CN108553649B - 一种新颖的管道结构的索拉非尼-γ-环糊精包合物及制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新颖的管道结构的索拉非尼‑γ‑环糊精包合物及制备方法及应用，其制备方法是将索拉非尼和γ‑环糊精以摩尔比1：1投料，加入到一定体积的有机溶剂与水的混合溶剂中，加热至60‑80℃，搅拌，直至完全溶清，再继续搅拌若干小时进行包合反应，停止加热和搅拌，自然降温析晶，直到析晶完全，抽滤，烘干，即得索拉非尼‑γ‑环糊精包合物。本发明制备得到索拉非尼‑γ‑环糊精包合物(Sor‑γ‑CD)具有水溶性好，生物利用度高，靶向性更好并兼具缓释作用等特点，为索拉非尼药物制剂的研发提供了一条实用途径。

Description

一种新颖的管道结构的索拉非尼-γ-环糊精包合物及制备方 法及应用
技术领域
本发明属于制药技术领域，具体地，涉及一种新颖的管道结构的抗肿瘤药物索拉非尼(Sorafenib)与γ-环糊精(γ-Cyclodextrin)包合物，及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤是人类的头号疾病，肿瘤的早期诊断治疗是关系人类健康的重要环节，目前肿瘤的发病机理、治疗方法等方面的研究成为了医学界备受关注的焦点，这对肿瘤研究手段提出了越来越高的要求。增加其靶向性，就是近年来研究和治疗肿瘤的一种重要手段。
索拉非尼(Sor)化学名称为：4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基}羰基)氨基]苯氧基}-N-甲基吡啶-2-甲酰胺，分子式C21H16ClF3N4O3，结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0001659506910000011
索拉非尼是raf、VEGFR-2、p38和PDGFR激酶的有效抑制剂，这些酶是治疗过度增生性疾病的分子靶向药物，因此索拉非可用作治疗该类疾病的药物。2005年底美国FDA批准索拉非尼用于治疗晚期肾癌的多靶点抗肿瘤药物，并于2006年在我国成功上市，2007年美国FDA批准其用于无法切除治疗的肝癌细胞，2008年中国SFDA批准其用于晚期肝癌的治疗。此外，由于索拉非尼具有较广的拟酶谱,其在非小细胞肺癌、乳腺癌甲状腺癌和结肠癌等领域也有一定应用前景。
尽管已经有多种激酶抑制剂用于临床研究和应用，但是对治疗癌症的改进药物及其组合物仍存在极大的需求，特别是对服用方便从而能增加病人顺应性的口服药物组合物需求较大。口服药物组合物必须提供足生产生有效治疗的血浆活性水平。索拉非尼虽然是比较成功的口服小分子多靶点抗肿瘤药物，但因为在水中溶解度极小(-1.7μg/mL)且肠胃渗透性较高，药物的溶出是吸收的限速过程，被列为BCS(Biopharmaceuticsclassification system)Ⅱ类药物，所以索拉非尼制剂的口服相对生物利用度较低(约为38％-49％)，口服剂量较大(400mg/次，2次/天)，长期服用具有一定的副作用。因此，改善索拉非尼制剂的溶出度，提高口服生物利用度，降低毒副作用具有重要意义。
γ-环糊精(γ-cyclodextrin,CD)，分子式为C48H80O40，分子结构如式Ⅱ所示。
Figure BDA0001659506910000021
环糊精通常是由6-12个D(+)-吡喃型葡萄糖组成的环状低聚糖，其中含有6、7、8个葡萄糖单元的分子被研究得较多，分别被称为α、β、γ环糊精，是迄今所发现的类似于酶的理想的主体分子，并且其本身具有酶模型的特性，因此在食品、药物、催化等领域受到了极大的关注和重视。环糊精药物包合物可增加药物的溶解性，提高药物的稳定性和生物利用度等。与α、γ相比，β-CD有适度的水溶性和适宜的空腔尺寸，在主客体化学中研究很多，而本发明使用的γ-
环糊精，其作为主体分子在医药上的应用研究甚少。γ-CD具有良好的水溶性和较大的空腔尺寸，可以包合结构较大的药物，更重要的是药物与γ-CD生成的包合物可组装成一种新颖的类似于碳纳米管的“管道”形结构，研究表明，这种管道结构在生物学上具有重要的应用价值。
