CN101665800B

CN101665800B - 一种微生态制剂的制备方法及其用途

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Publication number: CN101665800B
Application number: CN2009100969813A
Authority: CN
Inventors: 吴根福
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2009-03-26
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2029-03-26
Also published as: CN101665800A

Abstract

本发明涉及一种微生态制剂的制备方法及其用途。目前高血压要靠药物来控制，存在药物副作用。本发明通过将硫化氢产生酶基因克隆至表达载体，并将载体转化至受体菌中，获得能高效表达硫化氢产生酶的工程菌株，经培养后制得微生态制剂，作为治疗高血压药物的基料。具体步骤是：将硫化氢产生酶基因克隆入表达载体；将带有硫化氢产生酶基因的表达载体转化入受体细胞，获得转化子；培养转化子至对数生长后期，收集菌体作为微生态制剂，即为携带有硫化氢产生酶基因的活菌体。采用该方法制备的微生态制剂在高血压治药物中的应用，患者只需每天摄食少量乳糖或其他辅助食物，工程菌株能在肠道内正常生长和繁殖，因此不需要经常服药，而且没有副作用。

Description

一种微生态制剂的制备方法及其用途

技术领域

本发明属于生物制药领域，特别是公开了一种微生态制剂的制备方法及其用途。

技术背景

随着社会的进步和人们物质生活水平的提高，心脑血管疾病的发生率也在不断上升，其中最常见的是高血压。据报道，全球有26.4％的成人(约9.72亿)患有高血压病或血压偏高，我国高血压患者也已达到了1.6亿。高血压不仅导致患者生活质量下降，还可引起脑中风、心肌梗死和肾功能衰竭等疾病，严重威胁患者的生命安全。目前心脑血管疾病已超越癌症和感染性疾病，成为国人死亡的首要原因。因此控制高血压的发生和发展已成为一个重要的社会问题。

高血压要靠药物来控制。目前高血压治疗药物的主要品种有利尿剂、β-阻滞剂、钙拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、非肽类血管紧张素II受体抑制剂和复方交感神经阻滞剂等几大类。虽然这几类药物的总有效率接近60％，但由于高血压患者需长期服药，其药物副作用(如不良反应多，对大血管的保护性差等)问题已越来越受到人们的关注。开发副作用小的抗高血压药物是当今医药工作者面临的重要课题。

正常情况下，机体的血压可通过神经和体液系统进行内源调节，以维持平衡。一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)是两类早已确认的内源气态调节因子，最近，硫化氢(H₂S)被证实为第三种气态信号分子，共同参与血压及其他生理功能的调节。研究表明，正常机体组织中存在着一定浓度的硫化氢，如大鼠血清中约含46μM硫化氢，哺乳动物脑组织中约含50-160μM硫化氢，它们1/3以气态的形式存在，2/3以离子(主要是HS^-)的形式存在。研究表明，自发性或诱发性高血压大鼠的血浆中硫化氢浓度显著低于正常大鼠，如果静脉注射或腹腔注射NaHS(H₂S的供体)，不仅可提高血浆中的硫化氢水平，还能显著降低大鼠的血压。

为了阐明内源性硫化氢的产生机理，科学家们对有关甲硫氨酸和半胱氨酸的代谢途径进行了研究，发现内源性硫化氢主要由两类磷酸吡哆醛依赖性酶：胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CGL；又称为γ-胱硫醚酶，γ-cystathionase，CSE)产生。研究还表明，硫化氢可直接作用于K_ATP通道，通过减少细胞外Ca²⁺的内流及促进内皮细胞释放内皮超极化因子等方式来舒张血管平滑肌，同时，还可通过对丝裂原激活蛋白激酶的作用抑制血管平滑肌细胞增殖，促进其凋亡，改善血管重构，如果体外灌注这些酶的激活剂，会使受试动物的血压降低，反之，如果灌注这些酶的抑制剂，则会使受试动物的血压升高。

Yang等用敲除CSE的突变小鼠进行实验，发现这种突变小鼠其硫化氢的水平显著下降：纯合突变鼠(CSE^-/-)的主动脉和心脏中硫化氢水平下降约80％，杂合突变鼠(CSE^+/-)下降约50％，并表现出明显的高血压倾向和依赖内皮的血管舒张功能丧失，从而直接证明了硫化氢的血管扩张作用和血压调节作用。

