CN101671320B - 一种去氧穿心莲内酯分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种去氧穿心莲内酯分离纯化方法，是一种集成溶剂萃取-柱层析-溶剂重结晶-超临界流体抗溶剂结晶方法。用该方法对穿心莲浸膏进行加工，制备高纯去氧穿心莲内酯。用氯仿萃取；柱层析填料(固定相)采用硅胶等，流动相为石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂；重结晶溶剂为乙酸乙酯，结晶方式为抽虑结晶；超临界CO2流体抗溶剂结晶，结晶条件为：压力≤15MPa，温度≤70℃。产品含量最高可达99％以上。该分离纯化工艺，方法简便、成本低、易于工业生产应用。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种中药有效成分分离纯化方法，确切地说是一种去氧穿心莲内酯分离纯化方法。
二、背景技术
穿心莲[Andrographis paniculate(Burm.f.)Nees]为爵床科植物穿心莲的全草或叶。别名：春莲秋柳(《岭南采药录》)、一见喜(《泉州本草》)、榄核莲、苦胆草、斩蛇剑、日行千里、印度草(广东)，苦草(福建)等。原产于印度，我国主产于华南、西南等长江以南温暖、湿润地区、其气味苦、性寒、归大肠、心、肺、膀胱经，具有清热解毒、凉血、消肿的功效。用于感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，毒蛇咬伤。
穿心莲内酯类化合物主要活性成分有穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯等。
其中，去氧穿心莲内酯(dexyandrographolide)，别名：穿心莲甲素，脱羟基穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯，为萜类化合物；可溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶和氯仿，微溶于苯和乙醚；这无色针状结晶(乙醚-轻石油醚)，无色片状结晶(丙酮、乙醇或氯仿)；熔点：174～175.5℃；分子式：C20H30O4；分子量334.44。有以下结构式：
去氧穿心莲内酯具有抗菌和钩端螺旋体作用。临床试用治疗钩端螺旋体、急性细菌性痢疾、上呼吸道感染、流行性感冒及原因不明的发热等病症均有一定疗效。毒性小，未见明显副作用。能减少二甲苯或H+刺激所致伊文思兰自毛血管壁的渗出，有抑制巴豆油所致大鼠炎性渗出作用，对大鼠蛋清性足肿显著抑制作用，对肾上腺皮质功能有不同程度的兴奋作用。
鉴于去氧穿心莲内酯有上述专属功效，有必要进行分离纯化。而国内对穿心莲内酯类化合物提取分离研究比较早，也比较多。早期主要以水浸提、乙醇提取、碱水提取为主，得到的产品为粗提物(穿心莲总内酯含量在30％左右)。目前也有采用新技术提取分离穿心莲内酯，取得了一定的成效，如南开大学采用大孔吸附树脂提取穿心莲总内酯的研究(范去鸽，张秀莉，史作清，等.《离子交换与吸附》，2002，18(1)：30-35)；也有采用超临界流体技术提取穿心莲总内酯(葛发欢，林秀仙，黄晓芬，等.《中药材》，2002，25(2)：101-102)，产品质量相对传统工艺有所提高，但在提高产品纯度上没有明显优势，只是以穿心莲内酯总内酯为考察指标的粗提物；也有采用超临界流体萃取技术提取分离穿心莲内酯专利报道，如专利：一种提取穿心莲有效成份的方法(专利号：ZL00114213.5)。国内外对去氧穿心莲内酯单体提取分离研究的报道较少。
2000药典则收集了穿心莲药材及片剂的质量检测方法，其内酯含量是重要的质控指标，已得到多数研究的肯定，且大多数是以穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯为研究对象，而去氧穿心莲内酯由于难与脱水穿心莲内酯分离，故研究较少，并被忽视利用。
目前制备高纯度萜类化合物在都采用有机溶剂反复重结晶方法，其耗时长、得率低，且纯度也难于达到98％以上。
三、发明内容
本发明旨在为开发I类中药新药提供高纯度的原料药去氧穿心莲内酯，所要解决的技术问题是去氧穿心莲内酯的分离和纯化。
本发明的技术方案是以穿心莲浸膏(穿心莲总内酯含量≥30％)为起始原料，浸膏先经过氯仿进行萃取，脱溶后得到浅黄色的粗晶体，然后上色谱柱，接收含量70％以上的去氧穿心莲内酯单体组分，脱溶后再用有机溶剂重结晶，最后进行超临界流体抗溶剂结晶。
所谓的超临界流体抗溶剂结晶，就是以超临界流体为逆溶剂，其与溶质、溶剂形成的溶液相混合，快速带走溶剂和部分杂质使溶液在较短的时间内形成较高的过饱和度，溶质结晶析出，得到纯度高，粒径分布均匀的微粒。一般选CO2为超临界流体。
