白酶)水解制备具有增强免疫功能的水解产物，以水解产物对脾淋巴细胞和胸腺细胞的免疫刺激指数为指标确定水解产物的制备条件，将所获得的水解产物添加到婴幼儿配方奶粉和老年配方奶粉中，生产一种具有增强免疫功能的婴幼儿配方奶粉和老年配方奶粉。以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。所用的乳清蛋白是指蛋白含量在80％以上的牛乳乳清蛋白。
1、胰蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白水解产物及水解产物免疫刺激指数的测定：
(1)配制质量百分比浓度为2％的酪蛋白溶液100ml，在45℃水浴锅中，调节pH值为8.0，预热30min。按照胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30加入胰蛋白酶溶液开始水解，水解过程中不断搅拌。水解过程中加入0.1mol/l NaOH，使pH值维持在最适值8.0，水解时间为110min。记录所加NaOH溶液的量，直至pH值不再改变。水解结束后，用80℃的水灭酶15min，用0.1mol/l盐酸溶液调节pH值为中性，4000r/min离心30min，取上清液，冷冻干燥至水分含量小于5％，获得胰蛋白酶水解酪蛋白的酪蛋白水解产物备用。
(2)水解产物免疫刺激指数测定：
脾细胞悬液制备：拉颈处死Balb/c小鼠后，无菌条件下取出脾脏，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液，经200目筛网过滤，或者用4层纱布将脾磨碎，用Hank’s洗两次；每次离心10min，速度1000r/min。然后将细胞悬浮于1ml的10％FCS RPMI 1640培养液中，用台盼兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后用10％FCS RPMI 1640培养液调细胞浓度为1×107/ml。
细胞培养：将制备好的小鼠脾细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔100μl(1×107个细胞/孔)。第一列加入1640培养液50μl为阴性对照；第二列加入培养液40μl，ConA 10μl为阳性对照；其余列加入样品。酪蛋白水解产物用培养液配制成10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml三种浓度，每孔加入样品40μl，ConA 10μl。空白对照：每孔加入培养液150μl。
淋巴细胞增殖反应：在浓度为5％的CO2培养箱中，37℃条件下培养60h后，每孔加入50μl MTT溶液(MTT浓度为5mg/ml)，继续培养4h后取出，吸取上清液150μl，加入酸化异丙醇150μl，然后在酶标仪上进行检测，在酶标光度计上振荡30秒，570nm测出OD值。
刺激指数SI＝(OD试验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)
用SPSS软件对免疫刺激指数进行分析得到刺激指数SI。
对对底物的质量百分比浓度分别为2％的酪蛋白溶液、胰蛋白酶与底物质量比分别为1∶60，1∶90采用步骤(1)的方法进行胰蛋白酶水解酪蛋白得到酪蛋白水解产物，并采用步骤(2)的方法进行免疫刺激指数测定的结果如表1所示。对底物的质量百分比浓度分别为4％，6％，8％的酪蛋白溶液、胰蛋白酶与底物质量比分别为1∶30，1∶60，1∶90采用步骤(1)的方法进行胰蛋白酶水解酪蛋白得到酪蛋白水解产物，并采用步骤(2)的方法进行免疫刺激指数测定的结果如表1所示。
酪蛋白的免疫刺激指数如表2所示。
表1酪蛋白水解产物SI值(OD570，n＝6，x±s)
表2酪蛋白的免疫刺激指数
| 酪蛋白浓度 | 10μg/ml | 100μg/ml | 1000μg/ml |
| 酪蛋白的SI值 | 1.75±0.04 | 2.0±0.03 | 2.2±0.02 |
由表1酪蛋白水解产物的免疫刺激指数与表2的酪蛋白的免疫刺激指数相比较可以看出，在相同的浓度条件下，酪蛋白的水解产物的免疫刺激指数要高于酪蛋白本身的免疫刺激指数。在相同的底物浓度和酶与底物比的条件下，高浓度的免疫刺激指数高于中浓度的免疫刺激指数和低浓度的免疫刺激指数，并且，是呈由低浓度到中浓度到高浓度依次递增趋势的。在底物的质量百分比浓度为8％，酶与底物质量比为1∶30，浓度为1000μg/ml时，对脾淋巴细胞的免疫刺激指数最高为5.83。
2、胰蛋白酶水解乳清蛋白制备乳清蛋白水解产物及水解产物免疫刺激指数的测定：
(1)配制质量百分比浓度为2％的乳清蛋白溶液100ml，放到温度为45℃的恒温水浴锅中，调节pH值到8.0，预热30min。按照胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30加入胰蛋白酶溶液进行水解，水解过程中不断搅拌。水解过程中加入0.1mol/l NaOH，使pH值维持在最适值8.0，水解时间为110min。记录所加NaOH溶液的量，直至pH值不再改变。水解结束后，用80℃的水灭酶15min，用0.1mol/l盐酸溶液调节pH值为中性，4000r/min离心30min，取上清液，冷冻干燥至水分含量小于5％，得到乳清蛋白水解产物备用。
(2)水解产物免疫刺激指数测定：与酪蛋白水解产物的免疫刺激指数测定方法相同。
