CN101693112A - 一种去氧鬼臼毒素环糊精包合物、其制法及抗癌用途 - Google Patents

一种去氧鬼臼毒素环糊精包合物、其制法及抗癌用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及制药领域，具体涉及一种去氧鬼臼毒素的环糊精包合物及其制备方法和抗癌用途。其特征是：去氧鬼臼毒素与β-环糊精衍生物的摩尔比为1∶1～1∶10，其中所述的β-环糊精衍生物为磺丁基醚β-环糊精或羟丙基β-环糊精。本发明将去氧鬼臼毒素通过选择合适的环糊精衍生物进行包合，制成水溶性制剂，使其可以进行动物体内外试验、进而开发成治疗多种癌症的药物。

Description

一种去氧鬼臼毒素环糊精包合物、其制法及抗癌用途
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种去氧鬼臼毒素的环糊精包合物及其制备方法和用途。
背景技术
去氧鬼臼毒素(DPT)是从中药桃儿七Sinopodophyllum emodi(Wall.)提取纯化而得的化合物。早在上世纪90年代即有实验报道，证明DPT对P-388白血病、人肺癌A-549及结肠癌HT-29的细胞株具有体外抑制作用(Arch Pharm(Weinheim).1994 Mar；327(3)：157～9.PlataMed.1993 Jun；59(3)：246～9)，但仅仅停留在体外活性试验阶段。十多年来之所以没有体内活性的试验报道，其主要原因是由于该化合物不溶于水，无法制成可供静脉注射的制剂。上世纪70年代利用鬼臼毒素4位羟基合成了一系列糖苷衍生物，其中著名的有依托泊苷(Etopside)和替尼泊苷(Teniposide)，并已成功应用于临床。但DPT的4位不存在羟基，无法制成糖苷类衍生物。如何将DPT制成注射剂以验证其动物体内抗癌活性、并进一步将其应用于临床，成为科学家研究的重大课题。
发明内容
本发明的目的是将去氧鬼臼毒素(以下简称DPT)制成水溶性制剂，使其可以进行动物体内外试验、进而开发成治疗多种癌症的药物。
DPT在水中的溶解度约为0.5mg/L，近乎不溶。本发明将DPT通过用β-环糊精(β-CD)衍生物包合制得水溶性较好的DPT包合物。试验发现，在制备DPT包合物时，β-CD的亲水性衍生物羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)和其可离子化衍生物磺丁基醚-β-环糊精(SBE-β-CD)与DPT包合效果远远好于其它β-CD衍生物的包合产物，制得的包合物具有极大的水溶性，可满足动物体内抗癌活性试验的要求。在此基础上，优选出去氧鬼臼毒素与β-环糊精衍生物的摩尔比为1∶1～1∶10，本发明以下所述的β-环糊精衍生物为磺丁基醚β-环糊精或羟丙基β-环糊精。
试验发现，包合物中β-环糊精衍生物与DPT摩尔比不同，导致DPT溶解度也不同。将HP-β-CD在不同条件下与DPT制成包合物，用紫外分光光度法测定包合物中DPT的含量，进一步计算出包合物中DPT与HP-β-CD的组成摩尔比；用中国药典2005年版凡例规定的方法测定包合物在水中的溶解度，进而计算出该包合物中DPT的溶解度。结果见表1。
表1  DPT与HP-β-CD包合物的组成及溶解度
  样品序号   DPT∶HP-β-CD(摩尔比)   DPT溶解度(mg/L)
  1   1∶0.54   45.8
  样品序号   DPT∶HP-β-CD(摩尔比)   DPT溶解度(mg/L)
  2   1∶0.82   62.5
  3   1∶1.08   145
  4   1∶1.65   263
  5   1∶2.24   597
  6   1∶4.06   882
  7   1∶6.35   1018
  8   1∶10.1   1142
  9   1∶13.6   1208
  10   1∶15.3   1247