具体的技术方案是：
将穿心莲浸膏溶于温水中，用氯仿萃取，萃取液脱溶后上色谱层析柱，并用混合溶剂洗脱，接收含量70％以上的去氧穿心莲内酯组分，脱溶后再采用乙酸乙酯进行重结晶，纯度达97％，最后进行超临界CO2抗溶剂结晶，通过控制压力、温度、时间进行结晶，经1次抗溶剂结晶后，可制得99％上的去氧穿心莲内酯高纯品。
具体操作步骤是：
(1)首先将穿心莲浸膏溶解到10-20倍体积的30～50℃的温水中，选择氯仿进行溶剂萃取至少2次；
(2)将萃取液合并、脱溶后，进行色谱柱层析分离，分离介质(固定相)选自硅胶等，流动相选自石油醚与乙酸乙酯的混合液，进行分段收集流份，主要收集含量70％以上的目标物质流份；
(3)将上述收集到的流分合并、真空浓缩干燥成粉末，再采用乙酸乙酯进行重结晶3次，纯度达97％；
(4)将纯度97％产品配成乙酸乙酯饱和溶液，进行超临界CO2抗溶剂结晶，控制在压力8～15MPa，温度在45～70℃，时间在45～90min；
(5)停机后收集抗溶剂结晶产物，可制得纯度99％以上去氧穿心莲内酯。
本发明为相关企业提供一种集成溶剂萃取-柱层析分离-溶剂结晶-超临界CO2抗溶剂结晶纯化的方法，制备纯度达99％以上的去氧穿心莲内酯。超临界流体(CO2)抗溶剂结晶不但具有传统的细化微粒的效果，同时具有脱除溶剂和萃取微量杂质等功能，从而达到结晶纯化效果；结晶条件要求较低，一般压力小于15MPa，温度70℃以下，所析晶体纯度高，可达到99％以上，适合高纯物质的制备。本法工艺简单，无需冷冻干燥或喷雾干燥等复杂耗能工艺。同时其得率也较传统工艺高，去氧穿心莲内酯纯度超过99％，收率≥40％(以浸膏中去氧穿心莲内酯计)，适合批量生产。穿心莲浸膏产品目前市场饱和，价格便宜，方便运输，既提高分离纯化的生产效率，又降低层析柱的污染。
四、具体实施方式
实施例1：
①称取1kg穿心莲浸膏(去氧穿心莲内酯含量4％以上)，按1∶10(W/V)的固液比溶于35℃温水中，再用氯仿萃取2次；
②将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯(40％∶60％～70％∶30％，V/V)流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集70％以上的去氧穿心莲内酯流分；
③将上述流分合并，真空浓缩干燥，得固体粉末，再溶解到乙酸乙酯中，按液固比30∶1(V/W)配成溶液，进行真空浓缩，当有微量晶体析出后停止浓缩，将溶液再冷却至25～30℃左右，倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、结晶；
④过程③重复两次，取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在97％以上；
⑤将上述结晶产物用45℃左右乙醇溶剂配成饱和溶液，再放置于超临界CO2结晶釜中，结晶压力控制在10MPa，温度在60℃，进行超临界CO2抗溶剂结晶60min；
⑥试验结束后，取样检测，可得到99％以上高纯去氧穿心莲内酯17.5g。
实施例2：
①称取1kg穿心莲浸膏(去氧穿心莲内酯含量4％以上)，按1∶20(W/V)的固液比溶于40℃温水中，再用氯仿萃取2次；
②将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯(40％∶60％～70％∶30％，V/V)流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集70％以上的去氧穿心莲内酯流分；
③将上述流分合并，真空浓缩干燥，得固体粉末，再溶解到乙酸乙酯中，按液固比30∶1(V/W)配成溶液，进行真空浓缩，当有微量晶体析出后停止浓缩，将溶液再冷却到25～30℃左右，倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、结晶；
④过程③重复两次，取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在97％以上；
⑤将上述结晶产物用45℃左右乙醇溶剂配成饱和溶液，再放置于超临界CO2结晶釜中，结晶压力控制在12MPa，温度在55℃，进行超临界CO2抗溶剂结晶70min；
⑥试验结束后，取样检测，可得到99％以上高纯去氧穿心莲内酯16.7g。
实施例3：
①称取1kg穿心莲浸膏(去氧穿心莲内酯含量4％以上)，按1∶15(W/V)的固液比溶于45℃温水中，再用氯仿萃取2次；
②将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯(40％∶60％～70％∶30％，V/V)流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集70％以上的去氧穿心莲内酯流分；