但是，动物对硫化氢浓度非常敏感，过高的硫化氢可损伤神经及呼吸系统，引起动物麻痹和肺水肿。大鼠脑组织中的硫化氢浓度2倍于内源水平时就可表现出毒性，小鼠的脑和肾的硫化氢毒害水平只比生理内源浓度高57％和64％。不过，在生理学条件下，过多的硫化氢可在线粒体内被硫代硫酸盐还原酶迅速代谢，因而不至于发生毒害。

硫化氢的脂溶性5倍于它的水溶性，因此能容易地穿过细胞膜，在细胞之间自由扩散。这种特性有利于口服或透皮药物的开发。但是NaHS因其瞬时释放特性，不可能直接作为药物，如果能让肠道内栖息的微生物菌群缓慢释放硫化氢，将可有效地控制高血压病症的发生和发展。可是肠道的正常微生物菌群不具有或只具有非常弱的硫化氢产生能力，而沙门氏菌及许多腐败菌虽具有较强的硫化氢产生能力，但因是致病菌而不能作为微生态制剂。如果将人、动物或微生物的硫化氢产生酶基因克隆到肠道正常微生物菌群或益生菌群中，将可开发出全新的用于高血压治疗的微生态制剂。

发明内容

本发明的目的就是一种微生态制剂的制备方法及其在制备高血压治疗药物中用途。通过该药物的使用，患者只需每天摄食少量乳糖或其他辅助食物，就可将血压控制在正常范围内。

本发明通过将硫化氢产生酶基因克隆至表达载体，并将载体转化至受体菌中，获得能高效表达硫化氢产生酶的工程菌株，经培养后制得相应的微生态制剂，作为治疗高血压药物的基料。

本发明利用工程菌株及其酶制剂产生的硫化氢来降低血压。由于工程菌株的性状与肠道菌群相似，能在肠道内正常生长和繁殖，因此不需要经常服药，而且没有副作用。本发明所述的硫化氢除了降压作用外，还能参与神经调节、血管重建等生理活动，具有广泛的保健功效。

本发明方法的步骤包括：

步骤(1)将硫化氢产生酶基因克隆入表达载体。

所述的硫化氢产生酶为胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶、半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase)中的一种。它们可以来自于动物细胞，也可以来自其他生物细胞。

所述的表达载体为能够承载外源基因并能使外源基因在受体菌中表达的质粒，是原核表达载体或是真核表达载体。所述的表达载体上具有可调控的启动子，最好不具有抗药基因。

克隆方法采用分子生物学中所用的常规方法，可以通过引物的设计，供体细胞DNA的提取和聚合酶链式反应(PCR)来扩增硫化氢产生酶基因；也可以通过引物的设计，供体细胞RNA的提取和逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)来扩增硫化氢产生酶基因，然后将扩增的硫化氢产生酶基因连接至表达载体中。

步骤(2)将带有硫化氢产生酶基因的表达载体转化入受体细胞，获得转化子。

所述的受体细胞可以是原核受体细胞，如大肠杆菌、乳酸球菌；也可以是真核受体细胞，如酿酒酵母。

转化方法采用分子生物学中常用的转化方法，如电转化法，化学(氯化钙)转化法。

步骤(3)采用适合于受体菌株生长繁殖的摇瓶培养或静置培养的方法培养转化子至对数生长后期，在8000～12000g的转速下离心10～20分钟收集菌体作为微生态制剂；转化子的培养温度为受体菌的最适生长温度25～37℃；培养16～48小时；

所述的微生态制剂为携带有硫化氢产生酶基因的活菌体。

本发明的另一发明点是采用以上方法制备的微生态制剂在制备高血压治疗药物中的应用。

本发明以硫化氢产生酶工程菌微生态制剂为原料，与制药学上可接受的载体或药用辅料开发成相宜的抗高血压制剂，如胶囊剂(如肠溶衣胶囊)、片剂、颗粒剂、口服液等。

本发明的优点是：(1)利用经基因工程改造过的肠道正常微生物菌株或益生微生物菌株作为微生态制剂，该工程菌能表达硫化氢产生酶，将食物中的含硫氨基酸，特别是胱氨酸和半胱氨酸分解成硫化氢，依靠肠上皮细胞的吸收作用，将硫化氢吸收，增加血液和组织中的硫化氢含量，因此不需要每天服药；(2)可通过服用不同种类或浓度的诱导剂来控制工程菌的硫化氢产生酶的表达，通过服用不同剂量的磷酸吡哆醛或二硫苏糖醇来控制工程菌的硫化氢产生酶的活力；(3)所用的诱导剂(如乳糖)、底物(如半胱氨酸)和辅助因子(如磷酸吡哆醛)是正常的食物组成部分，没有副作用，患者只需控制牛奶(乳糖和吡哆醛)及蛋白质(含硫氨基酸和吡哆醛)的摄食量即可控制血压。