从表1可见，随着包合物中HP-β-CD比例逐渐增大，DPT的溶解度也逐步增大。当包合物中HP-β-CD与DPT的摩尔之比为2.24∶1时，DPT的溶解度增至597mg/L已可满足体内药效学试验要求。当包合物中HP-β-CD与DPT组成摩尔比大于6.35∶1，虽然DPT的溶解度也会有所增加，但相对幅度已很小；更重要的是，此时反应液中，因HP-β-CD浓度太大，导致反应体系的粘度很大，过滤和浓缩、干燥工艺难度大，可操作性差。因此，当使用HP-β-CD与DPT进行包合时，优选的DPT与HP-β-CD的摩尔比为1∶2.24～1∶6.35。
当选用SBE-β-CD对DPT进行包合时，同样地，包合物中SBE-β-CD与DPT摩尔比不同，导致DPT溶解度也不同。见表2。
表2DPT与SBE-β-CD包合物的组成及溶解度
  样品序号   DPT∶SBE-β-CD(摩尔比)   DPT溶解度(mg/L)
  1   1∶0.48   108
  2   1∶0.72   182
  3   1∶1.00   615
  4   1∶2.33   1238
  样品序号   DPT∶SBE-β-CD(摩尔比)   DPT溶解度(mg/L)
  5   1∶3.27   2351
  6   1∶6.42   5938
  7   1∶8.06   8154
  8   1∶11.9   9806
  9   1∶13.4   10620
  10   1∶15.6   11385
从表2可见，随着包合物中SBE-β-CD比例逐渐增大，DPT的溶解度也逐步增大。当包合物中SBE-β-CD与DPT的摩尔之比为1.00∶1时，DPT的溶解度增至615mg/L，已满足体内药效学试验所需。当包合物中SBE-β-CD与DPT组成摩尔比大于8.06时，DPT的溶解度虽仍有所增加，但相对增幅已很小；更重要的是，此时反应液粘度很大，过滤和浓缩、干燥工艺难度大，操作困难。因此，当使用SBE-β-CD与DPT进行包合时，优选的DPT与SBE-β-CD的摩尔比为1∶1.00～1∶8.06。
比较表1和表2，SBE-β-CD较HP-β-CD对DPT的增溶作用更强。因此，选用SBE-β-CD与DPT的包合物进行体内外抗癌活性试验。
本发明的包合物的制备方法，包括：将β-CD衍生物配成水溶液，保温搅拌或研磨，DPT溶于有机溶剂中制成，所述有机溶剂为乙醇、丙酮或甲醇，滴加到β-环糊精衍生物的水溶液中，滴毕继续保温搅拌或研磨，干燥即得。
其中β-CD衍生物配成的水溶液浓度优选为30％～40％，为重量体积百分比。
其中包合温度优选40℃～70℃。更优选50℃～55℃。
其中有机溶剂优选乙醇。
其中DPT溶液滴加完毕后，继续搅拌或研磨时间优选0.5～3小时。更优选1～2小时。
试验发现：不同的条件制备DPT-β-CD衍生物包合物其结果也不同DPT-HP-β-CD包合物的制备：
用水溶液搅拌-减压浓缩干燥法制备，具体操作如下：
配制100ml不同浓度的HP-β-CD水溶液，于烧杯中加温磁力搅拌，逐滴加入DPT的乙醇溶液(DPT与HP-β-CD按1∶2摩尔比投料)，滴毕，继续保温搅拌一定时间，用0.45μm滤膜乘热过滤，除去未包合的DPT，滤液以薄膜旋转减压浓缩，真空干燥，得白色固体。
对HP-β-CD溶液浓度、包合温度、包合时间三个因素，在三个水平(HP-β-CD溶液浓度：10％、20％、30％；温度：40℃、50℃、60℃；时间：1h、2h、3h)进行正交试验设计，以包合物中DPT的含量和溶解度作为包合效果的考核指标，试验结果见表3。包合物中DPT的含量用紫外分光光度法测定。溶解度用中国药典2005年版凡例规定的方法测定，结果见表4。
从表3综合评分的极差值(R)判断，三个因素中以HP-β-CD的浓度对包合效果的影响最大，其中以浓度为30％的最佳；包合温度的影响次之，其中以50℃为最佳；包合时间的影响最小，其中以1h为较好。因此，最佳包合工艺的条件为：30％HP-β-CD水溶液，包合温度50℃，DPT乙醇溶液滴加完毕后继续搅拌1h。
上述9份试验样品中DPT与HP-β-CD的组成摩尔比在1∶2.07～1∶2.40，平均为1∶2.24；溶解度在352～943mg/L，平均为597mg/L。
表3DPT-HP-β-CD包合正交试验结果
Figure G2009100359780D0000041
注：综合评分＝溶解度×0.7+含药量×0.3。