对底物的质量百分比浓度分别为2％的乳清蛋白溶液、胰蛋白酶与底物的质量比分别为1∶60，1∶90采用步骤(1)的方法进行胰蛋白酶水解酪蛋白得到酪蛋白水解产物，并采用步骤(2)的方法进行免疫刺激指数测定的结果如表3所示。对底物的质量百分比浓度分别为4％，6％，8％的乳清蛋白溶液、胰蛋白酶与底物的质量比分别为1∶30，1∶60，1∶90采用步骤(1)的方法进行胰蛋白酶水解酪蛋白得到酪蛋白水解产物，并采用步骤(2)的方法进行免疫刺激指数测定的结果如表3所示。
乳清蛋白的免疫刺激指数如表4所示。
表3乳清蛋白水解产物SI值(OD570，n＝6，x±s)
| 底物浓度 | 酶与底物质量比 | 乳清蛋白水解产物浓度为10μg/ml的SI值 | 乳清蛋白水解产物浓度为100μg/ml的SI值 | 乳清蛋白水解产物浓度为1000μg/ml的SI值 |
| 2％ | 1∶30 | 2.26±0.004 | 2.40±0.012 | 2.60±0.045 |
| 1∶60 | 2.17±0.008 | 2.24±0.02 | 2.30±0.28 | |
| 1∶90 | 2.30±0.001 | 2.46±0.013 | 3.06±0.15 | |
| 4％ | 1∶30 | 2.36±0.01 | 2.30±0.125 | 2.50±0.07 |
| 1∶60 | 2.20±0.045 | 2.80±0.009 | 3.70±0.165 | |
| 1∶90 | 2.70±0.018 | 2.94±0.28 | 3.80±0.18 | |
| 6％ | 1∶30 | 3.00±0.14 | 3.70±0.092 | 4.40±0.02 |
| 1∶60 | 3.19±0.18 | 3.27±0.068 | 4.20±0.045 | |
| 1∶90 | 3.27±0.605 | 3.64±0.15 | 4.50±0.076 | |
| 8％ | 1∶30 | 3.80±0.54 | 4.20±0.06 | 4.89±0.036 |
| 1∶60 | 4.40±0.02 | 4.57±0.17 | 4.62±0.27 | |
| 1∶90 | 3.30±0.001 | 3.04±0.02 | 3.88±0.081 |
表4乳清蛋白的免疫刺激指数
| 乳清蛋白浓度 | 10μg/ml | 100μg/ml | 1000μg/ml |
| 乳清蛋白的SI值 | 1.75±0.02 | 1.93±0.1 | 2.05±0.06 |
由表3乳清蛋白水解产物的免疫刺激指数与表4的乳清蛋白的免疫刺激指数相比较可以看出，在相同的浓度条件下，乳清蛋白的水解产物的免疫刺激指数要高于乳清蛋白本身的免疫刺激指数。在相同的底物浓度和酶与底物比的条件下，高浓度的免疫刺激指数要高于中浓度的免疫刺激指数和低浓度的免疫刺激指数，并且，是由低浓度到中浓度到高浓度依次递增的。在底物质量百分比浓度为8％，酶与底物质量比为1∶30，浓度为1000μg/ml时，对脾淋巴细胞的免疫刺激指数最高，为4.89。
3、胃蛋白酶水解乳铁蛋白制备乳铁蛋白水解产物及其免疫刺激指数测定：
(1)称取乳铁蛋白，用去离子水溶解，配成底物的质量百分比浓度为2％的溶液，用1mol/l的HCl调整pH＝3.0。按照胃蛋白酶与底物的质量比为1∶30取胃蛋白酶溶于pH＝3.0的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液(W/V，5％)，得到胃蛋白酶溶液，将胃蛋白酶溶液缓慢加到乳铁蛋白水溶液中，于37℃条件下，维持pH＝3.0，记录HCl耗用量，水解时间3h。水解结束后，80℃加热15min灭酶。用1mol/lNaOH调节pH值为中性，4000r/min离心30min，收集上清液，冷冻干燥至水分含量小于5％，获得乳铁蛋白水解产物备用。
(2)水解产物免疫刺激指数测定：同酪蛋白水解产物的免疫刺激指数测定方法。
对底物的质量百分比浓度分别为2％的乳铁蛋白溶液、胃蛋白酶与底物的质量比分别为1∶60，1∶90采用步骤(1)的方法进行胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到乳铁蛋白水解产物，并采用步骤(2)的方法进行免疫刺激指数测定的结果如表5所示。对底物的质量百分比浓度分别为4％、6％的乳铁蛋白溶液、胃蛋白酶与底物的质量比分别为1∶30，1∶60，1∶90采用步骤(1)的方法进行胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到乳铁蛋白水解产物，并采用步骤(2)的方法进行免疫刺激指数测定的结果如表5所示。
乳铁蛋白的免疫刺激指数如表6所示。
表5乳铁蛋白水解产物SI值(OD570，n＝6，x±s)
表6乳铁蛋白的免疫刺激指数
| 乳铁蛋白的浓度 | 10μg/ml | 100μg/ml | 1000μg/ml |
| 乳铁蛋白的SI值 | 1.96±0.05 | 2.07±0.03 | 2.29±0.1 |
由表5乳铁蛋白水解产物的免疫刺激指数与表6的乳铁蛋白的免疫刺激指数相比较可以看出，在相同的浓度条件下，乳铁蛋白的水解产物的免疫刺激指数高于乳铁蛋白本身的免疫刺激指数。在相同的底物浓度和酶与底物比的条件下，高浓度的免疫刺激指数高于中浓度的免疫刺激指数和低浓度的免疫刺激指数，并且，是呈由低浓度到中浓度到高浓度递增趋势的。在底物质量百分比浓度为6％，酶与底物质量比为1∶30，浓度为1000μg/ml时，对脾淋巴细胞的免疫刺激指数最高，为5.33。
使用上述得到的蛋白水解产物配制具有免疫增强功能的奶粉。
实施例1：具有免疫增强功能的奶粉的制备：
取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物1g，与100g常规的奶粉基础组分混合得到含有酪蛋白水解产物的具有增强免疫功能的奶粉。