目前针对索拉非尼的研究主要集中于索拉非尼对甲苯磺酸盐(Sor-Tos)的制备(US8217061、WO0041698、CN101052619)及不同晶型(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ)的制备(WO0042012、CN103664771、CN101065360)。整体来看，对甲苯磺酸索拉非尼的溶解性极差，在水中几乎完全不溶，生物利用度仍有待提高(38-49％，相对于口服剂量100-400mg)，而且甲苯磺酸索拉非尼呈强酸性(pH<2)，对于口服药物来说，酸性强会产生明显的肠胃刺激，另外甲苯磺酸索拉非尼晶体的制备过程还存在多晶和混晶的问题。不同晶型的索拉非尼盐型的制备也有报道过(US2012264789，US2012264789，US2013274478)，但是只提到了制备方法与结构表征，具体物化性质没报道。另外，CN102145175公开了一种甲苯磺酸索拉非尼-羟丙基-β-环糊精包合物及其制备方法，采用羟丙基-β-环糊精作为主体分子对索拉非尼进行包合，但所形成的包合物结构表征不充分，仅公开了包合物的差示扫描量热曲线，因此包合物的结构不明确。CN102145175对包合物性质的研究也较少，仅公开了其在水中的平衡溶解度，而在投料比为1：1的时候，该包合物相比于甲苯磺酸索拉非尼的溶解性几乎没有提升(1.1倍)。因此，制备溶解性更好、生物利用度更高的索拉非尼制剂形式，并对其进行清晰的结构表征、性质及应用研究具有重要的实用价值。
发明内容
本发明提供一种水溶性好，生物利用度高，靶向性更好的索拉非尼-γ-环糊精包合物(Sor-γ-CD)及其制备方法，并对其进行结构表征和性质研究。所获得的包合物提高了药物的溶解性、稳定性和靶向作用和缓释作用，从而提高了药物的生物利用度。并为索拉非尼药物制剂的研发提供了一条实用途径。
令人吃惊的是，根据本发明提供的药物包合物中的式(1)化合物具有良好的生物利用度，并达到了有效的血浆水平。更令人吃惊的是，根据本发明提供的包合物中的索拉非尼具有极好的靶向性，索拉非尼在肿瘤部位的浓度远远高于对照组索拉非尼磺酸盐，同时又兼具缓释作用。另外根据本发明的包合物中的索拉非尼具有良好的稳定性。
本发明的一个目的，公开了一种索拉非尼-γ-环糊精包合物。
本发明的另一个目的，是公开了一种管道结构的索拉非尼-γ-环糊精包合物及其制备方法。
本发明的又一个目的，是公开了索拉非尼-γ-环糊精包合物在治疗癌症中的作用。
为达到上述技术效果，本发明提供的技术方案如下：
本发明公开了一种索拉非尼-γ-环糊精包合物，所述的包合物以索拉非尼作为客体，以γ-环糊精作为主体，在溶剂的介导下通过包合反应组装成“管道”结构的包合物。
作为进一步地改进，本发明所述的包合物用CuKα辐射进行X射线衍射分析，以衍射角2θ°±0.2表示的X-射线衍射包含5.3°,7.5°,10.5°,11.5°,12.1°,14.2°,14.9°,15.8°,16.67°,19.3°,20.3°,21.9°,22.5°,23.7°处的特征衍射峰。
作为进一步地改进，本发明所述的包合物属于P 4212的空间群，晶胞参数为：
Figure BDA0001659506910000031
Figure BDA0001659506910000032
属“管道”结构的包合物，索拉非尼位于管道结构的内腔中。
作为进一步地改进，本发明所述的索拉非尼与γ-环糊精的摩尔比为1：1。
本发明还公开了一种索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备方法，具体制备步骤如下：
1)、将索拉非尼和γ-环糊精以摩尔比为1：1投料，加入到有机溶剂与水的混合溶剂中；
2)、将步骤1)获得的混合溶液加热至60～80℃，搅拌至完全溶清；
3)、将步骤2)获得的澄清溶液进行包合反应，继续加热搅拌；
4)、停止加热和搅拌，自然降温析晶，直到析晶完全，抽滤，烘干，即得索拉非尼-γ-环糊精包合物。
作为进一步地改进，本发明所述的步骤1)所采用的有机溶剂为醇或醚，醇为甲醇或乙醇，有机溶剂的体积mL与水的体积mL的比为1.5～4：1，步骤3)搅拌时间为1～40小时。
作为进一步地改进，本发明所述的步骤2)混合溶液体系中索拉非尼的量毫摩尔和溶液的体积毫升比为1：30～100。
作为进一步地改进，本发明所述的步骤1)醇优选为乙醇，醚优选为四氢呋喃，步骤3)搅拌时间优选为3～8小时。
作为进一步地改进，本发明所述的步骤4)所述的析晶温度为15～30℃；所述的烘干方式为真空干燥，烘干温度为20～50℃。
本发明还公开了一种索拉非尼-γ-环糊精包合物在制造治疗肝癌，结肠癌等疾病的药物中的用途。
本发明相对于现有技术的有益效果如下：
(1)本发明所提供的索拉非尼-γ-环糊精包合物及其制备方法，制备使用的工艺比较简单易操作，重复性好，有利于工业生产。