包合的目的是为了增加其溶解度，所以将其权重定为0.7。
表4DPT-HP-β-CD包合物的溶解度试验结果
  样品号   供试品取样量(mg)   内含DPT的量(mg)   完全溶解时水量(ml)   溶解度(mg/L)
  1   99.5   10.85   29.0   374
  样品号   供试品取样量(mg)   内含DPT的量(mg)   完全溶解时水量(ml)   溶解度(mg/L)
  2   91.3   10.39   26.0   400
  3   87.6   10.03   28.5   352
  4   86.7   10.20   18.5   551
  5   105.3   11.44   19.0   602
  6   91.5   10.69   20.5   521
  7   98.8   11.94   15.0   796
  8   110.5   13.68   14.5   943
  9   84.5   10.01   12.0   834
DPT-SBE-β-CD包合物的制备：
用水溶液搅拌-冷冻干燥法制备，具体操作如下：
配制100ml不同浓度的SBE-β-CD水溶液，于烧杯中加温磁力搅拌，逐滴加入DPT的丙酮溶液(DPT与SBE-β-CD按1∶3摩尔比投料)，滴毕，继续保温搅拌一定时间，室温静置2h，用0.45μm滤膜过滤，滤液在冰箱中预冻12h，移至冻干机中冷冻干燥48h，得白色固体。
对SBE-β-CD溶液浓度、包合温度、包合时间三个因素，在三个水平(SBE-β-CD溶液浓度：10％、25％、40％；包合温度：40℃、55℃、70℃；包合时间：0.5h、1h、2h)进行正交试验设计，以包合物中DPT的含量和溶解度作为包合效果的考核指标，试验结果见表5。包合物中DPT的含量用紫外分光光度法测定。溶解度按中国药典2005年版凡例规定的方法测定，结果见表6。
表5DPT-SBE-β-CD包合正交试验结果
Figure G2009100359780D0000051
注：综合评分＝溶解度×0.7+含药量×0.3。
包合的目的是为了增加DPT的溶解度，所以将其权重定为0.7。
表6DPT-SBE-β-CD包合物的溶解度试验结果
  样品号   供试品取样量(mg)  内含DPT的量(mg)   完全溶解时水量(ml)   溶解度(mg/L)
  1   188   10.90   14.8   736
  2   175   11.06   13.5   819
  3   170   9.42   13.8   683
  4   192   10.33   6.50   1589
  5   185   10.95   6.25   1752
  6   198   9.59   6.35   1510
  7   210   10.21   2.30   4439
  8   205   10.70   2.10   5095
  9   195   8.85   1.95   4538
从表5综合评分的极差值(R)判断，三个因素中以SBE-β-CD的浓度对包合效果的影响最大，其中以浓度为40％最佳；包合温度的影响次之，其中以55℃为最佳；包合时间的影响最小，其中以2h为较好。因此，最佳包合工艺的条件为：40％SBE-β-CD水溶液，包合温度55℃，DPT丙酮溶液滴加完毕后继续搅拌2h。
上述9份试验样品中，DPT与SBE-β-CD的组成摩尔比在1∶2.74～1∶3.89，平均为1∶3.27；溶解度在736～5095mg/L，平均为2351mg/L。
用SBE-β-CD与DPT的包合物作的一种动物肿瘤细胞和6种人肿瘤细胞的体外活性试验中，DPT均有显著抑制作用，其中对大鼠胶质瘤(C6)、人肺腺癌细胞(A-549)、人白血病细胞(HL-60)、人红白血病细胞(K-562)、人宫颈癌细胞(Hela)和人胃癌细胞(BGC-823)的抑制作用较依托泊苷强(浓度在10-5～10-8M)。且DPT在10-5～10-8M浓度范围内对上述所有试验瘤株的抑制作用无显著变化，而依托泊苷在10-5～10-8M浓度区间的抑制作用呈显著下降。