取底物质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解乳清蛋白得到的乳清蛋白水解产物1g，与100g的常规的奶粉的基础组分混合得到含有乳清蛋白水解产物的具有增强免疫功能的奶粉。
取底物质量百分比浓度为6％、胃蛋白酶与底物比为1∶30、水解pH为3.0、水解温度为37℃的条件下胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到的乳铁蛋白水解产物1g，与100g常规的奶粉的基础组分混合得到含有乳铁蛋白水解产物的具有增强免疫功能的奶粉。
将上述得到的三种含有不同乳源蛋白水解产物的具有增强免疫功能的奶粉加入去离子水分别配制成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，用MTT法对免疫刺激指数进行检测，结果见表7。
实施例2：具有免疫增强功能的奶粉的制备：
按照乳铁蛋白水解产物∶酪蛋白水解产物∶乳清蛋白水解产物的比例为0.5％∶80％∶19.5％，上述三种乳源蛋白水解产物的添加总量为6g，取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物4.8g，取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解乳清蛋白得到的乳清蛋白水解产物1.17g，取底物质量百分比浓度为6％、胃蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH为3.0、水解温度为37℃的条件下胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到的乳铁蛋白水解产物0.03g，与100g常规的奶粉的基础组分混合得到含有三种乳源蛋白水解产物的具有增强免疫功能的奶粉。将上述得到的含有三种乳源蛋白水解产物的具有增强免疫功能的奶粉加入去离子水分别配制成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，用MTT法对免疫刺激指数进行检测，结果见表7。
实施例3：具有增强免疫功能的婴幼儿配方奶粉和老年配方奶粉的制备：
取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物6.00g，与100g常规的婴幼儿配方奶粉混合，得到含有酪蛋白水解产物的具有增强免疫功能的婴幼儿配方奶粉。将得到的具有增强免疫功能的婴幼儿配方奶粉加入去离子水分别配成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，利用MTT法测定混合物的免疫刺激指数，结果见表7。
取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物6.00g，与100g常规的老年配方奶粉混合，得到含有酪蛋白水解产物的具有增强免疫功能的老年配方奶粉。将得到的具有增强免疫功能的老年配方奶粉加入去离子水分别配成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，利用MTT法测定混合物的免疫刺激指数，结果见表7。
实施例4：具有增强免疫功能的婴幼儿配方奶粉和老年配方奶粉的制备：
按照乳铁蛋白水解产物：酪蛋白水解产物：乳清蛋白水解产物为0.5％∶80％∶19.5％，添加乳源蛋白水解产物的总量为6.00g，取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物4.8g，取底物质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH值为8.0，水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解乳清蛋白得到的乳清蛋白水解产物1.17g，取底物质量百分比浓度为6％、胃蛋白酶与底物质量为1∶30、水解pH为3.0、水解温度为37℃的条件下胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到的乳铁蛋白水解产物0.03g，以及质量为3g的山药粉，质量为2g的低聚异麦芽糖，质量为1g的初乳粉，与100g常规的老年配方奶粉基础组分充分混合，得到含有三种乳源蛋白水解产物和辅料的具有增强免疫功能的老年配方奶粉。将该老年配方奶粉加入去离子水分别配成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，利用MTT法测定混合物的免疫刺激指数，结果见表7。
按照乳铁蛋白水解产物：酪蛋白水解产物：乳清蛋白水解产物为0.5％∶80％∶19.5％，添加乳源蛋白水解产物总量为6.00g，取底物质量百分比浓度为6％、胃蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH为3.0、水解温度为37℃的条件下胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到的乳铁蛋白水解产物0.03g，取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0，水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物4.80g，取底物质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解乳清蛋白得到的乳清蛋白水解产物1.17g，以及质量为1g低聚果糖，质量为2g低聚异麦芽糖，质量为1g初乳粉，与100g常规的婴幼儿配方奶粉充分混合得到含有三种乳源蛋白水解产物和辅料的具有免疫增强功能的婴幼儿配方奶粉。将该婴幼儿配方奶粉加入去离子水分别配成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，利用MTT法测定混合物的免疫刺激指数，结果见表7。