(2)溶解度、溶出速度大提高：本发明针对索拉非尼游离碱和已上市的甲苯磺酸索拉非尼水溶性差的情况，采用包合技术，改善其水溶性。图6是索拉非尼-γ-环糊精包合物、索拉非尼、甲苯磺酸索拉非尼在水和pH 1.2酸性水溶液中的溶出速度曲线；表明索拉非尼-γ-环糊精包合物能够有效提高药物成分的溶出度。索拉非尼经由γ-环糊精包合后，溶解性显著提高，因此它在两种溶出介质中均比索拉非尼游离碱和甲苯磺酸盐索拉非尼溶解得快。溶解性实验显示(表1)，相比于索拉非尼原药和甲苯磺酸索拉非尼，虽然索拉非尼-γ-环糊精包合物在中性水溶液(pH 7.0)溶解度和溶出速度提高不大，但是在模拟胃液(pH1.2酸性水溶液)中的溶解度和溶出速率均大大增加，索拉非尼-γ-环糊精包合物两个小时后溶出的浓度达到平衡溶解度的三分之一，并且是中性的水中的溶出浓度6.2倍。
表1为索拉非尼-γ-环糊精包合物与索拉非尼游离碱、甲苯磺酸索拉非尼在37℃的条件下的溶解度
Figure BDA0001659506910000041
(3)本发明所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物生物利用度相比于索拉非尼和甲苯磺酸索拉非尼显著提高。图7是索拉非尼-γ-环糊精包合物、索拉非尼、甲苯磺酸索拉非尼的药代动力学曲线图；图8是索拉非尼-γ-环糊精包合物，由图可知，索拉非尼在释放过程中出现“爆释”现象，在1.7小时即出现最大释放浓度。而索拉非尼-γ-环糊精包合物却缓慢释放，在血液中维持较高的浓度，给药四小时后血液中的浓度比索拉非尼或甲苯磺酸盐索拉非尼高两倍，表明索拉非尼-γ-环糊精包合物改善了药物成分的缓释作用。
表2 药动学参数
编号 最高浓度(ug/mL) AUC 半衰期(小时)
索拉非尼 8.24 16.21 1.69
甲苯磺酸盐索拉非尼 1.29 7.01 4.55
索拉非尼-γ-环糊精包合物 2.78 13.01 2.96
图8是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼口服2小时(图8-1)和4小时(图8-2)后，在体内主要器官和肿瘤部位的分布图；整体来看，索拉非尼-γ-环糊精包合物和甲苯磺酸盐索拉非尼均比索拉非尼游离碱在体内的分布浓度高。具体地，索拉非尼在给药两小时后的分布浓度比四小时的高，表明索拉非尼在体内代谢很快，出现“爆释”现象，药物代谢较快，不利于药效的有效发挥；甲苯磺酸盐索拉非尼和索拉非尼-γ-环糊精包合物在各重要器官分布浓度差异不明显；在肿瘤部位两小时后甲苯磺酸盐索拉非尼的浓度比索拉非尼-γ-环糊精包合物的高4倍，但四小时后索拉非尼-γ-环糊精包合物的浓度又比甲苯磺酸盐索拉非尼的高8.5倍，药物分布结果理想。
药代动力学实验显示(图7)和体内分布实验表明(图8)：相比于甲苯磺酸盐索拉非尼，索拉非尼-γ-环糊精包合物在血浆中浓度较高，且在肿瘤部位有明显提高，具体地：两小时给药后，甲苯磺酸盐索拉非尼和索拉非尼-γ-环糊精包合物在肿瘤部位是索拉非尼的38倍和9.5倍；四小时给药后，甲苯磺酸盐索拉非尼和索拉非尼-γ-环糊精包合物在肿瘤部位比索拉非尼的高8倍和64.5倍，这也表明索拉非尼经由γ-环糊精包合后可延长及提高索拉非尼成分在肿瘤部位的浓度，同时兼具有非常好的缓释效果。
(4)本发明所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物可促进药物成分抑制肿瘤生长的作用，改善药物成分的生物利用度，从而提高对肿瘤的治疗效果。
本发明中检测索拉非尼-γ-环糊精包合物结构及性能的仪器如下：
X射线粉末衍射仪：日本理学公司，型号为D/Max-2550PC，Cu-Kα
Figure BDA0001659506910000051
辐射，管电压40KV，管电流250mA，扫描速度
Figure BDA0001659506910000052
步宽
Figure BDA0001659506910000053
扫描范围
Figure BDA0001659506910000054
(2θ)的θ-2θ连续扫描。
综合热分析仪：美国TA公司，型号为SDTQ600，吹扫气：氮气120mL/min，升温速度10℃/min，温度范围：室温～400℃。
差示扫描量热仪：美国TA公司，型号为DSCQ100，吹扫气：氮气120mL/min，升温速度10/min，温度范围：室温～300℃。
傅里叶红外光谱仪：德国Bruker公司，型号为Vector 22，扫描波数范围：4000-400cm-1。
核磁共振光谱：仪器型号：Bruker DMX-500核磁共振仪，溶剂：DMSO-d6
紫外吸收光谱(UV)：采用Dynamica HALO DB-20紫外分光光度计，将样品配制成一定浓度溶液，并用同批溶剂作为空白对照，采用1cm吸收池在200～400nm范围内测定。索拉非尼-γ-环糊精包合物和索拉非尼的最大吸收峰均位于266nm。