用SBE-β-CD与DPT的包合物溶解于生理盐水后，采用尾静脉注射对小鼠移植瘤S180、Heps抑制作用试验表明：DPT的给药剂量为10、5mg/Kg时，对S180的抑瘤率分别为54.53、41.67％，对Heps的抑瘤率分别为52.09、42.27％，均有显著抑制作用；且与阳性对照药环磷酰胺(20mg/Kg)和依托泊苷(20mg/Kg)的抑瘤作用相近。
用SBE-β-CD与DPT的包合物溶解于水后尾静脉注射对人非小细胞肺癌H460裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用试验表明：DPT的给药剂量为8mg/Kg时，肿瘤增值率(T/C)为49.68％，抑瘤率为43.08％，有显著抑制作用，与阳性对照药依托泊苷(20mg/Kg)抑制作用接近。试验表明：DPT各剂量组对实验动物体重均无明显抑制，而依托泊苷组对实验动物体重则有明显抑制，表明DPT的毒性较依托泊苷小。
下面是用DPT与SBE-β-CD包合物进行的具体药理试验及结果。
DPT包合物对不同肿瘤细胞的体外活性试验：
试验瘤株，分别是A-549(人肺腺癌细胞)，BGC-823(人胃癌细胞)，C-6(大鼠神经胶质瘤)，Hep G2(人肝癌细胞)，HL-60(人白血病细胞)，K-562(人红白血病细胞)和Hela(人宫颈癌)。试验样品为DPT与SBE-β-CD的包合物(含量为5.05％)；对照药为依托泊苷注射液(规格5ml∶0.1g，齐鲁制药有限公司生产)。实验前均用生理盐水配制成10-2M的母液，再分别稀释成5个不同浓度梯度的供试液：C1 5×10-5M，C2 10-5M，C3 10-6M，C4 10-7M和C5 10-8M。
实验方法：取处于对数生长期的不同瘤株细胞按一定的细胞量接种于96孔培养板内，培养24h后加入所筛样品(悬浮细胞接种后可直接加)，细胞在37℃，5％CO2条件下继续培养48h后，加入MIT继续培养4h，用DMSO溶解在酶标仪下进行检测。结果见表7。
表7DPT、依托泊苷对7种肿瘤细胞体外生长的抑制作用
Figure G2009100359780D0000071
结果表明：DPT对一种动物肿瘤细胞和六种人肿瘤细胞均有显著抑制作用，其中对大鼠神经细胞胶质瘤(C6)、人肺腺癌细胞(A-549)、人白血病细胞(HL-60)、人红白血病细胞(K-562)、人宫颈癌细胞(Hela)和人胃癌细胞(BGC-823)的抑制作用较依托泊苷强(浓度在10-5～10-8M)。作用特点是：DPT在10-5～10-8M浓度之间对上述所有试验瘤株的抑制作用无显著变化，而依托泊苷在10-5～10-8M浓度区间的抑制作用则显著下降。DPT包合物尾静脉注射对小鼠移植瘤S180、Heps的抑制作用：
受试药物：DPT与SBE-β-CD包合物，含量5.05％，用生理盐水配制成所需浓度。
实验组别：DPT设10，5，2.5mg/kg 3个剂量组；空白对照组；阳性药对照组：环磷酰胺(CTX)组20mg/kg、依托泊苷组20mg/kg。
给药途径：尾静脉注射，按0.4ml/20g体积给药。给药周期：于接种24h后给药，隔天一次，共4次。
实验方法取标准体重18～22g ICR小鼠60只，按移植瘤试验法，接种S-180或Heps实体型瘤，每个小鼠的右前肢腋窝皮下接种0.2ml，接种后24h称体重，并随机分为6组：空白对照组、CTX组(20mg/kg)、依托泊苷组(20mg/kg)、DPT组(10，5，2.5mg/Kg)。在接种24h后给药，隔天一次，共给药4次，于停药后第二天处死荷瘤小鼠并称其体重，对分离出的瘤块称重，所得数据进行统计学处理(t检验)。试验结果见表8～9。
表8DPT iv对小鼠移植瘤Heps的抑制作用(X±SD)(n＝10)
Figure G2009100359780D0000081
*P＜0.05，**P＜0.01与空白组比较