实施例5：具有增强免疫功能的婴幼儿配方奶粉和老年配方奶粉的制备：
在底物质量百分比浓度为6％、胃蛋白酶与底物质量为1∶30、水解pH为3.0、水解温度为37℃的条件下胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到的乳铁蛋白水解产物的量为0.5g，调整酪蛋白水解产物和乳清蛋白水解产物的质量比为3∶1，乳源蛋白水解产物的添加总量为6g，即：取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物4.125g，取底物质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物质量为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解乳清蛋白得到的乳清蛋白水解产物1.375g，掺入质量为3g的山药粉、2g低聚异麦芽糖以及1g初乳粉做为辅料与100g常规中老年配方奶粉混合，得到具有免疫增强功能的中老年配方奶粉。将该具有免疫增强功能的中老年配方奶粉加入去离子水分别配成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，利用MTT法测定混合物的免疫刺激指数，结果见表7。
在底物质量百分比浓度为6％、胃蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH为3.0、水解温度为37℃的条件下胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到的乳铁蛋白水解产物的量为0.5g，调整酪蛋白水解产物和乳清蛋白水解产物的质量比为3∶2，乳源蛋白水解产物添加总量为6g，即：取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物4.4g，取底物质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解乳清蛋白得到的乳清蛋白水解产物1.1g，掺入质量为3g的山药粉、2g低聚异麦芽糖以及1g初乳粉做为辅料与100g常规中老年配方奶粉混合，得到具有免疫增强功能的老年配方奶粉。将该具有免疫增强功能的老年配方奶粉加入去离子水分别配成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，利用MTT法测定混合物的免疫刺激指数，结果见表7。
在底物质量百分比浓度为6％、胃蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH为3.0、水解温度为37℃的条件下胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到的乳铁蛋白水解产物的量为0.5g，调整酪蛋白水解产物和乳清蛋白水解产物的质量比为1∶1，乳源蛋白水解产物的添加总量为6g，即：取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物2.75g，取底物质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解乳清蛋白得到的乳清蛋白水解产物2.75g，掺入质量为3g的山药粉、2g低聚异麦芽糖以及1g初乳粉做为辅料与100g常规老年配方奶粉混合，得到具有免疫增强功能的老年配方奶粉。将该具有免疫增强功能的老年配方奶粉加入去离子水分别配成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，利用MTT法测定混合物的免疫刺激指数，结果见表7。
在底物质量百分比浓度为6％、胃蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH为3.0、水解温度为37℃的条件下胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到的乳铁蛋白水解产物的量为0.5g，调整酪蛋白水解产物和乳清蛋白水解产物的质量比为3∶1，乳源蛋白水解产物添加总量为6g，即：取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物4.125g，取底物质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解乳清蛋白得到的乳清蛋白水解产物1.375g，掺入质量为1g的低聚果糖、2g低聚异麦芽糖以及1g初乳粉做为辅料与100g的常规婴幼儿配方奶粉混合，得到具有免疫增强功能的婴幼儿配方奶粉。将该具有免疫增强功能的婴幼儿配方奶粉加入去离子水分别配成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，利用MTT法测定混合物的免疫刺激指数，结果见表7。