高效液相色谱测定方法(HPLC)：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，流动相为乙腈-水(7：3)，流速为0.8mL/min，检测波长为265nm，保留时间为10.8min。准确称取索拉非尼游离碱对照品适量，以流动相作为溶剂，配制一系列浓度梯度的索拉菲尼溶液(从0.2μg/mL至1μg/mL)，建立标准曲线。准确称取样品适量，用流动相配制溶液，分别取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，根据标准曲线峰面积计算浓度。
附图说明
图1是索拉非尼-γ-环糊精包合物、γ-环糊精、索拉非尼的XRD谱图的叠加图；
图2是索拉非尼-γ-环糊精包合物、γ-环糊精、索拉非尼的TG图；
图3是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，γ-环糊精的DSC图；
图4是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，γ-环糊精的红外光谱FT-IR；
图5是γ-环糊精、索拉非尼、索拉非尼-γ-环糊精包合物在DMSO-d6的1H-NMR谱；
图6是索拉非尼-γ-环糊精包合物、索拉非尼、甲苯磺酸索拉非尼在水和pH 1.2酸性水溶液中的溶出速度曲线图；
图7是索拉非尼-γ-环糊精包合物、索拉非尼、甲苯磺酸索拉非尼的药代动力学曲线图；图8-1，图8-2分别是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼口服2小时和4小时后，在体内主要器官和肿瘤部位的分布图；
图9是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼治疗组及阴性对照组抑制结肠癌肿瘤的曲线图；
图10是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼治疗组及阴性对照组抑制结肠癌肿瘤的相对肿瘤增殖率T/C(％)柱状图；
图11是带结肠癌的裸鼠被索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼及阴性对照组治疗过程中的体重变化图；
图12是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼治疗组及阴性对照组抑制肝癌肿瘤的曲线图；
图13是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼治疗组及阴性对照组抑制结肠癌肿瘤的相对肿瘤增殖率T/C(％)柱状图；
图14是带肝癌的裸鼠被索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼及阴性对照组治疗过程中的体重变化图。
具体实施方式
本发明公开了一种新颖的管道结构的抗肿瘤药物索拉非尼(Sorafenib)与γ-环糊精(γ-Cyclodextrin)包合物，及其制备方法和用途，以索拉非尼为客体分子(如式Ⅰ)，γ-环糊精为主体分子(如式Ⅱ)，索拉非尼分子与γ-环糊精分子的摩尔比为1：1，在溶剂介导下通过包合组装，索拉非尼分子嵌入γ-环糊精的分子空腔内，形成包合物并组装成管道结构。
采用CuKα辐射对本发明所述的包合物进行X射线衍射分析，以衍射角2θ，±0.2°表示在5.3°,7.5°,10.5°,11.5°,12.1°,14.2°,14.9°,15.8°,16.67°,19.3°,20.3°,21.9°,22.5°,23.7°等处有特征衍射峰，与索拉非尼和γ-环糊精的特征衍射谱图明显不同，且该衍射峰峰是γ-环糊精包合物的管道(channel)结构的特征峰，属于P 4212的空间群，晶胞参数为：
Figure BDA0001659506910000071
说明主客体分子间产生了相互作用，形成了新的物质，索拉非尼位于管道结构的空腔中。图1是索拉非尼-γ-环糊精包合物、γ-环糊精、索拉非尼的XRD谱图的叠加图。图中，(a)γ-环糊精，(b)索拉非尼-γ-环糊精包合物，(c)索拉非尼；图中索拉非尼-γ-环糊精包合物的谱图具有独特的衍射峰，既不同于原料药索拉非尼也不同于γ-环糊精，证明有新的物相生成，为本发明所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物。另外，索拉非尼-γ-环糊精包合物的特征峰与γ-环糊精包合物的管道结构的空间群P 4212的特征峰相同，表明索拉非尼-γ-环糊精包合物的结构也是管道结构排列。