实验结果表明，对小鼠移植瘤S180，与空白对照组相比，DPT(10，5mg/kg)组的抑瘤率分别为54.53，41.67％，皆有显著抑制S180肿瘤生长的作用(P＜0.01)；对鼠移植瘤Heps，与空白对照组相比，DPT(10，5mg/lg)组的抑瘤率分别为52.09，42.27％，皆有显著抑制Heps肿瘤生长的作用(P＜0.01)，达到国家SFDA对抗肿瘤药物研究指导原则的要求(抑制率＞40％)。与阳性对照药环磷酰胺(20mg/Kg)和依托泊苷(20mg/Kg)相比，抗肿瘤作用相近。
表9DPT iv对小鼠移植瘤S180的抑制作用(X±SD)(n＝10)
Figure G2009100359780D0000091
*P＜0.05，**P＜0.01与空白组比较
DPT包合物对人非小细胞肺癌H460裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用：
受试药物DPT与SBE-β-CD包合物，含量5.05％。配制方法：用适量生理盐水溶解，轻轻振摇使溶解，浓度为0.4mg/ml(此为8mg/kg剂量组的受试药液)；其它浓度取0.4mg/ml母液用生理盐水稀释至所需浓度。
对照药物依托泊苷注射液齐鲁制药有限公司出厂批号8060012EV规格：5ml：0.1g。配制方法：依托泊苷注射液为澄明的黏稠液体，用适量生理盐水稀释，轻轻振摇成均匀溶液，浓度为1mg/ml。
剂量设置DPT高剂量组为8mg/kg，DPT中剂量组为4mg/kg，DPT低剂量组为2mg/kg。阳性对照依托泊苷注射液组剂量为20mg/kg。
实验动物来源、种系、品系：BALB/c裸小鼠，由中国医学科学院实验动物研究所提供。日龄：35-40天；体重：18-24g；性别：雄性
移植瘤人非小细胞肺癌H460裸小鼠移植瘤，由人非小细胞肺癌H460细胞株接种于裸小鼠腋窝皮下而建立。细胞接种量为2×106。
实验方法
取对数生长期的人非小细胞肺癌H460细胞株，在无菌条件下，制备成2×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100～300mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次，。给药体积为0.4ml/20g。给药21天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：
TV＝1/2×a×b2    其中a、b分别表示长、宽。
根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，按照公式计算如下：
T / C ( % ) = T RTV C RTV × 100
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。
实验结果
DPT对人非小细胞肺癌H460裸小鼠移植瘤的实验性治疗结果见表10～11。DPT以8mg/kg尾静脉注射给药，每周3次，共给药9次，给药21天后，对人非小细胞肺癌H460裸小鼠移植瘤的T/C(％)为49.68％；抑瘤率为43.08％。且DPT各剂量组对实验动物体重均无明显的抑制作用。
阳性对照药依托泊苷注射液以20mg/kg尾静脉注射给药，每周3次，共给药9次，给药21天后，对人非小细胞肺癌H460裸小鼠移植瘤的T/C为32.18％；抑瘤率为61.08％。但对实验动物体重有明显的抑制作用，表现出明显的毒性。
实验结论：
DPT对人非小细胞肺癌H460裸小鼠移植瘤的T/C和抑瘤率的实验结果表明对人非小细胞肺癌H460裸小鼠移植瘤的生长有显著抑制作用，显示DPT具有良好的抗肿瘤活性，达到国家SFDA对抗肿瘤新药有效性(T/C＜60％，抑瘤率＞40％)的要求，且毒性较小。
表10DPT对人非小细胞肺癌H460裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用(X±SD)
组别 剂量mg/kg 起始体重(g)   起始动物数 终末体重(g)   终末动物数 瘤重(g) 抑瘤率(％)
  空白对照组   -   22.83±1.60   6   25.61±2.32   6   3.25±0.91   -
组别 剂量mg/kg 起始体重(g)   起始动物数 终末体重(g)   终末动物数 瘤重(g) 抑瘤率(％)