硫化氢产生酶工程菌微生态制剂的抗高血压药效学试验

微生态制剂：转胱硫醚-β-合成酶酵母菌微生态制剂，转胱硫醚-γ-裂解酶乳酸菌微生态制剂，转半胱氨酸脱硫酶大肠肝菌微生态制剂；制剂中微生物活菌数为1-2亿个/ml，制剂需4℃冷藏。

动物：普通Wistar大鼠；Wistar Kyoto大鼠(WKY)；自发性高血压大鼠(SHR)。

饲料：玉米粉，15％；黄豆粉，25％，麸皮，10％；面粉，10％；鱼粉，10％；草粉，10％；骨粉，10％，奶粉，10％。上述原料混匀后，每千克中再添加10克复合维生素，0.2毫升(浓)鱼肝油，1克磷酸吡哆醛，1克二硫苏糖醇，10克乳糖。混匀，加适量水后加工成型。

1.转胱硫醚-β-合成酶酵母菌微生态制剂对自发性高血压大鼠血压的影响试验

取3-4周龄WKY雄性鼠(45-60克)16只，随机分成组A和组B；取3-4周龄SHR雄性鼠(45-60克)16只，随机分成组C和组D。每天按每千克体重喂食50克饲料，分两次供给，吃完为止；组A和组C供应普通饲料(作为对照)，组B和组D供应含转胱硫醚-β-合成酶酵母菌微生态制剂的饲料(每千克饲料颗粒用100毫升转胱硫醚-β-合成酶酵母菌微生态制剂喷淋后，常温干燥备用)；饮水充分供应，分别于实验前及实验5周后用尾容积法测清醒时的动脉血压(收缩压)。结果见表1。

表1.转胱硫醚-β-合成酶酵母菌微生态制剂对自发性高血压大鼠尾动脉血压的影响(mmHg)

*：与组C比较，P＜0.05

2.转胱硫醚γ-裂解酶乳酸乳球菌微生态制剂对低氧性高血压大鼠血压的影响试验

取7周龄普通Wistar雄性鼠(180-200克)30只，随机分成3组：组A、组B和组C。组A常规饲养，组B和组C每天在常压低氧舱中连续低氧处理(低氧舱内通入氮气，使氧气浓度保持在10.0±0.5％)6小时，共持续21天。每天按每千克体重喂食50克饲料，分两次供给，一次在低氧处理前3小时，一次在低氧处理后3小时；饮水充分供应，组A和组B供应普通饮用水(作为对照)，组C供应含转胱硫醚γ-裂解酶乳酸乳球菌微生态制剂的饮用水(每升水中添加10毫升乳酸球菌微生态制剂以及10克乳链菌肽)；实验结束后，腹腔注射12％乌拉坦(10毫升/千克)麻醉大鼠，用右心导管法测肺动脉平均压。结果见表2。

表2.转胱硫醚γ-裂解酶乳酸乳球菌微生态制剂对低氧性高血压大鼠血压的影响(mmHg)

处理	A(n＝10)	B(n＝10)	C(n＝10)
				肺动脉压	15.8±3.8	24.1±4.1	16.3±2.7**

**：与组B比较，P＜0.01

3.转半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌微生态制剂对肾血管性高血压大鼠血压的影响试验

取7周龄普通Wistar雄性鼠(180-200克)28只，随机分成4组：组A、B、C和D；每天按每千克体重喂食50克饲料，分两次供给，吃完为止；饮水充分供应，组A、B和C供应普通饮用水(作为对照)，组D供应含转半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌微生态制剂的饮用水(在10ml大肠杆菌微生态制剂中添加1克乳糖，10毫克磷酸吡哆醛和10毫克二硫苏糖醇，混匀后用明胶包裹制成肠溶衣微胶囊，添加至100毫升饮用水中)；饲喂一周后，将组B和组D的大鼠进行双肾一夹手术，组C的大鼠进行假手术(不对肾动脉进行处理)。手术后四组动物统一供应普通饮用水。分别于手术前及术后1-4周用尾容积法测清醒时的尾动脉血压(收缩压)。结果见表3。