③将上述流分合并，真空浓缩干燥，得固体粉末，再溶解到乙酸乙酯中，按液固比30∶1(V/W)配成溶液，进行真空浓缩，当有微量晶体析出后停止浓缩，将溶液再冷却到25～30℃左右，倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、结晶；
④过程③重复两次，取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在97％以上；
⑤将上述结晶产物用45℃左右乙醇溶剂配成饱和溶液，再放置于超临界CO2结晶釜中，结晶压力控制在8MPa，温度在65℃，进行超临界CO2抗溶剂结晶60min；
⑥试验结束后，取样检测，可得到99％以上高纯去氧穿心莲内酯16.1g。
Claims (3)
1.一种去氧穿心莲内酯分离纯化方法，其特征在于：
①称取1kg穿心莲浸膏，去氧穿心莲内酯含量4％以上，按1∶10(W/V)的固液比溶于35℃温水中，再用氯仿萃取2次；
②将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯体积比40％∶60％～70％∶30％的流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集70％以上的去氧穿心莲内酯流分；
③将上述流分合并，真空浓缩干燥，得固体粉末，再溶解到乙酸乙酯中，按液固比30∶1(V/W)配成溶液，进行真空浓缩，当有微量晶体析出后停止浓缩，将溶液再冷却至25～30℃，倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、结晶；
④过程③重复两次，取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在97％以上；
⑤将上述结晶产物用45℃乙醇溶剂配成饱和溶液，再放置于超临界CO2结晶釜中，结晶压力控制在10MPa，温度在60℃，进行超临界CO2抗溶剂结晶60min；
⑥试验结束后，取样检测，可得到纯度99％以上去氧穿心莲内酯17.5g。
2.一种去氧穿心莲内酯分离纯化方法，其特征在于：
①称取1kg穿心莲浸膏，去氧穿心莲内酯含量4％以上，按1∶20(W/V)的固液比溶于40℃温水中，再用氯仿萃取2次；
②将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯体积比40％∶60％～70％∶30％的流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集70％以上的去氧穿心莲内酯流分；
③将上述流分合并，真空浓缩干燥，得固体粉末，再溶解到乙酸乙酯中，按液固比30∶1(V/W)配成溶液，进行真空浓缩，当有微量晶体析出后停止浓缩，将溶液再冷却到25～30℃，倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、结晶；
④过程③重复两次，取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在97％以上；
⑤将上述结晶产物用45℃乙醇溶剂配成饱和溶液，再放置于超临界CO2结晶釜中，结晶压力控制在12MPa，温度在55℃，进行超临界CO2抗溶剂结晶70min；
⑥试验结束后，取样检测，可得到纯度99％以上去氧穿心莲内酯16.7g。
3.一种去氧穿心莲内酯分离纯化方法，其特征在于：
①称取1kg穿心莲浸膏，去氧穿心莲内酯含量4％以上，按1∶15(W/V)的固液比溶于45℃温水中，再用氯仿萃取2次；
②将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯体积比40％∶60％～70％∶30％的流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集70％以上的去氧穿心莲内酯流分；
③将上述流分合并，真空浓缩干燥，得固体粉末，再溶解到乙酸乙酯中，按液固比30∶1(V/W)配成溶液，进行真空浓缩，当有微量晶体析出后停止浓缩，将溶液再冷却到25～30℃，倒入放有两层滤纸的布氏漏斗上过滤、结晶；
④过程③重复两次，取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在97％以上；
⑤将上述结晶产物用45℃乙醇溶剂配成饱和溶液，再放置于超临界CO2结晶釜中，结晶压力控制在8MPa，温度在65℃，进行超临界CO2抗溶剂结晶60min；
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