在底物质量百分比浓度为6％、胃蛋白酶与底物比为1∶30、水解pH为3.0、水解温度为37℃的条件下胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到的乳铁蛋白水解产物的量为0.5g，调整酪蛋白水解产物和乳清蛋白水解产物的质量比为3∶2，乳源蛋白水解产物的添加总量为6g，即：取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物4.4g，取底物质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物比质量为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解乳清蛋白得到的乳清蛋白水解产物1.1g，掺入质量为1g的低聚果糖、2g低聚异麦芽糖以及1g初乳粉做为辅料与100g的常规婴幼儿配方奶粉混合，得到具有免疫增强功能的婴幼儿配方奶粉。将该具有免疫增强功能的婴幼儿配方奶粉加入去离子水分别配成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，利用MTT法测定混合物的免疫刺激指数，结果见表7。
在底物质量百分比浓度为6％、胃蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH为3.0、水解温度为37℃的条件下胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到的乳铁蛋白水解产物的量为0.5g，调整酪蛋白水解产物和乳清蛋白水解产物的质量比为1∶1，乳源蛋白水解产物添加总量为6g，即：取底物的质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物2，75g，取底物质量百分比浓度为8％、胰蛋白酶与底物质量比为1∶30、水解pH值为8.0、水解温度为45℃的条件下胰蛋白酶水解乳清蛋白得到的乳清蛋白水解产物2.75g，掺入质量为1g的低聚果糖、2g低聚异麦芽糖以及1g初乳粉做为辅料与100g的常规婴幼儿配方奶粉混合，得到具有免疫增强功能的婴幼儿配方奶粉。将该具有免疫增强功能的婴幼儿配方奶粉加入去离子水分别配成100mg/ml、10mg/ml两种浓度，利用MTT法测定混合物的免疫刺激指数，结果见表7。
表7配方对脾淋巴细胞的免疫刺激指数(OD570，n＝6，x±s)
从表7的结果可以看出，添加乳源蛋白水解产物的老年奶粉和婴幼儿配方奶粉，在实验浓度范围内，其免疫刺激指数明显高于原配方奶粉，其中以实例4制备的奶粉效果更好。
本发明的具有增强免疫功能的奶粉的适用范围：除了适于对免疫系统尚未发育健全的婴幼儿、身体虚弱的老年外，对由于免疫低下所造成疾病的患者，均有增强免疫力和对疾病抵抗力的作用。但不适于身体正常健康的人。
食用方法：本发明的具有增强免疫功能的奶粉可按照正常奶粉食用方法和食用量食用。
功能评价：
按照国家颁布的具有增强免疫功能食品的评价方法对添加乳铁素和酪蛋白水解产物的具有增强婴幼儿和老年免疫功能的奶粉的功能评价。
实验以实例4制备的配方奶粉进行功能评价。
实验1：添加乳铁素和酪蛋白水解产物的具有增强婴幼儿和老年免疫功能的奶粉对免疫脏器质量的影响。
①建立小鼠免疫低下模型：
BalB/c小鼠30只，18-22g，康雌、雄性各半，随机分3组，每组10只。对各组小鼠分别以0、40、80mg/kgBW的环磷酰胺一次性腹腔注射，注射量为10ml/kg BW。在第2、3、4、5、6天测定脾脏指数、胸腺指数。数据经过EXCEL软件处理，用t检验进行显著性检验。根据显著程度判断造模结果。
②灌胃及指标测定：
取体重为18g-22g左右的小鼠(40只)，雌雄兼用，随机分为四组。对各组小鼠分别按照表8中各组别中的不同组分的奶粉以不同灌胃量每天灌胃，灌胃量为：20ml/kg.BW。同时设正常组对照，每天灌胃生理盐水，灌胃量为：20ml/kg.BW。连续灌胃15天，第16天灌胃表8中各组别中的不同组分的奶粉后，给小鼠一次性腹腔注射80mg/kgBW的环磷酰胺，注射量为10ml/kg.BW。再继续按照表8中各组别中的不同组分奶粉以不同的剂量灌胃，在第18天(由模型确定)，摘眼球放血处死动物，剥离胸腺和脾脏，用电子天平称重，结果以胸腺指数和脾脏指数比较各组间的差异。
胸腺指数＝胸腺质量/身体质量 (公式1)
脾脏指数＝脾脏质量/身体质量 (公式2)
③结果见表8。
表8
| 组别 | 脾脏指数 | 胸腺指数 |
| 生理盐水对照组，灌胃量20ml/kg | 3.32±0.041 | 1.38±0.026 |
| 老年配方奶粉，灌胃量0.05g/ml×20ml/kg | 3.55±0.055 | 1.42±0.025 |
| 添加乳源蛋白水解产物的老年配方奶粉，灌胃量0.05g/ml×20ml/kg | 4.04±0.090bd | 1.89±0.054bd |
| 老年配方奶粉，灌胃量0.5g/ml×20ml/kg | 3.56±0.083 | 1.43±0.022 |
| 添加乳源蛋白水解产物老年配方奶粉组，灌胃量0.5g/ml×20ml/kg | 3.92±0.107ac | 1.94±0.040bd |
| 婴幼儿配方奶粉，灌胃量0.1g/ml×20ml/kg | 3.53±0.064 | 1.43±0.032 |
| 组别 | 脾脏指数 | 胸腺指数 |
| 添加乳源蛋白水解产物的婴幼儿配方奶粉，灌胃量0.1g/ml×20ml/kg | 3.94±0.084bd | 1.94±0.043bd |
| 婴幼儿配方奶粉，灌胃量1g/ml×20ml/kg | 3.51±0.036 | 1.44±0.026 |
| 添加乳源蛋白水解产物的婴幼儿配方奶粉，灌胃量1g/ml×20ml/kg | 3.97±0.069bd | 2.01±0.036bd |