表3.转半胱氨酸脱硫酶大肠杆菌微生态制剂对肾血管性高血压大鼠血压的影响(mmHg)

处理	A(n＝7)	B(n＝7)	C(n＝7)	D(n＝7)
					手术前	109.6±6.3	108.2±3.8	111.3±7.1	110.8±2.1
术后1周	110.5±4.2	110.4±5.1	120.7±4.6	119.7±3.0
					术后2周	112.8±5.1	109.8±2.4	148.6±7.6	125.6±3.9
术后3周	111.5±4.6	113.2±3.2	160.1±8.1	129.4±4.1*
					术后4周	113.0±5.5	112.5±4.3	183.7±6.8	135.6±4.5*

*：与组C比较，P＜0.05

具体实施方式

实施例1-1：

(1)取大鼠肝组织，匀浆后，用分子生物学常规方法提取总RNA；

(2)合成胱硫醚γ-裂解酶(CSE)的PCR引物，正向引物为

5’-ATGCCTCGAGATGCAGAAGGACGCCTCTTTGAG-3’，

反向引物为5’-ATGCATGCGCGGCCGCTTAAGGGTGCGCTGCCTTCAA-3’；

(3)用(1)中提取的总RNA为模板，利用(2)中合成的胱硫醚γ-裂解酶引物，用逆转录试剂盒进行逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)。反应产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，切割大小约为1200bp的条带，用割胶回收试剂盒进行回收；

(4)将(3)中的PCR纯化产物用Xho|和Not|双酶切后与经同样酶切的酵母-大肠杆菌穿梭质粒pGAPZ混合，在连接酶作用下连接后，转化入大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞中，筛选阳性克隆，培养后提取重组质粒；

(5)将(4)中提取的重组质粒用Sal|酶切线性化后，用电转化仪转入毕赤酵母MC100-3受体菌株(感受态细胞)中，平板筛选胱硫醚-γ-裂解酶阳性的工程菌；

(6)将(5)中筛选所得的工程菌在25℃摇瓶(180rpm)培养24小时，8000g离心10分钟收集菌体，加5％甘油溶液调成1亿个酵母细胞/ml，每毫升悬液中添加10毫克乳糖，1毫克磷酸吡哆醛和1毫克二硫苏糖醇，低温保存，作为微生态制剂应用于高血压患者。

实施例1-2：

(1)取小鼠胰腺组织，匀浆后，用分子生物学常规方法(试剂盒)提取总RNA；

(2)合成胱硫醚β-合成酶(CBS)的PCR引物，正向引物为

5’CGCATGCATCGTCCCAGCATGCAGAAGAA3’，

反向引物为5’-CGCCTCGAG-CAGTTATTCAGAAGGTCTGGCCC-3’；

(3)用(1)中提取的总RNA为模板，利用(2)中合成的胱硫醚β-合成酶引物，进行逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)。反应产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，切割1700bp左右的条带，用割胶回收试剂盒进行回收；

(4)将(3)中的PCR纯化产物用Nsi|和Xho|双酶切后与经同样酶切的乳酸菌表达质粒pNICE:sec混合，在连接酶作用下连接后，转化入乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞中，筛选阳性克隆；

(5)将获得的基因工程菌在30℃静置培养48小时，12000g离心15分钟收集菌体；

(6)将培养获得的活菌体以10毫克湿菌体/100克酸奶的添加量添加于酸奶中作为微生态制剂应用于高血压患者。

实施例1-3：

(1)常规法从自然环境中分离筛选硫化氢产生菌；

(2)冻融法提取(1)中筛选得到的硫化氢产生菌的总DNA；

(3)合成半胱氨酸脱硫酶的3’端和5’端引物，正向引物为：5’-GCATTGAGCCATGGACGGAGTTTA-3’，反向引物为：5’-CCGATTAAAGCTTAGCCCATTCGA-3’；

(4)用(2)中提取的细菌总DNA为模板，利用(3)中合成的正向及反向引物，进行多聚酶链式反应。反应产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳后，切割大小约为1300bp的部分，进行回收，纯化的PCR产物用Nco|和Hand III双酶切后，连接于pET 28b+表达载体上；