另外，对本发明所述的包合物用热重分析(TG)和差热分析(DSC)进行热分析。图2是索拉非尼-γ-环糊精包合物、γ-环糊精、索拉非尼的TG图；图中，(a)γ-环糊精，(b)索拉非尼-γ-环糊精包合物，(c)索拉非尼；索拉非尼原药的熔点为211℃，而本发明所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物在297℃的下开始分解，说明药物的热稳定性得到提高。索拉非尼-γ-环糊精包合物在室温至120℃范围内，其失重率为11.3％，表明结构有结晶水。
图3是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，γ-环糊精的DSC图；图中，(a)γ-环糊精，(b)索拉非尼-γ-环糊精包合物，(c)索拉非尼；由图可知，索拉非尼的211℃熔融峰经由γ-环糊精包合后明显消失，和γ-环糊精相比包合物的失水峰也有改变，表明索拉非尼与γ-环糊精通过包合反应形成了新的物质，同时药物成分热稳定性提高，该包合物脱水过程中在90.4℃处出现峰，该峰已无索拉非尼的熔点峰(211.9℃)和γ-环糊精失水峰(64.4和92.5℃)，说明索拉非尼已被γ-环糊精包合。
对本发明所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物进行红外光谱(IR)分析，图4是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，γ-环糊精的红外光谱FT-IR；图中，(a)γ-环糊精，(b)索拉非尼-γ-环糊精包合物，(c)索拉非尼；由图可知，相比于γ-环糊精的红外光谱，索拉非尼-γ-环糊精包合物变化不大，索拉非尼几乎被γ-环糊精所遮蔽，在1579cm-1和1538cm-1处出现了两个吸收峰，是索拉非尼的两个最强的吸收峰，分别对应C＝C的伸缩振动及C＝N的伸缩振动，为索拉非尼分子结构中吡啶环所引起，表明索拉非尼被包合在γ-环糊精分子中而形成了新的物质。相比于索拉非尼与γ-环糊精，所述包合物的红外图谱中未出现新的吸收峰，大部分索拉非尼的特征峰已经消失；在1579cm-1和1538cm-1处存在两个很弱的吸收峰。这两个吸收峰分别对应C＝C的伸缩振动及C＝N的伸缩振动，由索拉非尼分子结构中吡啶环所引起，这结果表明主客体分子经包合后并未产生新的化学键，而产生分子间弱作用或氢键作用，索拉非尼的部分基团被包合于γ-环糊精的空腔内。
氢核磁共振1H-NMR分析进一步证实了包合物的结构特征，图5是γ-环糊精、索拉非尼、索拉非尼-γ-环糊精包合物在DMSO-d6的1H-NMR谱。图中，(a)γ-环糊精，(b)索拉非尼-γ-环糊精包合物，(c)索拉非尼；由图可知，索拉非尼-γ-环糊精包合物图谱中明显包含索拉非尼和γ-环糊精氢原子的核磁共振信号，另外相比于索拉非尼，包合物从9.6–6.8ppm范围内出现索拉非尼氢原子的核磁共振信号且信号很弱，表明γ-环糊精包合含有索拉非尼，并对索拉非尼基团上的氢原子产生了屏蔽作用。
本发明提供一种上述索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备方法，该方法具有操作简便、省时，可重复性高的特点，具有较高的实用价值。具体实施步骤如下：
将索拉非尼和γ-环糊精以摩尔比1：1投料，加入到一定体积的有机溶剂与水的混合溶剂中，加热至60-80℃，搅拌，直至完全溶清，再继续搅拌若干小时进行包合反应，停止加热和搅拌，自然降温析晶，直到析晶完全，抽滤，烘干，即得索拉非尼-γ-环糊精包合物，有机溶剂为醇和醚，醇优选为甲醇和乙醇，醚优选为四氢呋喃，混合溶剂的组成比例，有机溶剂与水的体积比为1.5～4：1，反应体系中索拉非尼物质的量(毫摩尔)和溶液的体积(毫升)比为1：30～100，优选1：40～70；搅拌时间为1～40hr，优选2～15hr，更优选3～8hr，析晶温度为15～30℃，烘干过程为20～50℃真空干燥。
本发明还公开了索拉非尼-γ-环糊精包合物在抑制肿瘤生长中的应用。
取20只BALB/c裸鼠(雄性；6周龄；体重：18～20g)饲养于无菌条件下。肿瘤模型采用人肝癌肿瘤细胞(HepG2细胞系)和人结肠癌肿瘤细胞(HT-29细胞系)建立，每只裸鼠用3x106cells/100μL于肿瘤接种。将100μL HepG2或HT-29细胞注射于表皮腹壁。15天后肿瘤大小约60-100mm3，将裸鼠随机分成4组。组Ⅰ为阴性对照组(Control)，组Ⅱ－组Ⅳ为治疗组。组Ⅱ－组Ⅳ分别接受索拉非尼、甲苯磺酸索拉非尼及索拉非尼-γ-环糊精包合物的治疗。给药方式：口服；给药剂量：16mg(活性成分索拉非尼)/kg，每天一次，每次200μL；连续给药21天。从第一天治疗开始每七天称裸鼠的体重，每三天测量肿瘤大小和每天观察裸鼠的健康状态并记录。