注：与生理盐水对照组a代表p＜0.05，b代表p＜0.01，与同剂量配方奶粉相比c代表p＜0.05，d代表p＜0.01，灌胃剂量20ml/kg。
由表8可以看出，添加乳源蛋白水解产物的老年奶粉，在以每公斤体重灌胃1克奶粉(0.05g/ml×20ml/kg)时，与生理盐水对照组及原老年奶粉组相比，具有强显著差异；而增加该奶粉灌胃量，以每公斤体重灌胃10克奶粉(0.5g/ml×20ml/kg)时，与生理盐水对照组及原老年奶粉组相比，显示出显著差异。说明，在食用添加乳源蛋白水解产物的老年配方奶粉，在食用量为1-10g/kg的范围内可显著提高免疫作用。但剂量过高，效果会减弱。
同样，添加乳源蛋白水解产物的婴幼儿配方奶粉，在食用量为2-20g/kg的范围内，与生理盐水对照组及原老年奶粉组相比，可显著提高免疫作用，并且均呈现强显著性。
实验2：添加乳铁素和酪蛋白水解产物的具有增强婴幼儿和老年免疫功能的奶粉对细胞免疫功能影响。
采用二硝基氟苯诱导小鼠迟发型过敏反应(DTH)(耳肿胀法)进行实验。
①建立小鼠免疫低下模型：BalB/c健康小鼠30只，18-22g，雌、雄性各半，随机分3组，每组10只。对各组小鼠分别以0、40、80mg/kg BW的环磷酰胺一次性腹腔注射，注射量为10ml/kgBW。在给药后第2、3、4、5、6天每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm、用DNFB溶液50μl均匀涂抹致敏。5天后，用DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。经过EXCEL软件处理，用t检验进行显著性检验。根据显著程度判断造模结果。
②灌胃及检测
取体重为18g-22g左右的小鼠(40只)，雌雄兼用，随机分为四组。对各组小鼠分别按照表9中各组别中的不同组分的奶粉以不同灌胃量每天灌胃，灌胃量为：20ml/kg.BW。同时设正常组，每天灌胃生理盐水，灌胃量也为：20ml/kg.BW。连续用药15天。第16天灌胃表9中各组别中的不同组分的奶粉后，给小鼠一次性腹腔注射80mg/kgBW的环磷酰胺，注射量为10ml/kg.BW。再继续按照表9中各组别中的不同组分的奶粉以不同的剂量灌胃，在第18天(由模型确定)，每只鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm、用DNFB溶液50μl均匀涂抹致敏。隔5天后，用DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。
③数据处理及结果判断：
所得数据用EXCEL软件处理，以x±s表示，用t检验进行显著性检验。左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于与对照组的差值，判定实验结果是否阳性。结果见表9。
表9添加乳铁素和酪蛋白水解产物的奶粉对耳肿胀变化结果
注：与生理盐水对照组a代表p＜0.05， b代表p＜0.01，与同剂量配方奶粉相比c代表p＜0.05，d代表p＜0.01，灌胃剂量20ml/kg。
由表9可以看出，添加乳源蛋白水解产物的老年奶粉，在以每公斤体重灌胃1克奶粉(0.05g/ml×20mL/kg)和以每公斤体重灌胃10克奶粉(0.5g/ml×20ml/kg)时，与生理盐水对照组及原老年奶粉组相比，显示出显著差异，且从数值上有增加趋势。说明，在食用添加乳源蛋白水解产物的老年配方奶粉，在食用量为1-10g/kg的范围内可显著提高免疫作用。
同样，添加乳源蛋白水解产物的婴幼儿配方奶粉，在食用量为2-20g/kg的范围内，与生理盐水对照组及原婴儿配方奶粉组相比，可显著提高免疫作用。
实验3：添加乳铁素和酪蛋白水解产物的具有增强婴幼儿和老年免疫功能的奶粉对体液免疫影响。
实验采用血清溶血素实验方法：
①建立小鼠免疫低下模型：
BalB/c健康雌、雄性(各半)小鼠30只，18-22g，随机分3组，每组10只。对各组小鼠分别以0、40、80mg/kgBW的环磷酰胺一次性腹腔注射，注射量为10ml/kg BW。在给药后第2、3、4、5、6天每只鼠腹腔注射0.2mlSRBC细胞悬液进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μl，再加入100μl 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。经过EXCEL软件处理，用t检验进行显著性检验。根据显著程度判断造模结果。
②灌胃及血清溶血素测定：
取体重为18g-22g左右的小鼠(40只)，雌雄兼用，随机分为四组。对各组小鼠分别按照表10中各组别中的不同组分的奶粉以不同灌胃量每天灌胃，灌胃量为：20ml/kg BW。同时设正常组，每天灌胃生理盐水，灌胃量也为：20ml/kg BW。连续用药15天。第16天灌胃表10中各组别中的不同组分的奶粉后，给小鼠一次性腹腔注射80mg/kg BW的环磷酰胺，注射量为10ml/kg BW。再继续按照表10中各组别中的不同组分的奶粉以不同的剂量灌胃，在第17天(由模型确定)，每只小鼠腹腔注射0.2mlSRBC细胞悬液进行免疫。隔4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μl，再加入100μl 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。
③数据处理及结果判断：
所得数据用EXCEL软件处理，以x±s表示，用t检验进行显著性检验，结果见表10。