(5)将克隆后的载体用氯化钙处理法转化至大肠杆菌BL-21菌株的感受态细胞中，选择转化子；

(6)将获得的基因工程菌在37℃通气(每立方发酵液每分钟通入0.5立方无菌空气)搅拌(每分钟250转)培养16小时；

(7)12000g离心20分钟收集菌体，将培养获得的活菌体作为微生态制剂应用于高血压患者。

实施例1-4：

(1)常规法从自然环境中分离筛选硫化氢产生菌；

(2)冻融法提取(1)中筛选得到的硫化氢产生菌的总DNA；

(3)合成胱硫醚γ-裂解酶(CSE)的PCR引物，正向引物为

5’-ATGCCTCGAGATGCAGAAGGACGCCTCTTTGAG-3’，

反向引物为5’-ATGCATGCGCGGCCGCTTAAGGGTGCGCTGCCTTCAA-3’；

(4)用(1)中提取的总DNA为模板，利用(2)中合成的胱硫醚γ-裂解酶引物，进行多聚酶链式反应。反应产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，切割大小约为1200bp的条带，用割胶回收试剂盒进行回收；

(5)将(3)中纯化的PCR产物用Nco|和Hand III双酶切后，连接于pET 28b+表达载体上；

(6)将克隆后的载体用氯化钙处理法转化至大肠杆菌BL-21菌株的感受态细胞中，选择转化子；

(7)将获得的基因工程菌在32℃摇床(200转/分)培养20小时；

(8)、10000g离心20分钟收集菌体，将培养获得的活菌体(湿)与乳糖、磷酸吡哆醛、二硫苏糖醇以100∶10∶1∶1的比例混合后，制成肠溶衣微胶囊，应用于高血压患者。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种微生态制剂的制备方法及其用途

<130>3

<140>200910096981.3

<141>2009-03-26

<160>6

<170>Patent In version 3.3

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>根据胱硫醚γ-裂解酶的氨基端编码序列设计，并加入了限制性内切酶Xho I的作用位点，用作以该酶的mRNA为模板进行逆转录多聚酶链式反应时的上游引物。

<400>1

atgcctcgag atgcagaagg acgcctcttt gag 33

<210>2

<211>37

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>根据胱硫醚γ-裂解酶羧基端编码序列设计，并加入了限制性内切酶Not I的作用位点，用作以该酶的mRNA为模板进行逆转录多聚酶链式反应时的下游引物。

<400>2

atgcatgcgc ggccgcttaa gggtgcgctg ccttcaa 37

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>根据胱硫醚β-合成酶的氨基端编码序列设计，并加入了限制性内切酶Nsi I的作用位点，用作以该酶的mRNA为模板进行逆转录多聚酶链式反应时的上游引物。

<400>3

cgcatgcatc gtcccagcat gcagaagaa 29

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>根据胱硫醚β-合成酶的羧基端编码序列设计，并加入了限制性内切酶Xho I的作用位点，用作以该酶的mRNA为模板进行逆转录多聚酶链式反应时的下游引物。

<400>4

cgcctcgagc agttattcag aaggtctggc cc 32

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>根据半胱氨酸脱硫酶氨基端编码序列设计，并加入了限制性内切酶Nco I的作用位点，用作该基因进行多聚酶链式反应时的上游引物。

<400>5

gcattgagcc atggacggag ttta 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>根据半胱氨酸脱硫酶羧基端编码序列设计，并加入了限制性内切酶Hind III的作用位点，用作该基因进行多聚酶链式反应时的下游引物。

<400>6

ccgattaaag cttagcccat tcga 24

Claims

1.一种微生态制剂的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤是：

步骤(1)将硫化氢产生酶基因克隆入表达载体；

所述的硫化氢产生酶为胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶、半胱氨酸脱硫酶中的一种；

所述的表达载体为能够承载外源基因并能使外源基因在受体菌中表达的质粒，是原核表达载体或是真核表达载体；

所述的表达载体上具有可调控的启动子；

步骤(2)将带有硫化氢产生酶基因的表达载体转化入受体细胞，获得转化子；

所述的受体细胞为原核受体细胞或真核受体细胞；

步骤(3)采用摇瓶培养或静置培养的方法培养转化子至对数生长后期，在8000～12000g的转速下离心10～20分钟收集菌体作为微生态制剂；转化子的培养温度为25～37℃；培养16～48小时；

所述的微生态制剂为携带有硫化氢产生酶基因的活菌体。

2.按照权利要求1所述的方法制备的微生态制剂在制备高血压治疗药物中的应用。