具体地，肿瘤体积测量：用游标卡尺测出肿瘤的长(a)和宽(b)，根据式Ⅲ估算肿瘤体积：
V＝a×b2/2 式Ⅲ
然后再进一步，从肿瘤体积计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV)，如式四：
RTV＝Vday/V0 式四
其中：Vday为每一次测量时的肿瘤体积
V0为第一天给药所得的肿瘤体积
更进一步，对抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)
Figure BDA0001659506910000091
其中：TRTV为治疗组的RTV
CRTV为阴性对照组的RTV
研究结果如图9-图14所示。
图9是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼治疗组及阴性对照组抑制结肠癌肿瘤的曲线图；从图可知，相对于阴性对照组，各治疗组曲线均表现出肿瘤生长被抑制的作用。这表明活性成分索拉非尼在结肠癌肿瘤治疗中发挥了作用。在各治疗组之间，索拉非尼-γ-环糊精包合物的肿瘤抑制效果得到了明显的提高。
图10是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼治疗组及阴性对照组抑制结肠癌肿瘤的相对肿瘤增殖率T/C(％)柱状图；图11是带结肠癌的裸鼠被索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼及阴性对照组治疗过程中的体重变化图；从图可知，裸鼠在治疗过程中体重基本恒定，表明药物对给药动物的毒副作用较小。
图12是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼治疗组及阴性对照组抑制肝癌肿瘤的曲线图；由图可知，和阴性对照组相比，各治疗组曲线均明显表现出肿瘤生长被抑制的特点，这表明索拉非尼成分在肝癌肿瘤治疗中发挥了作用。在各治疗组之间，索拉非尼-γ-环糊精包合物疗效最好。
图13是索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼治疗组及阴性对照组抑制结肠癌肿瘤的相对肿瘤增殖率T/C(％)柱状图；由图可知，索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼的T/C值均显著小于40％，表明药物对肝癌肿瘤有效。
图14是带肝癌的裸鼠被索拉非尼-γ-环糊精包合物，索拉非尼，甲苯磺酸索拉非尼及阴性对照组治疗过程中的体重变化图；从图可知，在治疗过程中裸鼠的体重基本恒定，表明药物对给药动物的毒副作用较小。
通过比较发现：(1)相对于阴性对照组，各治疗组对肝癌和结肠癌模型均抑制了肿瘤生长。这表明活性成分索拉非尼在肿瘤治疗中发挥了作用。(2)对这两种癌症模型，索拉非尼成分对肝癌模型明显有疗效比结肠癌模型优越。这是因为索拉非尼主要用来治疗肝癌，对肝癌发挥作用比较好。(3)对这两种癌症模型，索拉非尼-γ-环糊精包合物均显着治疗效果最好。首要原因为：本发明所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物提高了药物成分的溶解度与溶出速率，特别的管道型结构使得药物在体内输送过程中发挥了独特的靶向富集作用，因而使得其在体内有较高的血药浓度(图7)与肿瘤部位分布(图8)，大大提高了索拉非尼的生物利用度。且索拉非尼-γ-环糊精包合物具有明显的缓释作用。(4)通过观察记录发现，各组裸鼠的体重均基本保持恒定，说明药物对给药动物的毒副作用较小。
下面通过具体实施例子进一步对本发明中所述方法进行描述，但本发明保护范围不受实施例限制，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能因此限定本发明的保护范围。
实施例1索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备
准确称取γ-环糊精1.297g(1mmol)和索拉非尼0.464g(1mmol)至茄型瓶中，加入四氢呋喃和水的混合溶剂(四氢呋喃和水的体积比为1.5：1)50mL，放入水浴锅中边搅拌边加热到75℃，溶清后继续搅拌，继续搅拌4小时，然后关加热搅拌，自然降温至室温(20～30℃)，静置析晶，析晶时间约8～10小时，直至析晶完全，抽滤，烘干(30℃真空干燥)2小时，即得。