表10添加乳铁素和酪蛋白水解产物的奶粉对体液免疫影响
注：与生理盐水对照组a代表p＜0.05， b代表p＜0.01，与同剂量配方奶粉相比c代表p＜0.05， d代表p＜0.01，灌胃剂量20ml/kg。
由表10可以看出，添加水解的老年奶粉，在以每公斤体重灌胃1克奶粉(0.05g/ml×20ml/kg)和以每公斤体重灌胃10克奶粉(0.5g/ml×20ml/kg)时，与生理盐水对照组及原老年奶粉组相比，显示出强显著差异。说明，在食用添加乳源蛋白水解产物的老年配方奶粉，在食用量为1-10g/kg的范围内可显著提高免疫作用。
同样，添加乳源蛋白水解产物的婴幼儿配方奶粉，在食用量为2-20g/kg的范围内，与生理盐水对照组及原婴儿配方奶粉组相比，具有强显著提高免疫作用。
实验4：添加乳铁素和酪蛋白水解产物的具有增强婴幼儿和老年免疫功能的奶粉对单核-巨嗜细胞功能的影响。
实验采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)。
①建立小鼠免疫低下模型：
BalB/c健康雌、雄性(各半)小鼠30只，18-22g，随机分3组，每组10只。对各组小鼠分别以0、40、80mg/kgBW的环磷酰胺一次性腹腔注射，注射量为10ml/kg BW。在给药后第2、3、4、5、6天测定吞噬功能，经过数据处理，根据显著程度判断造模结果。
②吞噬功能测定：
取体重为18g-22g左右的小鼠(40只)，雌雄兼用，随机分为四组。对各组小鼠分别按照表11中各组别中的不同组分的奶粉以不同剂量每天灌胃，灌胃量为：20ml/kg BW。同时设正常组，每天灌胃生理盐水，灌胃量也为：20ml/kg BW。连续灌胃15天。第16天灌胃表11中各组别中的不同组分的奶粉后，给小鼠一次性腹腔注射80mg/kg BW的环磷酰胺，注射量为10ml/kg BW。再继续按照表11中各组别中的不同组分的奶粉以不同的剂量灌胃，在第18天(由模型确定)，每鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml。间隔30min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿沙布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。
③数据处理及结果判定：
所得数据用EXCEL软件处理，以x±s表示，用t检验进行显著性检验，结果见表11。表11添加乳铁素和酪蛋白水解产物的奶粉对单核巨嗜细胞功能的影响
| 组别 | 吞噬率 | 吞噬指数 |
| 生理盐水对照组，灌胃量20ml/kg | 43.4±0.58 | 0.75±0.009 |
| 老年配方奶粉，灌胃量0.05g/ml×20ml/kg | 44.3±0.73 | 0.75±0.007 |
| 添加乳源蛋白水解产物的老年配方奶粉，灌胃量0.05g/ml×20ml/kg | 49±1.2bd | 0.81±0.007bd |
| 组别 | 吞噬率 | 吞噬指数 |
| 老年配方奶粉，灌胃量0.5g/ml×20ml/kg | 44.1±0.59 | 0.75±0.011 |
| 添加乳源蛋白水解产物老年配方奶粉组，灌胃量0.5g/ml×20ml/kg | 49.3±1.08bd | 0.79±0.010ac |
| 婴幼儿配方奶粉，灌胃量0.1g/ml×20ml/kg | 43.4±0.79 | 0.75±0.010 |
| 添加乳源蛋白水解产物的婴幼儿配方奶粉，灌胃量0.1g/ml×20ml/kg | 48.6±1.07bd | 0.79±0.011ac |
| 婴幼儿配方奶粉，灌胃量1g/ml×20ml/kg | 44.8±0.77 | 0.74±0.013 |
| 添加乳源蛋白水解产物的婴幼儿配方奶粉，灌胃量1g/ml×20ml/kg | 48.7±0.82ac | 0.78±0.010ac |
注：与生理盐水对照组a代表p＜0.05，b代表p＜0.01，与同剂量配方奶粉相比c代表p＜0.05，d代表p＜0.01，灌胃剂量20ml/kg。
由表11可以看出，添加乳源蛋白水解产物的老年奶粉，在以每公斤体重灌胃1克奶粉(0.05g/ml×20ml/kg)和以每公斤体重灌胃10克奶粉(0.5g/ml×20ml/kg)时，与生理盐水对照组及原老年奶粉组相比，显示出显著差异。说明，添加乳源蛋白水解产物的老年配方奶粉，在食用量为1-10g/kg的范围内可显著提高免疫作用。
同样，添加乳源蛋白水解产物的婴幼儿配方奶粉，在食用量为2-20g/kg的范围内，与生理盐水对照组及原婴儿配方奶粉组相比，可显著提高免疫作用。
根据上述实验结果可以判定，添加乳源蛋白水解产物的婴幼儿和老年配方奶粉，具有增强免疫的作用。
Claims (10)
1.一种具有增强免疫功能的奶粉，包括由奶粉基础组分组成的奶粉基质，其特征在于，在100克奶粉基质中添加1-6克水分含量小于5％的采用人体消化系统所具有的蛋白酶水解乳源蛋白的乳源蛋白水解产物，所述乳源蛋白水解产物为乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物中的至少一种；所述人体消化系统所具有的蛋白酶为胰蛋白酶或胃蛋白酶；
所述乳铁蛋白水解产物采用下述方法制备：将胃蛋白酶与乳铁蛋白在温度为35-40℃、pH值为2-4的条件下水解3-4h，将水解产物冷冻干燥至水分含量小于5％得到乳铁蛋白水解产物，其中底物的质量百分比浓度为2-7％，胃蛋白酶与底物的质量比为1∶30-150；