  Etoposide组   20   22.67±1.37   6   16.82±2.06**   6   1.27±0.61**   61.08
  DPT高剂量组   8   22.33±1.51   6   22.55±2.50   6   1.85±0.95*   43.08
  DPT中剂量组   4   23.33±2.25   6   23.32±2.08   6   2.52±0.92   22.56
  DPT低剂量组   2   22.50±1.38   6   25.32±2.25   6   2.94±0.68   9.49
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表11DPT对人非小细胞肺癌H460裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的影响(X±SD，n＝6，肿瘤体积：单位mm3)
Figure G2009100359780D0000102
Figure G2009100359780D0000111
附图说明
图1是DPT(a)、SBE-β-CD(b)及其包合物(c)的X-射线粉末衍射图
图2是DPT(a)、SBE-β-CD(b)及其包合物(c)的差示扫描量热法(DSC)图
具体实施方式
实施例1
将30％HP-β-CD水溶液100ml置于500ml三颈玻瓶中，水浴加热，使内温保持在50±5℃，搅拌下滴加10％DPT乙醇溶液44ml，滴毕继续保温搅拌1小时，同时收集蒸发的乙醇。用0.45μm滤膜趁热过滤，滤液用薄膜旋转减压浓缩，稠状物继续真空干燥，得白色块状物33.6g。用紫外分光光度法测定DPT的含量为12.12％；用2005年版中国药典凡例方法测得该包合物中DPT在水中的溶解度为84.1％(mg/ml)。
实施例2
将30％SBE-β-CD水溶液200ml置于500ml三颈玻瓶中，水浴加热，使内温保持在50±5℃，搅拌下滴加10％DPT丙酮溶液37.3ml，滴毕继续保温搅拌2小时，室温静置2小时，用0.45μm滤膜趁热过滤，滤液预冻12小时，再于-45℃冷冻干燥48小时。得白色疏松状固体，重62.9克。用紫外分光光度法测定DPT的含量为5.05％；用2005年版中国药典凡例方法测得该包合物中DPT在水中的溶解度为460％(mg/ml)
DPT-SBE-β-CD包合物的X-射线粉末衍射图见图1、差示扫描量热法(DSC)图见图2，证明确实已形成复合物。

Claims (10)

1.一种去氧鬼臼毒素与β-环糊精衍生物的包合物，其特征是去氧鬼臼毒素与β-环糊精衍生物的摩尔比为1∶1～1∶10，其中所述的β-环糊精衍生物为磺丁基醚β-环糊精或羟丙基β-环糊精。
2.权利要求1的包合物，其中当β-环糊精衍生物为磺丁基醚β-环糊精时，去氧鬼臼毒素与磺丁基醚β-环糊精的摩尔比为1∶1.00～1∶8.06。
3.权利要求2的包合物，其中去氧鬼臼毒素与磺丁基醚β-环糊精的摩尔比为1∶2.33～1∶6.42。
4.权利要求1的包合物，其中当β-环糊精衍生物为羟丙基β-环糊精时，去氧鬼臼毒素与羟丙基β-环糊精的摩尔比为1∶2.24～1∶6.35。
5.权利要求1的包合物的制备方法，包括：将β-环糊精衍生物配成水溶液，保温搅拌或研磨，去氧鬼臼毒素制成乙醇、丙酮或甲醇溶液，滴加到β-环糊精衍生物的水溶液中，滴毕继续保温搅拌或研磨，干燥即得。
6.权利要求5的制备方法，其中β-环糊精衍生物配成的水溶液浓度为10％～40％，为重量体积百分比。
7.权利要求5的制备方法，其中包合温度为40℃～70℃。
8.权利要求7的制备方法，其中包合温度为50℃～55℃。
9.权利要求5的制备方法，其中滴毕继续保温搅拌或研磨的时间为0.5～3小时。
10.权利要求1的包合物用于制备治疗小细胞肺癌、恶性淋巴瘤、恶性生殖细胞瘤、白血病、神经细胞胶质瘤、宫颈癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的药物的用途。
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