实施例2索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备
准确称取γ-环糊精1.297g(1mmol)和索拉非尼0.464g(1mmol)至茄型瓶中，加入四氢呋喃和水的混合溶剂(四氢呋喃和水的体积比为1.5：1)100mL，放入水浴锅中边搅拌边加热到65℃，溶清后继续搅拌，继续搅拌6小时，然后停止搅拌和加热，自然降温至室温析晶，即有晶体析出，继续析晶直至析晶完全，抽滤，烘干(40℃真空干燥)3小时，即得。
实施例3索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备
准确称取γ-环糊精1.297g(1mmol)和索拉非尼0.464g(1mmol)至茄型瓶中，加入四氢呋喃和水的混合溶剂(四氢呋喃和水的体积比为2：1)40mL，放入水浴锅中边搅拌边加热到75℃，溶清后继续搅拌，继续搅拌3小时，然后停止搅拌和加热，自然降温析晶，降温至约20～25℃时，即有晶体析出，继续析晶直至析晶完全，抽滤，烘干(40℃真空干燥)3小时，即得。
实施例4索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备
准确称取γ-环糊精1.297g(1mmol)和索拉非尼0.464g(1mmol)至茄型瓶中，加加入四氢呋喃和水的混合溶剂(四氢呋喃和水的体积比为2：1)70mL放入水浴锅中边搅拌边加热到65℃，溶清后继续搅拌5小时，然后停止搅拌和加热，自然降温析晶，降温至约20～25℃时，即有晶体析出，继续析晶直至析晶完全，抽滤，烘干(30℃真空干燥)，即得。
实施例5索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备
准确称取γ-环糊精1.297g(1mmol)和索拉非尼0.464g(1mmol)至茄型瓶中，加四氢呋喃和水的混合溶剂(四氢呋喃和水的体积比为3：1)30mL，放入水浴锅中边搅拌边加热到50℃，溶清后继续搅拌8小时，然后取出放置室温(20～30℃)，静置析晶，析晶时间约8～10小时，直至析晶完全，抽滤，烘干(35℃真空干燥)，即得。
实施例6索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备
准确称取γ-环糊精1.134g(1mmol)和索拉非尼0.650g(1.4mmol)至茄型瓶中，加四氢呋喃和水的混合溶剂(四氢呋喃和水的体积比为4：1)30mL放入水浴锅中边搅拌边加热到60℃，溶清后继续搅拌10小时，然后停止搅拌和加热，自然降温析晶，降温至约20～25℃时，即有晶体析出，继续析晶直至析晶完全，抽滤，烘干(30℃真空干燥)，即得。
实施例7索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备
准确称取γ-环糊精1.134g(1mmol)和索拉非尼0.650g(1.4mmol)至茄型瓶中，加乙醇和水的混合溶剂(乙醇和水的体积比为4：1)60mL放入水浴锅中边搅拌边加热到80℃，溶清后继续搅拌10小时，然后停止搅拌和加热，自然降温析晶，降温至约20～25℃时，即有晶体析出，继续析晶直至析晶完全，抽滤，烘干(30℃真空干燥)，即得。
实施例8索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备
准确称取γ-环糊精1.134g(1mmol)和索拉非尼0.650g(1.4mmol)至茄型瓶中，加乙醇和水的混合溶剂(乙醇和水的体积比为3：1)80mL放入水浴锅中边搅拌边加热到80℃，溶清后继续搅拌10小时，然后停止搅拌和加热，自然降温析晶，降温至约20～25℃时，即有晶体析出，继续析晶直至析晶完全，抽滤，烘干(30℃真空干燥)，即得。
实施例9测索拉非尼-γ-环糊精包合物在水和pH 1.2酸性溶液中的平衡溶解度，并与索拉非尼和甲苯磺酸索拉非尼进行对比
将过量的索拉非尼、甲苯磺酸索拉非尼和索拉非尼-γ-环糊精包合物分别加入20mL的烧瓶，再分别加入10mL pH为7.0，pH为1.2的水溶液，密闭，在水浴(37℃)下搅拌24小时至达到平衡。将饱和溶液快速过滤(0.45μm的微孔滤膜)至离心管中，在最大吸收波长处测定所制备溶液的吸光度。每个样品平行测定3次。用标准曲线法计算其对应的饱和浓度。
实施例10测定索拉非尼-γ-环糊精包合物在水和pH1.2酸性水溶液的溶出速度，并与索拉非尼和甲苯磺酸索拉非尼进行对比