所述酪蛋白水解产物采用下述方法制备：将胰蛋白酶与酪蛋白在温度为40-50℃、pH值为7.5-8.5的条件下水解90-120min，将水解产物冷冻干燥至水分含量小于5％得到胰蛋白酶水解酪蛋白的酪蛋白水解产物，其中，底物的质量百分比浓度为2-8％，所述胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30-200；
所述乳清蛋白水解产物采用下述方法制备：将乳清蛋白与胰蛋白酶在温度为40-50℃、pH值为7.5-8.5的条件下水解90-120min，将水解产物冷冻干燥至水分含量小于5％得到胰蛋白酶水解乳清蛋白的乳清蛋白水解产物，其中，底物的质量百分比浓度为2-8％，所述胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30-150。
2.根据权利要求1所述的具有增强免疫功能的奶粉，其特征在于，当奶粉中含有乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物三种乳源蛋白水解产物时，乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物的质量比例为乳源蛋白水解产物总量的0.5％∶80％∶19.5％。
3.根据权利要求1所述的具有增强免疫功能的奶粉，其特征在于，当奶粉中含有乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物三种乳源蛋白水解产物时，在乳铁蛋白水解产物的添加量为0.5g条件下，酪蛋白水解产物和乳清蛋白水解产物的质量比为1-3∶1。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的具有增强免疫功能的奶粉，其特征在于，在100g奶粉基质中还添加质量为1g的低聚果糖、质量为2g低聚异麦芽糖和质量为1g初乳粉。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的具有增强免疫功能的奶粉，其特征在于，在100g奶粉基质中还添加质量为3g的山药粉、质量为2g的低聚异麦芽糖和质量为1g的初乳粉。
6.一种权利要求1所述的具有增强免疫功能的奶粉的生产方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)采用人体消化系统所具有的蛋白酶水解乳源蛋白制备乳源蛋白水解产物：
称取乳铁蛋白，用去离子水溶解，配成底物的质量百分比浓度为2-7％的乳铁蛋白水溶液，调整pH为2-4，将胃蛋白酶溶液缓慢加到乳铁蛋白水溶液中，于35-40℃条件下，水解3-4h，水解过程中维持pH值不变；水解结束后，80℃加热15min灭酶，调节pH值为中性，离心，收集上清液，冷冻干燥至水分含量小于5％，获得胃蛋白酶水解乳铁蛋白的乳铁蛋白水解产物；其中，胃蛋白酶与底物的质量比为1∶30-150；
调整质量百分比浓度为2％-8％的酪蛋白溶液pH值为7.5-8.5，将胰蛋白酶溶液加入到酪蛋白溶液中，于40-50℃水解90-120min，水解过程中维持pH值不变，水解结束后80℃灭酶15min，调节pH值为中性，离心，取上清液，冷冻干燥至水分含量小于5％，获得胰蛋白酶水解酪蛋白的酪蛋白水解产物；其中，胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30-200；
调整质量百分比浓度为2-8％的乳清蛋白溶液的pH值为7.5-8.5，将胰蛋白酶溶液加入到乳清蛋白溶液中，于温度为40-50℃的条件下水解90-120min，水解过程中维持pH值不变，水解结束后80℃灭酶15min，调节pH值为中性，离心，取上清液，冷冻干燥至水分含量小于5％得到胰蛋白酶水解乳清蛋白的乳清蛋白水解产物，其中，胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30-150；
(2)将上述得到的乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物中的至少一种按照每100克奶粉基质中添加1-6克的比例加入到奶粉基质中混合均匀得到具有增强免疫功能的奶粉。
7.根据权利要求6所述的具有增强免疫功能的奶粉的生产方法，其特征在于，步骤(1)中胃蛋白酶水解乳铁蛋白的条件为：底物的质量百分比浓度6％，胃蛋白酶与底物的质量比为1∶30，水解pH值为3.0，水解温度为37℃，水解时间3h。
8.根据权利要求6所述的具有增强免疫功能的奶粉的生产方法，其特征在于，步骤(1)中胰蛋白酶水解酪蛋白的条件为：底物的质量百分比浓度为8％，胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30，水解pH值为8.0，水解温度为45℃，水解时间为110min。
9.根据权利要求6所述的具有增强免疫功能的奶粉的生产方法，其特征在于，步骤(1)中胰蛋白酶水解乳清蛋白的条件为：底物的质量百分比浓度为8％，胰蛋白酶与底物的质量比为1∶30，水解pH值为8.0，水解温度为45℃，水解时间为110min。
10.根据权利要求6所述的具有增强免疫功能的奶粉的生产方法，其特征在于，在步骤(2)中，在100g奶粉基质中还添加质量为2g的低聚异麦芽糖、质量为1g的初乳粉、质量为1g的低聚果糖或质量为3g的山药粉与乳铁蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物中的至少一种和奶粉基质充分混合得到具有增强免疫功能的奶粉。
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