采用转篮法测定药物的溶出速度：分别取索拉非尼(1g)、甲苯磺酸索拉非尼(1g)和索拉非尼-γ-环糊精包合物(3g)粉末分别在10MPa的水压机压片5分钟。取供试品6片(分别每种两片)，分别投入6个转篮内，将转篮降入已含有加0.2％SDS(十二烷基硫酸钠)的水或pH 1.2酸性水溶液，以温度37℃，转速100rpm缓慢搅拌的容器中，立即开始计时，在1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、90、120min时取5mL溶液，过0.45μm的微孔滤膜至离心管中，自取样至过滤，应在30秒钟完成。取滤液，每次取样完成后加等温等量的溶出空白介质。为使测定得到的吸光度值在规定范围内，取样得到的澄清溶液用相应的空白介质稀释一定的倍数，在最大吸收波长处测定所制备溶液的吸光度。每个样品平行测定3次。用标准曲线法计算其对应的浓度，绘制出对应的溶出曲线。
实施例11索拉非尼、甲苯磺酸索拉非尼及索拉非尼-γ-环糊精包合物的体内药物代谢动力学和体内分布
36只体重相似(18～22g，△m<5g)的雄性BALB/c裸鼠随机分成三组(12只/组)进行体内药物代谢动力学和体内分布实验。组Ⅰ索拉非尼原药，组Ⅱ甲苯磺酸索拉非尼，组Ⅲ索拉非尼-γ-环糊精包合物。给药方式：口服；给药剂量：20mg(活性成分)/kg；血药浓度检测时间：(口服后)0～24小时；取血方式：眼眶取血，血样迅速离心处理(转速：8000rpm，时间：5min)，-20℃保存待测；组织取样方式：解剖取裸鼠组织肝、肾、脾、肺和心，用0.1mol/L的PBS洗涤组织，吸干，称重，2毫升组织匀浆器研磨，流动相震荡萃取，三氟醋酸沉淀蛋白，NaOH中和，定容后离心去蛋白，准确移取一定量的上清液定容至2毫升容量瓶，-20℃保存待测。浓度检测方法：高效液相色谱检测。
最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的几个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种索拉非尼-γ-环糊精包合物，其特征在于，所述的包合物以索拉非尼作为客体，以γ-环糊精作为主体，在溶剂的介导下通过包合反应组装成“管道”结构的包合物，所述的包合物用CuKα辐射进行X射线衍射分析，以衍射角2θ°±0.2表示的X-射线衍射包含5.3 o ,7.5 o, 10.5 o, 11.5 o, 12.1 o, 14.2 o, 14.9 o, 15.8 o, 16.67o, 19.3 o, 20.3 o, 21.9 o, 22.5 o, 23.7o 处的特征衍射峰，所述的包合物属于P 4 21 2 的空间群，晶胞参数为：a=23.81Å，c=23.20Å，属“管道”结构的包合物，索拉非尼位于管道结构的内腔中，所述的索拉非尼与γ-环糊精的摩尔比为1：1。
2.一种如权利要求1所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下：
1）、将索拉非尼和γ-环糊精以摩尔比为1：1投料，加入到有机溶剂与水的混合溶剂中；
2）、将步骤1）获得的混合溶液加热至60~80 oC，搅拌至完全溶清；
3）、将步骤2）获得的澄清溶液进行包合反应，继续加热搅拌；
4）、停止加热和搅拌，自然降温析晶，直到析晶完全，抽滤，烘干，即得索拉非尼-γ-环糊精包合物。
3.如权利要求2所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备方法，其特征在于，步骤1）所采用的有机溶剂为醇或醚，所述的醇为甲醇或乙醇，有机溶剂的体积mL与水的体积mL的比为1.5~4：1，步骤3）所述的搅拌时间为1~40小时。
4.如权利要求2所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备方法，其特征在于，步骤2）所述的混合溶液体系中索拉非尼的量毫摩尔和溶液的体积毫升比为1：30～100。
5.如权利要求3所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的醇优选为乙醇，所述的醚优选为四氢呋喃，步骤3）所述的搅拌时间优选为3~8小时。
6.如权利要求2所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物的制备方法，其特征在于，步骤4）所述的析晶温度为15~30 ℃；所述的烘干方式为真空干燥，烘干温度为20～50 ℃。
7.一种如权利要求1 所述的索拉非尼-γ-环糊精包合物在制造治疗肝癌，结肠癌疾病的药物中的用途。
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